INSTITUTO TECNOLOGICO DE TEHUACAN

INGENIERA BIOQUMICA
INVESTIGACION:

EMISIN ESPECTROSCOPICA
PROFESOR: CRISTALINAS HINOSTROSA JUAN MANUEL

ELABORADO POR: GUZMAN JIMENEZ AURA RUTH

TEHUACAN, PUE., A 1 DE DICIEMBRE DE 2014

INDICE
Introduccin 3
Objetivo.4
Diferentes tipos de cromatografa
Fenmeno5
Vidas de emisin.6
Flourencence instrumentacin.9
Aplicaciones analticas.10
Efectos de solvente13
Disminucin de la fluorecencia...15
Energa de resonancia fluorecente.16
La polarizacin lineal de la fluorecencia17
Fluorecence apliacada a las protenas...24
Fluorecence aplicada a los acidos nucleicos27
Conclusin ..30
Bibliografa ..31

EMISIN ESPECTROSCOPICA
En discutir absorcin, con la excitacin de un molcula desde su estado a un nivel
superior de energa y tener una accin dada no considerable a la posterior destinada
a la excitada molcula. En muchos casos, la continuacin no es muy interesante; la
energa es transferida como calor a los alrededores. Sin embargo, en algunos casos
la luz es emitida por la muestra de cualquiera de los dos como fluorescencia o
fosforescencia. La caracterstica general de emisin y pasar por alto la excepciones
fluorescencia espectroscopia tiene demostrado particularmente en investigar
molculas biolgicas. Trata de ser usado a sonda dinmica con procesos de
electrnicos, visualiza muestras, mide distancias en estructuras biolgicas, y sogue
el progreso de reacciones. Polarizada fluorescencia trata de ser usado para
determinar la relacin constructiva e instrucciones de transicin dipolo, investiga la
forma de estructuras terciarios, y medir el peso molecular de biopolmeros. la
aplicacin de espectroscopia fluorescencia al estudio de solo molculas

OBJETIVO
El objetivo de este trabajo es conocer los diferentes tipos de cromatografa y
electroforesis y as tambin conocer su utilidad de cada uno de ellos. En este trabajo
se describen los principios fsicos en que se basan las tcnicas empleadas para la
separacin de protenas, el sistema empleado en su purificacin y algunos de los
mtodos para la determinacin de sus pesos moleculares.

EL FENOMENO
Fluorescencia es la emisin desde un estado singlet, donde el giro del electrn en la
molcula que son emparejado. Ls molculas en su estado slido electrnico son
interiores, y veremos para la molcula de hidrgeno o un enlace en el orbital
aproximado en figura 11.1. Nosotros recordaremos que para dos electrones el
espacio y vuelta de regiones de la funcin de onda factor en Eq. 8.80. el espacio
parte del estado slido (con los giros denotados por las flechas) en una sola
configuracin, como en la figura 11.1. Es necesario tener una parte antisimtrica, del
estado slido de moles de hidrgeno con NCA. 8.79 y 8.80. tambin cualitativamente
es la electrnicamente exitado singlete, donde el orbital aproxima un electrn que
tiene absorbido luz y ocupa una energa superior al orbital. Son dos opciones para
una excitacin: cualquiera de los dos electrones con vuelta arriba o el electrn con
vuelta abajo trata de ser excitado. El excitado

figura 11.1 Diagramas para el espacio en regiones del estado slido, primer estado
singlet, y primer estado trillizo (tres) para la molcula de hidrgeno. Los signos son
para los espacios con los giros denotado por la direccin de la flechas.
Singlet es la normalizada suma de estas dos posibilidades dando un espacio
simtrico parte de la funcin de onda, como en figura 11.1. la vuelta parte
necesariamente debe ser antisimtrica como la molcula de hidrgeno en NCA. 8.82
y 8.83. Fosforescencia es una emisin desde un estado trillizo excitado. Aunque es
un raro evento y as tiene una bajo intensidad, la excitacin a un trillizo implica
cambios en la tentacin de un giro. Ya son tres posibilidades, y es porque el estado
excitado de un triplete tiene dos de las posibilidades; los dos electrones
desapareados. EI tener ambos de sus giros arriba o ambos giros hacia abajo. Para
el hidrgeno esto hara ser simtrico con vueltas en regiones (l ) a (2) o f3 (1) f3 (2).
No es as en la tercera posibilidad, para un hidrgeno, una vuelta simtrica parte que
es la suma de estados de vueltas emparejado, un (1) f3 (2) + un (2) f3 (1). El
correspondiente espacio parte necesario de ser antisimtrica como ilustra para las
tres posibilidades en figura 11.1, as que la funcin de onda es antisimtrica
5

VIDAS DE EMISION
La siguiente excitacin por absorcin de energa, una molcula pierde energa como
calor por CAS- Cading a travs de la cercanamente espaciados niveles vibrnica de
todos los singletes excitados juntos tomado (interna conversin). la molcula titubea
en la ms bajo de la vibracin al nivel de la primera singlete, porque una gran
cantidad de energa necesario debe ser perdido e ir al estado slido. Durante este
vacilacin, una de las tres cosas sucede: la molcula mayor de fluorescencia y
suelta al estado slido, emitiendo un fotn; el mayor a convertir al trillizo (entre
sistemas cruce); o al mayor ir al estado slido sin emitir un fotn (de transicin no
radiactivo). Si la molcula conserva el triplete, este de nuevo titubea ante cualquiera
de los dos fluorescente y gotas al estado slido, emitiendo un fotn, o sufre una
transicin no radiactiva.
Vidas para todos estos procesos son ilustrado en la figura 11.2 para los varios
estados en la distancia del equilibrio nuclear del estado slido, en custodia con el
principio de Franck-Condon. La absorcin es bastante rpida, toma el tiempo para
una longitud de onda de luz a pasar la molcula, acerca de 10- 15 seg. la molcula
es en su suelo electrnico y vibracin al estado en habitacin la temperatura.
Absorcin mayor es a cualquier vibracin al estado de cualquier singlete- excitado
arbitrariamente es preferido a la tercera vibracin al nivel del segundo singlete. la
prdida de vibracin, energa y transferencia de energa electrnica que trae la
molcula al suelo del nivel vibracin del primer excitado del estado electrnico son
tambin rpidas, con una vida de cerca de 10- 12 seg. La vida de la molcula en la
vibracin al estado slido del primer excitado Glet antes fluorescente es bastante
largo, y cerca de 10- 8 segundo es comparable al tiempo de vida para perder energa
en un no radiactivo de conversin.

