Tema 2.

Clulas en cultivo: Curva de crecimiento, cultivo de clulas eucariotas

y procariotas, ventajas y desventajas
Clula
Robert Hooke (1665) acuo el nombre de clula.
Es la unidad esencial que forma a todo ser vivo.

La unidad anatmica y funcional fundamental de la materia viva, capaz de

vivir independientemente como entidad unicelular, o formar parte de un
nivel de organizacin mayor, como por ejemplo un organismo pluricelular.
Las clulas estn separadas del medio circundante por una membrana celular.
Esta membrana restringe el paso de sustancias de afuera hacia el interior y
viceversa, y protege de esta manera su integridad estructural y funcional.

Las clulas de las plantas, de la mayora de las algas, hongos y procariotas,

estn adems separadas del ambiente por una pared celular.

Teora celular

Todos los seres vivos estn formados por clulas o por sus
productos de secrecin. La clula es la unidad anatmica de la
materia viva, por lo que una clula puede ser suficiente para
constituir un organismo.
Todas las clulas proceden de clulas preexistentes, por divisin
de stas .
Las funciones vitales de los organismos ocurren dentro de las
clulas, o en su entorno inmediato, controladas por sustancias
que ellas secretan. Cada clula es un sistema abierto, que
intercambia materia y energa con su medio. En una clula
ocurren todas las funciones vitales, de manera que basta una
clula para tener un ser vivo. La clula es la unidad fisiolgica de
la vida.
Cada clula contiene toda la informacin hereditaria necesaria
para el control de su propio ciclo y del desarrollo y el
funcionamiento de un organismo de su especie, as como para la
transmisin de esa informacin a la siguiente generacin. As
que la clula tambin es la unidad gentica.

CELULA PROCARIOTA
Formas celulares, que carecen de ncleo y
organelas limitadas por membrana.

Los Procariotas son los organismos celulares

ms pequeos y representan el grupo ms
antiguo y ms abundante de los seres vivos.

CELULA EUCARIOTA
Clula que tiene el ncleo y organelas rodeados por una
membrana (Compartamentalizacin), y cromosomas en los que
el DNA est combinado con protenas histnicas.

VIRUS
Partcula de cido nucleco envuelta por una cubierta proteica
(Cpside).
ADN Doble o simple banda
ARN
Las protenas de la cpside (protenas de envoltura) determinan
la especificidad de un virus; una clula puede ser infectada por
un virus si la protena viral puede "encajar" en uno de los
receptores especficos de la membrana celular de ese tipo de
clula.

Crecimiento
Incremento ordenado de todos los constituyentes y estructuras
celulares. En muchos microorganismos, este incremento continua
hasta que la clula se divide en dos nuevas clulas: Fisin binaria.
Tasa de crecimiento
Es el cambio del numero de clulas (Biomasa) por unidad
de tiempo
Tiempo de generacin
Tiempo que tarda una poblacin en duplicarse, o el tiempo
necesario
para
completar
un
ciclo
de
divisin.

Curva de crecimiento
# clulas

t (h)

# clulas

65536

0,5

8,5

131072

262144

1,5

9,5

524288

16

10

1048576

2,5

32

10,5

1572000

64

11

1832000

3,5

128

11,5

2000000

256

12

2100000

4,5

512

12,5

2150000

1024

13

2150000

5,5

2048

13,5

2150000

4096

15

2100000

6,5

8192

15,5

2000000

16384

18

1572000

7,5

32768

Tiempo de generacin 30 min.

1.
2.
3.
4.

2500000

Fase lag o de retraso

Fase exponencial
Fase estacionaria
Fase de muerte

2000000

4
N clulas

t (h)

1500000

2
1000000
500000

1
0
0

10

20
t (h)

30

40

Variacin de la biomasa (nmero de clulas, etc.) de un

cultivo (lnea roja) a lo largo del tiempo. En el medio de
cultivo, el substrato se va consumiendo, por lo que su
concentracin (lnea azul) decrece de forma proporcional
al incremento de la biomasa.

