CARPETA

DE
TRABAJOS PRCTICOS
DE
QUMICA BIOLGICA II

Profesor: Dr. Osvaldo Len Crdoba

J.T.P: Bioq. Mara Andrea Abalos
Aux. 1ra: Bioq. Mnica Beatriz Becerra

REGLAMENTO DE QUIMICA BIOLOGICA II 2010

1- Puntualidad en el horario de los trabajos Prcticos
2- Aprobacin del 85% de los Trabajos Prcticos (asistencia, aprobacin cuestionario y del
informe).
3-El parcialito se tomara antes de cada TP; los desaprobados podrn recuperarse antes de cada
parcial.
4- Se tomaran 3 exmenes parciales que incluirn cada uno 5 unidades del programa de la
asignatura.
5- Cada unidad se aprueba con el 60%, pudiendo recuperarse hasta dos unidades
6- Al final de la cursada se podr rendir un recuperatorio final.
7- Como trabajo final los alumnos debern exponer en un seminario, un trabajo de
investigacin, entregado por la ctedra.

CRONOGRAMA QUIMICA BIOLOGICA II

2010

TEORIAS Mircoles 11-14 hs Aula: 101 y Jueves 10-13 hs Aula: 103

TRABAJOS PRACTICOS MARTES 9,30-13 h Laboratorio A
Martes

3/8

Presentacin Teora

Martes

10/8

Teora

Martes

17/8

Teora

Martes

24/8

Teora

Martes

31/8

I PARCIAL

Martes

7/9

TP 1. Protenas I

Martes

14/9

SEMANA DEL ESTUDIANTE

Jueves

16 /9

RECUPERATORIO I PARCIAL

Martes

21/9

TP 2. Protenas II

Martes

28/9

TP 3. Protenas III

Martes

5/10

TP 4. Protenas IV

Martes

12/10

TP 5. Induccin

Martes

19/10

TP 6. Glucgeno: cuantificacin en tejidos

Martes

26/10

TP 7. Produccin de Piruvato y Acetaldehdo durante la fermentacin de

Glucosa.

Viernes

29/10

II PARCIAL

Martes

02/11

TP 8. Fotosntesis

Viernes

12/11

RECUPERATORIO II PARCIAL

Martes

16/11

III PARCIAL

Jueves

18/11

SEMINARIO

Jueves

25/11

RECUPERATORIO III PARCIAL

Lunes

29/11

RECUPERATORIO FINAL

Qumica Biolgica II

2010

TRABAJO PRCTICO 1
PROTEINAS I
PURIFICACION DE UNA ENZIMA: LA LISOZIMA DE HUEVO
OBJETIVO:
Purificar la enzima lisozima a partir de la clara de huevo por cromatografa de intercambio
inico. Purificacin mediante electroforsis en geles de poliacrilamida
Determinacin de la actividad enzimtica por espectrofotometra.
INTRODUCCION:
El nombre de lisozima o muramidasa (EC 3.2.1.17) incluye a un grupo de enzimas que catalizan la
hidrlisis de enlaces glicosdicos (1 4) de los polisacridos de la pared celular bacteriana. Son
protenas globulares constituidas por una sola cadena polipeptdica (129 aminocidos para la
lisozima de Gallus gallus) y de peso molecular comprendido en el rango de 14 a 30 KDa. Estas
protenas contienen cuatro puentes cruzados disulfuro que contribuyen a su elevada estabilidad.
La lisozima fue la primera protena secuenciada, la primera enzima de la que se dispuso de un
modelo tridimensional (usando cristalografa de rayos x) y la primera para la que se propuso un
mecanismo de accin detallado.

1)

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

La cromatografa de intercambio inico se fundamenta en las propiedades cido-base de las

protenas. Una protena, a pH menor de su pI (punto isoelctrico), tendr carga positiva y a pH
mayor de su pI presentar carga negativa. Por lo que, en el primer caso, se unir a una resina con
carga negativa (Carboximetil-celulosa, CM-celulosa) y en el segundo a una resina con carga
positiva (Dietilaminoetil-celulosa, DEAE-celulosa).

Qumica Biolgica II

2010

Una vez unida la protena a las resinas, estas se pueden eluir de dos formas distintas:
1) variando el pH del medio hasta alcanzar el pI
2) mediante un gradiente inico aadiendo el contrain correspondiente (Na+ en el caso de
intercambio catinico o Cl- para el intercambio aninico)
Dado que el pI de la LISOZIMA es de 11, dos unidades de pH superior al del resto de las protenas
de la clara del huevo, a un pH de 9,5 - 10 la lisozima es prcticamente la nica protena con
carga positiva neta. Ello permite separar esta enzima del resto de protenas mediante la utilizacin
de resinas INTERCAMBIADORAS DE CATIONES.
MATERIALES Y METODOS
Huevos de gallina para la obtencin de la enzima.
Buffer A: glicina/NaOH 100 mM, pH 10
Buffer B: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, conteniendo 0.6 M NaCl
Carboximetil-Celulosa
Activacin de la CM: previamente a su utilizacin, la resina se lava con HCl 0.5 M (5 minutos), 2
veces con H2O (hasta pH neutro), NaOH 0.5 M (5 minutos) y finalmente dos veces con H 2O (hasta
pH neutro). Por ltimo se hace una suspensin 1/1 (vol/vol) en tampn glicina/NaOH 100 mM pH
10
Buffer fosfato sdico 100 mM, pH 6,2
Suspensin de la bacteria Micrococus, (obtenida de suelo y suspendida en caldo de
enriquecimiento) de D.O entre 0,6-0,7 en el tampn fosfato anterior.
1. a. PURIFICACION DE LA LISOZIMA
1. Recoger la clara procedente de un huevo. Diluirla 1/5 (vol/vol) con Buffer A. Tomar 10 ml de la
muestra anterior en un tubo cnico con tapn de 15 ml.
2. Antes de comenzar la purificacin de la lisozima separar una alcuota de 1 ml (Fraccin O, Fo),
para medir la actividad de la enzima en la fraccin de partida.
3. A los 9 ml restantes aadir 4 ml de CM-celulosa previamente activada y agitar suavemente
durante 15 min, para que la lisozima se adsorba a la resina.
4. Al finalizar la incubacin, centrifugar la muestra a 600 rpm durante 3 min. Guardar el
sobrenadante (Fraccin 1, F1).
5. Aadir a la resina (precipitado) 10 ml de Buffer A. Agitar suavemente y centrifugar de nuevo.
Recoger el sobrenadante (Fraccin 2, F2).
5