FIGURA 11.2 fosforescencia en la equilibrio intermolecular de distancia del estado

fundamental

FIGURA 11.3 la absorcin y emisin espectros de una molcula hipottica.

El primer singlete al primer triplete. Estos tres procesos compite y, la vida para un
tipo de molcula particular uno ms corto de ser la uno que prevalece. Si la energa
radiactiva se pierde es rpida para el tipo de molcula, entonces no hay voluntad de
emisin. Si la molcula emite luz relativamente rpidamente, nosotros observaremos
fluorescencia. La fluorescencia es sensible a dinmica de procesos ocurriendo
durante este excitado estado
de vida. Si la molcula conversa al triplete
relativamente rpidamente, entonces ya est en la posibilidad de visin
fosforescencia. Una vez en el estado triplete, la energa mayo se ha perdido en una
manera
no radiactiva o los moles emiten un fotn, dependiendo en los
correspondientes estados de vida. Emisin entre s mismo es rpido como absorcin,
acerca de 10- 15 seg.
Figura 11.3 ilustra absorcin y emisin espectros en la misma grfica para una
molcula hipottica. Bandas absorcin Electrnico son se muestra que corresponde
a cuatro transiciones en el espectro singlete. La absorcin es improbable, y tal banda
tener muy poca intensidad. La emisin fluorescencia en ms longitud de onda de la
absorcin singlete, pero ya est es una leve superposicin de la banda fluorescencia
con la banda correspondiente al primer singlete. El primer trillizo es en general en
energa inferior del primer singlete, y la correspondiente emisin de fosforescencia
se muestra en una incluso con ms longitud de onda. Aunque fluorescencia es una
tcnica comn espectroscpica para estudiar molculas biolgicas, su fosforescencia
es raramente investigada.
ESPECTROSCOPIA FLOURESCENCIA
En orden a entender la aplicacin de
fluorescencia
espectroscopia
a
resolucin biolgica, los propsitos del
proceso siempre toma lugar desde el
suelo de vibracin al nivel del primer
singlete excitado. Una vez cada la
fluorescencia en ms longitud de onda
del primer singlete de absorcin pero
con un pequeo superposicin entre la
bandas.
Como
figura
11.4
espectculos, absorcin a la

figura 11.4 (a) la suelo y primero

camiseta electrnico estados de un
enlace con la vibracin al los niveles. la
flechas denotar la ms probable

absorcin y fluorescencia. (b) la vibrnica bandas para la correspondiente absorcin

(00 ' -08 ') y fluorescencia (00 ' -60 ') son tambin se ilustra.
Primer singlete es desde la ms baja vibracin al nivel (cuntica nmero 0) de la
suelo estado a cualquier vibracin al nivel del estado excitado. La ms baja posible
energa de absorcin voluntad ser a la suelo vibracin al nivel (cuntica nmero 0 ')
de la primero excitado singlete. Excitacin a superior vibracin al nivel de lo primero
emocionado camiseta exigir ms energa y ocurrir en ms corto longitud de onda.
fluorescencia desde la suelo vibracin al nivel de la primero emocionado camiseta
mayo ser a cualquier vibracin al nivel de la suelo electrnico estado, pero en Por el
contrario, fluorescencia a la suelo vibracin al nivel de la suelo electrnico estado
emite la ms energa. fluorescencia a cualquier otro vibracin al nivel voluntad
involucrar menos energa y ocurrir en un ms longitud de onda. as la fluorescencia
ciencia banda es siempre en ms longitud de onda de absorcin a la primero
emocionado pecado Glet. la superposicin entre la bandas ocurre porque ambos
procesos tener la 0-0 '
Banda en comn; la ms bajo en energa de absorcin es la mismo como la ms alto
energa de fluorescencia. Nosotros voluntad ver fluorescencia si este emisin
proceso tiene un vida que es ms corto de la conversin a la trillizo o no radiactivo
prdida de energa. este voluntad ser conexo a la Einstein coeficiente para inducido
emisin B y espontneo emisin la como discutido en Seccin 8.4. para electrnico
transiciones, la probabilidad de inducido emisin voluntad ser pequeo comparado a
la probabilidad para espontneo emisin, que en vez es conexo a la probabilidad
para inducido emisin por Eq. 8.98. en efecto, la capacidad para espontneo emisin
es conexo a la integrado intensidad de una absorcin banda por Eq. 8.102, as que la
ms fuerte la absorcin de la primero camiseta, la superior la probabilidad para
fluorescencia. si la primero camiseta es un fuerte 1T1T * transicin, como ella es
para la lado cadenas de tirosina y triptfano amino cidos, entonces la vida para
espontneo emisin es acerca de 10- 9 segundo y nosotros voluntad ver
fluorescencia. en la otro mano, si la primero emocionado camiseta es un dbil sr *
transicin, entonces la correspondiente ing vida voluntad ser acerca de 10- 6
segundo y nosotros voluntad no ver espontneo fluorescencia BE- causa algunos
otro proceso voluntad ser ms rpido. Fluorescente molculas son a menudo referido
como Los fluorforos.

11.4 FLUORESCENCE INSTRUMENTACIN

Fluorescente luz es emitida desde muestras en una emocionado electrnico estado.

fluorescencia cencia instrumentos uso luz a excitar la muestra y observar la
fluorescencia en derecho ngulos (Figura 11.5). la monocromador antes la muestra
elige la

figura11.5
diagrama de un
simple
fluorescencia
instrumentacin
longitud de onda
de
emocionante
luz,
y
un
monocromador
despus
la
muestra
exploraciones la vario longitudes de onda de emitida luz. la forma de la fluorescencia
espectro como escaneada por la emisin monocromador voluntad ser independiente
de la longitud de onda de absorcin porque emocionado molculas decaimiento a la
suelo vibracional nivel de la primero camiseta antes fluorescente. la absorcin y
fluorescencia espectros ploterted en figura 11.3 son obtenido de forma
independiente. Ya Est es un fluorescencia espectro para cada absorcin longitud de
onda; la absorcin lata ser escaneada mientras observacin fluorescencia en
algunos longitud de onda.