FACTORES QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO

Factores externos

Condiciones ambientales
pH,
Temperatura,
Aw,
O2, y CO2
Nutrientes: Tasa C/N

Factores internos
Capacidad metablica

Temperatura
La temperatura afecta la estabilidad de las protenas
celulares porque induce cambios conformacionales que
alteran su actividad biolgica.
Ejemplo: Enzimas.
Todos los microorganismos tienen una temperatura ptima
de crecimiento. Esto significa que a determinada
temperatura la velocidad de duplicacin (o la velocidad de
crecimiento poblacional) de los microorganismos es mayor.
Adems presentan una temperatura mnima y mxima de
crecimiento.

Clasificacin

Rango de crecimiento

Temp optima

Termfilos

25 - 80 C

50 - 60 C

Mesfilos

10 - 45 C

20 - 40 C

Psicrfilo

-5 - 30 C

10-20 C

 pH
La neutralidad mayora de los microorganismos crecen en pH
cercanos a la, entre 5 y 9.

Fuente de Carbono
Utilizada por los microorganismos para sintetizar los compuestos
orgnicos requeridos para formar las estructuras y realizar las
funciones celulares.

 Actividad de Agua. Presin Osmtica

El agua es el solvente en donde ocurren las reacciones qumicas y
enzimticas de la clula y es indispensable para el desarrollo de
los microorganismos.
La actividad de agua (aW) del medio representa la fraccin molar
de las molculas de agua totales que estn disponibles para ser
utilizadas por los microorganismos.
El valor mnimo de aW en el cual las bacterias pueden crecer vara
ampliamente, pero el valor ptimo para muchas especies es
mayor a 0.99.
Algunas bacterias halfilas (bacterias que se desarrollan en
altas concentraciones de sal) crecen mejor con una aW = 0.80.

 Oxigeno.
Los organismos vivos poseen diferentes requerimientos de oxigeno, pudiendo
clasificarse en:

Aerobios: requieren oxgeno para crecer. Ej. Mycobacterium tuberculosis.

Anaerobios: crecen en ausencia de oxgeno. En presencia de oxgeno su
crecimiento cesa, algunos mueren rpidamente. Ej. Especies del gnero
Clostridium.
Facultativos: pueden crecer en presencia o en ausencia de oxgeno. Ej.Levaduras,
enterobacterias.
Aerotolerantes: crecen en ausencia de oxgeno, pero la presencia de oxgeno no
perjudica su crecimiento.

Microaeroflicos: requieren pequeas concentraciones de oxgeno para crecer.

Medio de cultivo
Mezcla equilibrada de nutrientes que en concentraciones
adecuadas y bajo condiciones fsicas ptimas permiten el
crecimiento optimo de los microorganismos.
Contiene una base mineral, fuente de carbono, nitrgeno y azufre;
atmsfera adecuada y los factores de crecimiento necesarios.

MEDIOS DE CULTIVO
Pueden clasificarse segn:
a) Su consistencia
b) Su utilizacin
c) Su composicin
d) Su origen
SEGN SU ESTADO FSICO (CONSISTENCIA).
1) Medios lquidos.
2) Medios slidos
3) Medios semislidos

SEGN SU UTILIZACIN.
1) Medios
2) Medios
3) Medios
4) Medios
5) Medios
6) Medios
7) Medios
8) Medios
9) Medios

comunes.
de enriquecimiento.
selectivos
inhibidores.
diferenciales.
de identificacin.
de multiplicacin.
de conservacin. ATENDIENDO A SU COMPOSICIN.
de transporte.
1) Medios complejos
2) Medios sintticos
3) Medios Semisintticos.
SEGN SU ORIGEN:
a) Naturales.
b) Sintticos.
c) Semisintticos

Tomado de: http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo.htm

Cultivo de clulas
Eucariotas
Procariotas
Cultivo: Metodologa empleada para la multiplicacin de
clulas u organismos (Eucariotas y/o Procariotas), o para
el crecimiento de tejidos, en el que mediante el uso de un
medio de cultivo se favorece el crecimiento.

