TECNOLOGA DEL ADN

RECOMBINANTE

Blga. Maribel Huatuco Lozano

TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE

Aislamiento y manipulacin de fragmentos
de ADN de un organismo para introducirlo
en otro (ADN recombinante)

Nathans D., Arber W., y Smith H.

(premio Nobel de Fisiologa y Medicina
en 1978 por el descubrimiento de las
enzimas de restriccin y su aplicacin en
Gentica Molecular).

TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE

Preparacin de la secuencia del ADN para su clonacin

Preparacin de un vector de clonacin

Una pequea secuencia de ADN fcil de aislar, como un plsmido, tambin

puede usarse un csmido, un virus.

Formacin del ADN Recombinante

Introduccin del ADN recombinante en la clula anfitriona

Propagacin del cultivo

Deteccin y seleccin de los clones recombinantes

Plsmido

gen de resistencia
a la ampicilina

Plsmidos

Extremos cohesivos

Molcula de ADN recombinante

Virus

Molcula A

Molcula B

Digestin de ambas molculas con la

misma enzima de restriccin, BamHI
Extremos
cohesivos
Mezclar

Tratar con ADN-ligasa

ADN recombinante

BIOTECNOLOGA VEGETAL
TRANSGNICOS

Blga. Maribel Huatuco Lozano

PRINCIPALES

TCNICAS DE BIOTECNOLOGA
VEGETAL

Las tcnicas empleadas en la generacin de

plantas transgnicas son diferentes si se
pretende expresar genes exgenos en la planta o
si, por el contrario, se busca alterar la expresin
de genes del organismo.
Para conseguir una transformacin eficiente de
un tejido vegetal es preciso satisfacer los
siguientes requisitos:

TCNICAS PRINCIPALES DE BIOTECNOLOGA

VEGETAL
Debe existir un mtodo eficiente de introduccin
de ADN en el tejido vegetal.
Debe existir un marcador que permita seleccionar
eficazmente los tejidos transformados.
Debe ser tcnicamente posible la propagacin y la
regeneracin del tejido diana, y posteriormente
de plantas frtiles a partir del tejido transgnico.
Cultivo in vitro.
Proceso
de transformacin simple, eficaz,
reproducible, econmico e independiente del
genotipo del organismo utilizado.
Proceso corto en el tiempo para evitar en lo
posible la variacin somaclonal y la esterilidad.

ADN EXGENO

Preparacin del ADN exgeno

Requiere los siguientes

componentes:
Transgen
Promotor
Marcador de seleccin
Marcador testigo

MTODOS DE TRANSFORMACIN
A.- Mtodos de Transformacin Biolgica
Transformacin con Agrobacterium:
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium rhizogenes

Otro mtodo que se desarroll, esta basado en una estrategia para

el control de plagas.
El objetivo esta en proveer resistencia a las plantas, incorporando
genes de la toxina natural de la bacteria Bacillus Thuringiensis
(Bt).
Esta toxina proteica afecta a ciertas larvas que tienen aparato
bucal masticador y producen graves daos a los cultivos, causando
su parlisis y muerte.
Cuando la planta posee ese gen, produce la toxina y, de esta forma,
se protege ante el ataque de los insectos.

Este es el porqu al
maz modificado
genticamente se le
llama maz Bt.

MTODOS DE TRANSFORMACIN
B.- Mtodos Fsicos de Transformacin
Transformacin de Protoplastos:
Los protoplastos son clulas desnudas que han perdido la
pared celular. Pueden aislarse generalemnte de cultivos de
callos. La entrada de ADN exgeno en el protoplasto puede
conseguirse utilizando diversos mtodos:
Electroporacin
Tratamiento con Polietilenglicol
Transformacin con Liposomas
Biolstica
Transformacin mediada por lser
Femtoinyeccin
Abrasin con fibras

TRANSFORMACIN BIOLGICA CON AGROBACTERIUM

Transformacin de la clula vegetal con el

plsmido Ti de A. tumefaciens

TRANSFORMACIN BIOLGICA CON AGROBACTERIUM

Agrobacterium tumefaciens es patgena de plantas. Produce tumores
Agrobacterium

ncleo
Plsmido Ti

cromosoma

inductor de tumores
contiene oncogenes
(genes onc)

cromosoma

Ingeniero
gentico natural
tras sutitucin de
genes onc por
genes de inters

clula
vegetal

tumores
Proliferacin de
hormonas crecimiento.
Se forman tumores en
las zonas de la lesin

TRANSFORMACIN BIOLGICA CON AGROBACTERIUM

TRANSFORMACIN BIOLGICA CON AGROBACTERIUM

TRANSFORMACIN BIOLGICA CON AGROBACTERIUM

Transformacin de la clula
plsmido Ti de A. rhizogenes

vegetal

con

el

A. rhizogenes es un patgeno vegetal que da lugar a una

proliferacin
radicular anormal en las plantas
infectadas.

