Esterilização de Equipamentos e Meio 2015

Esterilizao de Equipamentos e Meios
Fundamentos da Engenharia Bioqumica

Escola de Qumica/UFRJ

1) Conceitos
Porque esterilizar? Eliminar Micro-organismos?
Esterilizao: Processo fsico ou qumico que destri ou inativa

todas as formas de vida (incluindo formas vegetativas e
esporuladas) presentes em um material
Material estril totalmente isento de que qualquer organismo ativo
Desinfeco: Processo menos rigoroso de eliminao de microorganismos envolvendo usualmente o uso de um agente qumico,
denominado desinfetante ou germicida, geralmente lquido e
temperatura ambiente ou moderada.


1) Conceitos
Desinfetante ou germicida: Agente qumico

capaz de promover desinfeco;
Antissptico: Agente qumico aplicvel

em pessoas ou animais, com
capacidade de eliminar
microrganismos patognicos;
Assepsia: Remoo de microrganismos

patognicos ou indesejados;


1) Conceitos
Desinfetante ou germicida:
Antissptico:
Hipoclorito, fenis, glutaraldedo,

dixido de cloro


2) Tipos de agentes contaminantes
Inibitrios:
- Competitivos
- Contaminante libera substncias inibitrias
Deletrio
Levam a destruio do produto
Dificultam a separao e reduzem a pureza do produto


3) Forma de atuao dos agentes esterilizantes


Calor mido: desnaturao irreversvel das protenas (essenciais para

sobrevivncia e multiplicao celular);
- Funo da hidratao da clula


Calor seco: oxidao dos constituintes qumicos;

- Mais lenta e menos eficaz;
- Nvel de hidratao tende a diminuir: proteo s protenas;
- Pode ocorrer tambm coagulao de protenas;
Radiaes: ionizante e no ionizante

- Alvo principal: DNA;


Radiao ionizante e no ionizante;

- Radiaes: alfa, beta, gama; raios X; raios catdicos, etc;
- Excitao de grupos qumicos: produo de radicais qumicos
altamente reativos quebra de fita de DNA: mutaes;


Radiao ionizante e no ionizante;



Radiao ionizante;

Esterilizao
de
Equipamentos
e
Meios
Irradiao por luz ultravioleta

- UV absorvida pelos cidos nucleicos: leses
- 220 a 330 nm: regio abitica;
- Ao esterilizante :
produo de ligaes cruzadas
entre pirimidinas adjacentes na
mesma fita de DNA, formando
dmeros.
Fatores que influenciam: pH, estado

fisiolgico, constituio gentica.

Esterilizao
de
Equipamentos
e
Meios
Irradiao por luz ultravioleta

- UV absorvida pelos cidos nucleicos: leses
- 220 a 330 nm: regio abitica;
- Ao esterilizante :
produo de ligaes cruzadas
entre pirimidinas adjacentes na
mesma fita de DNA, formando
dmeros.
Fatores que influenciam: pH, estado

fisiolgico, constituio gentica.


Agentes qumicos


Agentes qumicos


Agentes qumicos


Agentes qumicos
clorexidina


Agentes qumicos


Agentes qumicos


Agentes qumicos


Agentes qumicos


Agentes qumicos


Agentes qumicos


Agentes qumicos
- xido de etileno: agente alquilante
- Glutaraldedo: age na superfcie das clulas

interaes glutaraldedo-protena: reao com grupos
amina livres das protenas da camada de
peptideoglicana


4) Tipos de agentes esterilizantes
4.1) Agentes Qumicos
A) Germicidas qumicos
- Agem em temperatura ambiente
- Capacidade sanitizante
Maior tempo de contato
Propriedades fsicas do material
Caractersticas qumicas do ambiente

Tempo X Concentrao
Tipo de microrganismo




- Agem em temperatura ambiente
- Capacidade sanitizante
Maior tempo de contato
Propriedades fsicas do material
Caractersticas qumicas do ambiente

Tempo X Concentrao
Tipo de microrganismo




B) Agentes gasosos
-
No o mtodo de escolha em industrias de fermentao;
Uso: assepsia de salas e laboratrios (vapores de formaldeido);
Agentes gasosos principais:
xido de etileno: esterilizao de artigos plsticos de laboratrio e outros

materiais;
xido de propileno: esterilizao de alimentos;
Vapores de formaldedo e betapropiolactona: desinfeco de cmaras, salas e
ambientes.

