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Mtodos para el estudio de la mdula sea


J.L. Aguilar i Bascompte y M. Daz-Ricart

CARACTERSTICAS GENERALES DE LA MDULA SEA


La mdula sea es el tejido donde se originan los elementos formes de la sangre. En el nio,
ocupa la cavidad esponjosa de prcticamente todos sus huesos, pero con el desarrollo,
parte de ella es reemplazada por tejido graso, por lo que finalmente queda reducida a unas
zonas concretas tales como el crneo, el esqueleto axial (columna vertebral) y la epfisis de
los huesos largos (v. fig.2-2). Histolgicamente, la mdula sea presenta una arquitectura
constituida por cordones de clulas que irradian hacia el interior a partir del endostio. Una
fina estructura reticular sirve de soporte a los cordones celulares y a los capilares sinusoides
(fig.8-1). Las caractersticas especiales de las paredes de estos capilares sinusoides permiten
el intercambio de sustancias nutritivas y de desecho entre el plasma y las clulas, pero
impiden la salida de estas hacia la circulacin, hasta que sus caractersticas fsicas (dadas
principalmente por la madurez celular) lo permiten. El medio intercelular (microambiente
medular), que est principalmente condicionado por el estroma, constituido a su vez por el
soporte reticular y el sistema vascular, es esencial para la duplicacin de los progenitores y su
maduracin a elementos ms diferenciados y finalmente a clulas sanguneas. Una alteracin
del estroma (p.ej., fibrosis medular) imposibilita el desarrollo del tejido hematopoytico, el
cual se desarrolla en otros tejidos diferentes a la mdula sea (hgado y bazo, principalmente),
dando origen a la llamada metaplasia mieloide. Las clulas que normalmente se hallan en la
mdula sea son de varios tipos (cuadro8-1), pero todas ellas derivan de una nica clula
madre, cuyo nmero permanece siempre constante por el mecanismo de autoduplicacin
(compartimento funcional de clulas madre). Un primer grado de diferenciacin da lugar
a los llamados progenitores comprometidos para una determinada lnea celular, cuya estirpe no es an reconocible morfolgicamente por lo que deben ser explorados mediante
mtodos indirectos, como por ejemplo, los cultivos in vitro de mdula sea.
El estudio de la mdula sea puede realizarse a nivel morfolgico y funcional: el nivel
morfolgico consiste en el examen microscpico de los precursores hematopoyticos
(mielograma) o citolgico de sus cromosomas (citogentica), el nivel funcional, en el
estudio de los progenitores mediante cultivos in vitro de mdula sea.

EXAMEN MORFOLGICO DE LA MDULA SEA


La exploracin de la mdula sea es obligada ante cualquier trastorno de origen desconocido que altere el nmero y/o la proporcin normal de las clulas sanguneas.
Asimismo, debe realizarse siempre que se observen clulas o precursores inmaduros
(blastos) en sangre perifrica.
Existen dos procedimientos para explorar la mdula sea:
1. Puncin aspirativa.
2. Biopsia sea.

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FIGURA 8-1. Esquema de la estructura general de la mdula sea.

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CUADRO 8-1. Tipos de clulas presentes en la mdula sea






Clulas de tejido seo (osteoblastos y osteoclastos)


Clulas de los endotelios vasculares
Clulas soporte o estroma (fibrocitos y fibroblastos)
Clulas grasas
Clulas hematopoyticas:
Clulas de la lnea madurativa eritropoytica (eritroblastos)
Clulas de la lnea madurativa granulopoytica (promielocitos, mielocitos
y metamielocitos)
Clulas del sistema mononuclear fagoctico
Monocitos
Histiocitos
Megacarioblastos y megacariocitos
Linfocitos

Puncin aspirativa de mdula sea (aspirado medular)


Principio
La puncin sea tiene como finalidad primordial realizar un examen morfolgico de
los elementos celulares presentes en la mdula sea. Este se realiza normalmente a partir
de una extensin del material medular obtenida por aspiracin despus de que se haya
practicado una puncin en el hueso. La puncin sea suele realizarse casi siempre a la
altura del esternn (puncin esternal), aunque en algunos casos es preferible realizarla
en la tuberosidad posterior de la cresta ilaca (fig.8-2).
Mtodo
1. Se anestesia la piel, el tejido celular subcutneo y el periostio.
2. Se realiza una puncin del hueso con aguja no muy gruesa, seguida de una aspiracin de material medular (0,1-0,3ml), que se depositar sobre un portaobjetos
bien limpio.
3. Se examinan las caractersticas morfolgicas del grumo y su cantidad. De acuerdo
con ello, el grumo puede caracterizarse por:
(a) Ser muy escaso o incluso inexistente (puncin blanca).
(b) Estar constituido casi exclusivamente por grasa o material necrtico.
(c) Ser abundante o incluso muy abundante.
(d) Ser de tamao grande, mediano o pequeo.
4. Se extiende el grumo sobre un portaobjetos, ayudndose de otro portaobjetos y
se procura aplastarlo suavemente al realizar la extensin (fig.8-3).
5. Se tie la extensin por el mtodo habitual (May-Grnwald/Giemsa o Wright).
6. Se examina la extensin as teida de acuerdo con la siguiente sistemtica:
(a) Cuando la puncin de la mdula sea no da salida a material alguno
(ni grumo ni sangre medular) se habla de puncin blanca o seca (dry-tap).
En una primera etapa, la extensin del aspirado medular debe examinarse mediante
un objetivo de poco aumento (10 A). Ello permite apreciar la celularidad global y la
presencia, la ausencia o el aumento del nmero de clulas grasas y/o de megacariocitos.
Los megacariocitos se encuentran en una proporcin aproximada de 1:2 por campo,
aunque este nmero vara de manera importante con la tcnica empleada para realizar
la extensin. La celularidad hematopoytica puede ser de tres tipos: normal, aumentada

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FIGURA 8-2. Zonas de eleccin para realizar el aspirado medular.

(hipercelularidad) o disminuida (hipocelularidad). La celularidad se valora de manera


precisa en el grumo aplastado. Debe sealarse, no obstante, que la apreciacin de la
celularidad mediante el aspirado medular, aunque es muy til, tiene a veces un valor
limitado, ya que existen situaciones patolgicas en las que aquella no se corresponde
con la que existe realmente. As, por ejemplo, en ciertas aplasias medulares en las que la
biopsia sea demuestra una mdula vaca, el aspirado puede presentar una celularidad
normal o incluso abundante. Lo contrario sucede en ciertas leucemias agudas con mdula
empaquetada o en la mielofibrosis primaria con mdula ahogada por la proliferacin de
fibras de reticulina y/o colgeno, donde no es infrecuente obtener una puncin blanca
a pesar de la existencia de una marcada proliferacin celular. En todos estos casos,
la celularidad real de la mdula sea solo puede apreciarse con seguridad mediante la
prctica de una biopsia sea.
En una segunda etapa, se debe proceder al examen a gran aumento (objetivo 100 A),
lo que permitir observar las caractersticas morfolgicas de las diferentes clulas y rea
lizar un recuento diferencial de las mismas (mielograma). El recuento diferencial de cada
tipo celular se efecta de forma similar al de la sangre perifrica, aunque en la prctica
suele suministrarse un recuento global correspondiente a la proporcin existente de las
ocho categoras principales de clulas presentes en la mdula sea (v. cuadro8-1). En la
figura8-4 se muestra un ejemplo de informe de examen de mdula sea o mielograma.

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FIGURA 8-3. Extensin de aspirado medular.

Al iniciar el examen morfolgico de la mdula sea destaca, en primer lugar, el predominio de los precursores granulopoyticos sobre los eritroblsticos. As, las clulas que
se ven con mayor frecuencia son mielocitos y metamielocitos neutrfilos, eritroblastos y
algn promielocito (fig.8-5). La eosinofilia medular es, en general, algo superior a la que
existe normalmente en sangre perifrica y se caracteriza por la presencia de un nmero
variable de mielocitos eosinfilos. Los elementos de la serie eritropoytica pertenecen en
su mayora a eritroblastos policromticos y ortocromticos; son menos abundantes los
eritroblastos basfilos y los proeritroblastos, caracterizados por su tamao y la inmadurez
nuclear as como por su elevada basofilia citoplasmtica (fig.8-6).
Al observar estas clulas, se debe consignar no solo su nmero, sino tambin la existencia de posibles alteraciones morfolgicas. As, al analizar los elementos de la serie
eritropoytica, es importante considerar las posibles alteraciones de la maduracin
(megaloblastosis) o la existencia de signos de diseritropoyesis (binuclearidad, puentes
internucleares o alteraciones de la cromatina) y/o un aumento del nmero de mitosis.
En la serie granulopoytica debe considerarse la posible existencia de clulas inmaduras (mieloblastos) y/o alteraciones de la granulacin (desgranulacin o hipergranulacin)
o de la segmentacin del ncleo (hipo- o hipersegmentacin).
Al analizar las restantes clulas, importa considerar la presencia de elementos atpicos
(generalmente blastos), clulas no hematolgicas (metstasis carcinomatosa), eosinofilia,
basofilia y el aumento de clulas cebadas (mastocitos) o de macrfagos y del nmero de
linfocitos o de clulas plasmticas.
Los megacariocitos normales son clulas poliploides que se caracterizan por su
gran tamao y la segmentacin nuclear (fig.8-7). Al realizar el examen morfolgico
de la mdula sea, debe observarse detenidamente el aspecto morfolgico de los

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FIGURA 8-4. Hoja-dictamen de un examen citolgico de mdula sea realizado a partir de un aspirado
medular.