11.5 APLICACIONES ANALTICAS

La intensidad de fluorescencia F es til para los bioqumicos en la observacin de la
presencia de una macromolcula. Por ejemplo, los biopolmeros que salen de un
cromatgrafo de lquidos de alta presin (HPLC) pueden ser controlados con un
detector de fluorescencia.
Melitina tiene un residuo de triptfano que se puede excitar a 280 nm a fluorescencia
en un intervalo de longitudes de onda que incluyen 340 nm. Dos pptidos se eluyen
de la HPLC que tienen 340 nm de fluorescencia, de una en 5,9 min y una en 11,7
min. La fraccin en 11,7 min tiene actividad melitina (hemlisis de los glbulos rojos).
Control de la elucin con absorbancia normal de UV a 214 nm (Figura 11.6b) revela
una serie de otras fracciones que contienen molculas biolgicas, pero stos no
tienen que ser considerados porque no son fluorescentes. Mediante el uso de la
fluorescencia para el anlisis, se simplifica la identificacin de la fraccin apropiada.
Consideremos otro ejemplo, en el que se utiliza la fluorescencia para detectar la
protena calmodulina y un derivado de calmodulina con sus dos tirosinas en las
posiciones 99 y 138 fotoqumicamente reticulados a travs de la irradiacin
prolongada con luz UV. Cuando se excita a 280 nm, las tirosinas en calmodulina
nativas tienen una gran fluorescencia a 300 nm, mientras que el derivado de
dityrosine tiene una gran fluorescencia a 400 nm.
10

La figura 11.7 muestra el perfil de elucin de una mezcla que contiene tanto la
calmodulina nativo y reticulado ejecuta a travs de una columna de afinidad-fenil
agarosa que ha sido equilibrada con un tampn que contiene 1 mM CaCl2
deteccin de fluorescencia a 400 nm muestra que el derivado de dityrosine eluye
alrededor de la fraccin 85, mientras que la calmodulina nativo eluye junto con el
dmero reticulado alrededor de la fraccin 124, pero slo en la subsiguiente
aplicacin de EDTA 2 mM para eliminar el calcio unido. Un contaminante que emite
fluorescencia a tanto 300 y 400 nm eluye fraccin alrededor de 38.
Protenas verde fluorescente (GFP) son sondas muy tiles. La mejor caracterizada
es de una medusa del Pacfico Noroeste, Aequorea victoria, y tiene 238 aminocidos
que envuelven todo el mineral de ph fluoro verde fluorescente. La GFP es a menudo
unida a otra protena utilizando tcnicas genticas. El cdigo de ADN para GFP se
empalma al lado del cdigo para la protena diana, y el cdigo de ADN para ambas
protenas se expresa como una secuencia de cido amino larga sola. Las dos
protenas de esta secuencia de fusin normalmente se pliegan de manera
independiente, y las protenas generalmente conservan su funcin y se comportan de
forma independiente. Como ejemplo, Greenwood y colaboradores (2003) fusionado
con GFP actinina para visualizar la inhibicin de un phosphoinositide-actinina
actividad. a-Actinin causa actina en las clulas para empaquetar y de adherirse a la
membrana celular, que es necesaria para la actina para funcionar como parte de la
estructura interna de la clula. Controla un fosfoinositida-actinina actividad, y en las
clulas normales, la GFP a travs de su fluorescencia permite la visualizacin de
paquetes normales de actina. Sin embargo, cuando la A-actinina se ha mutado de
manera que ya no se une phosphoinositide, visualizacin GFP muestra fuera
ofcontrol agrupacin enredado en las clulas, ya que no hay control de
phosphoinoside.

11

EFECTOS DE SOLVENTES
Fluorescencia cae en longitudes de onda ms largas que la primera absorcin
singlete debido a los niveles de vibracin. Adems, los efectos del solvente afectarn
12

a la posicin de la banda de fluorescencia. Los efectos de un disolvente en la

fluorescencia pueden ser muy grandes, y muchos estudios de macromolculas
utilizan este hecho. Efectos generales de disolventes dependen de la capacidad Ariz
pol del disolvente, y el aumento de la constante dielctrica por lo general desplaza la
fluorescencia para la longitud de onda ms larga. Los efectos del solvente
especficos son el resultado de la reaccin qumica del estado excitado con el
disolvente. Reacciones qumicas importantes incluyen enlaces de hidrgeno, la
qumica cido-base, y la formacin de complejos de transferencia de carga en un
electrn en el fluorforo se transfiere a otro grupo de excitacin.
La fluorescencia detectada (400 nm) perfil
de elucin de una mezcla que contiene
calmodulina tanto nativos como derivado
que emerge de una columna de fenil
agarosa. El derivado dityrosine eluye
alrededor fraccin 85, mientras que la
calmodulina nativa y un elute dmero
reticulado alrededor fraccin 124. Un
contaminante no identificado alrededor
eluye fraccin 38.

Vamos a considerar los efectos del solvente especficas primero

Ellos a menudo acompaan a los efectos del solvente generales, ya que los
solventes con un gran polarizabilidad suelen ser capaces de enlaces de hidrgeno.
Efectos disolvente especfico se producen cuando el disolvente reacciona
qumicamente con el fluorforo, por lo que slo una pequea concentracin del
disolvente reaccionar qumicamente es necesario traer el efecto a la terminacin.
Adems, las nuevas especies a menudo tiene una nueva banda fluorescente
caracterstico. Un ejemplo es la reaccin de enlace de hidrgeno de 2anilinonaftaleno (2-AN) con etanol. La figura 11.8 muestra que pequeas cantidades
de etanol aaden a una mayor disolvente ciclohexano dar lugar a una nueva banda
fluorescente a aproximadamente 400 nm, que es presumiblemente debido a la
compleja con enlaces de hidrgeno 2-anilinonaphthaleneethanol.
Efectos generales de disolventes implican la interaccin del momento dipolar
permanente de la molcula, tanto en el suelo y estados excitados con el campo
reactiva inducida en el disolvente circundante. El campo reactivo tiene dos partes, la
reaccin inmediata de los electrones de las molculas de disolvente y la reaccin
ms lenta reorientacin de las molculas de disolvente en su conjunto debido a su
propio momento dipolar permanente. Vemos este efecto de 2-AN en la figura 11.9.
Etanol a 3% satura el efecto disolvente especfico y crea una nueva banda para la
13

especie 2-AN con enlaces de hidrgeno a aproximadamente 400 nm. El gran

momento dipolar permanente de agua con respecto a la mezcla de ciclohexanoetanol cambia la fluorescencia de la especie con enlaces de hidrgeno a
aproximadamente 448 nm debido a los efectos de disolventes generales.
La ecuacin Lippert predice el cambio de energa para los efectos del solvente
generales suponiendo que la reorientacin disolvente alcanza el equilibrio antes de la
emisin. Se trata de una primera aproximacin que considera la fluorescencia en un
continuo disolvente con un ndice de refraccin n y una constante dielctrica e que es
adimensional y con respecto to o D=4 o . Consideremos la figura 11.10. Un
fluorforo en su estado fundamental tendr un momento
Re

y ver un electrn reactivo al campo

Rr

dipolar permanente

y una reorientacin. Inmediatamente

15

despus de la excitacin a la primera singlete ( acerca de 10

tendr un nuevo (normalmente mayor) momento dipolar
Rr

sec

el fluorforo

y ver un nuevo electrn

campo reactivo.