4.2) Agentes Fsicos
A) Calor seco
-
No se aplica para equipamentos;
Uso: filtros de ar, vidrarias, metais

e slidos resistentes ao calor;
Em fornos ou estufas (T > 150oC; t > 2 horas);
Ausncia de umidade
transferncia
de calor lenta
maior tempo

maior probabilidade
de formar esporos

4.2) Agentes Fsicos
B) Calor mido
B.1) Presso atmosfrica (at 100oC)
- Vapor fluente: 100oC, por 15-30 min
No eficiente para esporos
- Pasteurizao: TML < T < 100oC, por 15-30 min
No elimina todas os tipos de clulas;
Alternativa: UHT - leite
Temperatura Mnima Letal (TML): a menor temperatura na qual observa-se o
incio da destruio do microrganismo por morte, atravs da ao do calor. A
TML caracterstica do microrganismo e do meio

4.2) Agentes Fsicos
B) Calor mido
- Vapor fluente: 100oC, por 15-30 min


4.2) Agentes Fsicos
B) Calor mido
- Pasteurizao:


4.2) Agentes Fsicos
B) Calor mido
- Tintalizao: TML < Te < 100oC, por 15-30 min 3 vezes consecutivas
Elimina esporos
Temperatura Mnima Letal (TML): a menor temperatura na qual observa-se o

incio da destruio do microrganismo por morte, atravs da ao do calor. A
TML caracterstica do microrganismo e do meio

4.2) Agentes Fsicos
B) Calor mido
B.2) Vapor saturado sob presso (T > 100oC)
- Usualmente 121oC (1 atm) por 20 min


4.2) Agentes Fsicos
B) Calor mido
B.2) Vapor saturado sob presso (T > 100oC)
- Indicadores:


4.2) Agentes Fsicos
C) Radiao
C.1) Radiao no ionizante: Ultravioleta
- Usos: esterilizar materiais slidos (vidrarias, utenslios metlicos, embalagens)
e cmara de fluxo laminar;
- No pode ser usado na presena de pessoas;
- Exposio do material pelo tempo adequado;
- Capacidade de penetrao baixa: superfcie e ar ao redor so esterilizados;


4.2) Agentes Fsicos
C) Radiao
C.1) Radiao no ionizante: Ultravioleta
- Usos: esterilizar materiais slidos (vidrarias, utenslios metlicos, embalagens)
e cmara de fluxo laminar;
- No pode ser usado na presena de pessoas;
- Exposio do material pelo tempo adequado;
- Capacidade de penetrao baixa: superfcie e ar ao redor so esterilizados;
C.2) Radiao ionizante: raios alfa, beta, gama, raios X
- Feito em cmaras especiais;
- Material colocado em uma esteira que circula no interior da cmara de
irradiao;
- Usos: esterilizao de vidrarias, metais, alimentos, etc.

4.2) Agentes Fsicos
C) Radiao
C.2) Radiao ionizante: raios alfa, beta, gama, raios X
- Feito em cmaras especiais;
- Material colocado em uma esteira
que circula no interior da cmara de
irradiao;
- Usos: esterilizao de vidrarias,
metais, alimentos, etc.


4.2) Agentes Fsicos
D) Filtrao
Materiais filtragens empregados:
- telas de asbesto filtro Seitz
- terras de diatomceas filtro
Berkefeld
- porcelana filtro Chamberland
- steres inertes de celulose
filtro Millipore
- fibras de vidro, discos de vidro,
etc.


4.2) Agentes Fsicos
D) Filtrao


5) Modos de Esterilizao do Meio e do Equipamento
5.1) Esterilizao do fermentador e do meio separadamente
Esteriliza-se o fermentador por radiao, calor mido ou mtodo qumico;
- Calor mido
Vlvula aberta
Injeo de vapor
direta
Vlvula fechada
Injeo de vapor
direta at P=1 atm
Vlvula fechada
testerilizao a P=1
atm
Entrada de ar estril
Resfriamento
5.2) Esterilizao do fermentador e do meio conjuntamente
Meio de
cultura estril

-
Modo Descontnuo
A) Aquecimento
B) Resfriamento
Meio
concentrado
Agitao do meio necessria!