Qumica Biolgica II

2010

6. Repetir el lavado anterior y desechar el sobrenadante.

7. Elucin. Resuspender la CM-celulosa con 3 ml de Buffer B e incubar, agitando suavemente,
durante 10 minutos. Centrifugar y recoger el eluido (Fraccin 3, F3, lisozima purificada).
Medir, exactamente, en tubo cnico graduado el volumen total de cada fraccin
B. MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
La medida de la actividad lisozima se realiza utilizando una suspensin de agregados de pared
celular del microorganismo:
Al incubar esta suspensin con lisozima, los fragmentos de pared celular se hidrolizan, originando
otros ms pequeos, lo que reduce la dispersin de la luz, que se manifiesta en una reduccin en la
absorbancia a
una longitud de onda fija de 450 nm. La actividad enzimtica es proporcional a la disminucin de la
absorbancia a 450 nm.
1. En una cubeta de espectrofotmetro, aadir 3 ml de suspensin de pared bacteriana. Meterla en
el espectrofotmetro y anotar la densidad ptica (D.O.). Esta medida constituye el tiempo cero y
hay que hacerlo para cada medida.
2. Aadir 25 l de la fraccin correspondiente a ensayar, tomar el tiempo por el reloj, agitar e
introducir la cubeta en el espectrofotmetro y anotar la absorbancia observada al primer minuto y al
segundo minuto. Calcular la variacin de absorbancia al primer minuto (A1/min) y al segundo
(A2/min). Hacer la media de las dos medidas.
Anotar los resultados en la tabla siguiente:
Volmenes

(ml)

Absorbancia
a t 0

Absorbancia a
t 1

Absorbancia
a t 2

A1/min

A2/min

_
A/min

Actividad
(U)

F0
F1
F2
F3
CALCULOS:
1. Actividad de cada fraccin
2. % Retencin de la resina:
Actividad F0 Actividad F1

100

Actividad F0
3. % de Recuperacin:
Actividad F3
Actividad F0

100

GUARDAR TODAS LAS FRACCIONES PARA USARLAS EN LAS PRXIMAS

PRCTICAS
-Recurso bibliogrfico: Practicas de Bioqumica General, Departamento de Bioqumica,
Universidad de Sevilla .Curso 2005/2006.

Qumica Biolgica II

2010

TRABAJO PRCTICO 2
PROTEINAS II
A) ELECTROFORESIS: Separacin de protenas en geles de poliacrilamida
OBJETIVO: utilizar la tcnica de la electroforesis en gel para analizar la purificacin de la
enzima LISOZIMA. Se analizar la composicin proteica de las distintas fracciones y se constatar
el grado de pureza de la lisozima.
FUNDAMENTO
La electroforesis es la migracin de iones en un campo elctrico. Es una de las tcnicas analticas
ms importantes dentro de la Bioqumica. Las molculas biolgicas (ADN, protenas, vitaminas,
etc.) poseen cargas elctricas, y por tanto poseen esta propiedad de movilidad en un campo
elctrico. La movilidad depender de la carga que presentan al pH que trabajemos. La
electroforesis en gel es el mtodo ms conveniente para realizar separaciones de macromolculas
(ADN y Protenas). El soporte de la electroforesis (el gel) es un entramado tridimensional que
impide o reduce la difusin. Este gel ha de ser compatible con los tampones usados y debe permitir
la entrada del lquido en los poros (reticulados hidratables).
Los soportes pueden ser ms o menos restrictivos segn que el tamao de poros limite o impida el
paso de las molculas. Los ms restrictivos, como los geles de acrilamida-bisacrilamida, oponen
impedimento al paso de las molculas, participando as en el proceso de separacin. Entre los menos
restrictivos est la agarosa. El tamao de poro que da unas dimensiones moleculares de criba de los
geles puede ser establecido previamente. El gel en la electroforesis retarda, en mayor o menor
medida, a las molculas mayores respecto a las de menor tamao. Las separaciones moleculares
estn pues basadas en el tamizado molecular junto a la movilidad electrofortica de las molculas
que van a ser separadas.