Estos campos reactivos dependen del momento dipolar del fluorforo y la

polarizabilidad de la P. El disolvente de alta frecuencia o polarizabilidad de electrones
es una funcin de la ndice de refraccin n.

2
n 1
(
)
P n= 2
2n +1

Los campos de reaccin electrnicos y la

reorientacin de un disolvente tienen un efecto
general sobre la energa de un dipolo.
La polarizabilidad de baja frecuencia, que
incluye reorientacin dipolo molecular, as
como la polarizabilidad de electrones, es una
funcin de la constante dielctrica relativa.

La capacidad Ariz pol debido a la reorientacin dipolo es la diferencia entre las

ecuaciones.
Los campos reactivos son entonces dadas por:
14

DISMINUCIN DE LA FLUORESCENCIA
Excitacin decae por un proceso de primer orden, que puede ser utilizado para
relacionar vidas a la probabilidad. Como esperamos para una descomposicin de
primer orden, el nmero de molculas de perder un quantum de energa en el tiempo
dt ser proporcional al nmero de molculas de N en el estado excitado. Esta
relacin est dada por

El rendimiento de fluorescencia f depender de la concentracin del fluorforo, la

forma del espectro de fluorescencia, y la longitud de onda elegida para la
observacin, as como los parmetros instrumentales. En contraste con la
absorbancia normal, que es una relacin de intensidades, log (Io / I), la interpretacin
cuantitativa del rendimiento de fluorescencia requiere un estndar absoluto. A
menudo, los fluorforos se compararon mediante la relacin de sus rendimientos de
fluorescencia, este rendimiento de fluorescencia relativa depender de la longitud de
onda elegida para la observacin a causa de las formas de los espectros de
fluorescencia.
ENERGA DE RESONANCIA FLUORESCENTE
En nuestro anlisis de fluorescencia hasta el momento, hemos asumido que el
fluorforo que emite la radiacin es el mismo grupo que el absorbedor. Esto no tiene
por qu ser el caso; bajo circunstancias favorables, la energa de excitacin puede
ser transferida de un fluorforo a otra. Esta transferencia de energa de resonancia
de fluorescencia es uno de los mecanismos de enfriamiento ms tiles en la
fluorescencia experimental. Los requisitos son (1) la interaccin dipolo de transicin
entre los dos fluorforos, y (2) un solapamiento apreciable del espectro de
15

fluorescencia del donante con el espectro de absorcin del aceptor. El requisito de la

interaccin dipolo-dipolo entre los fluorforos conduce a una fuerte dependencia de
la transferencia de energa de la distancia entre los grupos participantes. La
eficiencia de la transferencia est dada por:
r / R0
1+

1
eficiencia=

La eficiencia de la transferencia de energa cambia

rpidamente con la distancia entre el donante y aceptor.

LA POLARIZACIN LINEAL DE LA FLUORESCENCIA

Si la luz usada para excitar la fluorescencia est polarizada linealmente, la absorcin
ser ms probable para aquellas molculas que pasan a estar con su dipolos de
transicin paralelo al plano de la polarizacin, como recordamos partir de la Ec.
8.114. La polarizacin de la luz emitida, sin embargo, depender de un nmero de
factores, incluyendo (1) la orientacin del dipolo de transicin emisor en relacin con
el dipolo de transicin absorbente, y (2) la cantidad de rotacin molecular que tiene
lugar durante la fluorescencia vida. En general, la luz fluorescente ser parcialmente
despolarizada.

16

La luz de excitacin se
enva en lo largo del eje x
con el vector elctrico a lo
largo del eje z. Una
molcula hipottica est en
el origen de la sistema de
coordenadas cartesianas y
tiene su dipolo de transicin
para la absorcin en un
ngulo () con respecto al eje
z. El ngulo entre el dipolo
de transicin absorbente y
el dipolo de transicin
emisor de la molcula es y.
La fluorescencia emitida se
observa a lo largo del eje y en ngulo recto a la muestra, y un polarizador lineal se
utiliza para separar la intensidad de los vectores elctricos paralelos y
perpendiculares al vector elctrico de la luz de excitacin (eje z). La despolarizacin
se describe en trminos de aquantity llamado la anisotropa de fluorescencia.

LA POLARIZACIN LINEAL DE LA FLUORESCENCIA

Si la luz usada para excitar la fluorescencia est polarizada linealmente, la absorcin
ser ms probable para aquellas molculas que pasan a estar con su dipolos de
transicin paralelo al plano de la polarizacin, como recordamos partir de la Ec.
8.114.
La polarizacin de la luz emitida, sin embargo, depender de un nmero de factores,
incluyendo (1) la orientacin del dipolo de transicin emisor en relacin con el dipolo
de transicin absorbente, y (2) la cantidad de rotacin molecular que tiene lugar
durante la fluorescencia vida. En general, la luz fluorescente ser parcialmente
despolarizada.

Aplicacin 11.1 Visualizacin c-AMP con fluorescencia

Las sondas fluorescentes tienen una amplia aplicacin. Como particularmente bello
ejemplo, DeBernardi y Brooker (1996) utilizaron el fluorosensor c-AMP discuti en la
Seccin 11.8 para detectar c-AMP en clulas vivas. Figura All.l muestra la formacin
de imgenes de vdeo no destructivo de las clulas

17

Figura A 11.1 La deteccin de c-AMP en clulas vivas utilizando el fluorosensor;

vase la Seccin 11.8.
[Reproducido por cortesa de Atto Instruments, Rockville, MD y Molecular Probes,
Eugene, OR.], Tanto antes como despus del tratamiento forskolina, que induce la
produccin de c-AMP en los ncleos. Antes del tratamiento forskolina, vemos que la
clula apenas emite fluorescencia a 520 nm con 488 nm de excitacin. Despus del
tratamiento, vemos marcado de fluorescencia del ncleo.

