Faculdade de Estudos Superiores

Dbora Tocafundo de Souza

Marina Celeste Martins
Rita de Cssia Lima Morais
Sabrina Campos da Silva
Suzielle Lorem Leonel Guimares

TCNICAS HISTOLGICAS

Belo Horizonte
2010

______________________________________________________________________

Dbora Tocafundo de Souza

Marina Celeste Martins
Rita de Cssia Lima Morais
Sabrina Campos da Silva
Suzielle Lorem Leonel Guimares

TCNICAS HISTOLGICAS

Trabalho apresentado disciplina

Histologia Veterinria como requisito
parcial obteno dos crditos.
Professor: Dirceu Antonio Cordeiro
Junior

Belo Horizonte
Faculdade de Estudos Superiores
2010
_____________________________________________________________________________________

NDICE

INTRODUO.................................................................................................. 3
PREPARAAO DE TECIDOS PARA EXAME MICROSCPICO..................................4
MICROSCOPIA DE LUZ...................................................................................... 7
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE E DE CONTRASTE DIFERENCIAL DE
INTERFERENCIA.............................................................................................. 8
MICROSCOPIA DE POLARIZAO......................................................................9
MICROSCOPIA CONFOCAL................................................................................ 9
MICROSCOPIA DE FLUORESCNCIA................................................................10
MICROSCOPIA ELETRNICA...........................................................................10
RADIOAUTOGRAFIA EM SECES DE TECIDOS................................................12
CULTURA DE CLULAS E TECIDOS..................................................................13
FRACIONAMENTO CELULAR..........................................................................13
HISTOQUMICA E CITOQUMICA.....................................................................14
DETECO DE MOLCULAS EM CORTES HISTOLGICOS POR MEIO DE
INTERAO MOLECULARES DE ALTA AFINIDADE............................................17
PROBLEMAS NA INTERPRETAO DE CORTES.................................................21
CONCLUSO.................................................................................................. 23
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.....................................................................24

INTRODUO
A Histologia o estudo da estrutura do material biolgico e das maneiras
como os seus componentes se inter-relacionam, tanto estrutural quanto funcionalmente.
O estudo da histologia se iniciou com o desenvolvimento de microscpios simples e de
tcnicas para preparo de material biolgico, tornando-o adequado para exame.
Este trabalho apresenta os mtodos de estudos desenvolvidos para
histologia, englobando a preparao de cortes de tecidos em lmina e o uso de
microscpios utilizados para visualizao.
O pequeno tamanho das clulas e dos componentes da matriz torna a
histologia dependente do uso de microscpios. Alm disso, pesquisas em qumica,
fisiologia, imunologia e patologia so fundamentais para um conhecimento adequado da
biologia, dos tecidos e dos rgos e de como seus vrios componentes interagem na
sade e na doena. O conhecimento das ferramentas e dos mtodos de investigao
essencial para uma compreenso adequada da estrutura e funcionamento das clulas,
tecidos e rgos.
Histologia o estudo dos tecidos do corpo e de como estes se organizam
para construir rgos. H quatro tecidos fundamentais: tecido epitelial, tecido
conjuntivo, tecido muscular e tecido nervoso.
Os tecidos so constitudos por clulas e por matriz extracelular (MEC). As
clulas produzem a MEC e so ao mesmo tempo influenciadas e controladas por
molculas da matriz, h uma integrao onde clulas e MEC formam uma entidade
contnua que funcionam conjuntamente e responde de modo coordenado s exigncias
do organismo.
Cada um dos tecidos fundamentais formado por vrios tipos de clulas
caractersticas daquele tecido, e por associaes e arranjos caractersticos entre clula e
matriz extracelular, mas estas associaes so muito peculiares. Por outro lado,
analisando o nvel de organizao dos rgos, observamos que estes so quase sempre
formados por uma associao muito precisa de vrios tecidos. Esta associao de
tecidos resulta no funcionamento adequado de cada rgo e do organismo como um
todo. O sistema nervoso a exceo, pois constitudo quase somente por tecido
nervoso.
-3-

PREPARAAO DE TECIDOS PARA EXAME MICROSCPICO

O procedimento mais usado no estudo de tecidos ao microscpio consiste na

preparao de cortes histolgicos. No microscpio de luz (ptico ou fotnico) a imagem
se forma aps um feixe de luz atravessa alguma estrutura. Clulas vivas, camadas muito
delgadas de clulas ou de tecidos, membranas transparentes de animais vivos podem ser
observadas diretamente ao microscpio. No entanto, na maioria dos casos os tecidos e
rgos so espessos e no permitem a passagem adequada de luz para formao de uma
imagem; antes de serem examinados no microscpio eles devem ser fatiados em seces
muito delgados que sero colocados sobre lminas de vidro. Os cortes so obtidos por
instrumentos de grande preciso chamados micrtomos, mas antes os tecidos precisam
passar por uma srie de tratamentos que sero descritos a seguir:

Fixao

Clulas ou fragmentos de tecidos e rgos, assim que retiradas do corpo,

so submetidas a um processo de fixao. Ela tem vrias finalidades: evitar a digesto
dos tecidos por enzimas presentes nas prprias clulas (autlise) ou em bactrias;
endurecer os fragmentos; preservar em grande parte a estrutura e a composio
molecular dos tecidos. Pode ser feita por mtodos qumicos ou, menos freqentemente,
por mtodos fsicos. Na fixao qumica os tecidos so imersos em solues de agentes
desnaturantes ou de agentes que estabilizam as molculas formando pontes com
molculas vizinhas (solues chamadas de fixadoras). Como pode demorar para que os
fixadores se difundam pelo interior dos fragmentos, bom que a amostra seja cortada
em fragmentos menores, facilitando a penetrao do fixador no fragmento e garantindo
uma melhor preservao da estrutura. Alternativamente, pode se usar a perfuso
intravascular do fixador, alcanando a intimidade dos tecidos rapidamente pelos vasos
sanguneos, sendo a fixao melhor.
Um dos fixadores mais comuns para a microscopia de luz uma soluo
isotnica tamponada de formaldedo a 4%. Formaldedo e glutaraldedo, outro fixador
extensamente usado, so conhecidos por reagir com os grupos amina (NH2) das
protenas.