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FIGURA 8-5. Imagen de una


mdula sea normal. Eritroblastos,
mielocitos y metamielocitos.
Neutrfilos (MGG, 1.000).

FIGURA 8-6. Imagen de un


proeritroblasto (MGG, 1.000).

FIGURA 8-7. Imagen de un


megacariocito (MGG, 1.000).

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Captulo 8 Mtodos para el estudio de la mdula sea

megacariocitos al objeto de poder hallar alteraciones tales como hipo- o hipersegmentacin nuclear, alteraciones de la madurez citoplasmtica o la presencia
de megacariocitos de tamao muy pequeo y escasa o nula segmentacin nuclear
(megacariocitos de aspecto hipoploide).
El recuento diferencial de los elementos celulares presentes en la mdula sea est
tambin indicado en el anlisis de la respuesta medular a citostticos, durante la fase
de recuperacin de una agranulocitosis o en ciertas formas de dishematopoyesis de
mecanismo oscuro.

Interpretacin del examen morfolgico del aspirado de mdula sea


El mielograma normal viene detallado en la tabla8-1, y entre sus principales alteraciones
patolgicas destacan:
Aumento de la celularidad a expensas de la serie eritropoytica. Constituye
lo que se llama hiperplasia eritroblstica, y se suele observar en casos de hiperregeneracin medular como respuesta a la prdida perifrica de eritrocitos
por hemorragia o hemlisis (anemia regenerativa) o cuando existe una incapacidad de los eritroblastos para madurar a eritrocitos (anemias megaloblsticas y diseritropoyticas). Estas ltimas tienen carcter arregenerativo. En la
anemia regenerativa por hemlisis o hemorragia, el aumento del nmero de
eritroblastos se realiza a expensas de los ms maduros (eritroblastos ortocromticos) y no se observan alteraciones de la maduracin celular. Por el contrario,
en la anemia megaloblstica desaparecen los eritroblastos ortocromticos y disminuyen los policromatfilos, por lo que se observa un predominio de eritroblastos de gran tamao con intensa disociacin madurativa ncleo-citoplasma
TABLA 8-1. Mielograma segn Wintrobe
Lmites de referencia (%)
Serie neutroflica total
Mieloblastos
Promielocitos
Mielocitos
Metamielocitos
Bandas
Segmentados
Serie eosinoflica total
Mielocitos
Metamielocitos
Bandas
Segmentados
Basfilos y mastocitos
Serie eritroblstica total
Proeritroblastos
Eritroblastos basfilos
Eritroblastos policromatfilos
Eritroblastos ortocromticos
Linfocitos
Clulas plasmticas
Monocitos
Megacariocitos
Histiocitos y clulas reticulares

49,2-65
0,2-1,5
2,1-4,1
8,2-15,7
9,6-24,6
9,5-15,3
6-12
1,2-5,3
0,2-1,3
0,4-2,2
0,2-2,4
0-1,3
0-0,2
18,4-33,8
0,2-1,3
0,2-1,3
17,9-29,9
0,4-4,6
11,1-23,1
0,4-3,9
0-0,8
0-0,4
0-0,9

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(ncleo inmaduro y citoplasma relativamente bien hemoglobinizado) que se


denominan megaloblastos (v. captulo17). Existen ciertas formas de anemia
arregenerativa, tales como las diseritropoyesis congnitas o adquiridas, en las
que se observan alteraciones cualitativas de los eritroblastos que afectan tanto
el ncleo (binuclearidad, alteraciones de la cromatina, puentes internucleares) como el
citoplasma (aumento de tamao, hemoglobinizacin irregular, presencia de material
cromatnico o depsitos abundantes de ferritina). Aunque en estas formas de anemia
puedan observarse rasgos megaloblsticos, no deben confundirse con la anemia megaloblstica genuina, por cuanto esta responde inmediatamente al tratamiento con
factores vitamnicos: cido flico o vitamina B12 (v. captulo17). Aunque el nombre de
diseritropoyesis se aplica de forma ms especfica a las formas congnitas, la presencia
de un mayor o menor grado de diseritropoyesis adquirida puede observarse en el
curso de diversas hemopatas, tales como los llamados sndromes mielodisplsicos
(anemia refractaria o displasia multilineal) y ciertas leucemias agudas y crnicas.
Finalmente, existe una forma de leucemia aguda llamada eritroleucemia (forma
M6 de la clasificacin FAB), en la que es muy caracterstica la hiperplasia de serie
roja y su marcada diseritropoyesis.
Aumento de la celularidad a expensas de la serie granulopoytica. Puede observarse
como fenmeno acompaante en el curso de procesos infecciosos (septicemia), inflamatorios, hepatopata crnica o metstasis carcinomatosa. De forma caracterstica se
observa un gran aumento de la proliferacin granulopoytica en la leucemia mieloide
crnica (LMC), en la cual las clulas se hallan presentes en todos sus estadios madurativos
normales. Un aspecto celular parecido puede observarse tambin en el curso evolutivo
de otros sndromes mieloproliferativos crnicos afines a la LMC, tales como la fase
hipercelular de la mielofibrosis idioptica, la policitemia vera y la trombocitemia esencial.
Aumento del nmero de linfocitos. La linfocitosis medular debe valorarse siempre
en relacin con la clnica general y la celularidad global, ya que puede observarse en
dos situaciones completamente diferentes:
Si se trata de una mdula hipocelular, el diagnstico ms probable es el de aplasia
medular y su confirmacin precisa una biopsia sea.
Si se trata de una mdula hipercelular, el diagnstico puede ser una reaccin de
la mdula a estmulo externo, pero si se aprecia infiltracin, lo ms probable es
que se trate de una leucemia linftica crnica. Ocasionalmente, puede tratarse
tambin de una infiltracin linfoide de la mdula sea en el curso de un linfoma.
El diagnstico diferencial exige no solo una adecuada valoracin clnica, sino la
prctica de una biopsia sea.
Aumento del nmero de clulas plasmticas. Puede aparecer como fenmeno secundario en el curso de procesos diversos, principalmente infecciones vricas, trastornos
inmunes, neoplsicos o de una hepatopata crnica (plasmocitosis reactiva) o constituir
el signo morfolgico de un plasmocitoma, enfermedad caracterizada por la proliferacin
clonal de clulas plasmticas que infiltran en mayor o menor grado la mdula sea.
Las clulas plasmticas del plasmocitoma suelen presentar un tamao superior al
delasclulas plasmticas normales, y a veces rasgos de inmadurez (plasmoblastos).
Presencia de macrfagos abundantes o con aspecto morfolgico peculiar.
La observacin del nmero y del aspecto morfolgico de los macrfagos que se
hallan en la mdula sea puede ser de gran inters diagnstico. As, la cifra de macrfagos suele hallarse aumentada en diversas situaciones patolgicas (sndromes
inflamatorios, anemia hemoltica autoinmune, hemopatas malignas y metstasis
neoplsicas), lo que se traduce en una respuesta medular a la agresin. En otros

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Captulo 8 Mtodos para el estudio de la mdula sea

FIGURA 8-8. Clulas de Gaucher en


la mdula sea (MGG, 1.000).

casos, los macrfagos, adems de hallarse aumentados, pueden contener parsitos


(leishmania) en su interior, que es un hallazgo fundamental para el diagnstico
del kala-azar (leishmaniosis visceral). Finalmente, en ciertas enfermedades con
afectacin especfica del sistema mononuclear fagoctico, los macrfagos pueden
adquirir un aspecto peculiar que permite su diagnstico. Tal sucede en las histiocitosis malignas y benignas o en las enfermedades acumulativas o tesaurismosis,
en las que los macrfagos se hallan repletos de material lipdico sin metabolizar
(enfermedad de Gaucher, enfermedad de Niemann-Pick y sndrome del histiocito
azul marino) (fig.8-8).
Infiltracin medular por blastos leucmicos. Es caracterstica de la leucemia aguda,
en la que dicha infiltracin suele ser homognea y monomorfa con desaparicin
completa de la celularidad normal y de los estadios madurativos de todas las series
celulares hematopoyticas (hiato leucmico). Cuando las caractersticas morfolgicas
de los blastos no permiten realizar una catalogacin citolgica, se hace necesaria la
prctica de tinciones citoqumicas o el anlisis de marcadores inmunolgicos tipo
CD mediante citometra de flujo (tabla 8-2) a partir del material medular obtenido
en la puncin (v. captulos12 y13).
Presencia de metstasis. Una metstasis de clulas carcinomatosas en la mdula sea
suele caracterizarse por la aparicin de uno o varios cmulos de dichas clulas en
diferentes puntos de la extensin (fig.8-9). La imagen caracterstica que suministran
estos agregados celulares es suficiente para establecer el diagnstico, y ante su sospecha
nunca est de ms observar cuidadosamente varias de las extensiones practicadas al
enfermo, cuando su hallazgo no ha sido posible al analizar la primera de ellas. En otras
ocasiones, no obstante, la metstasis medular puede invadir totalmente la mdula sea,
sustituyendo incluso la celularidad hematopoytica normal. En tales casos, resulta a
veces difcil diferenciar la metstasis de una leucemia, por cuanto las caractersticas
morfolgicas de las clulas carcinomatosas pueden ser muy similares a las de ciertos
blastos leucmicos, en especial los de estirpe monoctica o indiferenciada (es el caso
del carcinoma anaplsico de pulmn). La prctica de estudios citoqumicos o de
marcadores celulares vuelve aqu a hacerse imprescindible para establecer el diagnstico diferencial.
Signos de afectacin en pacientes HIV+. En individuos con el sndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es frecuente la alteracin de la hematopoyesis, que