MTODOS FSICOS DE TRANSFORMACIN

o Electroporacin
Se basa en la aplicacin de pulsos
elctricos cortos y de alto voltaje
en la membrana celular, esto
hace que aparezcan de forma
temporal poros que van a
permitir la entrada en el interior
de la clula de macromolculas
presentes
en
la
solucin
extracelular.
Este
proceso
permite a las clulas suspendidas
en un tampn con plsmidos de
DNA incorporar al interior
celular
el
ADN
tras
la
electroporacin, resultando en
una trasformacin transitoria o
estable.

MTODOS FSICOS DE TRANSFORMACIN

Tratamiento con Polietilenglicol (PEG)

Un agente fusagnico que modifica qumicamente

las membranas al interaccionar con los fosfolpidos
que las componen, permite la entrada del ADN
exgeno en suspensin presente en el medio. El
mecanismo de la captacin de DNA implica la
contraccin del volumen del protoplasto debido a la
alta presin osmtica originada por el PEG, seguido
de la creacin de vesculas endocticas que
incorporan el complejo catin/DNA.

MTODOS FSICOS DE TRANSFORMACIN

Biolstica
La tcnica consiste en baar
partculas esfricas de oro o tungsteno
(aproximadamente
de
0,4-1,2
micrmetros de dimetro, o del
tamao
de
algunas
clulas
bacterianas) con DNA, el cual ha sido
precipitado con CaCl2, espermidina o
polietilenglicol.
Las
partculas
baadas con DNA son aceleradas a
altas velocidades (300-600 metros /
segundo) con un equipo especial
llamado pistola de partculas (o pistola
de genes).

MTODOS FSICOS DE TRANSFORMACIN

Biolstica
Los proyectiles acelerados van a
penetrar la pared celular y la
membrana de la clula, aunque
la
densidad
de
partculas
utilizadas no va a resultar
significativamente daina para
la misma. El alcance de la
penetracin de las partculas en
las clulas vegetales puede ser
controlada variando la intensidad
del
estallido,
alterando
la
distancia que las partculas han
de atravesar para alcanzar la
clula o utilizando partculas de
diferentes tamaos.

MTODOS FSICOS DE TRANSFORMACIN

Transformacin con liposomas
Se emplean liposomas artificiales en cuyo interior
viaja la suspensin de molculas de ADN.
Transformacin mediada por lser
Esta tcnica supone la apertura de microorificios
mediante un haz de lser, por los que se facilita
la penetracin de ADN desnudo en el interior de
la clula.
Abrasin con fibras
Consiste en la apertura de entradas permanentes en
las paredes y membranas celulares mediante la
mezcla a alta velocidad de clulas vegetales y fibras
abrasivas, generalmente de carburo de silicona,
recubiertas de ADN.

MTODOS FSICOS DE TRANSFORMACIN

Femtoinyeccin
La transferencia del transgn es mediante una
microinyeccin de ADN con una femtojeringa de
expansin con galinstano, que consiste en un
microcapilar de borosilicato o cuarzo sellado y cuya
punta tiene un dimetro de tan solo 0.1 m.

ADN ENDGENO

Silenciamiento gnico

Son tcnicas capaces de impedir la expresin de

endgeno.
Pueden destacarse las siguientes:

un gen

ARN antisentido.- Consiste en la sntesis de ARNm

complementario al del gen cuya expresin se desea inactivar.
Apartir del ARN antisentido se generan molculas de ARN
bicatenario que son escindidas y actan como ARNm que no
pueden ser traducidos.

Ribozimas.-Por ingeniera gentica se sintetiza ribozimas

especificas capaces de degradar ARNm de cualquier gen que se
desea silenciar en forma especifica.

Blga. Maribel Huatuco Lozano

Segn la OMS son organismos en los

cuales el material gentico a sido alterado
de un modo artificial por medio de
biotecnologa que permite transferir genes
seleccionados de un organismo a otro ,
incluso entre especies no relacionadas

Los alimentos transgnicos son

semillas, cultivos o ingredientes
modificados por medio de ingeniera
gentica

En 1990 se inicia la
transformacin del
maz usando el
bombardeo
de macropartculas

Se crea el primer
algodn tolerante al
herbicida Bromoxynil

1995 la FDA aprueba el primer

producto GM para consumo humano:
el tomate de maduracin retardada
Flavr
Savr

PORQUE SE PRODUCEN LOS

ALIMENTOS TRANSGNICOS?