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Devido alta resoluo oferecida pelo microscpio eletrnico,

necessrio um cuidado maior na fixao para melhor preservar os detalhes da ultraestrutura das clulas e da matriz. Para esta finalidade uma fixao dupla de
glutaraldedo tamponado, seguida por uma segunda fixao em tetrxido de smio,
tornou-se um procedimento padro para estudos ultra-estruturais. O efeito do tetrxido
de smio preservar e fornecer contraste aos lipdeos e protenas.

Incluso

Para obter seces delgadas com micrtomo os fragmentos de tecidos e

rgos devem, aps fixao, ser infiltrados com substncias que lhes proporcionem uma
consistncia rgida. usada a parafina (para microscopia de luz) e algumas resinas de
plstico (para microscopia de luz e eletrnica).
O processo de impregnar os tecidos com parafina chamado incluso ou
embebio em parafina e geralmente precedido por duas etapas: desidratao e
clareamento.

A gua extrada passando os fragmentos por diversos banhos de

solues de concentraes crescentes de etanol.

Aps a desidratao o etanol presente nos fragmentos deve ser substitudo
por uma substancia intermediria que miscvel tanto em etanol como no meio que foi
escolhido para incluso (parafina ou resina). Para a incluso em parafina a substncia
intermediria mais comumente usada o xilol. Quando os fragmentos de tecidos so
embebidos em solvente orgnico, eles ficam transparentes ou translcidos.
A seguir, so colocados em parafina derretida e quente. O calor causa
evaporao do solvente orgnico, e os espaos existentes dentro do tecido so
preenchidos por parafina. Depois dos fragmentos serem retirados da estufa a parafina
solidifica e torna-se rgida.
Os blocos de parafina so ento levados ao micrtomo, onde so
seccionados por uma lmina de ao ou de vidro de modo a fornecer cortes de 1-10
micrmetro. Aps serem seccionados, os cortes so colocados para flutuar numa
superfcie de gua aquecida e depois colocados sobre lminas de vidro, onde aderem e
onde sero depois corados.

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Fixao fsica por congelao

Pode se usar mtodo de submeter os tecidos a um congelamento rpido.

Os tecidos fixados assim ficam ao mesmo tempo rgidos e prontos para serem
seccionados. O micrtomo para tecidos congelados o crostato .
So habitualmente usados em hospitais para analisar em poucos minutos
espcimes obtidas durante procedimentos cirrgicos. tambm muito til para os
estudos histoqumicos em cortes de enzimas e de outras protenas, pois o congelamento
no as inativa e mantm muitas protenas em suas conformaes naturais e em seus
locais originais.
Quando se deseja estudar lipdeos presentes nos tecidos, aconselhvel o
uso de seces congeladas, pois a imerso de tecidos em solventes como o xilol dissolve
essas substncias.

Colorao

A maioria dos cortes corada, porque com poucas excees, os tecidos so

incolores.
A seletividade com que os corantes coram os componentes dos tecidos pode
ser maior ou menor. Muitos corantes comportam como substancias de carter acido ou
bsico e tendem a formar ligaes eletrostticas (salinas) com componentes ionizados
dos tecidos. Os componentes dos tecidos que se coram bem com corantes bsicos so
chamados de basfilos, e os que tm afinidade com corantes cidos so os acidfilos.
O azul-de-toluidina e o azul-de-metileno so exemplos de corantes
bsicos. Outros como hematoxilina, comportam como bsicos e se ligam s estruturas
basfilas das clulas e tecidos. Os principais componentes dos tecidos que reagem com
corantes bsicos l fazem por conter cidos em sua composio cidos nuclicos,
glicosaminoglicanos e glicoproteinas cidas.

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Corantes cidos ( como Orange G, eosina, fucsina acida) coram

principalmente os componentes acidfilos dos tecidos, como por exemplo as
mitocndrias, grnulos de secreo, protenas citoplasmticas e colgeno.
A combinao de hematoxilina com eosina (HE) a mais comum. A
hematoxilina cora em azul ou violeta o ncleo das clulas e outras estruturas acidas
(como pores do citoplasma rica em RNA e matriz da cartilagem hialina). A eosina
cora o citoplasma e o colgeno em cor - de rosa. So usados tambm os tricrmicos
(como os corantes de Mallory e de Masson), mostra bem o ncleo e o citoplasma,
ajudam a diferenciar colgeno e msculo liso entre si. Uma tcnica boa pra diferenciar
colgeno o uso do picro-sirius associado com luz polarizada.
Em muitos procedimentos as estruturas so evidenciadas por um
precipitado ou por um corante fluorescente, mas as clulas e os seus limites no so
visveis. Neste caso usado um contratransporte trata-se de um corante aplicado a um
corte para permitir a visualizao dos contornos das clulas ou ncleos. Uma outra
maneira de evidenciar componentes de clulas e tecidos a sua impregnao por metais,
como prata e ouro, mtodo comum para estudar tecido nervoso.
O procedimento inteiro pode demorar de 12 h dois dias, dependendo do
tamanho do tecido, do fixador e do meio de incluso utilizados.