Cultivo de clulas Procariotas

Para qu cultivar bacterias?
Investigacin
Comprender los procesos de patognesis, estudios sobre el material gentico,
etc.

Produccin de metabolitos con inters, Biomdico, Farmacutico.

Aplicaciones Industriales, Biomineria, nuevos procesos.

Aplicaciones ambientales en el rea de Biorremediacin y

descontaminacin de suelos y aguas.
Propagacin de especies de inters Agrcola y forestal, Inoculantes
(Leguminosas rhizobium; Maiz y Trigo Azospirillum; micorrizas)

Ventajas
El cultivo puede ser iniciado a partir de una solo clula.

Pocos requerimientos de cultivo.

Medios sencillos, bajo costo
No requieren suplementos especiales
Tiempos de generacin cortos

Cultivo de clulas eucariotas

Cultivo de tejidos
Se refiere al cultivo asptico de clulas, tejidos, rganos
fuera del organismo de origen en condiciones nutricionales
y ambientales controladas.
Clulas Animales (vertebrados o invertebrados)
Clulas Vegetales
Los cultivos celulares producen clones, por lo que todas las
clulas de un cultivo poseen el mismo genotipo, excepto
que se produzcan mutaciones durante el proceso

Para qu cultivar clulas in vitro ?

Investigacin
Comprender la fisiologa celular, Toxicologa, virologa, etc

Ingeniera de tejidos
Piel, hgado, hueso, cartlago, etc
Trasplante de tejidos y rganos

Propagacin de especies de inters Agroforestal

Para qu cultivar clulas in vitro ?

Produccin de insumos biolgicos

Anticuerpos monoclonales
Hormonas (FSH), Enzimas
Vacunas virales (polio, aftosa, parvo, moquillo, etc.)
Protenas recombinantes
Alcaloides, pigmentos, aceites esenciales.

Ejemplos de Lneas celulares.

BHK: Fibroblastos de rin de hamster sirio dorado

CrFK: Fibroblastos de rin de gato domstico
MDCK: Epitelio de rin canino (Cocker Spaniel)
CHO: Epitelio de ovario de hamster chino
VERO: Fibroblastos de rin de mono verde africano
HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano
MDBK: Epitelio de rin de bovino adulto
HUVEC: Endotelio de vena umbilical humana
FHBE: Endotelio de corazn fetal bovino

Colecciones internacionales importantes

Sigla

Nombre u organismo

Ciudad, Pas

N de
cultivos

ATCC

American Type Culture Collection Minassas, USA

800

DSMZ

Human and Animal Cell Cultures

Braunschweig,
Alemania

500

ECACC

European Collection of Cell

Cultures

Salisbury, Wiltshire,
UK

1000

GEIMM

Istituto Giannina Gaslini

Genova, Italia

2300

Fuente: www.biotech.ist.unige.it/cldb/indexes.html
25

Tipos de cultivo

Cultivo primario: clulas, tejidos u rganos tomados directamente de un

animal.

Cultivo de rganos, explantes: mantenimiento de rganos o parte de

rganos in vitro.

Cultivo de tejidos: mantenimiento de tejidos in vitro.

Cultivo de clulas: mantenimiento de clulas dispersas.

Lneas celulares: clulas mantenidas por subcultivos sucesivos

comenzando por un cultivo primario.

Cultivos continuos: clulas que han logrado sobrevivir a muchos

subcultivos. Expectativa de vida infinita.