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Manual de tcnicas de laboratorio en hematologa

TABLA 8-2. Marcadores que pueden ser utilizados en la biopsia medular con la tcnica
de inclusin en parafina
Marcador

Dilucin

Reactividad

CD3
CD4

(1:30)
(1:5)

CD5
CD8
CD10 (CALLA)

(1:25)
(1:10)
(1:25)

CD15
CD20
CD21
CD23
CD30
CD34
CD56
CD68
CD79a
CD117 (C-kitt)
CD138
Bcl-2
Bcl-6
Cadena ligera k
Cadena ligera l
Cam 5.2
Ciclina O1

(1:25)
(1:100)
(1:100)
(1:10)
(1:10)
(1:20)
(1:5)
(1:6.000)
(1:20)
(1:100)
(1:5)
(1:50)
(1:1)
(1:64.000)
(1:64.000)
(1:100)
(1:10)

Ema
Factor VIII
Glucoforina C
Granzima B
LMP-1
Lisozima
Mieloperoxidasa
PGM1
TdT
TIA-1

(1:100)
(1:400)
(1:200)
(1:50)
(1:100)
(1:4.000)
(1:4.000)
(1:1.000)
(1:2/1:4)
(1:100)

LEX

(1:250)

Linfocitos T
Subpoblacin de linfocitos T (colaboradores)
Monocitos/histiocitos
Linfocitos T y subpoblaciones de linfocitos B
Subpoblacin de linfocitos T (supresores)
Linfocitos B y T inmaduros, linfocitos B del centro
germinal y neutrfilos
Neutrfilos, clulas de Reed-Sternberg
Linfocitos B
Clula dendrtica
Clula dendrtica y linfocito B activado
Clulas linfoides activadas y clulas de Reed-Sternberg
Clula progenitora linfoide mieloide
Clula natural killer (NK) y clula plasmtica maligna
Serie monoctica
Linfocitos B
Serie mieloide inmadura y mastocitos
Clula plasmtica normal y mielomatosa
Sobreexpresa en linfoma reticular
Linfocitos B del centro germinal
Linfocitos B
Linfocitos B
Metstasis epitelial
Linfoma de clulas del manto y algunos mielomas
Tricoleucemia
Clula epitelial y clula plasmtica
Megacariocito
Serie eritroide inmadura
Grnulos citotxicos (indica fenotipo activado)
Virus Epstein-Barr
Lnea monoctica
Lnea mieloide
Lnea monoctica
Linfocito inmaduro
Grnulos citotxicos (linfocito T citotxico; linfocito
NK y neutrfilos)
Serie eritroide inmadura y megacariocito

en sangre perifrica se caracteriza por una leucopenia con linfopenia y disminucin


significativa de los linfocitos T CD4+ (T colaboradores o inductores). Resulta bastante frecuente tambin la plaquetopenia de origen probablemente perifrico. En la
mdula sea aunque no puede hablarse de alteraciones especficas s existen signos
bastante constantes. Entre ellos destaca la relativa frecuencia con que se obtienen
punciones blancas (dry-tap) en pacientes HIV+. Ello contrasta con la imagen de
la biopsia, caracterizada por una celularidad normal o incluso aumentada. Cuando
es posible obtener material del aspirado, el examen morfolgico del mismo muestra
generalmente una celularidad abundante en la que destacan signos dishematopoyticos, especialmente en los precursores eritroides (megaloblastosis y diseritropoyesis) y

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Captulo 8 Mtodos para el estudio de la mdula sea

FIGURA 8-9. Nido de clulas


neoplsicas (micrometstasis) (MGG,
1.000).

un cierto grado de linfocitosis con plasmocitosis. La observacin de hipoplasia de serie


roja, intensa plasmocitosis y aumento del nmero de macrfagos debe hacer pensar en
una infeccin diseminada por citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (VEB),
Leishmania donovani o por el bacilo cido-alcohol resistente a Mycobacterium avium
intracellulare (MAI) que afecta la mdula sea, lo que obliga a realizar los estudios
microbiolgicos pertinentes.

Biopsia sea
Introduccin
La biopsia de mdula sea o biopsia medular (BMO) constituye en la actualidad un
procedimiento de indudable inters diagnstico en hematologa y, en algunos casos,
decisivo para el establecimiento definitivo del mismo. As, por ejemplo, es la nica
exploracin que nos permite establecer el diagnstico de extensin de los linfomas
y conocer las caractersticas de su patrn invasivo, fundamental para iniciar o controlar la conducta teraputica adecuada. En la aplasia medular resulta imprescindible
para conocer su grado de extensin y determinar el pronstico. En el SIDA, el estudio de la biopsia de mdula sea puede tambin tener inters clnico cuando la
puncin medular ha resultado blanca (cuadro8-2). El hecho de que, para estudiar
la mdula sea hematopoytica, haya que abordar la profundidad del hueso y la
muestra extrada deba someterse a un proceso relativamente largo de preparacin
antes de poder ser observada al microscopio hace que su empleo sea algo ms
limitado que la simple puncin y el aspirado medular. No obstante, su utilidad
diagnstica se ha visto en los ltimos aos revalorizada debido sobre todo a tres
hechos fundamentales:
1. La mayor simplicidad y eficacia del instrumental empleado en la extraccin de
las muestras.
2. El perfeccionamiento de los procedimientos histolgicos que atenan el problema
de la descalcificacin. A este respecto cabe decir que hoy en da es posible utilizar
algunos marcadores monoclonales en las muestras de biopsia sea incluidas en
parafina. Este hecho permite ampliar considerablemente la utilidad diagnstica
de este procedimiento en la prctica clnica (v. tabla8-2).

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CUADRO 8-2. Alteraciones de la biopsia sea en pacientes HIV positivos


Aumento de la celularidad y del nmero de megacariocitos
Signos de mielodisplasia
Eritrocitaria y megacarioctica
Granulopoyesis+eritropoyesis
Plasmocitosis
Infiltracin linfoide de aspecto maduro (26% de biopsias)
Dilataciones vasculares y proliferacin vascular anmala
Granulomas (10% de biopsias)
Eritrofagocitosis (6% de pacientes)
Aumento de macrfagos con pigmento frrico
Parasitosis (leishmaniosis) (6% de los casos)
Fibrosis reticulnica grados I o II
HIV, virus de la inmunodeficiencia humana.

3. La toma de conciencia de que la mayora de las hemopatas son, en realidad,


enfermedades de la mdula sea hematopoytica es fundamental, ya que solo
a travs de su estudio morfolgico e histolgico minucioso podr conseguirse
un diagnstico correcto. Como se ha indicado ya anteriormente, ello no resta
importancia al estudio del aspirado medular, ni hace que ambas tcnicas sean
excluyentes, sino al contrario, complementarias (tabla8-3).
La biopsia sea es una tcnica histolgica que informa sobre las caractersticas estructurales de la mdula hematopoytica respecto al tejido, y hace nfasis en la arquitectura
de la misma. El aspirado medular, en cambio, es una tcnica citolgica que permite
la descripcin minuciosa y detallada de las caractersticas morfolgicas de las clulas
hematopoyticas.
En la actualidad, la toma de biopsia se hace casi de forma exclusiva por puncin
transcutnea mediante un trocar, y se ha abandonado completamente la prctica de
una biopsia quirrgica debido al mayor riesgo que conlleva (sobre todo de hemorragia
e infeccin) y por producir mayores molestias al paciente. Dicha tcnica empleaba el
llamado mieltomo de Burkhardt que, previa incisin cutnea, actuaba mediante un
motor elctrico que accionaba una fresa dotada de dientes cortantes que despus de
cortar el cilindro facilitaban su ulterior extraccin mediante una pinza de tornillo. Esta
tcnica no se utiliza prcticamente en la actualidad, aunque tiene la ventaja de permitir
la obtencin de cilindros muy gruesos y no afectarse tanto como los trocares actuales

TABLA 8-3. Utilidad complementaria del aspirado y la biopsia de mdula sea (MO)
Caracterstica
Sencillez
Rapidez
Morfologa celular
Celularidad
Arquitectura celular
Fibrosis
Progenitores

Aspirado de MO (citologa)

Biopsia de MO (histologa)

+++
+++
+++
+

+
+
+
+++
+++
+++

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215

Captulo 8 Mtodos para el estudio de la mdula sea

FIGURA 8-10. Trocar de Jamshidi utilizado


para la realizacin de la biopsia sea.

frente a huesos muy duros, como en casos de osteoesclerosis donde la extraccin del
cilindro seo puede ser muy difcil.

