Extraccin de ADN

cromosomal a partir de una

muestra de fresa.
HOMOGENIZACIN

Se
congelaron
cuatro
fresas
(Fragaria
ananassa)
durante un da a

Se
descongelaron
las
fresas
(dentro de la
bolsa Ziploc),
minutos antes
de la prctica.

Se prepararon 9 mL de una
solucin de SDS 1%, NaCl
0,25 M. (Ver anexo # 1)

Una vez se descongeladas

las fresas, fueron maceradas
de forma manual hasta
formar un pur.

Se adicionaron
(previamente
bolsa y se
maceracin de

9 ml de la solucin
preparada) a la
continu con la
las fresas.

Se procedi a filtrar el contenido de

la bolsa Ziploc con ayuda de una
gasa y se recolecto en un Beaker de
50 ml.
Se adicionaron aproximadamente 2 ml
de jugo de pia fresco al filtrado
recolectado en el Beaker, se mezclaron y
se dejaron actuar por 15 minutos (1*).
Se transfirieron 8 ml del filtrado a
un tubo falcn de 15 ml.

Se adicionaron 0.6 volmenes de

isopropanol frio (conservado a -20C)
(ver anexo # 2).
Se observ la formacin de
un ovillo por precipitado.

Con ayuda de capilares

se
recolectaron
dos
precipitados
y
se
dejaron secar (pellet).

Se trasladaron cada
pellet a dos tubos
eppendorf de 2 ml
que contenan 800 l
de buffer TE para su
conservacin. As se
obtuvieron
dos
muestras:
- A con
un volumen final de
900 l
- B con un volumen
final de 750 l.
Se almacenaron a

Extraccin de ADN cromosomal a

partir de una muestra de fresa.

PURIFICACION

Se adicionaron 1 volumen de fenol saturado

(ver anexo # 3), a los dos tubos con 900 l y
750 l de ADN disuelto en TE, as como 30 l
y 23 l de NaCl 4M (muestra A y B
respectivamente), se mezcl con ayuda de

PRECIPITACION

Se adicionaron 0,1 volmenes (ver anexo #

6) de acetato de sodio 3M y 2,5 volmenes
(ver anexo # 7) de etanol absoluto fro a
cada muestra (A y B).

Se centrifugaron las muestras (A y B)

durante 8 minutos (*2) a 13.000 rpm
para separar las fases.
Se recuperaron 750 l de la muestra A y 650
l de la muestra B de la fase acuosa y se
transfirieron a dos tubos eppendorf nuevos.

Se adicionaron a los dos tubos eppendorf nuevos, 1

volumen (ver anexo # 4) de la mezcla
fenolcloroformo-isoamilico
(25:24:1),
y
se
mezclaron con ayuda del vrtex. Se separaron las
fases por centrifugacin a 13.000 rpm durante 5
minutos.
Se transfirieron las fases acuosas a dos tubos
nuevos, recuperndose 650 l de la muestra A y
550 l de la muestra B.
Se adiciono 1 volumen (ver anexo # 5) de la mezcla
cloroformoisoamilico (24:1), se mezcl con ayuda de un
vortex y luego se separaron las fases por centrifugacin
durante 3 minutos a 13.000rpm.
Se recuperaron 600 l de la muestra A y 450 l de la
muestra B; los cuales se mezclaron en un solo tubo y luego
fueron dividimos en partes iguales obtenindose dos tubos,
cada uno con un volumen de 520 l de ADN (*3).
DISCUSION

Se mezclaron por centrifugacin a

13.000 rpm durante 10 minutos.

Se eliminaron los sobrenadantes,

invirtiendo cuidadosamente cada tubo
(muestra A y B) para no desprender el
pellet de ADN.

Para lavar el ADN, se adicionaron 300

l de etanol al 70%, a cada muestra.
Se
agitaron
en
vrtex
y
se
centrifugaron durante 5 minutos a
13.000 rpm.

Se elimin el sobrenadante con

ayuda de la micropipeta y se
centrifugo durante 5 segundos a
13.000 rpm (*4).
Se resuspendieron las dos
muestras de ADN en 30 l
de buffer TE.

Se conservaron las dos

soluciones
a -20C para
posterior
evaluacin
electrofortica.