La configuracin experimental para medir la despolarizacin de la fluorescencia

la luz se muestra en la figura 11.16. La luz de excitacin se enva en lo largo del eje x
con el vector elctrico a lo largo del eje z. Una molcula hipottica est en el origen
de la sistema de coordenadas cartesianas y tiene su dipolo de transicin para la
absorcin en un ngulo con respecto al eje z. El ngulo entre el dipolo de transicin
absorbente y el dipolo de transicin emisor de la molcula es y. La fluorescencia
emitida se observa a lo largo del eje y en ngulo recto a la muestra, y un polarizador
lineal se utiliza para separar la intensidad de los vectores elctricos paralelos y
perpendiculares al vector elctrico de la luz de excitacin (eje z). La despolarizacin
se describe en trminos de una cantidad llamada la anisotropa de fluorescencia.

18

En la literatura antigua, la
polarizacin
Sin embargo, esta cantidad
era difcil de manipular debido
a que el denominador no es
proporcional a la cantidad total
de luz emitida. Por ejemplo, el
promedio anisotropa medido
para
una
mezcla
de
componentes es slo la suma
del
individuo
anisotropas
ponderados
por
su
rendimiento de fluorescencia
F,

En referencia a la figura 11.16 y teniendo en cuenta las polarizaciones, nos damos

cuenta que I y I se emiten a lo largo del eje x, as como el eje y, pero que 2 I se
emite a lo largo del eje z. La cantidad total de luz emitida ser proporcional a la suma
de la luz emitida a lo largo de los tres ejes cartesianos ortogonales entre s, o la I +
2I que se encuentra en el denominador de r. Las dos cantidades estn relacionadas
por r = 2P / (3~P)
En primer lugar, vamos a concentrarnos en la situacin ms simple donde la
orientacin del dipolo emisor es paralela a la orientacin del dipolo absorbente ( =
0), y el tiempo de vida de fluorescencia es corto en comparacin con la rapidez de la
rotacin molecular. Los dos dipolos de transicin son siempre paralelas para la
absorcin en el primer singlete, ya fi = if
Molecular rotacin puede ralentizarse mediante la congelacin en un vaso, o incluso
mediante su disolucin en un disolvente viscoso como el glicol de etileno. Si las
molculas son todos alineados en paralelo al eje z ( = 0), entonces r = 1,0. En
general, cada molcula har un ngulo diferente 8 con el eje z. Entonces, para
nuestra molcula hipottica en la figura 11.16, la magnitud del vector elctrico
absorbida, Eabs ser proporcional a cos . Adems, la magnitud del vector elctrico
emite paralelo a la polarizacin lineal,
E ser proporcional a Eabs i que es proporcional a cos sin cos . La intensidad
de luz es proporcional al vector elctrico al cuadrado, por lo que

19

Una muestra verdadera tendr muchas molculas con todos los valores de y , as
que debemos integrar en estas dos variables para obtener las intensidades emitidas
por una solucin de molculas de la muestra

As, por = 0 y sin rotacin molecular

Este es la despolarizacin de la luz emitida por la orientacin aleatoria de las

molculas. Cuando los dipolos de absorcin y de emisin no son paralelas, r o se
reduce por el factor (3 cos2 - 1) / 2. En general,

Vemos que la anisotropa cuando no hay rotacin molecular puede variar entre 2/5 y
-1/5; es una despolarizacin ms dependiendo de la orientacin relativa de los
dipolos de transicin de absorcin y de emisin. Es evidente que la anisotropa a alta
viscosidad, donde no hay rotacin molecular, se puede utilizar para determinar el
ngulo 'Y entre la absorcin y emisin de los dipolos de transicin. Si se conoce la
direccin del dipolo de transicin para la primera singlete, a continuacin, se aprende
acerca de las direcciones de los dipolos de transicin para los singletes ms altas.
Como ejemplo, la figura 11.17 parcelas la anisotropa observada para la
fluorescencia del colorante rodamina como la luz de excitacin se escanea desde el
principio de la primera singlete a 480 nm a travs de longitudes de onda ms cortas a
280 nm. Vemos cinco transiciones electrnicas. La primera singlete que comienza en
480 nm tiene una anisotropa de alrededor de 0,4, como se esperaba, ya que los
dipolos de transicin de absorcin y de emisin son paralelos. El segundo singlete a
aproximadamente 420 nm tiene una anisotropa de aproximadamente -0,1, que
corresponde a una "Y de alrededor de 66 . La tercera singlete a aproximadamente
390 nm tiene una anisotropa de alrededor de 0,08, que corresponde a una "Y de 47
. Las siguientes dos singletes a mayor energa tienen el mismo anisotropa muy
negativa de -0,16 y estos dipolos de transicin son casi perpendicular al dipolo de
transicin de la primera singlete.

20

POLARIZACIN LINEAL DE FLUORESCENCIA

Figura 11.17 La anisotropa observada para la fluorescencia del colorante rodamina

como una funcin de la longitud de onda de la luz de excitacin.
Si las molculas rotan durante la vida de la fluorescencia, esperamos an ms la
despolarizacin y la magnitud de la anisotropa se reducir an ms. La mayora de
los biopolmeros en un disolvente no viscoso pueden someterse a una reorientacin
perceptible durante el tiempo de vida del estado excitado tpica de 9.10 a 08.10 seg,
por lo fluorescencia polarizada se pueden utilizar para medir esta propiedad
dinmica. La rotacin depende del volumen molecular y forma. La mayora de las
protenas tienen una densidad y forma similar, por lo que en este caso la rotacin es
sensible al peso molecular. Fluorescencia polarizada es la nica tcnica
espectroscpica que es sensible a los cambios de peso molecular, y por lo tanto es
conveniente para el estudio de reacciones tales como los equilibrios monmerodmero. A pesar de que la molcula como un todo es grande y lento, en particular
grupos fluorescentes (es decir, cadenas laterales de triptfano) son a menudo
suficientemente libre para ejecutar rotacin rpida. Estos movimientos tambin se
sumar a la despolarizacin intrnseca descrito anteriormente. Cuando no hay
rotacin molecular, la anisotropa tiene un ro mxima magnitud que depende de la
longitud de onda de absorcin como se discuti anteriormente. Si las molculas
pueden reorientar al azar durante el tiempo de vida de fluorescencia, a continuacin,
la luz emitida se despolariza totalmente y r = O. La mayora de los casos reales se
encuentran entre estos dos extremos, y la rotacin molecular durante la vida de la
fluorescencia disminuye r con respecto al pulso Roo fluorometria es una forma
directa e intuitiva para examinar la rotacin molecular. La muestra fluorescente se
excita con un muy corto pulso de luz (aproximadamente 10-9 seg) y luego la
anisotropa se mide como una funcin del tiempo. Esas molculas que emiten
inmediatamente despus del pulso no habr tenido tiempo para girar; sin
despolarizacin de rotacin, que mostrarn un valor de anisotropa cerca de Roo Por
otro lado, las molculas que emiten ms tarde habr tenido tiempo para someterse a
un movimiento de rotacin, y su anisotropa disminuir a travs de la despolarizacin.