Material
En nuestro medio, dos son los trocares que han demostrado ser ms tiles:
1. Trocar de Tanzer.
2. Trocar de Jamshidi.
Ambos modelos consisten en una aguja hueca, con un extremo proximal en forma
de T, que permite sujetarlo fcilmente, y un extremo distal cortante; en su interior
se inserta un mandril punzante y los dos van provistos de un expulsor. El trocar de
Jamshidi se diferencia del de Tanzer en que su extremo distal es algo ms estrecho que el
resto del trocar, por lo que el cilindro seccionado no es comprimido en el interior de la
aguja (fig.8-10). La expulsin del cilindro se hace, en el trocar de Jamshidi, en sentido
distal-proximal. En los ltimos aos han ido apareciendo en el mercado modelos de
trocares inspirados en el original de Jamshidi que no han hecho sino mejorarlo, concretamente el extremo proximal, realizado con material de plstico y que posee, en general,
un diseo muy cuidado, a menudo ergonmico que hace ms idnea su adaptacin a la
mano del operador. El estilete o mandril es punzante, suele ser muy afilado y posee tres
o cuatro facetas que facilitan la penetracin y el ulterior anclaje en la cortical del hueso.
El extremo distal de la cnula o aguja es muy cortante (puede tener forma de corona o de
boca de pez), lo cual le confiere gran efectividad en el avance a travs del hueso medular.
Recientemente, la mayora de los suministradores de material para el diagnstico
in vitro han ido incorporando a sus equipos de biopsia sea un sistema capturador del
cilindro seo o atrapa muestras. El sistema puede formar parte inherente del propio
trocar o, lo que es ms frecuente, consiste en una pieza adicional. Segn el diseador
esta novedad mejora la calidad tcnica de la extraccin, ya que aumenta el porcentaje
de xitos en la obtencin de la muestra y evita en todos los casos los movimientos de
deflexin del trocar.
Mtodo
1. Normalmente, se elige como punto de eleccin la cresta ilaca, antero- o posterosuperior.
2. Tras asepsia cuidadosa de la piel de la zona y anestesia local, se procede a la puncin
con el trocar, provisto de su mandril. En los centros hospitalarios, dotados de
servicio de anestesia es posible mejorar la calidad de la extraccin de la biopsia sea
si se completa la anestesia local con sedacin endovenosa o con analgesia espinal;

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3.
4.

5.

6.
7.

Manual de tcnicas de laboratorio en hematologa

ambas tcnicas consiguen eliminar el dolor que provoca el avance del trocar en
la cavidad medular y que solo con anestesia local no se consigue anular. Los dos
procedimientos requieren la presencia de un anestesista. La sedacin endovenosa
se efecta con hipnticos tipo midazolam, propofol u opioides como alfentanilo
o remifentanilo (analgsicos m-receptores potentes de vida media corta). La
utilizacin de estos frmacos hace necesaria la monitorizacin del paciente.
La analgesia espinal se consigue mediante puncin lumbar, utilizando un anestsico local (bupivacan a en dosis analgsicas) asociado o no a un opioide liposoluble
tipo fentanilo o sufentanilo.
Se imprimen al trocar movimientos de rotacin y de presin hasta conseguir
perforar la cortical del hueso. En este momento, el trocar queda anclado en la
cresta ilaca.
Se extrae el mandril y se continan los movimientos de rotacin-presin, por
lo que el cilindro medular, que va cortndose por el extremo distal del trocar, se
introduce poco a poco en el interior del mismo. La aguja penetra hasta unos 3cm
de profundidad.
Antes de proceder a la retirada de la aguja, se imprimen a esta movimientos laterales
algo enrgicos (deflexin) con el fin de romper la base del cilindro medular que
lo mantiene unido al resto del hueso. Seguidamente, se hunde algo ms la aguja
con el fin de conseguir que el cilindro seo cortado quede bien introducido en el
trocar y luego se procede a su extraccin. En caso de utilizar los equipos con un
sistema de atrapa muestras (especialmente los de pieza adicional, que son los ms
usuales), una vez finalizado el corte del hueso, se introduce el capturador hasta el
fondo, y se imprimen al trocar un par de vueltas de 360 y acto seguido se procede
a la extraccin. Como los movimientos de deflexin se evitan en esta modalidad,
la tcnica gana en comodidad para el enfermo, as como en seguridad, puesto que
no es excepcional que en huesos muy duros la maniobra de deflexin comporte
el riesgo de rotura del trocar y la porcin enclavada quede insertada en la cresta
ilaca.
El cilindro se obtiene mediante la introduccin del expulsor en el interior del
trocar, al ejercer una ligera presin (fig.8-11).
Procesamiento del cilindro seo:
(a) Se introduce la pieza en lquido fijador (Bouin-Holanda) durante 24h. Se
lava con H2O del grifo un mnimo de 5min. Si se introduce un fragmento

FIGURA 8-11. Cilindro seo


obtenido por puncin con trocar.

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Captulo 8 Mtodos para el estudio de la mdula sea

TABLA 8-4. Pauta para deshidratar el cilindro


Lquido

Tiempo

Alcohol de 96
Alcohol de 96 (renovado cada vez)
Alcohol de 99
Alcohol de 99 (renovado cada vez)
Tolueno
Tolueno (renovado cada vez)

45min
45min
45min
45min
45min
1h

del cilindro seo en formaldehdo como lquido fijador es posible, sobre esa
muestra as fijada, efectuar tcnicas de biologa molecular.
(b) Se descalcifica la misma con cido ntrico al 10% durante 24h.
(c) Se lava durante 5-10min con agua del grifo y se sumerge el cilindro en lquido
con capacidad creciente de deshidratacin (tabla8-4). El cilindro, despus de
estos pasos, adopta un aspecto translcido. De no ser as, debe permanecer
en el ltimo paso por tolueno 1h ms.
(d) Se introduce el cilindro as preparado en un bloque de parafina (cuadro8-3),
que permitir la obtencin de cortes de la pieza mediante un micrtomo. El
grosor de los cortes debera ser de 1-2m (mm). Sin embargo, la inclusin en
material de plstico presenta algunas ventajas frente a la inclusin en parafina:
a) no requiere descalcificacin (de esta manera se evita la accin corrosiva
del cido ntrico y, por tanto, se conserva mejor el tejido medular), y b) la
retraccin del cilindro es mnima. En contrapartida, esta tcnica presenta
tambin algunos inconvenientes:
(i) Es relativamente prolongada y requiere gran meticulosidad en su rea
lizacin.
(ii) Una vez realizada la inclusin, no es posible retroceder para recuperar
el cilindro entero.
(iii) La polimerizacin que deben sufrir algunos tipos de plstico debido a
su carcter exotrmico (desprendimiento de calor) puede desnaturalizar
los componentes del cilindro seo.
(iv) Requiere un micrtomo especial capaz de cortar piezas muy duras,
por tanto, su coste suele ser elevado.

CUADRO 8-3. Inclusin del cilindro en parafina


Inmersin en parafina a 60 durante 1h
Inmersin en nueva parafina durante 2h
En el molde metlico que servir para realizar el bloque de parafina se pone 1ml
de parafina fundida
Se deposita el cilindro y se coloca encima una pieza de plstico (casete), que lleva el
nmero de identificacin de la muestra, la cual se acaba de rellenar con parafina fundida
Se deposita la placa fra hasta la solidificacin total (el bloque queda constituido
por el casete ms laparafina slida y la muestra)
Los cortes obtenidos del micrtomo se extienden en un bao de agua a 45C y se
seleccionan cogindolos con portaobjetos que se colocan en estufa a 67C (30min)

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Manual de tcnicas de laboratorio en hematologa

CUADRO 8-4. Desparafinado y tincin de hematoxilina-eosina de los cortes

Desparafinado
Se introduce el portaobjetos con los cortes en:
Xileno: 5min
Xileno: 5min
Xileno: 5min
Alcohol absoluto: 5min
Alcohol absoluto: 5min
Alcohol absoluto: 3min
Alcohol de 96: 3min
Alcohol de 96: 3min
Alcohol de 96: 3min
Se lava con agua corriente o agua bidestilada

Tincin de hematoxilina-eosina
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.

Hematoxilina de Harris (preparado comercial): 5min


Se lava con agua corriente
cido actico al 1%: 4-5s
Se lava con agua corriente
Alcohol litiado: 4-5s. Alcohol de 96+una punta de cuchara de carbonato de litio
Eosina alcohlica: 5min
Se pasa por alcohol de 96
Se pasa por alcohol de 96
Se pasa por alcohol de 96
Se pasa por alcohol absoluto
Se pasa por alcohol absoluto
Se pasa por alcohol absoluto
Se pasa por xileno
Se pasa por xileno
Se pasa por xileno
Se pasa por xileno
Se pasa por xileno
Se monta la preparacin con DPX de inmediato (sin dejar que se evapore el xileno)

(v) La utilizacin de marcadores monoclonales, si bien es posible, es ms


restringida que en las muestras incluidas en parafina.
8. Tincin del cilindro seo: para la observacin del conjunto de clulas y trabculas
se emplea la tincin de hematoxilina-eosina (cuadro8-4). Otras tinciones como
la impregnacin argntica (cuadro8-5), que visualiza las fibras de reticulina,
o la del tricrmico de Masson (cuadro8-6), que permite visualizar las fibras de
colgeno, son de gran utilidad, junto a la de hematoxilina-eosina, para la mejor
interpretacin y diagnstico de los diferentes trastornos medulares.