Para llevar a cabo la electroforesis se necesita: A) una fuente de Tensin que proporciona el campo
elctrico, mediante dos electrodos, positivo (nodo) y negativo (ctodo), entre los que se establece
la diferencia de potencial. B) una cubeta o recipiente, en cuyos extremos se sitan los electrodos.
C) un soporte electrofortico. D) el buffer de electroforesis: durante la electroforesis se produce
electrolisis del agua, generndose protones en la proximidad del nodo e iones hidroxilos en la
proximidad del ctodo; el tampn evitar que el entorno andico se acidifique y el catdico se haga
ms bsico a lo largo de la electroforesis.
7

Qumica Biolgica II

2010

El polmero utilizado para la formacin del gel es la acrilamida y la bis-acrilamida, los cuales se
polimerizan mediante la adicin de catalizadores (persulfato amnico, TEMED).
En nuestro caso, la separacin de las protenas se ver condicionada slo por su tamao y no por su
carga ya que previamente las protenas sern desnaturalizadas utilizando un detergente (SDS), el
cual despliega a las protenas y se queda pegado a su superficie confirindole una gran carga
negativa. Esa gran carga negativa enmascara la carga intrnseca de la protena, y las protenas una
vez tratadas con SDS presentan todas las mismas cargas, y la separacin ser debida
solamente a la masa molecular de la protena.

PROTOCOLO
La separacin electrofortica se lleva a cabo segn el mtodo descrito por Laemmli en geles de
poliacrilamida en presencia de SDS.
Reactivos
- Monmero: (30% T; 2,67% C)
Acrilamida : 29,2 g
Bis-acrilamida: 0,8g
Agua (d) c.s.p. 100 ml
-Buffer de muestra:
Tris HCL 0,5M pH 6,8: 1 ml
Mercaptoetanol: 0,4 ml
Glicerol: 0,8 ml
SDS 10%: 1,6 ml
Bromofenol Blue 0,05 %: 0,2ml.
- Buffer ctodo:
Tris base: 6,055 g
Tris HCL : 8,36 g
SDS: 0,5 g
Agua (d) c.s.p. 500 ml
- Buffer nodo:
Tris base: 25,17 g
8

Qumica Biolgica II

2010

Tris HCL : 3,84 g

Agua (d) c.s.p. 1000 ml
- Gel buffer:
Tris base: 25,17 g
Tris HCL: 14,55 g
SDS: 0,3 g
Agua (d) c.s.p. 100 ml
- Colorante: Coomasie Blue R250 0,1% en MeOH-acido actico-agua (d) (4:1:6)
- Decolorante: MeOH-acido actico-agua (d) (3:1,2:5,8)

Preparacin de la muestra: La protena se diluye 1:1 con sample buffer, y se calienta a

90C por 3 minutos.

Preparacin del gel : Gel 10% ,para un gel.

Monmero: 2 ml
Agua (d): 1,2 ml
Gel buffer: 2 ml
Glicerol: 0,8 g (0,65 ml)
TEMED: 5 l
APS 10%: 50 l
Siembra: Se siembran 5 l del marcador de peso molecular elegido (seminario) en la calle nmero
1. Se deja libre una calle y a continuacin se siembran 20 l de cada muestra preparada.
Agitar bien y armar el gel rpidamente antes de que comience a notarse la polimerizacin
del
mismo.
Desarrollo: Se arma la cuba electrofortica. Se introduce el gel en su interior, el buffer nodo por
fuera y el buffer ctodo por dentro. Se conecta la corriente elctrica y se deja correr a un voltaje de
60 V por 10 minutos para concentrar, luego 10 minutos a 80 V y el resto 100 V.
Coloracin y decoloracin: Una vez terminada la corrida, se colorean las protenas por 30 minutos
con Coomassie Brilliant Blue y luego se decolora el gel con decolorante durante toda la noche.

Qumica Biolgica II

2010

B.- EFECTO DE LA TEMPERATURA Y DE LA REDUCCIN DE LOS PUENTES

DISULFURO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA LISOZIMA

OBJETIVO: estudiar la contribucin de los enlaces disulfuro y puentes de hidrgeno a la

conformacin del centro activo de la lisozima y su efecto sobre la actividad de la enzima.
El DTT (ditiotreitrol) es un reductor de puente disulfuro. Por tanto, su adicin en concentracin
suficiente, reducir los -S-S- de la lisozima y producir cambios en la estructura terciaria de la
protena. Estos cambios pueden afectar a la actividad enzimtica de la lisozima.
Por otra parte, los puentes de hidrgeno tambin estn implicados en el mantenimiento de la
estructura de las protenas. Estos puentes de hidrgenos se pueden romper fcilmente por
tratamiento con calor. Del mismo modo al caso anterior, la modificacin de la estructura de la
protena por rotura de los puentes de hidrgeno puede modificar la actividad del enzima.
PROTOCOLO
El estudio se lleva a cabo en la fraccin F3 purificada en la prctica anterior.
1. Preparar 4 tubos eppendorf numerados del 1 al 4 y pipetear las cantidades adecuadas segn se
indica en la tabla siguiente
Tubo
1
2
3
4

Fraccin F3
200 l
200 l
200 l
200 l

DTT (0.5 M)*

20 l
20 l

50C/30min
+
+

10

Qumica Biolgica II

2010

* La concentracin de DTT de 0.5M es concentracin inicial (75 mg/1000 ml)

Los tubos 1 y 2 se mantienen a temperatura ambiente
Los tubos 3 y 4 se calientan a 50C durante 30 min.
2. Medir la actividad como se indic en la prctica anterior.
Anotar los resultados en la tabla siguiente
Tubo

Absorba
ncia a t
0

Absorba
ncia a t
1

Absorba
ncia a t
2

A1/mi
n

A2/
min

_
A/mi
n

Activi
dad
(U)/20
0 ml

1
2
3
4

Recurso bibliogrfico:
- Practicas de Bioqumica General, Departamento de Bioqumica, Universidad de
Sevilla .Curso 2005/2006.
- Curso de posgrado: PURIFICACION DE PROTEINAS. UNPSJB 2008