El soporte de cultivo
Brinda a las clulas, tejidos u rganos en Cultivo el
soporte fsico necesario para realizar sus reacciones
metablicas, desarrollar su metabolismo y desarrollar sus
procesos de crecimiento.
Vidrio
Plstico (poliestireno)
Microsoportes
Sustratos metlicos
Superficies tratadas
Matrices tridimensionales
Haces microcapilares permeables
Nuevos dispositivos

Recipientes de cultivo
Slido: Clulas adheridas a vidrio o distintos tipos de
materiales sintticos.

28

FRASCOS ESTTICOS

BOTELLAS RODANTES (ROLLERS)

Recipientes de
cultivo

Medios de cultivo celulares

CUALIDADES:

31

Especfico para la clula a cultivar

Nutritivo
pH adecuado
Capacidad buffer
Isotnico
Estril

Medios de cultivo celulares

COMPONENTES:

32

Agua
Sales
Glucosa
cidos grasos
Vitaminas
Suero
Pptidos

Micro y oligoelementos
Aminocidos esenciales
Factores de crecimiento
Reguladores del pH
Indicador de pH
Antiespumante
Antibiticos?

Factores crticos
Suero:
Ventajas: Gran aporte de nutrientes bsicos, protenas,
factores de crecimiento, hormonas, promotores de
adhesin, inhibidores enzimticos, etc.
Desventajas: Composicin indefinida, variabilidad entre
lotes, interferente en procesos de purificacin de
protenas, interferente en procesos de multiplicacin viral,
vehculo de entrada de contaminaciones, etc.

34

Factores crticos
Temperatura de cultivo: depende del origen de las clulas.
Mamferos: 37C, peces e insectos: 18-22C, aves: 38.5C, etc.
Contaminacion: importante en los laboratorios de cultivos
celulares, principalmente a escala industrial. Pueden ser por
levaduras, hongos, virus, bacterias, micoplasma, otras clulas,
etc.
Experticia: Contaminacin Operador-Muestra

35

Ventajas
Un solo tipo bien definido de clulas en cada cultivo
Fcil de manipular, condiciones controladas (pH, Temp,
Osmolridad, nutrientes, factores de crecimiento).
Disponibilidad
de
lneas
celulares
internacionalmente, de fcil acceso, validacin

Pueden obtenerse grandes cantidades de clulas

establecidas

Ventajas
Alternativa al uso de animales
Sistema para estudiar, farmacos, cosmeticos, principios
fisiolgicos, citotoxicidad, etc.
Chequeo posterior en un nmero reducido de animales
Permite trabajar en pequea, media y gran escala
Las clulas pueden mantenerse congeladas (N liquido) por
largos perodos de tiempo con mnima prdida de viabilidad

Desventajas
No son animales enteros
Las clulas no estn organizados en verdaderos tejidos

El entorno es distinto
No hay interrelacin con otros tejidos
El comportamiento es distinto a la organizacin tridimensional en un
rgano.

Las condiciones de crecimiento son distintas

Las conclusiones de los ensayos deben ser debidamente
acotadas

Desventajas
Estrictos controles del ambiente: pH, temp, incubacin,
Costos elevados: Equipos, Medios, Suero fetal (Esterilidad
tica)
Inestabilidad Gentica, heterogenidad.

MTODOS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE VIRUS

PARASITOS INTRACELULARES ESTRICTOS

CLULAS VIVAS

ANIMALES DE
LABORATORIO

HUEVOS DE
POLLO
EMBRIONADOS

CULTIVOS CELULARES
Primarios, Secundarios y
Lneas celulares

CULTIVOS
CELULARES

RGANOS y TEJIDOS

Ventajas

Animal bacteriolgicamente estril

Escaso riesgo de virus latentes
Falta de especializacin de los tejidos del embrin
No hay respuesta inmunitaria.
Utilizado en virus con dificultad de replicacin en otros sistemas
Estudio de patognesis
Para atenuar virus
Para pruebas de antigenicidad de vacunas
Para pruebas de agentes quimioterpicos

Desventajas
CUIDADO!!! BIOTICA