MICROSCOPIA DE LUZ

No microscpio de luz, as preparaes coradas so examinadas por

iluminao que atravessa o espcime. O microscpio composto por partes mecnicas e
pticas. O componente ptico tem trs lentes: condensadora, objetivas e oculares. O
condensador concentra a luz de uma lmpada e projeta um feixe luminoso sobre o
espcime. A objetiva recebe a luz que atravessou o espcime e projeta uma imagem
aumentada do objeto em direo a ocular, que novamente amplia a imagem e a projeta
na retina, em uma tela, em uma cmera fotogrfica ou em um detector eletrnico. No
caso das imagens projetadas na retina, a ampliao total calculada multiplicando-se o
aumento da objetiva pelo aumento da ocular.

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Resoluo

Poder de resoluo definido como a menor distncia entre duas

partculas ou entre duas linhas a qual permite que elas sejam vistas como dois objetos
separados. O poder de resoluo mximo do microscpio de luz de aproximadamente
0,2 um; esta resoluo permite a obteno de boas imagens aumentadas ate 1000 a 1500
vezes. Objetos menores que 0,2 um no podem ser distinguidos com este instrumento.
Dois objetos sero vistos como um s objeto se eles estiverem separados por menos de
0,2 um. Aumentar s tem valor pratico se for acompanhado de resoluo que depende
essencialmente da objetiva, pois a lente ocular apenas aumenta a imagem nela projetada
pela objetiva.
Esta sendo ampliada o uso de vdeo-cameras de alta sensibilidade e
resoluo que permitem a digitalizao de imagens que podem ser usadas em
computadores para analisa quantitativa por meio de aplicativos de analise de imagens.

MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE E DE CONTRASTE

DIFERENCIAL DE INTERFERENCIA

Sistemas pticos que permitem a observao de clulas e cortes no

corados. Microscopia de contraste de fase usa um sistema de lentes que produz imagens
visveis de objetos quase transparentes.
A microscopia de contraste de fase baseada no fato de que a luz muda sua
velocidade ao atravessar estruturas celulares e extracelulares que tenham ndices de
refrao diferentes. Estas mudanas so usadas pelo sistema de contrastes de fase para
fazer com que as estruturas apaream mais claras ou mais escuras e fazem deste tipo de
microscopia uma ferramenta para observar clulas vivas. A microscopia de contraste
diferencial produz uma imagem aparentemente tridimensional.

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MICROSCOPIA DE POLARIZAO

Quando raios de luz passam atravs de um filtro polarizador (como um

Nicol ou um filtro Polaroid), eles saem vibrando em uma s direo. Um segundo filtro
colocado com seu eixo principal perpendicular ao primeiro filtro bloquear a passagem
da luz. Se um tecido que tiver estruturas formadas por tomos e molculas com um alto
grau de orientao (como celulose, colgeno, cristais, microtbulos e microfilamentos)
for colocado entre os dois filtros, a estrutura molecular repetitiva e orientada modifica o
plano de vibrao da luz que emerge do primeiro filtro, fazendo com que estas
estruturas apaream luminosas contra um fundo escuro aps passarem pelo segundo
filtro. A capacidade que estruturas tm de girar o plano de vibrao da luz polarizada
chamada birrefringncia.

MICROSCOPIA CONFOCAL

Geralmente na imagem h superposio de vrios planos os quais aparecem

em foco simultaneamente, causando um certo grau de deteriorao da imagem. H um
microscpio confocal, que torna possvel focalizar um plano muito delgado do
espcime. O espcime iluminado com um feixe de luz muito estreito; a imagem
coletada do espcime deve passar por um orifcio muito pequeno; s a imagem
originada do plano focalizado alcana o detector, enquanto as imagens de planos
anteriores e posteriores so bloqueadas. A luz proveniente de fora do plano de foco
eliminada, a definio do objeto focalizado fica melhor e a localizao dos componentes
do espcime pode ser feita com muito mais preciso que no microscpio de luz.
Arranjo usado na maioria dos microscpios confocais: a iluminao
freqentemente provida por uma fonte de laser; como esta fornece um ponto de
iluminao muito pequeno, ele deve ser varrido sobre o espcime para permitir a
observao de uma rea muito maior do espcime; o componente do espcime que de
interesse deve ser marcado com uma molcula fluorescente; a luz usada para formar
uma imagem aquela que refletida pelo espcime; a luz refletida capturada por um
detector, onde o sinal amplificado eletronicamente para ser visto em um monitor.

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Como somente um plano focal muito delgado focalizado de cada vez,

possvel reunir os vrios planos de um espcime e reconstru-los em um objeto
tridimensional.