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Qumica Biolgica II

2010

TRABAJO PRCTICO 3
PROTEINAS III
DETERMINACIN DE PROTEINAS
OBJETIVO: Calcular la concentracin total de protenas contenida en una disolucin. Con este fin,
utilizaremos las muestras obtenidas en la prctica de Purificacin de la Lisozima y seguiremos el
mtodo de Lowry.
FUNDAMENTO
El mtodo de Lowry se basa en la reaccin de las protenas con el reactivo de Folin dando un
complejo coloreado. Este reactivo es una disolucin de tungstato sdico y molibdato sdico en
cido fosfrico y cido clorhdrico. El mecanismo del proceso es el siguiente: el Cu2+, en medio
alcalino, forma un complejo con los enlaces peptdicos de las protenas reducindose a Cu +. Este
ion, as como los grupos R de los residuos de tirosina y triptfano de las protenas, reaccionan con
el reactivo de Folin, produciendo inicialmente un producto inestable, que se reduce para formar un
compuesto coloreado.
La intensidad del color depende de la cantidad presente en las protenas de estos aminocidos
aromticos y ser proporcional a la concentracin de protenas en la disolucin.
La concentracin de una disolucin problema puede calcularse interpolando el valor obtenido de
absorbancia en una recta de calibrado trazada con valores conocidos de concentracin de una
protena y sus respectivas absorbancia.

MATERIAL Y REACTIVOS
Reactivo 1: Na OH 0,1 N. Preparar 50 ml.
Reactivo 2: 50 ml de Sn 1 y 1 ml de Sn 2
Solucin 1: Na2CO3 al 2% en reactivo 1
Solucin 2: 5 ml Tartrato de sodio al 2% + 5 ml SO4Cu 1% + 0,25 ml de NaOH
1 N.
Reactivo 3: de Folin-Ciocalteus( tungstato Na y molibdato sdico en PO4H3 y ClH) 1 ml + 1 ml de
H2O.Preparado en el momento de usar y guardado en oscuridad!!!!!!!!!!!!! .
Albumina: 500 g /ml .
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Qumica Biolgica II

2010

PROTOCOLO
1.- Diluir las muestras a las cuales vamos a determinarles la concentracin de protenas:
F0 y F1, como tendrn una mayor concentracin de protenas se diluyen 100 veces
(dilucin 1/100) (0.1 ml fraccin + 9.9 ml H2O)
F2, fraccin que procede de lavar la columna de CM y que tendr una menor cantidad
de protenas se diluye 10 veces (dilucin 1/10) (0.1 ml fraccin + 0.9 ml H2O)
F3, fraccin de lisozima pura se diluye 50 veces (dilucin 1/50) (0.1 ml fraccin + 4.9
ml H2O)
2.- Rotular tubos de transparente del 1 al 10 y seguir el esquema.

Mezclar con Vortex y dejar 15 minutos a T ambiente

Rvo 3 (l) 200
200
200
200

200

200

200

Mezclar inmediatamente y dejar reposar 30 en oscuridad. Leer en espectrofotmetro a

750 nm. Llevar a cero con el blanco.
La reaccin es estable por una hora
CALCULOS:
Representar los valores de absorbancia a 750 nm frente a los g/ml de albmina.
Extrapolar los valores correspondientes a las distintas fracciones de la purificacin
para el clculo de la concentracin de protenas en mg/ml. Tener en cuenta el factor de
dilucin empleado.

13

Qumica Biolgica II

2010

N TUBO
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Fracciones

[Protenas]
25 g/ml
75 g/ml
125 g/ml
250 g/ml
500 g/ml
F0 (1/100)
F1 (1/100)
F2 (1/10)
F3 (1/50)

Volmenes de las
fracciones de la
prctica 1
(ml)

Protenas
(mg/ml)

Absorbancia a 750

Protenas
totales
(mg)

F0
F1
F2
F3

Recurso bibliogrfico:
-Practicas de Bioqumica General, Departamento de Bioqumica, Universidad de Sevilla
Curso 2005/2006.
- Curso de posgrado: PURIFICACION DE PROTEINAS Universidad Nacional de la
Patagonia San Juan Bosco. 2008.
- Gua de Trabajos Prcticos Qumica Biolgica II 2007/2008.UNPSJB.

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Quimica Biologica II

2010

TRABAJO PRCTICO 3
HPLC (High Perfomance Liquid Chromatography)
OBJETIVO
Realizar el anlisis cualitativo de una mezcla de compuestos mediante HPLC
INTRODUCCIN
La cromatografa de lquidos a alta presin es una de las tcnicas ms utilizadas tanto con fines
analticos como preparativos. Su uso est muy extendido debido a las ventajas que presenta frente a
otras tcnicas, entre las que se destacan su aplicacin al anlisis y a la separacin de mezclas de
cualquier clase de compuestos, independientemente de su polaridad, estabilidad trmica o
volatilidad.
Requiere de la utilizacin de un cromatgrafo de lquidos en el que la fase mvil (disolvente) es
lquida, y se bombea a travs de la columna a alta presin (1000 a 6000 psi) y velocidad de flujo
constante. La columna contiene la fase estacionaria. La muestra a analizar se inyecta en la columna
y sus componentes se van separando a medida que el disolvente eluye la muestra, en funcin de sus
afinidades relativas por la fase estacionaria y la fase mvil. Una vez finalizada la elusin, cada
componente de la muestra pasa por un detector que convierte la informacin en una seal elctrica y
la enva a un integrador y a un registro grfico, obtenindose el correspondiente cromatograma, que
consiste en una grfica de la concentracin de las fracciones eludas en funcin del tiempo, junto
con la medida del rea de cada uno de los picos.
El cromatograma informa:
-

complejidad de la muestra en base al nmero de picos observados

identificacin cualitativa de los componentes de la muestra, en base a la posicin

precisa de cada pico (tiempo de retencin) en condiciones cromatogrficas concretas

