UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE INGENIERA GEOGRFICA, AMBIENTAL Y ECOTURISMO

ESCUELA DE INGENIERA AMBIENTAL

TOXICOLOGA
PRUEBA DE GENOTOXICIDAD (ENSAYO DE
MICRONUCLEOS)
PROFESOR:
Blgo. ALVAREZ ALVAREZ Felix J.
ALUMNO:
PUENTE RAMOS, Rodney Danny
CODIGO:
2012001023
Ciclo/Turno:
6to / TA
LIMA, 31 DE OCTUBRE DEL 2015

Contenido
1.

introduccion .....................................................................................................................................3

2.

objetivos ...........................................................................................................................................4

3.

marco teorico ...................................................................................................................................4

4.

3.1.

TOXICOLOGIA ACUATICA......................................................................................................4

3.2.

GENOTOXICIDAD ..................................................................................................................4

3.3.

ENSAYO DE MICRONUCLEOS ................................................................................................5

materiales y metodos .......................................................................................................................6

4.1.

MATERIALES .........................................................................................................................6

4.2.

METODOS .............................................................................................................................7

5.

resultados .........................................................................................................................................9

6.

discusion y conclusiones ............................................................................................................... 10

7.

referencias bibliograficas .............................................................................................................. 11

1.

INTRODUCCION
Una gran cantidad de compuestos txicos, de origen natural y antrpico. Llegan a los
ecosistemas acuticos, donde son absorbidos, acumulados, biotransformados por procesos
biolgicos y/o qumicos. Estos compuestos disueltos o dispersos en el agua, ingresan a los
organismos acuticos a travs de las branquias, la piel y/o el tracto digestivo. Una vez dentro
del organismo, estas sustancias txicas interactan en diversos procesos fisiolgicos y rutas
metablicas.
Se pueden definir dos tipos de contaminacin: Contaminacin puntual o localizada, donde
los contaminantes ingresan de forma directa a los cursos acuticos (tpica de efluentes
urbanos e industriales) y Contaminacin difusa o no localizada, donde no existe un punto
claro de ingreso al curso de agua (tpicamente la producida por actividades agrcolas). En el
primer caso, las fuentes son fciles de identificar, monitorear y regular, pero producen un
alto impacto sobre el sitio inmediato que recibe la descarga. En el segundo caso, los
contaminantes (pesticidas, fertilizantes y otros qumicos asociados) generalmente son
arrastrados por lixiviado y escorrenta, del medio terrestre al medio acutico. Los impactos
producidos por estos dos tipos de fuentes, van a depender de las caractersticas propias de
los contaminantes, su periodicidad de descarga y el tipo de ambiente donde son vertidos. El
ambiente puede ejercer funciones de filtracin, descomposicin, neutralizacin o
almacenamiento de ciertos contaminantes. De esta manera puede reducir en determinado
grado, la disponibilidad del contaminante en el medio, disminuyendo as su efecto nocivo en
los organismos. Pero tambin puede provocar acumulacin de contaminantes como metales
pesados unidos a partculas del sedimento que quedan biodisponibles por cambios en
parmetros fisico-quimicos.

2.

OBJETIVOS
Evaluar el dao gentico en la especie de pez cebra a travs del ensayo de micronucleo MN,
relacionado con el genoma humano para as extrapolarlo.
Determinar la cantidad de eritrocitos micronucleados (EMN) en la especie de pez cebra.
identificar el nivel de dao celular en los peces.

3.

MARCO TEORICO
3.1.