MICROSCOPIA DE FLUORESCNCIA

Quando algumas substncias so irradiadas por luz de certo comprimento de

onda, elas emitem luz com um comprimento de onda mais longo. Este fenmeno a
fluorescncia. Na microscopia de fluorescncia as seces de tecidos so irradiadas
com luz ultravioleta e emitem luz na poro visvel de espectro, fazendo com que as
substancias fluorescentes apaream brilhantes. O microscpio possui uma fonte de luz
ultravioleta muito intensa e filtros especiais que selecionam o comprimento de onda dos
raios luminosos que atingem o espcime e tambm dos raios que so emitidos pelo
espcime.
Substancias fluorescentes que tenham afinidade por molculas presentes
nas clulas ou na matriz extracelular podem ser usadas como corantes fluorescentes,
como o alaranjado de acridina, que pode combinar com o DNA e o RNA. O complexo
DNA-alaranjado de acridina emite fluorescncia de cor verde-amarelada e o complexo
RNA-alaranjado de acridina emite vermelha alaranjada. Outra aplicao resulta da
combinao qumica de substancias fluorescentes (como isotiocianato de fluoresceina
FITC) com molculas que se ligam especificamente a componentes das clulas e
tecidos, permitindo a identificao destes componentes atravs da fluorescncia que eles
iro emitir.
MICROSCOPIA ELETRNICA

A microscopia eletrnica de transmisso e de varredura se baseia na

interao entre eltrons e componentes dos tecidos.

Microscopia eletrnica de transmisso

um sistema de produo de imagens que permite uma altssima

resoluo (0,1 nm, na prtica 3nm), resolues que permite que espcimes ampliados a
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at 400000 vezes sejam vistos com detalhes. Esta ampliao s pode ser usada para
analisar partculas ou molculas isoladas, pois cortes delgados de clulas e tecidos
podem ser observados com detalhes em aumento de ate cerca de 120000 vezes.
O funcionamento do microscpio se baseia em: eltrons podem ser
desviados por campos eletromagnticos de uma maneira semelhante ao desvio
(refrao) produzido na luz por lentes de vidro. Eltrons so liberados pelo aquecimento
de um filamento metlico (catodo de tungstnio) em vcuo.Os eltrons liberados no
catodo so submetidos a uma diferena de voltagem de 60-120 kV existente entre
catodo e anodo. Os eltrons so atrados pelo anodo e acelerados, atingindo altas
velocidades. Aps passarem pelo orifcio do anodo eles formam um feixe de eltrons
que percorre o tubo do microscpio. No tubo, o feixe de eltrons passa pelo interior de
bobinas eltricas (bobinas eletromagnticas) e desviado de maneira anloga ao que
acontece com um feixe luminoso em lentes de vidro.
A configurao do microscpio: a primeira lente uma condensadora que
focaliza o feixe de eltrons do espcime. Ao atravessar o corte alguns eltrons interagem
com tomos do espcime e continuam seus trajetos em direo s outras lentes,
enquanto outros eltrons simplesmente cruzam o corte e =sem interagir com ele. Dos
eltrons que atingem a lente objetiva forma-se uma imagem aumentada do objeto que
projetada nas outras lentes que por sua vez aumentam a imagem ainda mais. Para se
observar uma imagem os eltrons necessitam ser captados por um detector, uma placa
fluorescente, um negativo fotogrfico o uma cmera CCD. Como a imagem no
microscpio produzida pelo balano da quantidade de eltrons que atingiram o
detector e eltrons que foram retidos no tubo do microscpio, a imagem resultante
sempre em preto-e-branco. As reas escuras de uma micrografia eletrnica costumam
ser denominada de eltron-densas, e reas claras de eltron-lucentes ou eltrontransparentes
O microscpio utiliza cortes muito mais delgados. Para obter estes cortes
os tecidos so includos em resinas plsticas, como as do tipo epxi. Os blocos de tecido
so seccionados com navalhas de vidro ou de diamante e os cortes so coletados sobre
pequenas grades de metal.

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Microscopia eletrnica de varredura

Fornece imagens pseudotridimensionais das superfcies de clulas,

tecidos e rgos. Neste microscpio um feixe de eltrons de dimetro muito pequeno
focalizado sobre o espcime percorrendo seqencialmente sua superfcie. Os eltrons
no atravessam o espcime. Os eltrons varrem uma delgada camada de metal
previamente aplicada ao espcime e so capturados por um detector e transmitidos a
amplificadores e outros componentes eletrnicos que geram um sinal. Este resulta em
uma imagem preto-e-branco que pode ser observada em um monitor, gravada ou
fotografada. Nas imagens os objetos parecem ser iluminados e possuem locais
sombreados fornecendo uma idia de trs dimenses.

RADIOAUTOGRAFIA EM SECES DE TECIDOS

Permite o estudo funcional de processos biolgicos em cortes de tecidos

pelo uso de radioatividade, aproveitando a capacidade de algumas substancias
radioativas sensibilizarem emulses fotogrficas. Cristais de brometo de prata presentes
na emulso fotogrfica funcionam como detectores de radioatividade da mesma maneira
como eles respondem luz em um negativo fotogrfico. A primeira etapa fornecer
tomos ou molculas radioativas s clulas. A escolha destas substncias depende da
finalidade do estudo: aminocidos radioativos, nucleotdeos radioativos, aucares
radioativos etc. Estas molculas so chamadas de precursores, porque podem ser usadas
pelas clulas para sintetizar molculas maiores como protenas, cidos nuclicos,
polissacardeos e glicoproteinas. Cortes dos tecidos a serem analisados so cobertos por
uma emulso fotogrfica. Depois de um tempo, as lminas passam por uma revelao
fotogrfica e so depois examinadas ao microscpio. Os cristais da emulso que foram
atingidos por radiao originam pequenos grnulos pretos de prata metlica que indicam
a existncia de radioatividade no tecido. As estruturas do corte que contem molculas
radioativas ficam cobertas por estes grnulos. Este procedimento pode ser usado tanto
em microscopia de luz como eletrnica.
Se o precursor fornecido tiver sido um aminocido radioativo possvel
conhecer quais clulas de um tecido produzem mais e quais produzem menos protenas,