-

concentracin de cada pico, en base a su rea relativa

Fase mvil:
El disolvente se almacena en un depsito, pasa por un filtro y luego a la bomba y debe:
-

ser calidad HPLC

disolver la muestra a analizar

no degradar la fase estacionaria

ser miscible con otros disolventes si se pretende utilizar mezclas

tener baja viscosidad

15

Quimica Biologica II

2010

Columnas:
Se construyen en acero inoxidable para resistir la elevada presin, con un dimetro interno de
0,3 a 0,5 cm. Este determina la capacidad de carga, dilucin de los picos y velocidad de flujo.
La longitud vara entre 3 a 30 cm y al aumentar mejora la eficacia.
Fase estacionaria:
Constituda por un slido o un lquido soportado en un slido inerte. La diferencia con la
cromatografa convencional reside en el empaquetado de la columna con micropartculas
porosas esfricas (5 a 10 um). El tamao de partcula determina el nmero de platos tericos
por unidad de longitud por lo que la mayor eficacia se logra con partculas muy pequeas. Al
seleccionar la columna se deben tener presentes dos objetivos:
-

obtener la mejor resolucin de los componentes de la muestra en el menor tiempo

posible.
-

asegurar alta precisin y exactitud.

Bomba:
La ms utilizada es la bomba de pistn de retroceso que se compone de un pequeo motor que
mueve linealmente un pistn con una cmara hidrulica de 40-400 ml. La velocidad de flujo
puede modificarse alterando el volumen que el pistn bombea en cada ciclo o modificando la
velocidad de bombeo. El bombeo del disolvente puede ser:
-

isocrtico: se bombea una fase mvil de composicin constante

en gradiente: sistema automatizado que permite cambiar la composicin de la fase

mvil, mezclando dos o ms disolventes en proporciones variables.

Inyector:
La muestra se disuelve en el mismo solvente o mezcla de la misma fase mvil. Debido a la
alta presin la muestra se inyecta en un sistema de inyeccin con una vlvula de giro (loop)
que no interrumpe el flujo del disolvente. Antes de introducir la muestra, la vlvula se coloca
en posicin de carga y luego de la inyeccin de la muestra se gira a la posicin de inyeccin
para permitir que la fase mvil la introduzca en la columna. La mejor resolucin se obtiene
con poca cantidad de muestra y bajo volumen de inyeccin.
Detector:
Es el componente que emite una respuesta cuando se produce la elusin de cada componente
16

Quimica Biologica II

2010

de la mezcla y la convierte en un pico del cromatograma. Se coloca inmediatamente despus

de la columna. Puede ser de varios tipos:
-

basado en una propiedad de la fase mvil como el ndice de refraccin.

basado en la propiedad de la sustancia a analizar como detector de UV o fluorescencia.

Aplicacin de HPLC: anlisis cualitativo de una mezcla de compuestos.

Cada compuesto tiene un tiempo de retencin caracterstico utilizando condiciones y
parmetros determinados. Este hecho permite su identificacin por comparacin con un
patrn de referencia.
Procedimiento:
Optimizar parmetros para obtener una buena resolucin de los componentes de inters.
Determinar los tiempos de retencin de los patrones que vayan a utilizarse en las mismas
condiciones cromatogrficas.
Preparar una disolucin de la mezcla problema junto con los patrones de referencia.
Realizar la cromatografa de dicha disolucin en las condiciones previamente optimizadas.
Un aumento en el rea relativa de uno de los picos permite la identificacin de uno de los
componentes de la mezcla con el patrn correspondiente a dicho tiempo de retencin,
mientras que la aparicin de un nuevo pico ser seal de que la mezcla original no contiene
dicho patrn.
PARTE EXPERIMENTAL
Muestra a sembrar: Fracciones F3, F0 en ese orden. Obtenidas de la cromatografa de
intercambio inico.
Volumen a sembrar: 50 l
Columna: C18
Fase mvil: Solvente A: TFA 0,1%
Solvente B: TFA 0,08% y Acetonitrilo 80%
Detector: medicin de absorbancia a 254 nm y a 280 nm.
Observar y sealar en el cromatograma el tiempo de elucin y la absorbancia a 254 nm.

17

TRABAJO PRACTICO 5
INDUCCION ENZIMATICA
OBJETIVO
Comprender el mecanismo de induccin enzimtica y su inhibicin.
INTRODUCCIN
Las bacterias son organismos verstiles y de respuesta rpida. Perciben los niveles de muchos
metabolitos y utilizan una amplia variedad de mecanismos de regulacin de sus patrones
metablicos.
La actividad de muchas enzimas puede estar regulada, por control alostrico, modificaciones
covalentes y por el control de la expresin gnica, de tal manera que una Escherichia Coli puede
contener 10 copias de una protena y 100.000 copias de otra, variando incluso la velocidad de
sntesis en respuesta a estmulos externos (nutrientes, condiciones ambientales).
Algunas enzimas se encuentran en cantidades constantes, independientemente del medio y del
estado metablico de la clula, son las enzimas constitutivas, otras se sintetizan rpidamente y en
mayor cantidad como respuesta a la presencia de un sustrato, son las enzimas inducibles.
En el genoma encontramos los genes para sintetizar todas las enzimas, pero la sntesis de stas esta
regulada, lo que est de acuerdo con el principio de economa celular.
Jacob y Monod estudiaron el mecanismo de regulacin en Escherichia Coli, y propusieron un
mecanismo de regulacin para explicar la induccin de enzimas que incluye control a nivel gentico,
proponiendo la existencia de un operon para la regulacin de la -galactosidasa por la Lactosa. Si
Escherichia Coli utiliza glucosa como fuente de carbono, no poseer ms de 10 copias de galactosidasa, mientras que en presencia de lactosa, se induce la expresin de esta enzima hasta
obtener varios miles de copias, transformando la lactosa en galactosa y glucosa que pueden entrar
por ejemplo al ciclo de Krebs.