Sistemtica para el examen histolgico de la mdula sea y su interpretacin


Antes de empezar el examen histolgico de mdula sea deben tenerse presente algunos
aspectos importantes:
Solo en un 20%, aproximadamente, de los aspirados y en un 3% de las biopsias se
obtiene material insuficiente para la interpretacin del resultado.

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Captulo 8 Mtodos para el estudio de la mdula sea

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CUADRO 8-5. Impregnacin argntica (reticulina de Gordon-Sweet)

Solucin A (bao argntico de Wilder)


Nitrato de plata: 1g. Agua destilada: 10ml
Hidrxido sdico: 0,3g. Agua destilada: 10ml
Se toman 5ml de solucin de nitrato de plata; se aade amonaco gota a gota hasta
que el precipitado casi se disuelva. Se precipita de nuevo la solucin con 5ml de hidrxido
sdico y, a continuacin, amonaco gota a gota hasta que la solucin quede clara.
Se completa con agua destilada hasta 50ml.

Solucin B
Cloruro de oro: 0,02g
Agua destilada: 10ml

Solucin C
cido oxlico: 0,5g
Agua destilada: 10ml

Solucin D
Alumbre de hierro: 0,2g
Agua destilada: 10ml

Solucin E
Tiosulfato sdico: 0,5g
Agua destilada: 10ml

Solucin F
Permanganato potsico: 0,5g. Agua destilada: 100ml
cido sulfrico al 3%
Se mezclan 47,5ml de la primera con 2,5de la segunda

Solucin G
Formol al 10%: 100ml

Mtodo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.

Se parte de los cortes desparafinados (v. cuadro8-4, Desparafinado)


Se oxida con permanganato potsico (solucinF) durante 5min
Se lava en agua destilada
Se blanquea con cido oxlico durante 1min
Se lava en tres cambios de agua destilada
Se trata con mordiente de alumbre de hierro en solucin acuosa al 2% durante 30min
Se lava bien en dos cambios de agua destilada
Se trata con el bao argntico de Wilder durante unos segundos
Se lava en agua destilada
Se trata con formol al 10% durante 10min
Se lava en agua. Si los cortes aparecen poco impregnados, se repite desde el paso 7
Se contrasta suplementariamente con cloruro de oro al 0,2% durante 5min
Se lava en agua destilada
Se fija con tiosulfato sdico durante 10min
Se lava con agua destilada
Se deshidrata y se monta (siguiendo los pasos 7 a 18 del cuadro8-4)

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Manual de tcnicas de laboratorio en hematologa

CUADRO 8-6. Tricrmico de Masson


1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.

Se parte de los cortes desparafinados (v. cuadro8-4, Desparafinado)


Solucin de cido pcrico o Bouin: 30min
Se lava en agua corriente hasta que se decolora
Hematoxilina de Gills II o de Harris: 5min
Se lava en agua corriente
Solucin de Ponceau-Fucsina: 5min
Se lava en agua corriente
Solucin de cido fosfomolbdico: 10min
Solucin de verde luz o azul de anilina: 5min
Se lava en agua corriente
Se deshidrata y se monta (siguiendo los pasos 7 a 18 del cuadro8-4)

La biopsia es el nico examen que ofrece una imagen en perspectiva de la situacin


de la cavidad medular. El aspirado realiza el anlisis de las clulas de un punto concreto de la mdula y, por tanto, nunca puede ofrecer una visin global del estado de
la celularidad hematopoytica ni de la arquitectura medular.
La relacin celularidad/grasa vara con la edad y mientras en una persona joven
todas las cavidades medulares contienen un predominio de clulas sobre la grasa, en
individuos adultos sucede lo contrario; este hecho es especialmente evidente en los
ancianos.
La mdula sea subcortical es ms pobre en clulas que la situada en otras regiones.
La biopsia no debe repetirse en el mismo sitio hasta pasado ms de 1 mes y no puede
utilizarse para realizar otros estudios que no sean de ndole histoqumica.
La mdula sea hematopoytica est albergada entre la cortical sea y las trabculas
del hueso esponjoso (fig.8-12).
En la lectura de una BMO hemos de considerar los siguientes apartados:
Trabculas seas: derivan de la cortical. En la superficie externa se observan los
conductos vasculares de Havers y el periostio. Es importante valorar siempre el grosor
de estas trabculas, que puede hallarse aumentado o disminuido. En el interior de
las mismas podemos observar los osteocitos; se pueden ver adosados a las trabculas
seas los osteoblastos, que son clulas encargadas de la sntesis sea endostal. Los
osteoclastos o clulas encargadas de la reabsorcin sea se observan rara vez en el

FIGURA 8-12. Imagen de una


biopsia sea normal (HE, 400).

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Captulo 8 Mtodos para el estudio de la mdula sea

221

hueso normal, y se trata de clulas de gran tamao polimorfonucleadas y albergadas


en huecos de la trabcula sea, llamadas lagunas de Howship. Entre las trabculas se
encuentran las clulas hematopoyticas, separadas entre s por clulas grasas (cavidad
medular).
Cavidad medular: Se encuentra entre las trabculas y en ella debe valorarse fundamentalmente lo siguiente:
Vascularizacin. Los vasos medulares contribuyen en gran manera a mantener
el armazn del estroma medular. Pueden ser de cuatro tipos: arteriolas, vnulas,
capilares arteriales y sinusoides medulares.
Celularidad hematopoytica. Est constituida por las tres series hematopoyticas:
eritropoytica, granulomonocitopoytica y trombocitopoytica. Tambin se
observan algunas clulas plasmticas y linfocitos. Los linfocitos pueden aparecer de
forma dispersa, junto al resto de las clulas hematopoyticas o formando folculos
(ms frecuentes en el anciano) de pequeo o mediano tamao, que se sitan hacia
el centro de la cavidad. Estos folculos se diferencian de los de los ganglios linfticos
en que carecen de centro folicular claro.
Clulas grasas. Son relativamente abundantes y se encuentran junto a las clulas
hematopoyticas. El contenido en adipocitos del hueso medular aumenta con la
edad. Al analizar la celularidad de un cilindro seo, es muy importante establecer
la relacin entre la celularidad hematopoytica propiamente dicha y la grasa. En la
aplasia medular, la celularidad hematopoytica se halla intensamente disminuida
al ser sustituida total o parcialmente por clulas grasas (relacin celularidad/
grasa disminuida). Por el contrario, en los sndromes mieloproliferativos o hiper
regenerativos, las clulas hematopoyticas desplazan las clulas grasas y las hacen
desaparecer tambin parcial o totalmente (relacin celularidad/grasa aumentada).
Armazn de reticulina. El armazn de fibras de reticulina constituye un entramado
fibrilar que va de la adventicia de las arteriolas medulares al endostio y que, junto a las
clulas del estroma, proporciona el soporte necesario a las clulas hematopoyticas.
Este armazn solo puede ser apreciado mediante la impregnacin argntica. En
condiciones normales es prcticamente invisible, pero puede aumentar en la mielofibrosis primaria, o secundaria, en el curso de diferentes hemopatas o enfermedades
diversas, con repercusin sobre el tejido hematopoytico (metstasis carcinomatosa).

Interpretacin del examen histolgico de la mdula sea (biopsia sea)


La biopsia de mdula sea (BMO) constituye siempre una prueba, a veces indispensable y
complementaria, del examen morfolgico de la mdula sea y sangre perifrica. En rea
lidad, cuando se requiere una biopsia sea, su examen nunca debe realizarse de forma
individualizada o independiente, sino siempre junto al examen morfolgico del aspirado
(o impronta obtenida del cilindro), el de sangre perifrica y la informacin clnica del paciente (fig.8-13). Su utilidad prctica resulta especialmente evidente en aquellas situaciones
caracterizadas por un aspirado insuficiente o sin clulas (aspirado blanco o dry-tap, de la
terminologa anglosajona). En estos casos, la prctica de una biopsia sea es obligada para
poder hacer el diagnstico. Fuera de aquellos raros casos de leucemia aguda sin expresividad perifrica y con mdula empaquetada, la biopsia sea permite distinguir fcilmente
entre una pancitopenia debida a una aplasia de mdula sea de una debida a mielofibrosis
idioptica. Ambas situaciones pueden cursar con una expresividad hemoperifrica bastante similar, pero su patrn histolgico es diametralmente distinto. Mientras que en la
primera se aprecia una ausencia prcticamente total de la celularidad hematopoytica
normal y sustitucin por clulas grasas (fig.8-14), en la segunda se aprecia un patrn

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Manual de tcnicas de laboratorio en hematologa

FIGURA 8-13. Los tres procedimientos bsicos de laboratorio para el diagnstico de las enfermedades de
la sangre: los frotis de sangre perifrica y mdula sea teidos con MGG, y la biopsia de mdula sea teida
con hematoxilina-eosina.

