Agronomía Trop. 56(4): 601-606.

2006

ESTABLECIMIENTO DE UN PROTOCOLO RAPDs
EFICIENTE PARA PLANTAS DE ÑAME
Maira Oropeza C.*, Erick A. Marilyn R.*
y Teresa Edith Vargas C.*

RESUMEN
Dada la importancia del cultivo de ñame, Dioscorea alata en Venezuela y el resto del
mundo, en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Central de Venezuela se logró establecer sistemas de regeneración in vitro para esta especie vía
Organogénesis y Micropropagación. Basado en la posibilidad de evaluar la variabilidad
genética de estas plantas, en el trabajo se estableció un protocolo de Amplificación al
Azar del ADN Polimórfico (RAPDs) para el ADN de plantas de ñame. Esta investigación
constó de 4 pasos: 1) Extracción del ADN: se realizó con el protocolo propuesto por
Doyle y Doyle (1990), modificado con tratamiento con solución limpiadora: (Etanol
76% en 10 mM (NH4COOH)) y precipitación de oligosacáridos con Acetato de Amonio
(NH4COOH) 7,5 M; 2) Evaluación del ADN extraído: se realizó mediante el uso de un
espectrofotómetro según el protocolo planteado por Sambrook et al. en 1989; 3) Amplificación vía RAPDs del ADN extraído: según el protocolo planteado por Ramser et al.
en 1997; 4) Comprobación de la amplificación del ADN extraído: en gel de agarosa
1,8%. Con las modificaciones aquí señaladas se logró obtener un protocolo adecuado de
extracción y amplificación del ADN de D. alata.

Palabras Clave: ADN; Dioscorea alata; RAPDs.

*

Profesores. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Ciencias. Instituto de
Biología Experimental. Centro de Botánica Tropical. Laboratorio de Biotecnología
Vegetal. Apartado 47114. Caracas 1041A, Venezuela.
RECIBIDO: febrero 20, 2006.

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Vol. 56-2006

AGRONOMÍA TROPICAL

Nº 4

ESTABLISHMENT OF AN EFFICIENT RAPD
PROTOCOL FOR YAM PLANTS
Maira Oropeza C.*, Erick A. Marilyn R.*
y Teresa Edith Vargas C.*

SUMMARY
Because of the importance of yam, Dioscorea alata plants in Venezuela
and the world, in the Plant Biotechnology Laboratory at the Universidad
Central de Venezuela, in vitro culture systems via organogenesis and
micropropagation for this plant species were established. Based on the
possibility of evaluating genetic variability in regenerated plants, a protocol
of Random Amplification Polymorphic DNA (RAPD) for yam plants was
developed. This research was made up of four steps: 1) DNA extraction
following Doyle and Doyle (1990) protocol modified with a cleaning
treatment with 76% Ethanol in 10 mM NH4COOH and oligosaccharides
precipitation with 7,5 M NH4COOH; 2) Spectrophotometric evaluation of
extracted DNA according to Sambrook et al. (1989); 3) RAPD amplification
of extracted DNA following the protocol established by Ramser et al. (1997)
and 4) Verification of the amplification of extracted DNA using 1,8% agarose
gel. Good quality D. alata DNA extracts and efficient DNA random
amplifications were obtained using the modifications incorporated in our
protocol.
Key Words: AND; Dioscorea alata; RAPDs.

*

Profesores. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Ciencias. Instituto de
Biología Experimental. Centro de Botánica Tropical. Laboratorio de Biotecnología
Vegetal. Apartado 47114. Caracas 1041A, Venezuela.
RECIBIDO: febrero 20, 2006.

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OROPEZA et al. - Protocolo RAPDs para ñame

INTRODUCCIÓN
El ñame, Dioscorea alata L, nativo de regiones cálidas de ambos hemisferios, es una de las especies más importante del género Dioscorea, dado
su gran valor económico, farmacológico y alimenticio, cultivándose a
través de los trópicos y en parte de las regiones sub-tropicales y templadas.
Debido a la gran importancia de este género, Royero (2004), logró establecer sistemas de regeneración in vitro para esta especie.
El cultivo in vitro puede generar alteraciones genéticas que en su conjunto
se denominan Variación Somaclonal (Larking y Scowcroft, 1981), por
lo que se han desarrollado numerosas técnicas para evaluar este fenómeno. La técnica de RAPDs (ADN Polimórfico Amplificado al Azar) es
una de las más eficientes y de mayor empleo para la detección de variaciones genéticas, no sólo de plantas regeneradas in vitro (Oropeza et al.,
1995), sino también en estudios de variaciones genéticas entre variedades
de plantas de la misma especie (Oropeza y García, 1997). En el presente
trabajo, se estableció un protocolo eficiente para la extracción y amplificación del ADN de plantas de ñame.

MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal: Hojas de plantas de Dioscorea alata en condiciones
de vivero (in vivo), y hojas de plantas de Dioscorea alata regeneradas
vía Organogénesis (in vitro). Extracción de ADN: Se realizó según el
método Doyle y Doyle (1990) y se modificó según Weising y Kahl (1997).
Evaluación del ADN extraído: Se realizó mediante el uso de un
espectrofotómetro, y se complementó con la electroforesis en gel de
agarosa 0,8% para evaluar la integridad del ADN extraído, según
Sambrook et al. (1989). Amplificación del ADN extraído vía RAPDs:
Se realizó con primers pertenecientes a la serie OPC de la casa OPERON,
según el protocolo planteado por Ramser et al. (1997), llevándose a cabo
en un volumen final de 25 µl que contenía: Buffer de reacción (1X);
MgCl2 (2 mM); dNTP’s (0,2 mM); Iniciador (primer) (10 pM); ADN de
Dioscorea alata (100 ng µl-1); Taq Polimerasa (0,06 U. por reacción).
Las condiciones de amplificación se fijaron según el protocolo planteado por Ramser et al. (1997). Comprobación de la amplificación: Se
realizó mediante electroforesis en gel de agarosa 1,8%.
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AGRONOMÍA TROPICAL

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Al analizar los resultados de la extracción del ADN de ñame, se encontró
que este estaba contaminado con ARN, por lo que se decidió introducir
la primera modificación al protocolo de extracción, la cual consiste de
un tratamiento con RNAasa “A” (10 mg ml-1) con lo cual se eliminó la
ccontaminación de ARN en las muestras. Luego de esta modificación, al
realizar la electroforesis en gel de agarosa, pudo observarse que todavía
la muestra se quedaba retenida en los bolsillos del gel, hecho este que
ponía en evidencia la presencia de oligosacáridos asociados al ADN extraído, por lo que se realizó la segunda modificación: Un tratamiento
con solución limpiadora de los oligosacáridos: (Etanol 76% en 10 mM
(NH4COOH)) y su posterior precipitación con Acetato de Amonio
(NH4COOH) 7.5 M. La eliminación de estos oligosacáridos fue un paso
sumamente importante, debido a que la presencia de estos no permitiría
la posterior amplificación del ADN al evitar que los primers se unan a
las cadenas del ADN extraído (Figura 1).

M

V

FIGURA 1.

V

O

M

V

O

Evaluación de la integridad del ADN extraído. Izq.: Sin
modificaciones; Der.: Luego de las modificaciones; M:
marcador de peso molecular; DNA: Fago Lambda
EcoR1 + Hind III (Promega); V: ADN de plantas in
vitro; O: ADN de plantas in vitro.
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OROPEZA et al. - Protocolo RAPDs para ñame

Para que un ADN extraído presente suficiente pureza para ser amplificado, debe presentar valores entre 1,8 y 2 en la relación 260/280 al ser
leído en un espectrofotómetro (Sambrook et al., 1989), por lo tanto, luego de las modificaciones, se obtuvo un ADN de ñame apto para ser amplificado. Para evidenciar esto, se realizó la amplificación vía RAPDs
del ADN de plantas de ñame in vivo y de plantas de ñame regeneradas
in vitro vía Organogénesis, y al realizar la electroforesis en gel de agarosa
1,8% claramente se observó una amplificación efectiva (Figura 2), por
lo que se dice que se obtuvo un protocolo eficiente de extracción y amplificación para el ADN de ñame.

M V O

P15
FIGURA 2.

V O

V O

V O

V O

P16

P17

P18

P19

Comprobación de la amplificación vía
RAPDs. M: Marcador de peso molecular;
DNA: Fago Lambda EcoR1 + Hind III
(Promega); V: ADN de plantas in vitro;
O: ADN de plantas in vitro (Organogénesis); P15: Primer 15; P16: Primer 16;
P17: Primer 17; P18: Primer 18. Todos los
primers son de la serie OPC de OPERON.
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BIBLIOGRAFÍA
DOYLE, J. J and J. L. DOYLE 1990. Isolation of plant DNA from freh
tissue. Phytochemical Bull. 19:11-15.
LARKING, P. J and W. R. SCOWCROFT 1981. Somaclonal variation –
a novel source of variability from cell cultures for plant impovement.
Theor. Appl. Genet. 60:197-214.
OROPEZA, M., P. GUEVARA, E. GARCÍA and J. L. RAMÍREZ 1995.
Identification of Sugarcane Saccharum spp. Somaclonal Variants
Resistant to Sugarcane Mosaic Virus, via Randomly Amplified
Polymorphic DNA (RAPD) markers. Plant Mol. Biol. Rep. 13:182-191.
OROPEZA, M. y E. GARCÍA 1997. Utilización de marcadores
moleculares para la identificación de variedades de caña de azúcar.
PHYTON: 61:81-85.
RAMSER, J., K. WEISING, V. CHIKALEKE and G. KAHL 1997.
Increased informativeness of RAPD analysis by detection of
microsatellite motifs. BioTechniques. 23:285-290.
ROYERO, M. 2004. Regeneración in vitro de Dioscorea alta (ñame).
Trabajo Especial de Grado. Caracas. Venezuela. Universidad Central de
Venezuela. Facultad de Ciencias. pp. 82.
SAMBROOK, J., E. F. FRITSCH and T. MANIATIS 1989: Molecular
cloning, a laboratory manual. Sec. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory
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WEISING, K. and G. KAHL. 1997. Hybridization-based microsatellite
fingerprint of plants and fungi. In: Caetano-Anollés G., Gresshoff P. M,
(Ed.). DNA markers. Protocols, applications and overviews. Wiley-VCH,
New York. pp. 27-54.

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