21

La decadencia de la anisotropa es de primer orden (Figura 11.18), y para una

molcula con un nico tiempo de correlacin rotacional p est dada por

Figura 11.18 decaimiento de la

anisotropa despus de la muestra se
ha emocionado con un pulso muy
corto. La rotacin de la molcula
provoca una prdida de seal.

Esta medicin de la anisotropa a travs de fluorescencia resuelta en el tiempo

proporciona una forma muy conveniente para medir el movimiento de rotacin de las
molculas biolgicas. Se requieren dos requisitos: (1) Esta relacin es estrictamente
correcto slo para las molculas aproximadamente esfricas; para molculas con
menor simetra, la situacin se vuelve ms compleja debido a que ms tiempos de
correlacin estn involucrados. (2) Se debe recordar que los movimientos locales del
fluorforo pueden contribuir a la
despolarizacin de la anisotropa; el
grupo fluorescente debe estar bien
fijada, por lo que se est
supervisando la rotacin de la
molcula como un todo. Utilizamos
la unin a calmodulina nativo de
calcio para ilustrar temple en la
Seccin 11.7, y calmodulina se
compar con su derivado dityrosine
para ilustrar las aplicaciones de
anlisis en la Seccin 11.5. Aqu
ilustramos polarizado fluorometra
pulso
timeresolved
con
experimentos en el derivado
dityrosine. Figura 11.19 muestra un
grfico logartmico de la fluorescencia decae mide como una funcin del tiempo en
paralelo y perpendicular a la excitacin polarizada linealmente. Estos resultados
experimentales se midieron con calcio unido a los sitios de calmodulina. Las
anisotropas como una funcin del tiempo medido para calmodulina libre de calcio y
calmodulina con sus sitios saturados por el calcio unido se dan en la Figura 11.20. Se
encontr que el tiempo de correlacin para la calmodulina activada por calcio ser 9,9
nseg, consistente con el de rotacin.
22

Figura 11.19 parcelas Logrithmic

de la intensidad de fluorescencia
polarizada
paralela
y
perpendicular ~ F ~ a la
polarizacin de la excitacin de
pulso
E
para
calmodulina
reticulado. [Tomado de EW
Pequea y SR Anderson (1988)
Bioqumica
27,419-428,
con
derechos de autor 1988 por la
Sociedad Americana de Qumica.]

Figura 11.20 Una parcela logaritmica

de la decadencia de la anisotropa de
la calmodulina reticulado que es libre
de calcio (EDTA) y que cuenta con
lugares de calcio (Ca2 + saturadas).
[Tomado de EW Pequeo y S.
Randerson (1988) Biochemistry 27,
419-428, con derechos de autor 1988
por la Sociedad Americana de
Qumica.]

difusin de una estructura alargada no esfrica. En contraste, la calmodulina libre de

calcio tiene un tiempo de correlacin mucho ms corto que indica que es muy
compacto. Por lo tanto, la anisotropa de fluorescencia demuestra que hay un cambio
en la forma concomitante con la activacin de la calmodulina por el calcio.
Fluorometra dominio de la frecuencia es una forma alternativa para medir la
fluorescencia resuelta en el tiempo. Sinusoidal modulada, emocionantes
rendimientos luz sinusoidal fluorescencia modulada que es cambiado de fase con
respecto a la luz de excitacin. Esta informacin es equivalente a la informacin
medida en el mtodo de pulso, pero el anlisis complicado no es intuitivo y no se
considera aqu. En una, pero mtodo ms antiguo que todava se utiliza con
frecuencia, la despolarizacin de la fluorescencia se mide mediante la determinacin
de la anisotropa en estado estacionario. Si una muestra se ilumina continuamente
con luz polarizada, podremos observar un valor promedio de la anisotropa, r. Esto se
reducir de ro por el factor 1 / (1 + Tip). El tiempo de correlacin rotacional para una
esfera depende de su volumen V, la viscosidad del disolvente T / (T), y la energa
disponible debido a la temperatura kBT,

23

donde kB es la constante de Boltzmann. La relacin entre la anisotropa estado

estacionario medido y la anisotropa intrnseca es, entonces,

Para una esfera, una parcela Perrin de Ill "versus TIT / (T) debe ser una lnea recta
con pendiente TkBlroV e interceptar 1 / r o. El grfico es por lo general tambin
directamente a un elipsoide achatado. El tiempo de vida T podra ser medido como
se describe en la Seccin 11.7, por lo que la medicin de la anisotropa en estado
estacionario dar el volumen de la molcula biolgica con disolvente unido. Si la
molcula tiene alguna otra forma, el grfico tiende a aplanar 524 espectroscopia de
emisin del captulo 11 para valores grandes de T / '1) (T). Si la grfica aumenta
anormalmente en pendiente en general '1) (T), a continuacin, la molcula se est
desarrollando.

FLUORESCENCE APLICADA A LAS PROTENAS

Fluorescencia ha demostrado ser una tcnica particularmente valiosa para el estudio
de protenas. Ya hemos usado la fluorescencia de las protenas para ilustrar la
deteccin analtica, cambios en el rendimiento cuntico, los efectos de la
transferencia de energa, y los cambios en la fluorescencia la polarizacin con el
tiempo que se puede utilizar para controlar la forma. Aqu veremos cmo
fluorescencia puede ser utilizado para estudiar la estequiometria de la formacin de
complejos, observar la presencia de intermediarios, a determinar las constantes de
equilibrio, y determinar el microambiente de sitios de unin. Seguimos usando la
particularmente interesante de protenas de unin a calcio, calmodulina, como un
ejemplo. Es sensible a la concentracin de calcio en eucaritico clulas que a su vez
provoca cambios en la forma. Los cambios en la forma de plomo a la unin de
pequeas molculas y el reconocimiento por parte de muchas enzimas calmodulina
dependiente.
Malencik y Anderson (1983) descubrieron pptido de unin a la calmodulina. Aqu
consideramos Polistes mastoparn, un pptido txico de la avispa social que se une
a la calmodulina con alta afinidad, y contiene un fluorforo triptfano. En Por el
contrario, la calmodulina contiene dos tirosinas como fluorforos, pero no triptfanos.
Excitacin a 295 nm resulta en la fluorescencia del triptfano, pero una mnima
interferencia de tirosina, por lo que es fcil de usar espectroscopia de fluorescencia
para monitorizar la unin de la pptido. El cambio a la longitud de onda ms corta
para la fluorescencia de Polistes mastoparn sobre la unin a la calmodulina se
muestra en la figura 11.21. Este es un efecto disolvente, que muestra que el entorno
del triptfano sobre la unin es hidrfobo y protegido del disolvente acuoso. Tambin
hay algo de extincin de la fluorescencia sobre la unin, que a menudo acompaa a