FIGURA 8-14. Biopsia sea. Patrn


histolgico hipocelular de un paciente
con aplasia de mdula sea (HE40).

hipo- o hipercelular con desaparicin prcticamente total de las clulas grasas y sustitucin
por una densa trama de fibras de reticulina y colgeno que constituye una imagen muy
caracterstica (fig.8-15). La tincin de reticulina acaba de confirmar el diagnstico de
mielofibrosis (fig.8-16). La biopsia no solo tiene inters diagnstico en hematologa,
sino que constituye una herramienta extraordinariamente til para la valoracin inicial
de la enfermedad, como sucede en pacientes afectados de linfoma de Hodgkin y otros
tipos de linfomas no hodgkinianos o para el seguimiento del curso de la enfermedad, especialmente despus de iniciar el tratamiento. Un ejemplo de esta situacin lo

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Captulo 8 Mtodos para el estudio de la mdula sea

FIGURA 8-15. Biopsia sea. Patrn


histolgico hipercelular con intensa
fibrosis en un caso de mielofibrosis
idioptica.

FIGURA 8-16. Biopsia sea.


Tincin mediante el mtodo de la
impregnacin argntica para poner
de manifiesto las fibras de reticulina
en un caso de mielofibrosis idioptica
acompaado de intensa fibrosis
reticulnica.

encontramos en la leucemia linftica crnica (fig.8-17), y el linfoma folicular (fig.8-18).


Finalmente, la biopsia sea puede ser tambin de utilidad diagnstica en enfermedades
no hematolgicas como, por ejemplo, tumores malignos primarios y metastsicos,
enfermedades granulomatosas y fiebre de origen desconocido, que en ocasiones pueden
acompaarse de punciones blancas. Como tcnicas complementarias a la biopsia
sea destaca la histoqumica e inmunohistoqumica que emplea anticuerpos monoclonales. Al igual que sucede con las extensiones de sangre perifrica y mdula sea, los
cortes histolgicos de mdula sea pueden ser sometidos a una reaccin inmunohistoqumica mediante anticuerpos monoclonales (AM) contra determinadas poblaciones
celulares, como por ejemplo para conocer la estirpe celular de una infiltracin linfoide
mediante la utilizacin de los AM CD13 (especfico de lnea T) y CD20 (especfico
de lnea B). La muestra histolgica de leucemia linftica crnica representada en la
figura8-17 puede ser tratada con anti-CD20 y anti-CD3, demostrando, de esta manera,
que la infiltracin linfoide es mayoritariamente B (fig.8-19) con muy escasas clulas T
(fig.8-20), respectivamente.

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224

Manual de tcnicas de laboratorio en hematologa

FIGURA 8-17. Biopsia sea.


Afectacin de la mdula sea en un
paciente con leucemia linftica. Patrn
histolgico de infiltracin difusa por
linfocitos de aspecto maduro.

FIGURA 8-18. Biopsia sea.


Afectacin de la mdula sea en un
paciente con linfoma folicular. Patrn
histolgico nodular con abundantes
folculos linfoides de mediano y gran
tamao, situados en los espacios
intertrabeculares, aunque tambin
se aprecia infiltracin linfoide
paratrabecular.

FIGURA 8-19. Biopsia sea con


marcada infiltracin linfoide de lneaB,
intensamente positiva para el
anticuerpo monoclonal anti-CD20.

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Captulo 8 Mtodos para el estudio de la mdula sea

FIGURA 8-20. Biopsia sea


con infiltracin linfoide de lnea T,
intensamente positiva para el
anticuerpo monoclonal anti-CD3.

CULTIVOS DE PROGENITORES HEMATOPOYTICOS

Introduccin
Los cultivos in vitro de progenitores hematopoyticos, desarrollados a principios de los
aos setenta, han permitido mejorar considerablemente nuestro conocimiento sobre
la hematopoyesis humana. As, han contribuido a demostrar la existencia de una clula
madre pluripotencial (stem-cell) con capacidad de autorreplicacin que, en su proceso
de diferenciacin, se transforma en un progenitor hematopoytico comprometido hacia
una lnea celular determinada. Ello puede evidenciarse por su capacidad de producir
colonias.
Desde los primeros trabajos hasta hoy, ha habido un incremento en el nmero
de precursores hematopoyticos que puede detectarse en un laboratorio, si bien
se realizan, fundamentalmente, determinaciones de colonias granulomacrofgicas
(CFU-GM), eritroblsticas (CFU-E, BFU-E), mixtas (CFU-GEMM) y megacariocticas (CFU-Meg).
El procesamiento de un cultivo consta, bsicamente, de una fase inicial de separacin
celular y posterior suspensin de las clulas en un medio de cultivo semislido (metilcelulosa o agar, fundamentalmente), al que se aaden distintos factores estimuladores del
crecimiento en funcin de la lnea celular que se investiga. Tras un perodo de incubacin,
el examen al microscopio invertido nos permitir la caracterizacin e identificacin de
las colonias obtenidas.

Metodologa clsica
Material fungible
Matraces Erlenmeyer de 1 y 2 l.
Frascos de cristal de 100ml de boca ancha.
Placas de cultivo Greiner de 30mm de dimetro.
Placas de cultivo Greiner de 150mm de dimetro.
Tubos Falcon estriles de 13ml.
Tubos Falcon estriles de base cnica de 50ml.
Filtros Millipore, 0,22mm, de 25mm de dimetro.

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Manual de tcnicas de laboratorio en hematologa

Filtros Corning, 0,22mm, de 200ml de capacidad.


Jeringas de insulina.
Jeringas de 20 y 2ml.
Agujas Becton Dickinson, 181/2G.
Recipientes Unopettes para recuento de leucocitos 1/20.
Pipetas Pasteur de plstico.
Pipetas de plstico estriles de 5 y 10ml.

Reactivos
Metilcelulosa Fluka.
Medio Iscove en polvo (IMDM) (con glutamina, sin NaHCO3) Gibco.
Medio Iscove lquido (IMDM) (con glutamina) Gibco.
Medio Hanks sin Ca2+, ni Mg2+ ni rojo de fenol.
Ficoll-Hypaque, 1,077g/cm3.
Albmina bovina desionizada (BSA).
Suero fetal de ternera (FCS).
Bicarbonato sdico (NaHCO3).
Agua destilada estril para cultivos celulares Gibco.
2-mercaptoetanol.
Factor estimulador de colonias granulomonocticas recombinante humano:
GM-CSF rh.
Interleucina 3 recombinante humana: IL-3 rh.
Eritropoyetina recombinante humana: EPO rh.
Instrumental
Cabina de flujo laminar vertical.
Incubador de CO2.
Microscopio invertido.
Microscopio convencional.
Agitador de tubos Vrtex.
Bomba de vaco.
Cmara de Neubauer.
Pipetas automticas Gilson P-1000, P-200, P-20 y P-10.
Pipeteador automtico.
Agitador magntico y recogeagitador.
Preparacin de la metilcelulosa
1. Se pesan 20g de metilcelulosa en papel de aluminio y se deja toda la noche bajo
la luz ultravioleta.
2. A la maana siguiente, se toma un Erlenmeyer estril de 2 l de capacidad y se
aaden 500ml de agua bidestilada para cultivos celulares dentro de la cabina.
Se cubre con un tapn de algodn y gasa estril, y se hierve al bao mara (fuera
ya de la cabina).
3. Cuando el agua hierva, se retira del bao mara y se aade la metilcelulosa dentro
de la cabina. Se agita suavemente sin agitador hasta que no se aprecien grumos.
4. Se deja de nuevo al bao mara durante 1h.
5. Mientras la metilcelulosa hierve, se disuelve un frasco de medio de cultivo Iscove en polvo en 500ml de agua bidestilada especial para cultivos y se agita

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Captulo 8 Mtodos para el estudio de la mdula sea

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suavemente (si bien posteriormente se filtrar, es mejor realizarlo tambin bajo


la cabina).
Se aaden 3,024g de NaHCO3 al medio resuspendido y se mueve suavemente
sin agitador procurando eliminar todos los agregados de bicarbonato.
Se deja bajo la cabina durante 1h y, a continuacin, se esteriliza con los filtros
Corning.
Despus de que la metilcelulosa haya hervido durante 1h, se aade bajo la cabina
un agitador magntico. Se deja agitando durante 2h a temperatura ambiente.
Pasadas las 2h, se aade el medio con el bicarbonato filtrado y se deja agitando
4h a temperatura ambiente.
Se deja toda la noche agitando en el frigorfico a 4C.
A la maana siguiente, se dosifica en frascos estriles de 100ml de boca ancha.
Se congela a 20C procurando que los frascos queden derechos. Se pueden
conservar durante 1 ao.