-
Modo Descontnuo
Fases do modo descontnuo:

a) Aquecimento
b) Esterilizao
c) Resfriamento
Vantagem: evita perigo de

contaminao
Desvantagens:
- T alta por longo perodo;
- Consumo de vapor elevado;
- Tempo morto;
- Corroso (meio em contato com o reator);
qe

-
Modo Contnuo
1o) Colocar em funcionamento
Vapor a 1 atm em todo o
sistema; seguido por ar estril no
fermentador
2) A esterilizao do meio

-
Modo Contnuo
qe
Esquema de representao da variao da temperatura com o tempo

Vantagens do modo contnuo
Tempo em temperatura alta reduzido;
Vazo promove agitao;
Evita primeira etapa de cozimento de matrias-primas amilceas;
Dimenses pequenas: tubo pode ser constitudo de ligas metlicas
especiais;
Economia de vapor e de gua de resfriamento;
q
qe
qe
q
q

6) Cintica de destruio trmica de micro-organismos
A velocidade de destruio pelo calor mido de microrganismos presentes
em um dado meio, depende de vrios fatores, a saber:
a) do microrganismo (gnero, espcie, linhagens, idade da cultura,
existncia ou no de esporos);
b) do meio (composio, pH, presena de slidos em suspenso);
c) da temperatura;

6) Cintica de destruio trmica de microrganismos
6.1) Cintica de destruio
Representao de um experimento com um microrganismo em um dado

meio submetido a uma temperatura constante.

Destruio do microrganismo: reao de primeira ordem
dN
k N
d
N: nmero de microrganismos vivos existentes no meio aps um tempo q
k: constante de velocidade de destruio trmica do microrganismo (min-1);
k depende de: tipo de microrganismo, meio de cultivo e da temperatura

Ln(N)
Se a Temperatura constante:
ln N ln N 0 k
k
log N log N 0
2,3
No: nmero de microrganismos vivos existentes no meio antes da

esterilizao
N: nmero de microrganismos vivos existentes no meio aps um tempo q
k: constante de velocidade de destruio trmica do microrganismo (min-1);

Se a Temperatura constante:
ln N ln N 0 k
k
log N log N 0
2,3
Para 105C
Para 121C k 3 min-1

6.2) Tempo de reduo decimal
Tempo de reduo decimal (D): Tempo necessrio para reduzir o

nmero de microrganismos a 1/10 do valor original
2,303
D
k

6.3) Dependncia de k com a temperatura
Segundo a Equao de Arrhenius

E
k A exp
RT
A: constante emprica;
R: constante universal dos gases
T: temperatura absoluta
E: energia aparente de ativao de destruio do mo (kcal/mol).
Para muitos microrganismos E esta em torno de 65 a 85 Kcal/mol.

6.3) Dependncia de k com a temperatura
Segundo a Equao de Arrhenius

E
k A exp
RT

6.4) Destruio dos nutrientes do meio como consequncia da esterilizao
Reaes indesejveis
Quanto maior Te, menor a destruio de nutrientes
E
k A exp
RT
Kcal/mol
Microrganismos 65-85
Composto
Vitamina A
cido flico
Vitamina C
Kcal/mol
14,6
16,8
23,1

6.4) Destruio dos nutrientes do meio como consequncia da esterilizao
No: nmero de mos viveis inicial;
Nf: nmero de mos aps a esterilizao;
1: tempo para reduzir o no. de mos de No para Nf na temperatura T1;
2: tempo para reduzir o no de mos de No para Nf na temperatura T2>T1;
k1: constante de velocidade de destruio de mos temperatura T1;
k2: constante de velocidade de destruio de mos temperatura T2;
Emo: energia de ativao de destruio dos mos;
S0: concentrao inicial do nutriente;
S1: concentrao final do nutriente aps o tratamento em T1;
S2: concentrao final do nutriente aps o tratamento em T2;
kS1: constante de velocidade de destruio de nutrientes temperatura T1;
kS2: constante de velocidade de destruio de nutrientes temperatura T2;
ES: Energia de ativao de destruio dos nutrientes < Emo;
Exerccio: Prove que S2 > S1

6.5) Consideraes sobre o clculo do tempo de esterilizao
1 N0
ln
k N
T constante
1) Meios de fermentao no possuem apenas uma espcie de

microrganismo a ser destruda. Bacillus stearothermophilus esporulado
2) Escolhe-se o microrganismo de referncia. k depende do meio e da
temperatura.
K = 1 min-1 (a 121C) e E = 75 Kcal/mol

6.5) Consideraes sobre o clculo do tempo de esterilizao
1 N0
ln
k N
T constante
3) Definio de esterilizao - Ln (N0/0) ?