Esto tiene como objetivo traducirse en un

producto con un menor precio, mayores
beneficios (en trminos de durabilidad o
valor nutricional) o ambos.

Los cultivos GM tienen

como objetivo principal
aumentar el nivel de
proteccin de los cultivos
mediante
la
introduccin
de
resistencia
a
enfermedades causadas
por insectos o virus a los
vegetales o mediante
una mayor tolerancia a
los herbicidas.

El Herbicida glifosfato es
efectivo
a
muy
bajas
concentraciones, no es txico
para
humanos
y
los
microorganismos del suelo lo
degradan rpidamente.
El gliofosfato mata las plantas
inhibiendo la accin de la
enzima de los cloroplastos
denominada EPSP sintetaza

Para producir una planta resistente a glifosfato:

Las plantas GM que producan
EPSP sintetasa crecieron y
desarrollaron, mientras que las
plantas control se marchitaron

1
2
3

Aisl el gen EPSP.

Este gen se clon en un vector

Se transfiri a en la bacteria Agrobacterium

tumefaciens

Se infectaron clulas en discos cortados de la planta y

se hizo crecer en presencia de glifosfato, rociandolas
con cantidades hasta 4 veces mayores de glifosfato

Muchos
cultivos
son
deficientes en algunos de
los nutrientes requeridos
en la dieta humana, y se
esta
usando
la
biotecnologa
para
producir
cultivos
que
cumplan
con
estos
requisitos dietticos.

Un ejemplo es la produccin
de arroz dorado con
niveles incrementados de caroteno, un precursor de la
vitamina A.
La deficiencia de vit A se da
en muchas reas de Asia y
frica, provocado ceguera en
nios.

Los tres temas principales debatidos son

las tendencias a provocar una reaccin
alrgica (alergenicidad), la transferencia
de genes y el cruzamiento lejano
(outcrossing).

Alergenicidad
Los cultivos GM pueden introducir
nuevos
compuestos
que
produzcan
alergias. Cuando se transfiere a una
planta ADN de una especie con
propiedades alergnicas, existe riesgo de
que el consumo de la variedad GM
provoque alergias.

Alergenicidad

Lo grave es que tambin pueden

producirse reacciones alrgicas a nuevas
protenas procedentes de una especie que
no tenga un historial de efectos
alergnicos. Hay que tener en cuenta que
se
estn
introduciendo
protenas
derivadas de bacterias, virus, insectos,
etc, de otras especies que nunca han
formado parte de la alimentacin humana

La transferencia gentica de alimentos

GM a clulas del organismo o a bacterias
del tracto gastrointestinal causaran
preocupacin si el material gentico
transferido afectara en forma adversa a la
salud humana. Esto sera relevante si
fueran a transferirse genes de resistencia
a antibiticos usados para crear GM.

El desplazamiento de genes de vegetales

GM a cultivos convencionales o especies
silvestres relacionadas (outcrossing), as
como la combinacin de cultivos
provenientes de semillas convencionales
con
aquellos
desarrollados
usando
cultivos GM, puede tener un efecto
indirecto sobre la inocuidad y la
seguridad de los alimentos.

Este riesgo es real, como se demostr

cuando aparecieron rastros de un tipo de
maz que slo fue aprobado para
alimentacin animal en productos del
maz para consumo humano en los
Estados Unidos de Amrica.

Muchos pases han adoptado estrategias

para reducir la combinacin, incluyendo
una clara separacin delos campos dentro
de los cuales se desarrollan cultivos GM y
cultivos convencionales.
Este entrecruzamiento
con plantas
silvestres, nos puede resultar con una
perdida de las especies naturales.

QU TIPO DE REGULACIONES EXISTEN?

Regulacin Normativa internacional

Declaracin de Ro de Janeiro (1992)
Principio Precautorio

Convenio sobre Diversidad Biolgica

Conservacin y cuidado del medio ambiente
Protocolo de Cartagena
Marco Regulador especfico

Regulacin Normativa internacional

Protocolo de Cartagena
Principio de Precaucin

Bases de legislacin internacional

Etiquetado: puede contener

Regulacin Normativa internacional

Evaluaciones que
incluyen la
identificacin de niveles
de nutrientes, anti
nutrientes y posibles
toxinas y alrgenos en
todo tipo de plantas de
cultivo.

Regulacin Normativa internacional

Iniciativa Europea
La alteracin gentica debe ser necesaria
y til

Seguros para la salud

Que sus caractersticas se mantengan en
el tiempo
Etiquetado identificativo