Dosificacin de los reactivos


Suero fetal de ternera (FCS)
1. Se descomplementa a 56C durante 30min al bao mara y se filtra.
2. Se dosifican los volmenes de 45ml en tubos Falcon de 50ml.
3. Se conserva a 20C.
Es necesario probar al menos cuatro lotes diferentes de FCS para asegurar el xito de los
cultivos, pues mientras que unos lotes favorecen el crecimiento, otros lo inhiben por completo.
Albmina bovina (BSA)
Es mejor utilizar BSA desionizada.
1. Se filtra y se dosifica en tubos Falcon de 50ml, a unos volmenes de 20ml.
2. Se conserva a 4C.
Medio de cultivo
1. Se preparan para cada frasco de 100ml cinco tubos Falcon cnicos de 50ml y se
aade a cada uno de ellos:
(a) 20ml de la mezcla de metilcelulosa y medio de cultivo con jeringas de 20ml
sin aguja.
(b) 8ml de FCS previamente descomplementado (al bao mara a 56C durante
30min).
(c) 4ml de BSA.
2. Se agita vigorosamente con un Vrtex y se deja reposar unos minutos.
3. Se preparan 100 tubos Falcon de 13ml estriles y se aaden 2ml por tubo de la
mezcla anterior. La concentracin final de los diferentes componentes ser:
(a) Metilcelulosa: 1,1%.
(b) FCS: 20%.
(c) Albmina bovina: 1%.
4. Se agitan de nuevo, se colocan en gradillas y se conservan a 20C.
2-mercaptoetanol
1. Se prepara una concentracin de 5mM.
2. Se filtra.
3. Se dosifica en tubos Eppendorf estriles de 0,5ml en volmenes de 30ml.

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Manual de tcnicas de laboratorio en hematologa

Eritropoyetina recombinante (EPO rh)


1. Se resuspende con agua bidestilada estril para cultivos celulares y se dosifica en
tubos de Eppendorf de 0,5ml una concentracin de 500U/ml.
2. Se conserva a 20C.
Factor estimulador de colonias granulomonocticas (GM-CSF rh)
1. Se resuspende con agua bidestilada estril para cultivos celulares y se diluye con
IMDM +10% BSA hasta conseguir una concentracin de 10.000ng/ml.
2. Se dosifican volmenes de 30ml en tubos Eppendorf de 0,5ml.
3. Se conserva a 20C.
Interleucina 3 recombinante (IL-3 rh)
1. Se diluye con (IMDM+10% BSA) hasta conseguir una concentracin final de
1.000U/ml.
2. Se dosifica en volmenes de 30ml.
3. Se conserva a 70C.
Medio de dilucin
1. Se prepara en tubos Falcon de 50ml una mezcla de medio Iscove lquido suplementado con el 20% de FCS descomplementado.
2. Se agita y se dosifican volmenes de 1,5ml en tubos Falcon de 13ml.
3. Se colocan en gradillas y se conservan a 20C.
Medio para el lavado de las clulas
1. Se prepara en tubos Falcon de 50ml una mezcla de medio Hanks suplementado
con el 10% de FCS descomplementado.
2. Se agita y se dosifica en volmenes de 30ml.
3. Se conserva a 20C.

Mtodo (cultivo in vitro de clulas hematopoyticas)


Recogida y procesamiento de la muestra
1. Se recoge 1ml de mdula sea en un tubo de 13ml que contenga 5ml de medio
Iscove lquido y 1.000 U de heparina sdica.
2. Se aaden, a otro tubo de la misma capacidad, 3ml de ficoll. Se deposita cuidadosamente con una pipeta Pasteur de plstico la mezcla anterior sobre la capa de
ficoll. Es necesario que los componentes estn a temperatura ambiente, pues la
densidad del ficoll vara con la temperatura.
3. Tambin podemos partir de una muestra de sangre perifrica. En este caso,
se diluyen 10ml de sangre perifrica anticoagulada con heparina sdica hasta
40ml con solucin de Hanks en un tubo de plstico de 50ml. Se depositan
10ml de ficoll en la base del tubo con cuidado para que no se mezcle con la
muestra.
4. Se centrifuga a 400g durante 30min a 25C.
5. Se recoge la capa de clulas mononucleadas y se efectan tres lavados de 10min
a 800g y a 4C con el medio de lavado.

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6. Despus del ltimo lavado, se resuspende el paquete celular y se efecta el recuento


de clulas.
7. Se ajusta la concentracin celular a 5105 cl./ml con el medio de dilucin.
Montaje de cultivo
1. Se extraen, para cada muestra, dos tubos de medio de cultivo. Como se conservan
a 20C, es conveniente sacarlos durante los lavados para que se vayan descongelando.
2. Se aade a cada tubo:
(a) Concentracin final/placa
(b) 20ml de EPO rh a 500U/ml = 4U/ml
(c) 25ml de GM-CSF rh a 10.000U/ml = 100ng/ml
(d) 25ml de IL-3 rh a 1.000U/ml = 10U/ml
(e) 25ml de 2-mercaptoetanol a 5 10-3M = 510-5M
(f) 500ml de suspensin celular 5105ml/ml = 1105 cl./ml
3. Se agita vigorosamente con el Vrtex y se deja reposar unos minutos.
4. Se preparan dos placas de Petri para cada tubo, de 30mm de dimetro, y se
aade, mediante una jeringa de insulina provista de una aguja de 181/2G, 1ml
del contenido del mismo.
5. Se reparte uniformemente por toda la base de la placa procurando que no queden
burbujas de aire.
6. Se colocan las dos placas, y tres con el mismo volumen de agua en el interior de
una placa de Petri de 150mm de dimetro.
7. Se incuba a 36,5C al 5% de CO2 y al 98% de humedad durante 14 das.
Recuento de colonias
El recuento de colonias se efecta los das 7 y 14 de incubacin mediante un microscopio invertido; se considera como agregado la agrupacin de 20 a 50 clulas y colonia,
la agrupacin de ms de 50 clulas. El resultado se expresa en nmero de colonias/105
clulas sembradas.
CFU-E (unidad formadora de colonias eritroides): aparecen el da siete de incubacin
(D7) y estn constituidas por eritroblastos.
BFU-E (unidad formadora de burst eritroides).
CFU-GM (unidad formadora de colonias granulomonocticas).
CFU-GEMM (unidad formadora de colonias granulomonocticas, megacariocticas
y eritroides).

Metodologa utilizando medios comerciales


En la actualidad, pueden adquirirse medios semislidos preparados para hacer los
estudios del crecimiento de colonias hematopoyticas. Estos medios comerciales
contienen metilcelulosa preparada en medio Iscove MDM, suero fetal de ternera,
albmina bovina, 2-mercaptoetanol y otros suplementos (p.ej., MethoCult). Este medio debe ser conservado a 20C en alcuotas, tal y como se ha indicado en
apartados anteriores.
En el momento de realizar el cultivo, aparte del nmero necesario de clulas, se
aadirn los factores estimuladores (EPO, GM-CSF) de la formacin de las colonias
que se quieran analizar.

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Manual de tcnicas de laboratorio en hematologa

Interpretacin del resultado y utilidad diagnstica de los cultivos


Las colonias obtenidas con esta tcnica son las siguientes: CFU-E, BFU-E, CFU-GM y
CFU-Meg.
Las CFU-E aparecen, aproximadamente, tras 7 das de incubacin; estas colonias son pequeas agrupaciones de eritroblastos y se caracterizan por su color
anaranjado debido a un ligero acmulo de hemoglobina en sus clulas (fig.8-21).
A medida que avanza el perodo de incubacin, van desapareciendo y proliferan
otras de mayor tamao, las BFU-E; estas colonias estn formadas por miles de eritroblastos en distintos estadios de maduracin y se identifican fcilmente por su
aspecto compacto e intensamente coloreado (fig.8-22). Las CFU-GM aparecen
entre los das 10 y 14 y estn constituidas por una mezcla de clulas granulocticas y macrfagos; se identifican fcilmente por su aspecto plano y translcido
(fig.8-23). Finalmente, aunque no muy frecuente, es tambin posible obtener las
denominadas CFU-GEMM que poseen, generalmente, la apariencia de un huevo
frito, con una zona central intensamente hemoglobinizada y compacta, rodeada
de una regin constituida por clulas ms translcidas. En general, las BFU-E,
CFU-GM y CFU-GEMM suelen contarse tras 14 das de incubacin. Los cultivos
de progenitores mieloides han demostrado ser tiles para estudiar la potencialidad de
los progenitores de sangre de cordn umbilical conservados. Por otro lado, el
crecimiento de colonias eritroides en cultivos en ausencia de EPO se utiliza como
criterio menor en el diagnstico de la policitemia vera.

FIGURA 8-21. Unidad formadora


de colonias eritroides (CFU-E, 1010).

FIGURA 8-22. Imgenes de


colonias obtenidas mediante
cultivo de progenitores
hematopoyticos (cultivo in
vitro de mdula sea o sangre
perifrica). BFU-E, unidad
formadora de brotes eritroides
tardos; CFU-E, unidad formadora
de colonias eritroides precoces.

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Las colonias de megacariocitos son de menor inters clnico y muestran una apariencia caracterstica (fig.8-24).

FIGURA 8-23.Cultivo in vitro


de mdula sea o sangre perifrica.
CFU-GM, unidad formadora de
colonias granulomonocticas.