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Jacob y Monod postularon:

- la existencia de un represor especfico que se une al DNA, cerca del comienzo del gen de la galactosidasa, que impide la accin de la RNA polimerasa que sintetiza el RNA mensajero.

la lactosa es un inductor, que al unirse al represor no permite su unin al DNA, de esta forma

la RNA polimerasa puede sintetizar el RNA mensajero de la -galactosidasa.

En el laboratorio se estudiara el fenmeno de induccin enzimtica en Escherichia Coli utilizando

como indicador de la presencia de la enzima el o-nitrofenilgalactsido (ONPG).
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ONPG (orto-nitrofenil--D-galactopiransido): es un sustrato de la -galactosidasa que, al

ser hidrolizado, produce un compuesto (ortonitrofenol) que presenta un intenso
color amarillo. El ONPG es muy utilizado en los ensayos in vitro de -galactosidasa,
en los que se puede obtener la concentracin de -galactosidasa en funcin de la
intensidad del color amarillo, medida por absorbancia a una longitud de onda de 420 nm.

Tambin se utilizara el cloranfenicol que inhibe la biosntesis de protena.

Materiales y reactivos:
Preparar Caldo LB y autoclavar. (triptona 2,5 g, extracto de levadura 1,25 g, NaCl 3,75 g, agua csp
250 ml).Distribuir una placa de medio EMB.
Sembrar la placa de EMB con E. Coli, dejar 24 h a 37 . Sembrar una colonia en el caldo nutritivo
LB. Dejar 24 h en estufa a 37.
Cloranfenicol: 60 g/ml.
Glucosa 200 mM.

PM 180

Pesar 0,36 g Volumen: 10 ml

Lactosa 200 mM.

PM 360

Pesar 0,72 g Volumen: 10 ml

Buffer fosfato 20 mM, NaCl 0,9 %, pH 7,5. Pesar 0,276 g de fosfato dicido de potasio, llevar a pH
7,5 y con agua a 100 ml. Agregar 0,9 g de NaCl.
Tolueno o xileno.
Discos de ONPG.

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Parte experimental:

Analizar los resultados.

En resumen:

En ausencia de lactosa, no hay produccin de enzima Lac (LacI est unido al operador).

Cuando hay lactosa presente, pero tambin hay una fuente de carbono preferida en el medio (como
la gluocsa), entonces slo una pequea cantidad de enzima se produce (LacI no est unido al
operador).

Cuando la lactosa es la fuente preferida de carbono (por ejemplo, en ausencia de glucosa) AMPcCAP se unen al promotor y la produccin de la enzima Lac se maximiza.

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TRABAJO PRACTICO 6
CUANTIFICACION DE GLUCOGENO EN TEJIDOS
Objetivos:
Adoptar conocimientos experimentales en la cuantificacin de polisacridos (glucgeno).
Introduccin:
El glucgeno es un polmero de glucosa, ramificado, distribuido fundamentalmente en hgado y
msculo, cuya funcin es la de ser una forma de almacenamiento de glucosa fcilmente movilizable.
El glucgeno acta como regulador de la glucosa sangunea, almacenndola como glucgeno durante
una buena alimentacin (glucogenognesis) y liberndola por fosforolisis (glucogenolisis) durante el
ayuno, ya que en esta situacin no hay absorcin intestinal. La duracin del glucgeno heptico en
ayunas es de aproximadamente 24 h. A partir de este momento, la concentracin en sangre se mantiene
por sntesis de glucosa a partir de sustancias distintas a los carbohidratos (gluconeognesis). El mtodo

de extraccin del glucgeno de los tejidos (msculo esqueltico, corazn e hgado) se realiza previa
homogeneizacin de los mismos en un potter, mediante calentamiento con un lcali fuerte y
posterior precipitacin con etanol. (Realizado en Quimica Biologica I)
La hidrlisis es cida en caliente, y luego de una posterior neutralizacin se cuantifica.
En este paso la muestra puede guardarse a -20C, para determinarse la concentracin en una prxima
clase de laboratorio.
Se calcular el porcentaje de glucgeno en los tejidos, no olvidar que la glucosa en el glucgeno
tiene una masa molecular de 162 y no de 180. El procedimiento permite extraer el 70% del
glucgeno.
Determinacin de azcares reductores: Mtodo de Somogyi - Nelson
Reactivo de Somogyi
Na2HPO4 .7H20 (76) 5,3 g
Tartrato de Na y K (161)

4g

NaOH (197) 1N

10 ml

CuSO4 (157)

0,8 g

Na2SO4

18 g

0,4 g y llevo a 10 ml.

Llevar a 100 ml con AD.

