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Microbiologa
01/06/16
como
la
fosforilacin,
ser
utilizado
para
comparar
Southern Blot
La tcnica de Southern Blot desarrollada en Edimburgo por E.M. Southerm,
permite identificar regiones especficas de ADN que han sido fragmentadas
por una enzima de restriccin. El ADN se separa mediante electroforesis en
gel de agarosa. Tras teirlo con bromuro de etidio, el gel se fotografa bajo
luz ultravioleta. Posteriormente se trata con hidrxido sdico o a altas
temperaturas para desnaturaliza el ADN y romper la unin entre sus dos
cadenas. Entonces el gel se neutraliza con un buffer adecuado. En una
cubeta se extiende una pieza de papel de filtro grueso sobre un soporte
elevado, con los extremos del papel de filtro sumergidos en una solucin
altamente salina. Se sita el gel sobre la pieza de papel de filtro y sobre el
pone una pila de toallas de papel. Por ltimo se presionan todas las capas
con un peso. La solucin altamente salina asciende a travs de la pieza de
papel y atraviesa el gel por accin capilar, llevando consigo el ADN
desnaturalizado. El ADN es transportado hasta la membrana de
nitrocelulosa, a la cual se adhiere. De este modo el filtro se convierte en
una rplica del gel original. Cuando se ha completado la transferencia, el
ADN puede ser irreversiblemente unido al filtro mediante calor o exposicin
a luz ultra violeta. El producto del Southern puede ser hibridado con una
sonda de ADN marcada radiactivamente especfica para el gen o regin del
ADN objeto de estudio. Despus de varias horas en contacto con el filtro se
elimina la sonda. La localizacin de la unin de la sonda con el filtro se
identifica mediante una autorradiografa. Para determinar el tamao del
fragmento de restriccin que contiene la secuencia de inters, se puede
hacer una comparacin con marcadores de peso molecular en un gel de
agarosa.
El mtodo consta bsicamente de las siguientes etapas:
El ADN vegetal es extrado de las clulas y dirigido con una o ms
enzimas de restriccin.
Los productos de la digestin del ADN son separados de acuerdo a
Northern Blot
El Northern blot es una tcnica de separacin de ARN. Gracias a ella podemos a
partir de una muestra biolgica, de cualquier organismo, podemos aislar un ARN
en particular si conocemos al menos parte de su secuencia. Adems permite
separar los ARN dependiendo de su tamao.
El Northern blot surge como variacin del Southern blot, una tcnica similar creada
para separar molculas de ADN. El Southern recibe su nombre de su creador, E.
Southern. El Northern se denomin de esta manera como oposicin (norte y sur)
al Southern. La tcnica para separar el ARN fue diseada por James Alwine, David
Kemp y George Stark, a finales de la dcada de 1970. Adems existen otras
tcnicas basadas en la misma tecnologa para separar protenas, el western, o
ARN
con
modificaciones
postranscripcionales,
el
Eastern
blot,
etc.
lo
cargaremos
en
un gel
de
agarosa al
que
se
ha
que
queremos
separar
es
de pequeo
tamao puede
de
un
ARN
concreto para
comprobar
que
ese ARN se
que
presenta
es
la fragilidad
al
Northern.
del
Por
ARN
durante
ejemplo
el
proceso.
los microarrays
PCR
PCR son las siglas en ingls de Polymerase Chain Reaction o Reaccin en
Cadena de la Polimerasa. La idea bsica de la tcnica es sintetizar muchas veces
un pedazo o fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a
temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus
(dNTPs),
las
condiciones
para
que
la
enzima
trabaje
a las
Bibliografa
Anderson, M. (1990) Perfecting the polymerase chain reaction. Laboratory
Equipment Digets. 1: 30-31
Watson, J, D.; Baker, T. A.; Bell, S. P.; Gann, A.; Levine, M. et Losick, R
(2004). Molecular Biology of the Gene (Fifth edition edicin)
Southern, E.M. (1975): "Detection of specific sequences among DNA fragments
separated by gel electrophoresis", J Mol Biol., 98:503-517.
Western blot antibody. exactantigen.com. Consultado el 20 de agosto de 2010.
Labome lists 449244 antibody products against 41374 genes, including 15695