Probabilidade de falha (P):
Et = nmero total de operaes de esterilizao realizadas nas mesmas condies;
Ef = numero de operaes de esterilizao que falharam, ou seja, no conduziram
a um meio estril.
P = Ef/Et; multiplicando-se por 100, tem-se em percentagem;
Grau de esterilidade = N0/N
Calcular o grau de esterilidade (No/N) para a uma esterilizao
descontnua, com eficincia h = 99,9999999999%

6.6) Clculo do tempo de esterilizao Processo descontnuo
Para calcular qe:
Representao de T x q
dN
k N
d
1 N0 A R
e ln
ke p
ke

Para calcular qe:
1)
2)
3)
4)
5)
6)
1 N0 A R
e ln
ke p
ke
Grau de esterilidade ou probabilidade de falha;

Nmero de clulas vivas no meio (N0)
Temperatura mnima letal;
Temperatura de esterilizao;
Curvas de aquecimento e resfriamento;
Curva de destruio trmica;
Como resolver
k d

Para calcular qe: e
1)
2)
3)
4)
5)
6)
1 N0 A R
ln
k e p
ke
Grau de esterilidade ou probabilidade de falha;

Nmero de clulas vivas no meio (N0)
Temperatura mnima letal;
Temperatura de esterilizao;
Curvas de aquecimento e resfriamento;
Curva de destruio trmica;

Tipo de transf. de
calor
Vapor direto
Perfil Temperatura - tempo
Parmetros
T T0 1, 0
1 b
(Hiperblico)
Aquecimento
eltrico
Aquecimento
indireto com vapor
Resfriamento
indireto
hs
s
,b
MT0Cp
M
T T0 1, 0 a
(linear)
T TN 1 b exp(a)
(exponencial)
T Te0 1 b exp(a)
(exponencial)
h = Entalpia do vapor, relativa a temperatura do

meio a esterilizar (kcal/kg);
s = Vazo mssica de vapor (kg/s, kg/min, kg/h);
M = Massa inicial de meio (kg);
T0 = Temperatura inicial (k);
q = Taxa de transferncia de calor (kcal/s);
U = coeficiente de transferncia de calor
global (kcal/(m2.h.oC));
wc
MC p
q
MT0Cp
T TN
UA
,b 0
Mc
TN
T0 Te0
UA
1
exp
,
b
Te0
wc
A = rea de transferncia de calor (m2);

TN = Temperatura da fonte de aquecimento (k);
w = Vazo mssica do fluido refrigerante (kg/s, kg/min, kg/h);
c= calor especfico do fluido refrigerante (kcal/(kg.oC));
c = calor especfico do meio (kcal/(kg.oC));
Te0 = Temperatura de entrada do fluido refrigerante (k);
r = densidade do meio;
Cp = capacidade calorfica do meio.

Como resolver
k d
Resoluo analtica
Resoluo numrica
Valores de (em A e R),

obtm-se T;
Pela relao k=f(T), obtm-se k;
Obtm-se k=g()
Resolve a integrao

Como resolver
k d
Resoluo analtica
Resoluo numrica
Valores de (em A e R),

obtm-se T;
Pela relao k=f(T), obtm-se k;
Obtm-se k=g()
Resolve a integrao

Como resolver
-
k d
Resoluo numrica
Resolve a integrao
Regra do Ponto Mdio ou dos retngulos:
f ( x) dx
f ( x)
x2 x1
Regra dos Trapzios:
Regra de Simpson:
h
f ( x)dx f ( x0 ) 4 f ( x1 ) 2 f ( x2 ) 4 f ( x3 ) ... 2 f ( xn 2 ) 4 f ( xn 1 ) f ( xn )
3
x0 a; xn b
h
xn x0
n

6.6) Clculo do tempo de esterilizao Processo contnuo
Para calcular qe:
1) Grau de esterilidade ou probabilidade de falha;
2) Temperatura de esterilizao;
3) Curva de destruio trmica;
1
N0
e ln
ke N