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porque o numero de grnulos de prata existentes sobre as clulas proporciona

intensidade de sntese de protena. Se for usado um precursor radioativo de DNA (como
timidina radioativa), possvel determinar quais e quantas clulas de um tecido esto se
preparando para se dividir.
CULTURA DE CLULAS E TECIDOS

Clulas podem ser mantidas vivas e estudadas fora do corpo sendo muito
til para estudar o efeito isolado de molculas sobre um determinado tipo de clulas ou
tecido. A cultura de clulas permite tambm a anlise direta do comportamento de
clulas vivas por meio de um microscpio e de varias experincia que podem ser
executadas em um animal vivo pode ser feitas in vitro.
As clulas e os tecidos so cultivados em solues de composio conhecida
(sais, aminocidos, vitaminas) s quais so freqentemente adicionados componentes do
soro. Para preparar devem ser inicialmente separadas mecanicamente ou por meio de
tratamento enzimtico. Uma vez isoladas as clulas podem ser cultivadas em suspenso
ou podem ser colocadas sobre uma placa de Petri ou sobre uma lamnula de vidro,
superfcies sobre as quais elas costumam aderir e crescer sob forma de uma nica
camada de clulas. Culturas feitas desta maneira so culturas primarias. A maioria das
clulas obtidas de tecidos normais tem uma durao de vida finita, programada
geneticamente. Muitos tipos de clulas originalmente isolados a partir de tecidos
normais ou patolgicos e mantidos in vitro constituem agora linhagem permanente de
clulas. Para permitir a imortalidade de clulas normais in vitro h necessidade
submet-las a um processo chamado de transformao. Todos os procedimentos com
clulas e tecidos vivos devem obviamente ser executados em uma rea estril e usandose solues e equipamentos estreis.
FRACIONAMENTO CELULAR

Organelas e outros componentes das clulas e tecidos podem ser purificados

e isolados por meio de uma tcnica chamada fracionamento celular. um processo
fsico pelo qual usada a fora centrifuga para separar as organelas e componentes
celulares em funo de seus coeficientes de sedimentao que depende de seu tamanho,

- 13 -

forma, densidade e viscosidade do meio em que esta suspensa. A composio qumica e

funes das organelas e molculas podem ento ser estudadas in vitro. As fraes
obtidas por estas tcnicas podem ser analisadas ao microscpio eletrnico para verificar
sua pureza.
HISTOQUMICA E CITOQUMICA

Estes termos so usados para indicar mtodos que identificam e localizam

substancias em cortes histolgicos ou em clulas cultivadas. H vrios procedimentos
para obter estas informaes, a maioria baseada em reaes qumicas especificas ou em
interaes de alta afinidade entre molculas. Estes mtodos normalmente originam
substancias insolveis coloridas ou eltron-densas, que permitem a localizao de
tomos ou de molculas por microscopia de luz ou eletrnica.

ons

Vrios ons podem ser localizados em tecidos com estes mtodos, usando
reaes qumicas que produzem produtos insolveis escuros ou coloridos.

cidos nuclicos

O DNA pode ser identificado e quantificado nos ncleos das clulas por
meio de reao de Feugen, que produz uma cor vermelha no DNA. O DNA e o RNA
tambm podem ser evidenciados pela colorao de clulas ou de cortes de tecidos com
corantes bsicos.

Protenas

Embora haja mtodos gerais para detectar protenas e, clulas e cortes de

tecidos, os mtodos histoqumicos normalmente no permitem localizao de protenas
especficas, o que pode ser feito pela imunocitoqumica
H, porm, vrios mtodos histoqumicos que revelam com maior ou
menor especificidade um grupo grande de protenas, as enzimas. Estes mtodos
normalmente aproveitam a capacidades das enzimas para reagir com ligaes qumicas
especificas. A maioria dos mtodos histoenzimticos funciona do seguinte modo:

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1) cortes de tecidos so imersos em uma soluo que contem o substrato da

enzima cuja presena se quer verificar, e desta maneira se permite enzimas se apresenta
nas clulas ou matriz interaja com o seu substratos ;
2) Em seguida o corte posto em contato com a substncia marcadora que
reage com uma molcula que deve ser insolvel, precipita sobre o local que contm a
enzima, denunciando-a; este produto final deve ser colorido ou eltron-denso para ser
visvel por microcospia de luz ou eletrnica. Ao examinar um destes cortes ao
microscpico, possvel observar as clulas (ou organelas) cobertas com um material
colorido ou eltron-denso.
Alguns exemplos de enzimas que podem ser detectadas so:

Fosfatases so enzimas amplamente encontradas no organismo.Elas

clivam a ligao entre um grupo fosfato e um resduo de lcool de
molculas fosforiladas. O produto estas tcnicas podem-se detectar
fosfatases alcalinas que tm sua atividade mxima em um pH
alcalino. Freqentemente usa um reao de deteco de fosfatases
cidas para de mostrar lisossomos, organelas citoplasmticas que
contm grande quantidade destas enzimas.