24

los efectos del solvente. Midi la anisotropa a travs de estado estacionario de

fluorescencia polarizada se puede utilizar para seguir el molecular.

Figura 11.21 El espectro de fluorescencia de Polistes mastoparn libre (- ..) y unido a

calmodulina (-). [Basado en los datos de DA Malencik y SR Anderson (1983)
Biochem. Biophys. Res. Comm. 114,50-56.) W la molecular
Figura 11.22 anisotropa de fluorescencia para la
titulacin estequiomtrica de Polistes mastoparn
con calmodulina. [Basado en los datos en D. A.
Malencik y S. R. Anderson (1983) Biochem.
Biophys. Res. Comm. 114,50-56.]
cambios de peso que resultan de la unin.
La figura 11.22 muestra el cambio en
anisotropa que se produce cuando el
pptido se titula con calmodulina. El
aumento de la anisotropa satura en el
complejo de uno-a-uno, lo que demuestra
que hay una sola sitio de unin de
calmodulina con una alta afinidad para el
pptido (vase la figura 14.5). La
fluorescencia tambin se puede utilizar para
seguir la dependencia de calcio de la unin
de Polistes mastoparn. El efecto del calcio
sobre la fluorescencia de una solucin que
contiene concentraciones iguales de
calmodulina y el pptido se muestra en la
figura 11.23.
La fluorescencia se control a tres
longitudes de onda. El mximo en la
traza 320 nm en dos calciums por
calmodulina (para la relacin de la
intensidad de fluorescencia medida F
comparacin con la intensidad debido
pptido solo, Fo) indica la formacin
una intermedio cuando media de los
cuatro sitios de unin a calcio estn
saturados. El mximo se produce
porque la fluorescencia cambia a la
longitud de onda ms corta. En

en
al
de

25

adicin ulterior de calcio, se produce la extincin, la reduccin de FIFO en las tres

longitudes de onda hasta que todos
cuatro sitios de calcio estn saturados. La suma de estos efectos es evidente en la
figura 11.21. Polistes mastoparn se une fuertemente a la calmodulina para permitir
la determinacin de una constante de equilibrio por este mtodo. Sin embargo, el
glucagn porcino muestra moderada unin, y como Polistes mastoparn tiene un
triptfano que aumenta su fluorescencia sobre la unin. Figura 11.24 muestra la
relacin de fluorescencia cuando es calmodulina
aadi a una solucin de glucagn, con respecto a la fluorescencia de la solucin de
glucagn solo. Los aumentos de fluorescencia como calmodulina se aade, como
esperamos. Fluorescencia para el complejo solo sin glucagn libre dara una
proporcin de 1,71 con respecto a la solucin de glucagn solo. Por lo tanto, con la
informacin en la figura 11.24, es posible para calcular el glucagn, la calmodulina, y
las concentraciones de complejos en cada concentracin de aadido calmodulina.
Estas concentraciones se pueden usar para calcular la constante de equilibrio para la
unin, como se describe en el Captulo 14. Las propiedades de los biopolmeros
suelen ir seguidas de la unin de un colorante que convenientemente emite en la
regin visible y tiene una larga vida til. Algunos de estos colorantes hacer no
fluorescente en agua pero slo fluorescencia cuando se une, haciendo la
interpretacin ms fcil. Vimos la fluorescencia del colorante 2-AN en las figuras 11.8
y 11.9 cuando ilustrando
Figura 11.24 La relacin de fluorescencia
cuando se aade a la calmodulina 2,5 JLM
porcino glucagn relativa a la fluorescencia de
glucagn solo (- - -) y los resultados
calculados para una completa unin (-). Estos
datos permiten el clculo de la constante de
equilibrio para la unin a cada concentracin
de calmodulina aadido. [Adaptado de DA
Malencik y SR Anderson (1982) Biochemistry
21, 3480 a 3486.]
los efectos del solvente. En este ejemplo, consideramos el colorante l
anilinonaftaleno-S-sulfonato estrechamente relacionado (ANS) que se une no
covalentemente al sitio AMP-efector de la enzima fosforilasa de glucgeno. La
excitacin de ANS est en 360 nm, y la fluorescencia monitoreado a 460 nm. Este
colorante no se muestra fluorescente apreciable en agua. encuadernacin
es ms fuerte que la forma ms activa, fosforilasa a, de lo que es el menos activo
forma, fosforilasa b. Fosforilasa es el sustrato para la enzima fosforilasa quinasa, que
une de forma covalente un nico fosfato de serina-14 de la subunidad, las causas el
N-terminal de asumir una conformacin helicoidal, y convierte fosforilasa a su forma
activa. La fosforilasa quinasa es una enzima complejo con cuatro copias de cuatro
diferentes subunidades. Curiosamente, una subunidad es la calmodulina, que
representa el calcio dependencia del complejo enzima. Adems, la protena quinasa,
la enzima utilizada para ilustrar la transferencia de energa en la Seccin 11.S, es de
inters, ya que activa la fosforilasa quinasa. La actividad de la fosforilasa quinasa
26

puede ser seguido por la observacin de la fluorescencia de ANS unido a su sustrato.