FIGURA 8-24.Cultivo in vitro


de mdula sea o sangre perifrica.
CFU-M, unidad formadora de
colonias megacariocticas.

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231.e1

Autoevaluacin
1. El tejido donde se originan las clulas de la sangre es:
(a) El bazo.
(b) El timo.
(c) Los ganglios linfticos.
(d) La mdula sea.
(e) El hgado.
Respuesta correcta: d.
Respuesta razonada: la mdula sea es el tejido donde se originan los elementos formes de la
sangre. En el nio, la mdula sea ocupa la cavidad esponjosa de prcticamente todos sus huesos,
pero con el desarrollo, parte de ella es reemplazada por tejido graso, quedando finalmente
reducida a unas zonas concretas tales como el crneo, el esqueleto axial (columna vertebral) y
la epfisis de los huesos largos.
2. La diseritropoyesis es una forma de expresar la siguiente alteracin:
(a) Aumento de eritropoyesis.
(b) Eritropoyesis fetal.
(c) Maduracin anmala de los eritroblastos.
(d) Falta de factores de maduracin nuclear.
(e) Ninguna de las anteriores.
Respuesta correcta: c.
Respuesta razonada: existen ciertas formas de anemia arregenerativa, tales como las diseritropoyesis congnitas o adquiridas, en las que se observan alteraciones cualitativas de los eritroblastos
que afectan tanto al ncleo (binuclearidad, alteraciones de la cromatina, puentes internucleares)
como al citoplasma (aumento de tamao, hemoglobinizacin irregular, presencia de material
cromatnico o depsitos abundantes de ferritina).
3. La biopsia de mdula sea es un complemento diagnstico en hematologa, especialmente
para establecer el diagnstico diferencial entre:
(a) Sndrome inflamatorio crnico y sndrome mielodisplsico.
(b) Insuficiencia medular y leucemia aguda.
(c) Gammapata monoclonal y mielofibrosis idioptica.
(d) Aplasia de mdula sea y mielofibrosis idioptica.
(e) Ninguna de las anteriores.
Respuesta correcta: d.
Respuesta razonada: la biopsia de mdula sea, o biopsia medular (BM), constituye en la actualidad un procedimiento complementario de indudable inters diagnstico en hematologa y, en
algunos casos, decisivo para el establecimiento definitivo del mismo. As, por ejemplo, es la nica
exploracin que nos permite establecer el diagnstico de extensin de los linfomas y conocer las
caractersticas de su patrn invasivo, fundamental para iniciar la conducta teraputica adecuada.
4. Un aumento significativo de linfocitos en la mdula sea hipercelular es orientativo de:
(a) Leucemia linftica crnica.
(b) Aplasia de mdula sea.
(c) Enfermedad de Wilson.
(d) Infeccin por HIV.
(e) Todas las anteriores.
Respuesta correcta: a.
Respuesta razonada: la linfocitosis medular debe valorarse siempre en relacin a la clnica general
y a la celularidad global, ya que puede observarse en dos situaciones completamente diferentes.
5. La potencialidad regenerativa de una mdula sea depende del nmero y funcionalidad de
las clulas madre. Para poder conocer si el sistema hematopoytico responde correctamente
a los estmulos de las citocinas suele utilizarse el siguiente procedimiento:
(a) Anlisis citogentico del aspirado medular.
(b) Cultivos in vitro de progenitores hematopoyticos.
(c) Estudio inmunofenotpico del aspirado medular mediante anticuerpos monoclonales.

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231.e2

Manual de tcnicas de laboratorio en hematologa

(d) Anlisis morfolgico mediante microscopia confocal.


(e) Son correctas a y c.
Respuesta correcta: b.
Respuesta razonada: los cultivos in vitro de progenitores hemopoyticos, han permitido mejorar
considerablemente nuestro conocimiento sobre la hemopoyesis humana. As, han contribuido
a demostrar la existencia de una clula madre pluripotencial (stem-cell) con capacidad de autorreplicacin que, en su proceso de diferenciacin, se transforma en un progenitor hemopoytico
comprometido hacia una lnea celular determinada.
6. En qu procedimiento diagnstico hematolgico se utiliza el microscopio invertido?
(a) Anlisis de la relacin entre linfocitos B y T.
(b) Como complemento a la citometra de flujo.
(c) En el examen morfolgico y recuentro de colonias hematopoyticas.
(d) En el recuento de cromosomas.
(e) En todas las anteriores.
Respuesta correcta: c.
Respuesta razonada: un microscopio invertido es un microscopio que est al revs comparado
con uno convencional. La fuente de luz y el condensador estn sobre la plataforma apuntando
hacia abajo. Los objetivos y la torrecilla estn debajo de la plataforma apuntando hacia arriba. Las
nicas cosas que estn en disposicin corriente son el tubo binocular o trinocular, as como la
muestra, que es colocada sobre la plataforma o platina mecnica. Con un microscopio invertido
se pueden observar cultivos de precursores hematopoyticos bajo forma de colonias que pueden
ser de tres tipos: granulomonopoyticas, eritroides o de megacariocitos. La observacin se realiza
a travs de las bases de diferentes recipientes con espesores y caractersticas pticas variables,
utilizndose, en general, material de plstico.
7. En la actualidad, los cultivos de mdula sea son especialmente utilizados para:
(a) Analizar la potencialidad de los progenitores hematopoyticos.
(b) El diagnstico diferencial de los sndromes mieloproliferativos.
(c) El diagnstico de la policitemia vera.
(d) La capacidad funcional de la sangre conservada para transfusin.
(e) Son correctas b y c.
Respuesta correcta: c.
Respuesta razonada: los cultivos de progenitores mieloides han demostrado ser tiles para estudiar la potencialidad de los progenitores de sangre de cordn umbilical conservados. Por otro
lado, el crecimiento de colonias eritroides en cultivos en ausencia de EPO se utiliza como criterio
menor en el diagnstico de policitemia vera.
8. En general las clulas del tejido hematopoytico se clasifican en tres tipos: clula madre
pluripotente (stem-cell), progenitores y precursores. Los precursores pueden ser identificados
fcilmente mediante:
(a) Cultivos in vitro de progenitores hematopoyticos.
(b) Anlisis inmunofenotpico mediante citometra de flujo.
(c) Fosfatasa alcalina granulocitaria.
(d) Examen morfolgico convencional mediante tincin del aspirado de mdula sea con
May-Grnwald/Giemsa (MGG).
(e) Todas las anteriores.
Respuesta correcta: d.
Respuesta razonada: las clulas que normalmente se hallan en la mdula sea son de varios
tipos, pero todas ellas derivan de una nica clula madre. Un primer grado de diferenciacin
da lugar a los llamados progenitores comprometidos para una determinada lnea celular, cuya
estirpe no es an reconocible morfolgicamente, por lo que deben ser explorados mediante
mtodos indirectos, como, por ejemplo, los cultivos in vitro de mdula sea. El estudio de la
mdula sea puede realizarse a nivel morfolgico y funcional. El nivel morfolgico consiste en
el examen microscpico de los precursores hematopoyticos, que son clulas ya reconocibles
morfolgicamente como pertenecientes a una determinada estirpe celular.

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231.e3

9. Una puncin blanca es aquella en la que se obtiene el siguiente material aspirado:


(a) Sangre medular.
(b) Ningn material.
(c) Grumos medulares my pequeos.
(d) Agregados de plaquetas.
(e) Partculas de hueso.
Respuesta correcta: b.
Respuesta razonada: cuando la puncin de la mdula sea no da salida a material alguno, o
nicamente sangre medular sin presencia de grumos, se habla de puncin blanca o seca (dry-tap).
Comnmente la puncin seca se ha atribuido a una tcnica defectuosa, pero revisiones de los
casos con este hallazgo mediante biopsia sea y otros datos clnicos y biolgicos han demostrado
que puede obedecer a fibrosis, aplasia de mdula sea o, ms raramente, hipercelularidad con
mdula empaquetada, casi siempre debida a leucemia aguda. Otros diagnsticos pueden ser
el carcinoma metastsico y la leucemia de clulas peludas (hairy-cell leukaemia).
10. La observacin de la morfologa de las clulas sanguneas puede sugerir la realizacin de un
examen morfolgico de la mdula sea en las circunstancias siguientes:
(a) Presencia de precursores mieloides.
(b) Anisopoiquilocitosis con cuerpos de Howell-Jolly y eritroblastos circulantes.
(c) Desgranulacin de ms del 80% de los polinucleares neutrfilos.
(d) Marcada anisocitosis plaquetaria con presencia de plaquetas gigantes.
(e) Todas las anteriores.
Respuesta correcta: e.
Respuesta razonada: al observar las clulas de la mdula sea se debe consignar las posibles
alteraciones morfolgicas de la serie eritropoytica, las posibles alteraciones de la maduracin
(megaloblastosis) o la existencia de signos de diseritropoyesis (binuclearidad, puentes internucleares o alteraciones de la cromatina), y/o un aumento del nmero de mitosis. En la serie
granulopoytica debe considerarse la posible existencia de clulas inmaduras (mieloblastos) y/o
alteraciones de la granulacin (desgranulacin o hipergranulacin) o de la segmentacin del
ncleo (hiposegmentacin, hipersegmentacin).

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