Deidrogenases removem hidrognio de um substrato e o transferem

a outro. H muitas deidrogenases nas clulas, onde tm um papel
importante

vrios

processos

metablicos.

demonstrao

histoqumica de deidrogenases consiste em incubar cortes de tecidos

no fixados em uma soluo que contem uma molcula que, ao
receber hidrognio, precipita sob forma de uma substancia colorida
insolvel.Por este mtodo, a succionodeidrogenase - enzima
fundamental do ciclo do cido ctrico (ciclo de Krebs ) pode ser
localizada nas mitocndria.

A peroxidase , presente em vrios tipos celulares, uma enzima que

promove a oxidao de certos de certos substratos e a transferncia
de ons de hidrognio para perxido de hidrognio, produzindo ao
mesmo tempo molculas de gua . Para a deteco de peroxidase,
clulas ou cortes de tecidos so incubados em uma soluo que

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contm perxido de hidrognio e 3,3-diaminoazobenzidina. Esta

ultima substncia oxidada na presena de peroxidase, resudoltando
em um precipitado insolvel marrom ou eltron-denso que permite a
localizao da atividade peroxidase em microscpicos de luz e
eletrnicos .A atividade de peroxidase em microscpicos de luz
eletrnicos.A atividade de peroxidase em clulas de sangue, que
importante no diagnostico de leucemias, pode ser evidenciada por
este mtodo.
Pelo fato da peroxidade ser uma enzima extremamente ativa e produzir
rapidamente uma quantidade de aprecivel de precipitado insolvel, ela tem uma
importante aplicao prtica: ser usada pra marcar outras molculas. Molculas de
peroxidase podem ser extradas de vegetais, isoladas a acopladas com outras molculas.

Polissacardeos e Oligossacardeos

Os Polissacardeos do nosso organismo existem livres ou combinados com

protenas e lipdios. Quando combinados eles constituem um grupo heterogneo e
extremamente complexo. Eles podem ser demonstrados pela reao de cido perodoSchiff (PAS), que se baseia na transformao de radicais 1,2-glicol presentes nos
aucares em resduos de aldedo. Estes resduos so, em seguida, revelados pelo
reagente de Schiff, que produz uma colorao prpura ou magenta nos locais do corte
em que h muitos polissacardeos.
Um polissacardeo livre muito encontrado no organismo o glicognio,
que pode ser demonstrado pela reao de PAS em fgado, msculo estriado e outros
tecidos onde se acumula.
Glicoprotenas so molculas de proteinas associadas com cadeias
pequenas e ramificadas de aucares (oligossacardeos). A cadeia protica predomina em
peso e volume sobre cadeia oligossacardeos. Enquanto algumas glicoprotenas no
contm nenhum grupo cido (glicoprotenas neutras ) e so PAS-possitivas , outras
possuem radicais carboxila ou sulfato.Com tanto o glicognio como as glicoprotenas
neutras so PAS-possitivos, a especificidade da reao de PAS pode ser melhorada
comparando a colorao de cortes submetidos a esta tcnica com outros que foram pr- 16 -

tratados com uma enzima que digere glicognio.(por exemplo, amilase salivar ).
Estruturas que se coram intensamente por PAS mas, que perdem estar capacidade
quando pr-tratadas com amilase contm glicognio.
Glicosaminoglicanos so polissacardeos no ramificados, fortemente
aninico, que contm monossacarodeos aminados (aminoacares). Quando um grande
nmero de cadeias de glicosaminoglicanos se prende ao longo de um eixo prottico elas
constituem os proteoglicanos.Alguns dos componentes mais importante da matriz
extracelular do tecido conjuntivo so proteoglicanos. Diferentemente das glicoprotenas,
nos proteoglicanos as cadeias de carboidrato constituem o componente principal da
molcula. Glicosaminoglicanos e glicoproteinas cidas so fortemente aninicas por
causa do seu alto contedo de grupos carboxila e de sulfato. Por esta razo, eles reagem
intensamente com corante Alcian blue

Lipdios

A melhor maneira de revelar os lipdios por meio de corantes que so

imersos em soluo alcolicas saturadas com esses corantes ( os corantes Suda IV e
Sudan Black so os mais usados ).O corante de dissolve na gotculas de lipdios, as
quais adquirem a cor do corante.Mtodos adicionais usados para localizao de
colesterol e seus steres, de fosfolipdios e de glicolipdios so teis para diagnostica
doenas metablicas em que h acmulo intracelular de diferentes tipos de lipdios.

DETECO DE MOLCULAS EM CORTES HISTOLGICOS POR MEIO DE

INTERAO MOLECULARES DE ALTA AFINIDADE

Uma molcula presente em uma clula ou em um corte de tecido pode ser

percebida por meio de compostos que interagem especificamente e ligam-se com a
molculas que queremos detectar.Os compostos capazes de fazer o reconhecimento
devem ser previamente acoplados a um marcador, para que o conjunto molculacompostomarcador possa ser visto por meio de um microscpico de luz ou
eletrnico.Os marcadores mais usados so: substancia florescentes ( param serem
visualizados como um microscpico de florescncia ou de laser ), tomos radioativos
(para serem detectados por radiofotografia), molculas de enzimas como a peroxidase
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que pode ser detectadas pela demonstrao da enzima com perxido de hidrognio e
DAB, metais (geralmente partculas de

ouro) que podem ser observados por

microscopia de luz e eletrnica.Estes mtodos se destinam principalmente para detectar

