Curso de Invierno

Facultad de Ingeniera Qumica

Santa Fe, 2014

FAGOS EN LA INDUSTRIA LCTEA

Enemigos invisibles
Mara Lujn Capra
Daniela Guglielmotti
Instituto de Lactolog
Lactologa Industrial (INLAIN, UNLUNL-CONICET)
Facultad de Ingenier
Ingeniera Qu
Qumica
Universidad Nacional del Litoral
mcapra@fbcb.unl.edu.ar,
mcapra@fbcb.unl.edu.ar, dgugliel@fiq.unl.edu.ar

BACTERIOFAGOS.
CARACTERSTICAS BSICAS
Frederick William Twort (1915, Londres)
Descubre un "agente bacterioltico" que infecta y mata a las bacterias,
pero no fue capaz de saber qu era exactamente dicho agente.

Descubiertos en 1917
por el franco-canadiense Flix dHrelle.

Flix dHerelle
On his discovery of bacteriophages in 1917

BACTERIOFAGOS.
CARACTERSTICAS BSICAS

Virus infectivos de bacterias (eaters of bacteria).

Poseen un slo tipo de cido nucleico (ADN o ARN).

Se replican en el interior de las clulas hospedadoras.
Utilizan el material gentico y la maquinaria
biosinttica de la clula infectada.

Bacteriofagos
Industria fermentativa
La bioconversin de sustratos en compuestos de mayor valor
agregado es el proceso bsico de una amplia variedad de
industrias

Las bacterias representan el pilar fundamental de los procesos

Cualquier poblacin bacteriana es susceptible a infecciones
fgicas
La mayora de las industrias fermentativas experimentan
contaminaciones fgicas
Graves consecuencias de estas infecciones para todos los
sectores industriales (elevados costos y tiempo para identificar el origen e
implementar medidas correctivas)

FAGOS DE BACTERIAS LCTICAS

Desde su primera deteccin, hace casi 80 aos (Whitehead and Cox,
Cox,
1935), los bacteriofagos siguen interfiriendo con las fermentaciones
lcticas,

PRODUCTOS DE
BAJA CALIDAD y/o
NO SEGUROS
28,8 nm

92,8 nm

PRDIDAS
ECONMICAS

FAGOS DE BACTERIAS LCTICAS

Los grandes volmenes de leche cruda procesados diariamente
facilitan la contaminacin con fagos que sobreviven a la
pasteurizacin.
Nuevos fagos surgen
recombinacin de ADN.

continuamente

PRESENCIA DE FAGOS EN EL
AMBIENTE INDUSTRIAL

PRCTICAMENTE INEVITABLE

por

mutacin

FAGOS DE BACTERIAS LCTICAS

Se han aislado fagos especficos para todos los gneros de
bacterias lcticas (BAL) que utiliza la industria:

Lactococcus

Leuconostoc
Streptococcus thermophilus

Lactobacillus
(incluye especies probi
probiticas)

BAL m
ms ampliamente utilizada
como starter (nivel mundial).
BAL para elaboraci
elaboracin de manteca,
crema y ciertos quesos (Q azules,
Gouda, Edam) (starters
(starters mixtos).
Starters para elaboraci
elaboracin de
leches fermentadas y quesos.

Starters para elaboraci

elaboracin de
quesos duros, leches fermentadas
tradicionales
tradicionales y probi
probiticas.

MORFOLOGA DE BACTERIOFAGOS

Genoma

cido nucleico
Cabeza

Vaina

Protenas

Placa basal
Fibras de la cola

MORFOLOGA DE BACTERIOFAGOS

ME Transmisi
Transmisin

ME Barrido
50 nm

CLASIFICACIN DE BACTERIOFAGOS
Familias de fagos de bacterias lcticas.
DNA lineal de doble cadena.