Figura 11.25 muestra el aumento fluorescencia del ANS como fosforilasa b se
convierte en fosforilasa a por la 33 kD fragmento de la fosforilasa quinasa. Esta es
una gran fraccin de la subunidad cataltica, que se prepara a partir del complejo
enzima mediante tratamiento con quimotripsina. La fluorescencia muestra que el
fragmento de 33 kD es de hecho activo, y se puede utilizar para seguir la cintica.
Tambin se muestra un ensayo radiactivo 32P para la incorporacin de fosfato. Este
segundo ensayo es de ms tiempo e implica el uso de una istopo peligroso, por lo
que la fluorescencia es el ensayo de eleccin.
Varios de los usos de la espectroscopia de fluorescencia en el estudio de las
protenas discutido anteriormente tambin se ilustran en la Solicitud de 11,2.
Figura 11.25 La fluorescencia del colorante unido a
ANS fosforilasa se utiliza para seguir la actividad de
el fragmento de 33 kD de la fosforilasa quinasa (-).
Esto es menos peligroso y menos tiempo de usando
el ensayo radiactivo 32P (- - -). [Basado en los datos
de DA Malencik, Z. Zhao, y SR Anderson (1991)
Biochem. Biophys. Res. Comm. 174. 344-350.J

FLUORESCENCIA APLICADA A LOS CIDOS NUCLEICOS

Las bases de ADN tienen slo una fluorescencia muy baja. Sin embargo, los
mtodos de fluorescencia pueden ser aplicados a los estudios de cidos nucleicos
mediante la sustitucin de un anlogo fluorescente para una base normal o mediante
la unin de un fluorforo.
El desenrollado de ADN de doble cadena por una helicasa se puede controlar
mediante fluorescencia. Un oligonucletido se sintetiza sustituyendo el fluorforo 2aminopurina de adenina. Enlaces de hidrgeno Este analgicas adenina a timina sin
distorsionar el ADN normal B-forma. Cuando el oligonucletido es de hidrgeno unido
a una cadena complementaria, la fluorescencia se apaga a la mitad de su intensidad
normal. A medida que la helicasa desenrolla el oligonucletido, los rendimientos
normales de fluorescencia, como esperamos. Figura 11.26 muestra la fraccin de
oligonucletido de cadena simple observado por fluorescencia como helicasa T4 dda
desenrolla el sustrato de doble hebra. Este ensayo basado en la fluorescencia
continua se puede utilizar en estudios de estados estacionarios y cinticos.
Los cidos nucleicos tambin se pueden hacer para emitir fluorescencia mediante la
adicin de un fluorforo que se une de forma no covalente. Por ejemplo, el uso ms
comn de la fluorescencia en la biologa molecular es visualizar ADN en geles. De
etidio se intercala en el ADN y este fluorforo entonces se excita con luz UV de
manera que a su vez emite luz visible. Etidio fluorescencia est fuertemente enfri en
agua, pero no cuando blindado en el entorno hidrfobo de la hlice. Otro ejemplo
simple que ilustra tambin la polarizacin de fluoroescence (vase la seccin 11.9)

27

se muestra en la Figura 11.27. En este experimento temprano inteligente, proflavina

se intercala entre las bases de un ADN
de doble cadena y helicoidal.
Figura 11.26 El desenrollado de ADN
de doble cadena de ADN helicasa
byT4 es seguida por el control de la
fluorescencia de un anlogo de
adenina. [Basado en los datos de K. D.
Raney et al. (1994) Proc. Natl.Acad.
Sci.USA 91,6644-6648).
Polarizacin en lugar de anisotropa fue utilizado para describir la medicin aqu, y
los resultados se representan grficamente como una parcela Perrin frente TI'Tj. La
polarizacin disminuye ligeramente con la temperatura, hasta que los desnaturaliza
ADN (60 C), y la polarizacin disminuye dramticamente a medida que se libera la
proflavina.
Figura 11.27 La polarizacin de estado estacionario de proflavina en
la intercalacin en el ADN de doble cadena como una funcin de la
temperatura. [Basado en los datos en N. F. Ellerton y l. Isenberg
(1969) Biopolmeros 8, 767-786.)

Aplicacin 11.3 El helicoidal geomtrico de ADN de doble cadena en la Solucin

Un uso ingenioso de FRET es la observacin de la geometra helicoidal del ADN de
doble cadena en solucin. Clegg et al. (1993) utilizaron una serie de ADN que varan
en longitud desde 8 pares de bases a 20 pares de bases. Ellos unidos
covalentemente colorante de fluorescena a uno extremo 5 'de cada ADN y colorante
rodamina de doble cadena a la otra extremo 5', y se utilizan FRET para medir la
distancia de extremo a extremo para cada miembro de la serie. Si los ADN fueron
lineales y no helicoidal, entonces el experimento no sera muy interesante, ya que la
distancia entre el donador (fluorescena) y el aceptor (rodamina) aumentara en la
misma cantidad que la longitud de los aumentos de ADN. Pero ya que el ADN de
doble hebra es helicoidal, el donante y aceptor estarn ms separados que el modelo
28

lineal para una vuelta completa del ADN (aproximadamente 10 pares de bases).
Esperamos que la eficiencia de la FRET para ser excepcionalmente sensibles a la
distancia relativa entre el donante y aceptor, porque va como la sexta potencia de la
distancia (Eq.11.12). Figura A11.3 confirma esta expectativa, como lo vemos
particularmente baja eficiencia a 10 pares de bases. Clegg et al. han demostrado que
la FRET tiene una alta precisin para el estudio de la conformacin del ADN.

Fig 3: La eficiencia de FRET para

una serie de oligmeros de ADN con
un nmero creciente de par de bases
no es una lnea recta. La eficiencia
ondula debido a que el ADN es
helicoidal de modo que el donador y
el aceptor localizado en los extremos
opuestos de la hlice estn ms
separadas de lo que podra
esperarse para una vuelta completa
de la hlice. La lnea punteada es la
eficiencia calculada para el modelo
helicoidal, suponiendo 10 pares de bases por vuelta. (Adaptado de datos en Clegg et
al.1993 J)

29

Conclusin
Con la elaboracin de este trabajo de investigacin llegue a la conclusin de que es
importante conocer los diferentes mtodos de cromatografa, son mtodos fsicos de
separacin para la caracterizacin de mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en
todas las ramas de la ciencia.

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BIBLIOGRAFIA

1. LEHNINGER. PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA ISBN: 9788428214100,

5 ed., 1 imp. de 12/2005 en Espaol, Ediciones Omega, S.A., 1232
pginas.
2. PRINCIPLES OF PHYSICAL BIOCHIMESTRY
Edicin Second
Autores: Kensal E. van Holde, Professor Emeritus of Biochemistry and Biophysics ,
Oregon State University, W. Curtis Johnson, Professor Emeritus of Biochemistry and
Biophysics

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