aucares, protenas e cido nuclicos.
Faloidina, protena A lectinas e anticorpos so exemplos de compostos que
interagem especificamente com outras molculas .
A Faloidina que extrada de um cogumelo (Amanita phalloides ), interage
fortemente com actina e geralmente marcada com substancias fluorescentes para
demonstrar filamentos de actina .
A protena A uma protena extrada Staphylococcus aureus que se liga
regio Fc de molculas imunoglobulinas (anticorpos). Quando a protena A ligada a
um marcador, podemos detectar imunoglobulinas com grande preciso.
As lectinas so protenas ou glicoprotenas derivadas principalmente de
sementes de vegetais que se ligam com alta afinidade e especificidade a
carboidratos.Diferentes lectinas interagem com diferente aucares ou seqncias de
aucares.Elas , portanto,se ligam a glicoprotenas, proteoglicanos e glicolipdios e so
muito usadas para caracterizar molculas de membranas celulares que contem
seqncias especificas de aucares

Imunocitoqumica

Uma interao altamente especifica entre molculas o que ocorre entre

uma molcula e um anticorpo. Mtodos que usam ante corpos marcados so de grande
utilidade para identificar protenas e glicoprotenas.A imunocitoqumica metodologia
que permite identificar molculas ou camadas de clulas por meio de anticorpos.
Em uma reao altamente imunocitoqumica, clulas em cultura ou um
corte de tecidos que supe conter uma determinada protena so incubados em uma
soluo que contm um anticorpo que reconhece esta protena. O anticorpo se liga
especificamente protena e sua localizao pode ento ser evidenciada por
microscopia de luz ou eletrnica, dependendo do marcador que foi acoplado ao
anticorpo.

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Uma

da

exigncia

mais

importantes

da

imunocitoqumica

disponibilidade de um anticorpo contra a protenas que se pretende detectar.Isto

significada que a protena deve ter sido previamente purificada e isolada de forma que
anticorpos possam ser produzidos contra ela.
-Anticorpos monoclonais e policlonais
Suponhamos que se quer produzir anticorpos contra protena X de certa
espcie animal (um rato, um humano ) . Se x j esta isolada, ela injetada em uma outra
espcie (um coelho, uma cabra). Se a protena suficientemente diferente para este
animal reconhec-la como estranha, o animal produzira anticorpos contra a protena.
Estes anticorpos os so coletados do plasma o animal e usado para imunocitoqumica.
Quando se oferece antgeno a um animal, vrios grupos de linfcitos deste
animal podem reconhecer pores diferentes de X e os grupos podem produzir
anticorpos diferentes contra as varias pores, resultando em uma mistura de anticorpos
chamado anticorpo policlonal.
possvel fornecer a protena X para linfcitos mantidos em cultura. Os
diferentes grupos (clones) de linfcitos produziro anticorpos diferentes contra as varias
pores da protena X. Cada clone pode ser isolado e cultivado isoladamente, de forma
que os diferentes anticorpos contra X podem ser coletados e separados. Cada um destes
anticorpos constitui um anticorpo monoclonal. H varias vantagens em usar um
anticorpo monoclonal em comparao com um anticorpo policlonal, eles costumam ser
mais especficos havendo menos ligaes inespecficas com outras protenas, o que
poderia dificultar o reconhecimento da protena X.
H fundamentalmente duas tcnicas usadas em imunocitoqumica: Tcnica
direta de imonocitoqumica o anticorpo contra a protena X ligado a um marcador
apropriado. Um corte de tecido incubado com o anticorpo de forma que o anticorpo
interage e se liga a X, e, a seguir, o corte levado para remover o anticorpo no ligado.
O corte observado a microscopia de luz ou eletrnica, dependendo do marcador
utilizado. Se o marcador foi peroxidase ou outra enzima, o corte deve ser colocado em
contato com o substrato desta enzima antes de ser analisado. Os locais do corte que
contem a protena X ficaro fluorescentes, ou sero cobertos por um precipitado escuro
ou coloridos devido presena da enzima ou partculas de ouro.

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A tcnica indireta de imunocitoqumica mais sensvel, porem requer mais

etapas. Se quisermos detectar uma protena X existente em tecidos de ratos, necessrio
inicialmente produzir dois anticorpos diferentes: anticorpos contra a protena X de rato
feitos, por exemplo, por um coelho; em um procedimento paralelo, imunoglobulina de
um outro coelho injetada em uma terceira espcie. Imunoglobulina de coelho
considerada estranha por ovelhas ou cabras, que respondem produzindo um anticorpo
contra a imunoglobulina, um antianticorpo ou antiimunoglobulina. Este anticorpo , em
seguida, ligado a um marcador adequado.
Na primeira etapa da tcnica indireta, um corte de tecido de rato que se
supe conter a protena X incubado inicialmente com anticorpo de coelho antiproteina
X de rato. Depois de lavar os cortes, estes so incubados com o anticorpo marcado que
reconhecer e se ligar ao anticorpo de coelho que se havia ligado protena X. Em
seguida o corte observado ao microscpio de luz ou eletrnico aps tratamento
adequado, dependendo do marcador utilizado. Apesar de ser mais complexa, a tcnica
de imunocitoqumica mais sensvel, respondendo com um sinal maior que a tcnica
direta. H mtodos indiretos que envolvem uso de outras molculas intermedirias,
como a tcnica que utiliza biotina-avidina.

