Agronoma Trop. 56(4): 601-606.

2006

ESTABLECIMIENTO DE UN PROTOCOLO RAPDs

EFICIENTE PARA PLANTAS DE AME
Maira Oropeza C.*, Erick A. Marilyn R.*
y Teresa Edith Vargas C.*

RESUMEN
Dada la importancia del cultivo de ame, Dioscorea alata en Venezuela y el resto del
mundo, en el Laboratorio de Biotecnologa Vegetal de la Universidad Central de Venezuela se logr establecer sistemas de regeneracin in vitro para esta especie va
Organognesis y Micropropagacin. Basado en la posibilidad de evaluar la variabilidad
gentica de estas plantas, en el trabajo se estableci un protocolo de Amplificacin al
Azar del ADN Polimrfico (RAPDs) para el ADN de plantas de ame. Esta investigacin
const de 4 pasos: 1) Extraccin del ADN: se realiz con el protocolo propuesto por
Doyle y Doyle (1990), modificado con tratamiento con solucin limpiadora: (Etanol
76% en 10 mM (NH4COOH)) y precipitacin de oligosacridos con Acetato de Amonio
(NH4COOH) 7,5 M; 2) Evaluacin del ADN extrado: se realiz mediante el uso de un
espectrofotmetro segn el protocolo planteado por Sambrook et al. en 1989; 3) Amplificacin va RAPDs del ADN extrado: segn el protocolo planteado por Ramser et al.
en 1997; 4) Comprobacin de la amplificacin del ADN extrado: en gel de agarosa
1,8%. Con las modificaciones aqu sealadas se logr obtener un protocolo adecuado de
extraccin y amplificacin del ADN de D. alata.

Palabras Clave: ADN; Dioscorea alata; RAPDs.

Profesores. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Ciencias. Instituto de

Biologa Experimental. Centro de Botnica Tropical. Laboratorio de Biotecnologa
Vegetal. Apartado 47114. Caracas 1041A, Venezuela.
RECIBIDO: febrero 20, 2006.

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AGRONOMA TROPICAL

N 4

ESTABLISHMENT OF AN EFFICIENT RAPD

PROTOCOL FOR YAM PLANTS
Maira Oropeza C.*, Erick A. Marilyn R.*
y Teresa Edith Vargas C.*

SUMMARY
Because of the importance of yam, Dioscorea alata plants in Venezuela
and the world, in the Plant Biotechnology Laboratory at the Universidad
Central de Venezuela, in vitro culture systems via organogenesis and
micropropagation for this plant species were established. Based on the
possibility of evaluating genetic variability in regenerated plants, a protocol
of Random Amplification Polymorphic DNA (RAPD) for yam plants was
developed. This research was made up of four steps: 1) DNA extraction
following Doyle and Doyle (1990) protocol modified with a cleaning
treatment with 76% Ethanol in 10 mM NH4COOH and oligosaccharides
precipitation with 7,5 M NH4COOH; 2) Spectrophotometric evaluation of
extracted DNA according to Sambrook et al. (1989); 3) RAPD amplification
of extracted DNA following the protocol established by Ramser et al. (1997)
and 4) Verification of the amplification of extracted DNA using 1,8% agarose
gel. Good quality D. alata DNA extracts and efficient DNA random
amplifications were obtained using the modifications incorporated in our
protocol.
Key Words: AND; Dioscorea alata; RAPDs.

Profesores. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Ciencias. Instituto de

Biologa Experimental. Centro de Botnica Tropical. Laboratorio de Biotecnologa
Vegetal. Apartado 47114. Caracas 1041A, Venezuela.
RECIBIDO: febrero 20, 2006.

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OROPEZA et al. - Protocolo RAPDs para ame

INTRODUCCIN
El ame, Dioscorea alata L, nativo de regiones clidas de ambos hemisferios, es una de las especies ms importante del gnero Dioscorea, dado
su gran valor econmico, farmacolgico y alimenticio, cultivndose a
travs de los trpicos y en parte de las regiones sub-tropicales y templadas.
Debido a la gran importancia de este gnero, Royero (2004), logr establecer sistemas de regeneracin in vitro para esta especie.
El cultivo in vitro puede generar alteraciones genticas que en su conjunto
se denominan Variacin Somaclonal (Larking y Scowcroft, 1981), por
lo que se han desarrollado numerosas tcnicas para evaluar este fenmeno. La tcnica de RAPDs (ADN Polimrfico Amplificado al Azar) es
una de las ms eficientes y de mayor empleo para la deteccin de variaciones genticas, no slo de plantas regeneradas in vitro (Oropeza et al.,
1995), sino tambin en estudios de variaciones genticas entre variedades
de plantas de la misma especie (Oropeza y Garca, 1997). En el presente
trabajo, se estableci un protocolo eficiente para la extraccin y amplificacin del ADN de plantas de ame.