Podoviridae
Myoviridae
Cabeza
isom
isomtrica

Cabeza
elongada

Siphoviridae

Dimensiones de fagos
de bacterias lcticas y probiticas

CABEZA
FAGO

ALQ1.3
(S. thermophilus)

BYM
92,8 nm

(Lb. delbrueckii)

MLCMLC-A
(Lb. paracasei)
paracasei)

CHD
(L. lactis)
lactis)

28,8 nm

COLA

Morfo
-log
loga

Di
Dim.
(nm)
nm)

Long.
Long.
(nm)
nm)

Di
Dim.
(nm)
nm)

Isom.
Isom.

55

220

Isom.
Isom.

50

181

Isom.
Isom.

57

156

Isom.
Isom.

57

170

Siphoviridae (B1)

CICLO VITAL DE UN BACTERIOFAGO

Cromosoma
bacteriano

DNA fgico

Ciclo ltico de un bacteriofago

Cromosoma
bacteriano

DNA fgico

90 min despus de la
infeccin

Clulas de Lactobacillus sp.

sp.
infectadas por un fago.

Lisis celular

Bacteriofagos
Industria lctea fermentativa

Micrograf
n de un cultivo de S. thermophilus. El cultivo se observa antes (A) y
Micrografas electr
electrnicas de la infecci
infecci
despu

s
(D)
de
la
infecci

n
.
Adsorci

n
despu
infecci
Adsorci de los viriones a la superficie celular bacteriana antes (B) y despu
despus
(C) de la inyecci
inyeccin del AND fgico en el citoplasma celular.
celular.

Acidificacin en leche:
Lb. helveticus en presencia de fagos.
6.5

pH

6.0

5.5
Control
m.o.i.=1
5.0

4.5

m.o.i.=10-1
m.o.i.=10-2

Tiempo (h)

SENSIBILIDAD DE PROCESOS
FERMENTATIVOS A BACTERIOFAGOS
QUESERAS

LECHES FERMENTADAS

Calentamiento suave de la
leche (63 y 72
72C),

Calentamiento en
enrgico de la
leche (90
(90C),

Elevada exposici
exposicin del
producto al ambiente,

Proceso relativamente
as
asptico,

Separaci
Separacin de suero y
generaci
generacin de aerosoles,

Ausencia de drenaje y
circulaci
circulacin de suero,

FAGOS
LECHE CRUDA

FAGOS
CULTIVOS
LIS
LISGENOS

ELEVADA FRECUENCIA DE
INFECCIONES FGICAS

CULTIVOS
LIS
LISGENOS

RUPTURA DE
BARRERAS FISICAS

BAJA FRECUENCIA DE
INFECCIONES FGICAS

INDUSTRIA LCTEA FERMENTATIVA:

Ecologa y diversidad fgica
QUESERAS

LECHES FERMENTADAS
3 FAGOS
11 FAGOS
DNAs de bacteriofagos de
Lb. delbrueckii (HindIII).

6 FAGOS
Dendrogramas de perfiles de
restriccin (EcoRI) de bacteriofagos de
S. thermophilus.

DNAs de bacteriofagos de
S. thermophilus (EcoRV).

Dos meses de monitoreo

Dos aos de monitoreo

Quiberoni et al., 2006

Quiberoni et al., 2002 & 2003

BACTERIOFAGOS EN PLANTAS QUESERAS

Necesario

Implementar medidas de control para mantener el nivel de

fagos en la leche de elaboracin,
< 105 PFU/ml
Adecuada acidificacin por parte del fermento,

Permite

Buen desarrollo de flavor, humedad y textura del queso.