TOXICOLOGIA ACUATICA

Los bioindicadores u organismos centinela, permiten estudiar los efectos de los

contaminantes en el ecosistema, a travs de una serie de respuestas moduladas e
integrables, las cuales posibilitan evaluar el bienestar del individuo, de la poblacin y de la
comunidad. Por bioindicadores se entienden todos aquellos organismos que proporcionan
informacin sobre la calidad del medioambiente o de una parte del mismo, a partir del uso
de marcadores especficos (de dao gentico, celular, inmunolgicos. neurotransmisores,
etc.). La informacin que proporcionan los organismos centinela, es el resultado de la
exposicin aguda o acumulativa de los diversos contaminantes en el ambiente. Se puede
evaluar el impacto sobre los organismos a lo largo de un periodo de tiempo. A diferencia de
los estudios fisico-quimicos tradicionales, los cuales brindan una informacin puntual en el
tiempo, que identifica los contaminantes presentes en el ambiente. Ambos estudios pueden
ser complemntanos.
Los peces son considerados buenos bioindicadores de la calidad del ecosistema acutico ya
que ocupan diferentes niveles de la cadena trfica, bioacumulan sustancias txicas y
reaccionan fcilmente a bajas concentraciones de agentes contaminantes. La eleccin de las
especies como bioindicadoras depender del conocimiento del contaminante del medio
acutico (si se deposita en el sedimento o si se mantiene en la columna de agua), como
tambin de la biologa del comportamiento del animal (tipo de alimentacin, posicin en la
columna de agua, movilidad, entre otros).
Las propiedades qumicas de los xenobiticos, as como la capacidad de los peces para
absorberlos, ingerirlos y metabolizarlos determinarn la importancia de las alteraciones o el
grado de dao causado. Algunas especies de peces que estn en niveles trficos superiores
(por ej. carnvoros) presentan mayores concentraciones de ciertos contaminantes y estn
potencialmente en mayor nesgo que otros de niveles inferiores (proceso de
biomagnificacin). En general, la persistencia de un contaminante en el ambiente determina
la peligrosidad del mismo.
3.2.

GENOTOXICIDAD

Dentro de los contaminantes que pueden ingresar a los ecosistemas acuticos, se

encuentran los agentes genotxicos. Dicho agentes actan directa o indirectamente sobre el
material gentico (ADN) y producen efectos detectables a concentraciones subletales.
Existen diversos tipos y fuentes de contaminacin que contienen agentes genotxicos, varios

de ellos relacionados con las actividades productivas del hombre (efluentes industriales,
cloacales, actividades agrcolas, entre otras).
La concentracin de estos agentes en el ambiente, su va de entrada al organismo, as como
la susceptibilidad y la capacidad de reparacin del organismo, determinaran en ltima
instancia, el grado de dao gentico producido. Dicho dao puede iniciar una cascada de
consecuencias biolgicas en clulas especficas, en tejidos u rganos xalbo, en el organismo
completo (afectando su sobrevivencia o su capacidad reproductiva) y finalmente en la
poblacin o en la comunidad, dependiendo de si el dao ocurre en clulas somticas o
germinales. En una variedad de animales acuticos, las alteraciones genticas, estn
asociadas a la reduccin del crecimiento corporal, desarrollo anormal del mismo,
disminucin de la sobrevivencia en embriones, larvas y adultos.

3.3.

ENSAYO DE MICRONUCLEOS

Los microncleos (MN) son indicadores de dao cromosmico que se originan durante la
divisin celular, tanto por fragmentos acntricos o cromosomas que no se incorporan en los
ncleos hijos. Esto se debe a la ocurrencia de eventos clastognicos (prdida de un
fragmento cromosmico acntrico) o aneugnicos (prdida de cromosomas completos)
ocurridos en algn momento del ciclo celular, provocados por la accin de agentes
genotxicos. Tambin pueden surgir debido a la interaccin de agentes qumicos, fsicos o
biolgicos con estructuras genmicas. que promueven disturbios en la maquinaria mittica y
falla en la segregacin cromosmica, originndose asL, uno o varios MN por clula.
El ensayo de MN fre desarrollado por Schmid (1975), el cual permite analizar la frecuencia
de MN en sangre perifrica de roedores, luego Hooftman & Raat (1982) adaptaron esta
tcnica para trabajar con peces en laboratorio. Son muchos los estudios posteriores que se
han hecho utilizando el ensayo de MN para detectar los efectos de la exposicin crnica a
sustancias qumicas mutagnicas y cancergenas en peces. Esta tcnica tambin puede ser
utilizada directamente en un ecosistema, como indicador biolgico de contaminacin en
peces, donde se pueden analizar los efectos mutagnicos de sustancias como mercurio,
nitrito, arsnico y otros agentes clastognicos.
El aumento en los vertidos de efluentes industriales y domsticos, en ambientes acuticos
(producto del aumento poblacional) provoca la exposicin de los organismos acuticos a una
alta concentracin de compuestos genotxicos. Una amplia variedad de compuestos
sintticos se han incrementado y dispersado en todos los hbitats. Entre ellos, los metales
pesados y los poluentes orgnicos persistentes (COPs) tales como hidrocarburos policiclicos
aromticos (HPAs) tienen severos efectos ambientales, dada su gran movilidad ambiental.
Vanos autores, han reportado el potencial genotxico de estas sustancias qumicas, como es
el caso del cobre que induce estrs oxidativo, provocando la formacin de MN.
La evaluacin genotxica de ambientes acuticos es un mecanismo clave para transformar el

principio de desarrollo sostenible en medidas concretas. Los agentes genotxicos se asocian

a la ocurrencia de mutaciones gnicas o cromosmicas, proliferacin de clulas cuyos
mecanismos de control se encuentran daados (carcinognesis), desarrollo de
malformaciones (teratognesis) y alteraciones en los mecanismos de reparacin del material
gentico.