MATERIALES Y MTODOS
Material vegetal: Hojas de plantas de Dioscorea alata en condiciones
de vivero (in vivo), y hojas de plantas de Dioscorea alata regeneradas
va Organognesis (in vitro). Extraccin de ADN: Se realiz segn el
mtodo Doyle y Doyle (1990) y se modific segn Weising y Kahl (1997).
Evaluacin del ADN extrado: Se realiz mediante el uso de un
espectrofotmetro, y se complement con la electroforesis en gel de
agarosa 0,8% para evaluar la integridad del ADN extrado, segn
Sambrook et al. (1989). Amplificacin del ADN extrado va RAPDs:
Se realiz con primers pertenecientes a la serie OPC de la casa OPERON,
segn el protocolo planteado por Ramser et al. (1997), llevndose a cabo
en un volumen final de 25 l que contena: Buffer de reaccin (1X);
MgCl2 (2 mM); dNTPs (0,2 mM); Iniciador (primer) (10 pM); ADN de
Dioscorea alata (100 ng l-1); Taq Polimerasa (0,06 U. por reaccin).
Las condiciones de amplificacin se fijaron segn el protocolo planteado por Ramser et al. (1997). Comprobacin de la amplificacin: Se
realiz mediante electroforesis en gel de agarosa 1,8%.
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RESULTADOS Y DISCUSIN
Al analizar los resultados de la extraccin del ADN de ame, se encontr
que este estaba contaminado con ARN, por lo que se decidi introducir
la primera modificacin al protocolo de extraccin, la cual consiste de
un tratamiento con RNAasa A (10 mg ml-1) con lo cual se elimin la
ccontaminacin de ARN en las muestras. Luego de esta modificacin, al
realizar la electroforesis en gel de agarosa, pudo observarse que todava
la muestra se quedaba retenida en los bolsillos del gel, hecho este que
pona en evidencia la presencia de oligosacridos asociados al ADN extrado, por lo que se realiz la segunda modificacin: Un tratamiento
con solucin limpiadora de los oligosacridos: (Etanol 76% en 10 mM
(NH4COOH)) y su posterior precipitacin con Acetato de Amonio
(NH4COOH) 7.5 M. La eliminacin de estos oligosacridos fue un paso
sumamente importante, debido a que la presencia de estos no permitira
la posterior amplificacin del ADN al evitar que los primers se unan a
las cadenas del ADN extrado (Figura 1).

FIGURA 1.

Evaluacin de la integridad del ADN extrado. Izq.: Sin

modificaciones; Der.: Luego de las modificaciones; M:
marcador de peso molecular; DNA: Fago Lambda
EcoR1 + Hind III (Promega); V: ADN de plantas in
vitro; O: ADN de plantas in vitro.
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OROPEZA et al. - Protocolo RAPDs para ame

Para que un ADN extrado presente suficiente pureza para ser amplificado, debe presentar valores entre 1,8 y 2 en la relacin 260/280 al ser
ledo en un espectrofotmetro (Sambrook et al., 1989), por lo tanto, luego de las modificaciones, se obtuvo un ADN de ame apto para ser amplificado. Para evidenciar esto, se realiz la amplificacin va RAPDs
del ADN de plantas de ame in vivo y de plantas de ame regeneradas
in vitro va Organognesis, y al realizar la electroforesis en gel de agarosa
1,8% claramente se observ una amplificacin efectiva (Figura 2), por
lo que se dice que se obtuvo un protocolo eficiente de extraccin y amplificacin para el ADN de ame.

M V O

P15
FIGURA 2.

V O

V O

V O

V O

P16

P17

P18

P19

Comprobacin de la amplificacin va
RAPDs. M: Marcador de peso molecular;
DNA: Fago Lambda EcoR1 + Hind III
(Promega); V: ADN de plantas in vitro;
O: ADN de plantas in vitro (Organognesis); P15: Primer 15; P16: Primer 16;
P17: Primer 17; P18: Primer 18. Todos los
primers son de la serie OPC de OPERON.
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BIBLIOGRAFA
DOYLE, J. J and J. L. DOYLE 1990. Isolation of plant DNA from freh
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