> 105 PFU/ml
freno o ausencia de
acidificacin
Queso con elevado pH, alto contenido de lactosa y
textura inadecuada
Lisis del cultivo

Produce

Puede prosperar FLORA ALTERANTE y/o PATGENA

Productos de BAJA CALIDAD y/o NO SEGUROS

BACTERIOFAGOS EN PLANTAS QUESERAS

ORIGEN
No se conoce con precisin, pero se admite
FERMENTOS
NATURALES
(cepas lisgenas)

LECHE CRUDA
(cepas lisgenas)
FAGOS

FAGOS

PASTEURIZACIN
FAGOS

LECHE DE ELABORACIN
FAGOS

AEROSOLES

FAGOS
SUERO

(bombas, transporte
manual, etc.)
procesamiento
y reciclo

concentraci
concentracin
de FAGOS

INDUSTRIA LCTEA FERMENTATIVA:

Ecologa y diversidad fgica
LECHES FERMENTADAS PROBITICAS
Procesos altamente controlados
(microbiol
microbiolgicamente),
gicamente),
Aumento y diversificaci
diversificacin en el uso de m.o.
m.o.
probi
probiticos,

Fagos ???

ADITIVO
FERMENTO
Menor in
inculo inicial,

Compatibilidad,

Mejor adaptaci
adaptacin,

Propiedades organol
organolpticas.

Propiedad probi
probitica y desarrollo.

BACTERIOFAGOS DE PROBITICOS
Cepas nicas e irreemplazables,
una cepa un producto
Comercialmente muy valiosas
Malos starters, fermentaciones
muy largas
Fermentos monocepa
Lisis del cultivo
Alta vulnerabilidad a fagos
Prdida de atributos probiticos
en el producto
Prdida de la produccin
Prdida del producto???

Elevacin del pH,

presencia del probitico y sus
metabolitos???
Productos de BAJA CALIDAD y/o
NO SEGUROS

INDUSTRIA LCTEA FERMENTATIVA:

Ecologa y diversidad fgica
LECHES FERMENTADAS PROBITICAS
25 nm

8 FAGOS

Primer bacteriofago de Lb. paracasei

aislado en nuestro pas.

Fermentos monocepa

DNAs de bacteriofagos de Lb. paracasei (BglII).

Tres aos de monitoreo

ELEVADA DIVERSIDAD
FGICA
Capra et al., 2009

BACTERIOFAGOS DE PROBITICOS
Fermentaciones en reactores
cerrados
Materias primas y ambientes muy
controlados microbiolgicamente

ELEVADA FRECUENCIA DE
INFECCIONES FGICAS

AMPLIA DISTRIBUCIN
FSICA EN LA PLANTA

ELEVADA DIVERSIDAD
FGICA

ALTA
RECOMBINACIN

CEPAS
LISGENAS

ORIGEN???

alta diversidad fgica

fagos altamente relacionados
Mercanti et al., 2011

FAGOS AISLADOS EN EL INLAIN:

1994-2014
1994

1997

234 fagos de Streptococcus thermophilus

25 fagos de Lactococcus lactis

1999
3 fagos de Lactobacillus delbrueckii
2001
2003

2009
2014

Quesos y
leches
fermentadas

40 fagos de Lactobacillus casei / paracasei

Leches
fermentadas
probiticas

10 fagos de Leuconostoc
Quesos azules

DETECCIN DE BACTERIOFAGOS
Preparacin de muestras para anlisis de bacteriofagos
Muestra
Ajuste de pH
Centrifugaci
Centrifugacin
o filtraci
filtracin

Filtraci
Filtracin est
estril (di
(dimetro de poro < 0.45 m)

Tratamiento
90
90C/15 min

Muestra para an
anlisis de
agentes inhibidores

Muestra para an
anlisis de
bacteriofagos

DETECCIN DE BACTERIOFAGOS.
METODOLOGAS TRADICIONALES
Se basan en la inhibicin de las bacterias componentes del
starter.
Test de Actividad: detecta diferencias en la produccin
de acidez (comparacin con control libre de muestra) (FIL(FILIDF, 1980).
Test de Turbidez: clarificacin (lisis) del cultivo en
presencia de la muestra (FIL(FIL-IDF, 1991).
Spot Test: detecta zonas de lisis en el cultivo
bacteriano (medio agarizado) (FIL(FIL-IDF, 1991).
Doble capa agarizada: permite enumerar las placas de
lisis formadas (FIL(FIL-IDF, 1991).