4.

MATERIALES Y METODOS
4.1.

MATERIALES
REACTIVOS.
Giemsa 10%
Metanol
Aceite de inmersin.
Agua destilada.
EQUIPOS:
Microscopio.
MATERIALES.
Laminas portaobjetos y cubreobjetos. (DEBE TRAER EL ALUMNO)
Cuchilla o bistur. (DEBE TRAER EL ALUMNO)
Cmara para laminas portaobjetos.
Pipetas Pasteur.
MUESTRA BIOLGICA:
Cada grupo de laboratorio debe traer 4 peces cebra adultos de aprox. 5 cm.

4.2.

METODOS

Se seleccionan los peces y se sacrifican realizando un corte en la parte anterior del mismo,
entre el oprculo y las aletas pectorales, con la finalidad de obtener la sangre perifrica.

Se colecta la sangre perifrica colocando una gota de sangre en un extremo de la lmina

porta objeto e inmediatamente se realiza el frotis. Se deja secar a temperatura ambiente por
15 minutos.

Se sumergen las muestras en Etanol Absoluto frio por 15 minutos. Luego se procede a
retirarlas y dejarlas secar por 15 minutos a temperatura ambiente.

 Las lminas se colorean con GIEMSA al 10% por 8 minutos.

Se lava con agua destilada para retirar el exceso de colorante y dejar seca por 1 hora a
temperatura ambiente.

Finalmente se procede a la observacin microscpica para el

conteo final. Se utiliza 400X.

5.

RESULTADOS
Se realiz un total de 3 individuos
(peces cebra) donde observamos la
clula del glbulo rojo del pez,
pero cuando hay un efecto toxico o
dao celular lo que vamos a
observar es que se deprende un
pedazo de manera pequea del
ncleo de la clula se llama
micronucleo I (MN I).
Si se desprende 2 pedazos del
ncleo de la clula se llama
micronucleo II (MN II).
En el (MN III) se ve la forma del
ncleo cambia casi en forma de un
rin.

En el MN IV la membrana nuclear
se comienza a destruir el ADN se
quiere escaparse, se observa como
saliendo hilitos.
En el (MN V) ncleo desaparece se
desintegra queda vestigios de lo
que fue un ncleo.
Podemos ver en el microscopio 2 a
3 micronucleo I (MN I).

6.

DISCUSION Y CONCLUSIONES
Usamos los peces cebra porque fciles de conseguir, tienen un genoma que se ha
demostrado que ms o menos relacionado a nuestro y muchos efectos txicos se puede
extrapolar al humano.
Hay peces de diferentes colores eso colores cambian con respecto a un toxico. Tambin
encontramos peces alvinos (peces que podemos ver sus rganos internos la piel casi
transparente) y eso me ayuda en estudios de deformidad. En una intoxicacin crnica a un
adulto vemos si lo est afectado de manera visible.
Lo otro podemos hacer genotoxicidad sacando de una muestra de sangre de pez para ver si
hay un tipo de dao celular.
El ensayo de MN aplicado en peces, evidencia la importancia del estudio de las diferentes
concentraciones o el tipo de genotxicos presente en una clula.

7.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Junn M., Rodriguez Mendoza N., Heras M., Braga L. Valoracin preliminar de la utilizacin de
bioindicadores de contaminacin en alguna especies de peces del delta del ro Paran,
Argentina. Ciencias Ambientales. 2008;1:17-24.
Torres Bugarin O., Zabala Aguirre J., Gmez Rubio P., Buelna Osben H., Ziga Gonzlez G.,
Garca Ulloa Gmez M. Especies de peces con potencial como bioindicadoras de
genotxicidad en el lago La Alberca, Michoacn, Mxico. Hidrobiologica. 2007;17:75-81