Tcnias de hibridizao

Tcnicas que permitem analises das molculas envolvidas no processo do

fluxo de informao do DNA para protena e no controle deste fluxo. Muitas tcnicas
so baseadas em hibridizao que a ligao entre duas molculas de cadeia nica de
cidos nuclicos que se reconhecem um ao outro se suas seqncias forem
complementares, formando molculas de cadeia dupla, permitindo a identificao de
seqncia especificas de DNA ou RNA.
-Hibridizao in situ
Quando aplicada diretamente a clulas e cortes de tecidos, esfregaos ou
cromossomos de clulas mitticas, a tcnica chamada hibridizao in situ. excelente
para averiguar se uma clula tem uma seqncia especifica de DNA, para definir a
localizao de um gene em um cromossomo e para identificar as clulas nas quais um
gene especifico esta sendo transcrito. O DNA deve ser inicialmente desnaturado por
calor ou agentes desnaturantes, fazendo com que as suas duas cadeias se separem. As

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cadeias esto agora prontas para serem ligadas a um segmento de cadeia simples de
DNA ou a um segmento de RNA que sejam complementares a seqncia que desejamos
analisar. Esta seqncia chamada de sonda que pode ser obtida por clonagem, por
amplificao das seqncias do meio de PCR ou por sntese se a seqncia desejada for
curta. A sonda deve ser ligada a um marcador, normalmente um istopo radioativo ou
um nucleotdeo modificado que pode ser identificado por imunocitoqumica.
Na hibridizao in situ as laminas contendo os cortes de tecidos, clulas ou
cromossomos so inicialmente aquecidas para separas as cadeias duplas de DNA, em
seguida, uma soluo contendo a sonda colocada sobre o espcime. Depois de lavar a
lamina, a localizao da sonda ligada a seqncia complementar denunciada pelo
marcador utilizado.
Hibridizao tambm pode ser executada com DNA ou RNA purificados,
colocados em apoio slidos. Trechos de molculas de DNA ou RNA so separados por
tamanho atravs de eletroforese em gel de agarose ou em gel de policrilamida. Em
seguida so transferidos a uma folha de nilon ou de nitrocelulose por meio de um
solvente onde os cidos nuclicos podem ser analisados por hibridizao. A tcnica de
identificao de DNA chamada de Southerm blotting; quando a eletroforese feita
com molculas de RNA a tcnica chamada de Northerm blotting.
As tcnicas de hibridizao so altamente especificas e habitualmente
usadas em pesquisa, diagnostico clinico e medicina forense.

PROBLEMAS NA INTERPRETAO DE CORTES

Distores e artefatos causados pelo processamento de tecidos

As vrias etapas dos procedimentos podem distorcer os tecidos, fornecendo

uma imagem que pode diferir da que os tecidos apresentavam quando vivos. Uma causa
de distoro a retrao produzida pelo fixador, pelo etanol e pelo calor da parafina
usada para incluso. A retrao atenuada quando os tecidos so includos em resina.
Uma conseqncia da retrao o aparecimento de espaos artificiais nas
clulas e entre clulas e outros componentes de tecido. Outra fonte de espaos artificiais
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 a perda de molculas que no foram mantidas corretamente nos tecidos pelo fixador
ou que foram retiradas pelas solues de desidratao e clareamento.
Todos estes espaos artificiais e outras distores causadas pelo
procedimento de preparao dos cortes so chamados artefatos de tcnica. Outros
artefatos podem incluir pregas do corte, precipitados de corantes ou sujeira .

A totalidade do tecido

Uma grande dificuldade apresentada por cortes de microscopia de luz a

impossibilidade de se corar facilmente todos os componentes das clulas e tecidos em
um s preparado. quase impossvel observar clulas por um microscpio de luz e
enxergar os seus ncleos, mitocndrias, lisossomos e peroxissomos, todos envolvidos
por uma membrana basal e por uma matriz extracelular contendo fibras colgenas,
elsticas e reticulares. Para se ter esta imagem, necessrio examinar vrias preparaes
diferentes, cada qual corada por mtodos diferentes, e assim obter uma viso completa
da composio e estrutura de um tecido. Por outro lado, o microscpio eletrnico de
transmisso permite a observao de clulas com todas suas organelas e incluses
envolvidas pela membrana e pelos componentes de matriz extracelular

Duas dimenses e trs dimenses

Quando uma estrutura tridimensional cortada em seces muito delgadas,

as seces parecem ter s duas dimenses: comprimento e largura. Is freqentemente
conduz o observador a erros se ele no conscientizar de que uma esfera seccionada
vista como um circulo e que um tubo seccionado visto como um anel.
Para entender a arquitetura de um rgo, necessrio estudar seces feitas
em planos diferentes. s vezes, somente a analise se seces consecutivas e a sua
reconstruo em um volume tridimensional tornam possvel compreender a organizao
de um rgo complexo.

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CONCLUSO

A histologia hoje muito importante em vrios campos, no estudo dos

tecidos, em diagnsticos ps-operatrios, no avano da rea mdica. Como a histologia
trabalha com partes muito pequenas de tecidos, clulas microscpicas, foi necessrio o
desenvolvimento de tcnicas que possibilitassem um estudo mais preciso.
Para cada tipo de tecido ou objetivo do pesquisador existe um mtodo que
ir se aplicar melhor. Mas para a utilizao de cada mtodo o pesquisador deve saber
em que consiste a pesquisa e aplica lo de forma correta.
Enfim, existem muitas tcnicas que nos possibilitam visualizar tecidos,
clulas melhorando assim o estudo da histologia que uma cincia imprescindvel para
os avanos da medicina.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia bsica. 11 ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2008.

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