6.6) Clculo do tempo de esterilizao Processo contnuo
Para dimensionar o tubo de espera
Ve: volume de meio para encher o esterilizador
d: dimetro interno do tubo de espera
u = velocidade do meio no tubo de espera
L = comprimento do tubo de espera
m = viscosidade do meio na Te;
= densidade do meio na Te;
F = vazo volumtrica de meio no tubo de espera
d
Re
4 F
d
Re
4 F
d2
L e

14- Trata-se de dimensionar uma esterilizao descontnua de 200 m3 de mosto a 120 C,
efetuada no prprio biorreator, em que o processo fermentativo passar-se- a 25,5 C.
A constante de velocidade de destruio dos esporos do contaminante pelo calor dada pela
equao descrita abaixo, onde R= 1,98 cal/g mol K (constante dos gases perfeitos) e T a
temperatura absoluta em K . K = 7,94 x 1038 exp (-68,7 x 103/RT) (min-1)
A temperatura mnima letal do contaminante (forma esporulada) 100 C, e as tabelas de
aquecimento e resfriamento do mosto do fermentador so as seguintes:
Considerando que o mosto inicial apresenta nvel de contaminao de 2 x 105 esporos /ml e que
somente se admite uma possibilidade de falha no processo de esterilizao em cada 20 dornas
esterilizadas, informe:
1) Qual o tempo de manuteno do mosto a temperatura de esterilizao propriamente dita
(120 C).
2) Se a esterilizao fosse processada em esterilizador contnuo a 120C e com as mesmas
exigncias de esterilidade, qual seria o comprimento da seo de espera (Dimetro= 10 in),
para assegurar uma vazo de 50 m3/h de mosto esterilizado? (Suponha no haver
condensao de vapores no ejetor)

14- Trata-se de dimensionar uma esterilizao descontnua de 200 m3 de mosto a 120 C, efetuada no prprio biorreator, em que o
processo fermentativo passar-se- a 25,5 C.
A constante de velocidade de destruio dos esporos do contaminante pelo calor dada pela equao descrita abaixo, onde R=
1,98 cal/g mol K (constante dos gases perfeitos) e T a temperatura absoluta em K .
K = 7,94 x 1038 exp (-68,7 x 103/RT)
(min-1)
A temperatura mnima letal do contaminante (forma esporulada) 100 C, e as tabelas de aquecimento e resfriamento do mosto do
fermentador so as seguintes:
AQUECIMENTO
RESFRIAMENTO
Tempo (min)
Temperatura
(C)
Tempo (min)
Temperatura
(C)
80
100
120
81
102
118
82
103
116
83
105
114
84
106
112
85
108
109
86
109
106
87
111
104
88
112
102
89
113
101
90
115
10
100
91
116
20
77
92
118
45
40
92,5
120
60
25,5
Considerando que o mosto inicial apresenta nvel

de contaminao de 2 x 105 esporos /ml e que
somente se admite uma possibilidade de falha no
processo de esterilizao em cada 20 dornas
esterilizadas, informe:
1) Qual o tempo de manuteno do mosto a
temperatura de esterilizao propriamente dita
(120 C).
2) Se a esterilizao fosse processada em
esterilizador contnuo a 120C e com as mesmas
exigncias de esterilidade, qual seria o
comprimento da seo de espera (Dimetro= 10
in), para assegurar uma vazo de 50 m3/h de
mosto esterilizado? (Suponha no haver
condensao de vapores no ejetor)

AQUECIMENTO
RESFRIAMENTO
Tempo (min)
Temperatura (C)
K(min-1)
Tempo (min)
Temperatura (C)
K(min-1)
80
100
0,0317
120
3,6109
81
102
0,0521
118
2,2987
82
103
0,0667
116
1,4566
83
105
0,1087
114
0,9187
84
106
0,1384
112
0,5766
85
108
0,2239
109
0,2841
86
109
0,2841
106
0,1384
87
111
0,4560
104
0,0852
88
112
0,5766
102
0,0521
89
113
0,7282
101
0,0407
90
115
1,1575
10
100
0,0317
91
116
1,4566
20
77
92
118
2,2987
45
40
92,5
120
3,6109
60
25,5

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Irradiao por luz ultravioleta

Fatores que influenciam: pH, estado

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