Reposar 5 das, filtrar y conservar en frasco oscuro a T ambiente.
Reactivo de Nelson
Molibdato de amonio

5g
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Sulfrico 96%

4,2 ml

Arseniato de sodio.7H20 0,6 g

Llevar a volumen 100 ml con AD. Conservar en frasco oscuro a T ambiente.
Testigo de glucosa
Pesar 9 mg y llevar a 50 ml con AD. Concentracin final de glucosa: 1 mM
Parte Experimental:
Los azcares reductores, en este caso la glucosa proveniente de la hidrlisis del glucgeno, se trata
con el reactivo de Somogyi (cobre en medio alcalino) en caliente. El grupo aldehdo del azcar
reductor reduce el ion cprico a cuproso y este xido cuproso resultante es reoxidado por el reactivo
arsenofosfomolbdico de Nelson a xido de molibdeno, de color azul. El color es proporcional a la
cantidad de glcido presente en la muestra y se compara con un testigo de concentracin conocida,
midiendo la absorbancia a 540 nm. La sensibilidad del mtodo es de 0,06 a 0,5 moles.
Reaccin principal
Glucosa + Cu++ ------------- Ac glucurnico + Cu+
Cu+ + arsenofosfomolibdato ---------- Cu++ + oxido de molibdeno (color azul)
Se trabaja con solucin testigo de glucosa 1 mM de tal manera que 1 ml contenga 1 umoles.

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Medir los tubos a 530 nm, llevando a 0 con el blanco. Graficar en papel milimetrado los resultados
de la curva de calibracin. Representar absorbancia en funcin de los moles de glucosa agregados.
Determinar la concentracin de azcares reductores antes y despus de la hidrlisis cida.

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TRABAJO PRACTICO 7
PRODUCCION DE PIRUVATO Y ACETALDEHIDO DURANTE LA FERMENTACION DE
GLUCOSA POR LEVADURA
INTRODUCCIN
Fermentacin: La primera etapa del catabolismo de glucosa es la produccin de piruvato. Este
proceso, que se efecta mediante una serie de reacciones que involucran un nmero considerable de
intermediarios, se conoce como gluclisis. La reaccin total de una molcula de glucosa produce dos
molculas de piruvato, dos molculas de ATP y dos molculas de NADH. Este cofactor se encuentra
en cantidades catalticas (es necesario reoxidarlo para que el proceso no se suspenda), y es utilizado
por la cadena respiratoria para obtener ATP dando as NAD +. Esto no es posible en condiciones
anaerbicas y en este caso la reoxidacin se efecta cuando el piruvato se convierte en acetaldehdo,
y luego en alcohol.
Intermediarios metablicos: Los metabolitos piruvato y acetaldehdo se encuentran presentes
normalmente en muy baja concentracin, por lo tanto, para demostrar su existencia como
intermediarios en el camino metablico, es necesario impedir que sean transformados en otros
compuestos. Este procedimiento se usa mucho para estudiar caminos metablicos y se puede
realizar:
- Bloqueando la enzima que cataliza la conversin del compuesto que se esta investigando mediante
inhibidores.
- Cambiando las condiciones fisiolgicas para que la enzima funcione a una velocidad muy por
debajo de su actividad mxima.
Usando un agente que atrape el intermediario y que forme un compuesto que no pueda
metabolisarse.
La piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el
piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la reaccin con nitroprusiato de sodio o
2,4 dinitrofenilhidrazina.
OBJETIVO
Experimentar en el metabolismo anaerbico, especialmente en la produccin de piruvato a partir de
la utilizacin de glucosa como fuente de hidrato de carbono.

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Materiales y reactivos:
- Levadura (1 g en 30 ml de Na2HPO4 700 mM).
- Bao termostatizado.
- Centrifuga.
- Glucosa 500 mM Pesar 4,5 g para 50 ml.
- Acido tricloroactico (100 g/l) Pesar 5 g para 50 ml.
- 2,4 dinitroafenilhidrazina (solucin saturada).
- NaOH 2,5 M.
- Nitroprusiato de sodio. Pesar 0,5 g para 10 ml.
- Amonaco y sulfato de amonio.
Parte experimental:
Formacin de piruvato a partir de glucosa:
Glucosa
Levadura

A
5 ml
5 ml

B
5 ml
---

Incubar a 37 C durante 1 hora.

Aadir a cada tubo 2ml de la solucin de cido tricloroactico, mezcle vigorosamente y centrifugue
a 2500 g durante 10 min.
Separar el sobrenadante para la determinacin de piruvato.
Determinacin de piruvato mediante 2,4 dinitrofenilhidrazina
Agregar 1 ml de solucin saturada de 2,4 dinitrofenilhidrazina a 2 ml de sobrenadante, mezclar
vigorosamente. Dejar 10 minutos a 37 . Colocar 2 o 3 gotas de la mezcla en un tubo de ensayo.
Agregar 1 ml de la solucin de hidrxido de sodio, agitar y agregar 4 ml de agua.
La formacin de un color rojo indica la presencia de piruvato.
Realizar en cada caso un control negativo, con agua.

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Qumica Biolgica II

2010

TRABAJO PRACTICO 8
PIGMENTOS FOTOSINTETICOS
Introduccin:
Entre todos los caracteres ms externos de los vegetales, el ms notable y caracterstico es
probablemente el color. El color no es nicamente un carcter llamativo de la vegetacin, sino que,
adems, algunos de los pigmentos que lo condicionan estn estrechamente ligados a las actividades
fisiolgicas del propio vegetal. Por consiguiente, el estudio de cmo las plantas viven

y se

desarrollan requiere el previo conocimiento de los pigmentos vegetales.