MTC M

Test de Actividad
Cinticas de acidificacin en leche por parte de
S. thermophilus, en presencia de fagos.
6.5

VENTAJAS
Mtodo sencillo.

pH

DESVENTAJAS
5.5

En general, poco
sensible, para
cultivos multicepa.

S. thermophilus St 12.4 + fago 021021-4

5
0

50

100

150

200

250

Tiempo (min)
control

m.o.i.=1.25.10-3

m.o.i.=1.25.10-4

m.o.i.=1.25.10-5

300

350

Spot Test y Doble capa agarizada

Deteccin y enumeracin
de bacteriofagos de S. thermophilus.

VENTAJAS
Mtodo sencillo.
Sensible (LD bajo).

Spot Test

DESVENTAJAS
Aplicable a cultivos
multicepa (previo
aislamiento de clones).
Mtodo de la Doble Capa
Agarizada

No detecta fagos que

no producen placas de
lisis visibles.

DETECCIN DE BACTERIOFAGOS.
METODOLOGAS INSTRUMENTALES
Permiten reducir tiempos de anlisis y aumentar el nmero de
muestras analizadas en menor tiempo.
Seguimiento de Impedancia o Conductancia: detecta
diferencias en estos parmetros cuando el cultivo
desarrolla en leche (comparacin con control libre de
muestra).
Inmunoensayos: reacciones con anticuerpos especficos
de los diferentes grupos morfolgicos de fagos.
Microscopa electrnica: clasificacin en diferentes
grupos morfolgicos.

Microscopa electrnica
Micrografas electrnicas
de fagos de S. thermophilus.

VENTAJAS

Permite diferenciar
grupos morfolgicos.

DESVENTAJAS
28,8 nm

LD: 107 UFP/ml.

Numerosas
etapas
de
purificacin
y
concentracin.

92,8 nm

DETECCIN DE BACTERIOFAGOS.
METODOLOGAS MOLECULARES

Permiten reducir tiempos de anlisis y aumentar el nmero de

muestras analizadas en menor tiempo.
Sondas especficas: dirigidas a determinar la naturaleza
de especies fgicas (Lactococcus) (Moineau et al., 1992).

PCR (Polymerase Chain Reaction): amplificacin de

secuencias conservadas en el genoma fgico.

DETECCIN DE BACTERIOFAGOS.
COMPARACIN DE METODOLOGAS
TRADICIONALES

Informacin sobre
sensibilidad de un
cultivo

INSTRUMENTALES Y
MOLECULARES

En general, no
detectan ciclos lticos
activos

No permiten discernir
grupos morfolgicos

Permiten detectar
naturaleza de grupos
fgicos diferentes

tiempo, clulas indicadoras

tiempo, deteccin directa

Fcilmente aplicables
en cualquier
laboratorio

Aplicables en
laboratorios equipados y
especializados

sensibilidad (~10 UFP/ml)

lmite de deteccin
(~104 UFP/ml)

Bacteriofagos en la Industria Lctea

ESTERILIDAD TOTAL
(medios de cultivo,
equipos, aire)

AUSENCIA DE FAGOS

Control fgico y no
erradicacin

Industria
farmace
farmacetica

IMPOSIBLE EN LA INDUSTRIA LCTEA

Notable plasticidad y
flexibilidad gen
genmica

BACTERIOFAGOS

Elevada frecuencia de
mutaci
mutacin

Rpida adaptaci
adaptacin
Colonizaci
Colonizacin de
ambientes industriales

Fagos

EVOLUCIN
Bacterias
ADAPTACI
ADAPTACIN

BALANCE
EVOLUTIVO

Curso de Invierno
Facultad de Ingeniera Qumica
Santa Fe, 2014

FAGOS EN LA INDUSTRIA LCTEA

Enemigos invisibles

Mara Lujn Capra

Daniela Guglielmotti
mcapra@fbcb.unl.edu.ar
dgugliel@fiq.unl.edu.ar