Si es posible encontrar en el reino vegetal todos los matices y combinaciones de colores del
espectro, existe un predominio general de los colores primarios: verde, amarillo, rojo, azul. Estos
colores son conferidos a los vegetales por determinados compuestos qumicos definidos, llamados
pigmentos. El color particular que presenta un determinado rgano vegetal depende generalmente
del predominio de uno u otro o la combinacin de ellos. Se debe tener claro que cuando un vegetal
presenta un color blanco, es debido a la falta de tales pigmentos. La luz solar que incide sobre ellas
no es absorbida selectivamente como ocurre en las partes coloreadas, sino que es transmitida o
reflejada prcticamente sin sufrir modificacin.
El color verde tan uniformemente presente en los vegetales es debido a la presencia de dos
pigmentos estrechamente emparentados llamados clorofila a y clorofila b. Se encuentran
prcticamente en todas las plantas con semilla, helechos, musgos y algas. Pueden formarse en las
races, tallos, hojas y frutos a condicin de que estos rganos estn situados por encima del suelo y
queden expuestos a la luz. Tambin aunque aparentemente falten en algunas hojas de color rojo o
amarillo, cuando se extraen las otras sustancias colorantes de estas, puede comprobarse incluso all
la presencia de las clorofilas, que estaban enmascaradas por los dems pigmentos.
Estos pigmentos se encuentran en el interior de la clulas vegetales especficamente en el
cloroplasto. Los compuestos cloroflicos estn ligados qumicamente con las estructuras internas
del cloroplasto (membrana tilacoide) y se hallan retenidos en estado coloidal. Asociados con las
clorofilas, existen tambin en los cloroplastos dos clases de pigmentos amarillos y amarilloanaranjados : xantofilas y carotenoides.
Los pigmentos cloroflicos son insolubles en el solvente universal agua, pero s son solubles en
solventes orgnicos como por ejemplo alcohol etlico y acetona. A los solventes que extraen
simultneamente todos los pigmentos de la hoja se los suele llamar extractantes. Existen otros
solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se los llama separadores, como por
ejemplo el tetracloruro de carbono y el ter de petrleo.

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Qumica Biolgica II

2010

En el mtodo de extraccin simple se utilizar como extractante el alcohol etlico y como separador
el tetracloruro de carbono. Estos dos solventes orgnicos responden en forma diferente a los
pigmentos cloroflicos, como as tambin a sus diferencias fsicas que hacen que sean dos lquidos
no misibles y con diferente peso especfico.
En el segundo mtodo por cromatografa se utilizar como extractante la acetona y como separador
el ter de petrleo. Este mtodo se trata de una separacin ms fina de los pigmentos, y se basa en
la absorcin y solubilidad diferenciales de varias sustancias entre las que se incluyen los pigmentos.
Un soporte inerte como papel de filtro para la corrida y unos granos de carbonato de calcio para
deshidratar la muestra, son los componentes necesarios para desarrollar la tcnica.
Mtodos de separacin de pigmentos:
Separacin de pigmentos vegetales por separacin simple.
Objetivo:
Extraer los pigmentos fotosintticos y separarlos mediante una tcnica sencilla de fases.
Materiales:
Mortero - Embudo cribado -Kitasato - Papel de filtro - Tubos de ensayo - Alcohol - Tetracloruro de
carbono - Hojas de espinaca o Acelga - Bomba de vaco.
Tcnica:
Lavar las hojas de espinaca o acelga, retirar los nervios y ponerlas en un mortero, junto con el
solvente extractante (alcohol).
Triturar la mezcla hasta que las hojas se decoloren y el disolvente adquiera un color verde intenso.
Filtrar con un embudo, papel de filtro y bomba de vaco. Pasar el filtrado a un tubo de ensayo.
Agregar tetracloruro de carbono y luego se lo agitar por unos segundos. Se lo dejar reposar en
una gradilla por 10 minutos. Los pigmentos se irn separando segn su adsorcin o afinidad con los
solventes. Veremos dos zonas que corresponden a los distintos pigmentos fotosintticos presentes
en las hojas de espinaca. Segn su grado de solubilidad con el alcohol y el tetracloruro de carbono
se reconocen estas zonas heterogneas y no miscibles en este orden:

Separacin de pigmentos vegetales por cromatografa sobre papel.

Objetivo:
Extraer los pigmentos fotosintticos y separarlos mediante una tcnica compleja de cromatografa
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Qumica Biolgica II

2010

en papel.
Materiales:
Mortero- Embudo cribado -Kitasato - Papel de filtro - Tubos de ensayo - Acetona - ter de Petrleo
- Hojas de espinaca o Acelga - Cloruro de Calcio- Bomba de vaco - Capilar o Pipeta Pasteur - Vaso
de precipitado.
Tcnica:
Lavar las hojas de espinaca o acelga, retirar los nervios y ponerlas en un mortero, junto con 4 ml del
solvente extractante acetona. Triturar la mezcla hasta que las hojas se decoloren y el disolvente
adquiera un color verde intenso. Filtrar con un embudo, papel de filtro y bomba de vaco. Pasar el
filtrado en un tubo de ensayo, agregar 3 ml de agua y 3 ml de eter de petrleo. Dejar reposar de 5
min. Se observarn 2 fases. Tomar con un capilar la fase superior etrea y sembrar una placa de
TLC, previamente activada, en banda para una cromatografa preparativa. Colocar en una cuba
utilizando como fase mvil acetona: ter de petrleo (25:75).Los pigmentos se irn separando segn
su adsorcin o afinidad con el solvente.
Observar el desarrollo del cromatograma al UV.

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