En la extraccin de ADN de tejido vegetal se utiliz la fresa por su alta carga

cromosomal (octaploide) asumiendo que hay ms posibilidades de extraer una
mayor cantidad de ADN, otra razn fundamental es la consistencia del tejido,
que permite acceder al ADN de una manera mucho ms fcil que en otra parte
de la planta (tallo, hojas y races), pudiendo realizar un proceso mecnico por
congelacin para lisar las clulas y maceracin para aumentar la lisis de las
mismas. Otra razn por la que se escogi el fruto es que all el ADN se
encuentra estable, a diferencia del tallo, hojas y races donde se encuentra el
tejido meristemo que est realizando mitosis constantemente lo que hace que
el ADN no sea estable al estar en continua divisin.
Uno de las mayores limitantes en el aislamiento y purificacin del ADN en este
fruto es la presencia de polifenoles y polisacridos; por lo tanto es de
importancia lograr mtodos eficaces y rpidos que den como resultado
muestras puras. La fresa (Fragaria ananassa) al tener un alto contenido de
polisacridos y polifenoles aumentan la viscosidad y disminuyen la calidad del
ADN, interfiriendo en los volmenes de extraccin y posteriormente
amplificacin PCR.
La contaminacin de la muestra con estos compuestos reduce o incluso inhibe
la actividad de las polimerasas de ADN y enzimas de restriccin. Cuando una
muestra de ADN contiene altos niveles de polisacridos, la viscosidad se
incrementa y la propagacin de interferencias en el anlisis molecular de esta
muestra aumenta. Con frecuencia, el volumen exacto de la muestra es difcil
de medir debido a la alta viscosidad y alta interaccin entre enzimas y la
cadena de ADN. Esta clase de compuestos orgnicos cuando se presentan en
su forma oxidada se unen covalentemente a la molcula de ADN produciendo
un precipitado blanco. En consecuencia, la cantidad y calidad de ADN se
reducen despus de la combinacin con los polifenoles.
Un mtodo eficaz para la purificacin de ADN consiste en evitar la degradacin
durante la extraccin y la eliminacin eficazmente de cualquier contaminante
durante los pasos de purificacin. Por lo tanto, la liofilizacin del tejido es un
proceso utilizado para extraer el contenido de agua por sublimacin a baja
temperatura, s se usa antes de la purificacin podra disminuir problemas de
degradacin de la muestra y una sustancia que sea capaz de actuar como
quelante de iones divalentes, evitando la unin a la cadena de ADN con los
polifenoles.
Otro problema que puede interferir en la obtencin de grandes volmenes de
ADN purificado y concentrado, puede estar relacionado con la recoleccin del
sobrenadante en el proceso de purificacin ya que en la interface puede
quedar suspendido ADN que lavado tras lavado va perdiendo volumen, por lo
que es necesaria un adecuado manejo de la micropipeta en la extraccin.

Adems que la degradacin por accin de las DNAsas, uno de los problemas
ms frecuentes fue intervenido con el uso de EDTA el cual inhibe la actividad
de estas protegiendo el ADN. Independiente del tipo del enfoque molecular, la
purificacin de muestras de ADN genmico debe producir suficientes
cantidades de ADN con la pureza adecuada para evitar inhibiciones o
interferencias en reacciones enzimticas durante la amplificacin por PCR,
tales como RAPD, AFLP y el anlisis SSR. Por lo tanto, las medidas adicionales
de liofilizacin anterior y la adicin de SDS al 1% durante la maceracin puede
asegurarse la eficiencia y la fiabilidad, la mejora de la cantidad de ADN
purificado, as como reduccin de los problemas indeseables con el
aislamiento.
La calidad y cantidad de ADN destacan como parmetros limitantes en la
realizacin de pruebas moleculares. Estos a su vez estn influenciados por
mltiples factores: naturaleza, concentracin, temperatura, pH, tiempo de
fijacin, tamao de la muestra.

Se utiliz como muestra la fresa (fragaria ananassa) debido a la

naturaleza de su tejido; ya que al ser blando facilita la extraccin del
ADN, adems porque posee una alta carga cromosmica (octaploide; 56
cromosomas).
Se mantuvo la muestra en congelacin por un da para facilitar la
desintegracin de las clulas provocando una lisis a causa de los
cristales de hielo y adems para evitar la accin de las nucleasas
endgenas las cuales pudieran degradar el ADN, asegurando as la
obtencin de un mayor rendimiento del mismo.
Se agreg una solucin de SDS debido a que este es un detergente
aninico el cual ayuda a la lisis de las membranas dejando libre el ADN
del ncleo. A esta solucin se le adicion NaCl el cual brinda un
equilibrio inico a la solucin.
La formacin de dos fases en el proceso de purificacin, se debe a que
los cidos nucleicos al ser polares y por su fuerte carcter hidroflico
proporcionado por los grupos fosfato, al encontrarse en una mezcla de
solventes no miscibles (uno acuoso y otro orgnico no polar), los cidos
nucleicos permanecern en una fase acuosa, en tanto los lpidos y gran
parte de las protenas desnaturalizadas se encontraran en la fase
orgnica.
Se adiciona zumo de pia debido a que esta fruta contiene una enzima
proteoltica conocida con el nombre de bromelina, la cual es capaz de
desnaturalizar algunas protenas rompiendo sus enlaces, convirtindolas
en aminocidos.

CONCLUSION
Uno de los principales objetivos de la extraccin de ADN es lograr obtener
altos volmenes y un alto grado de purificacin del mismo, sin embargo al
utilizar material vegetal se enfrenta a un gran problema como lo es la

presencia de compuestos no deseables, tales como polifenoles y polisacridos

que aumentan la viscosidad de la mezcla de protenas y ADN, que al momento
de retirar la mezcla en fase acuosa se puede aumentar la perdida de
volmenes, esto combinado con una inadecuada tcnica en la utilizacin de la
micropipeta y la aplicacin errnea del protocolo pueden dar resultados a
degradacin de ADN por DNasas. Al final del procedimiento se logr observar
la formacin de un precipitado, pero para ratificar la presencia de ADN
cromosomal se hace necesaria la posterior evaluacin electrofortica y
espectrofotomtrica.
ANEXOS

Modificaciones (*)

(*1). El tiempo de accin de la bromelina fue mayor (15 minutos) al estipulado

en el protocolo (5minutos) esto debido a que al agregar la enzima la muestra
se encontraba fra inhibiendo la accin de la misma, por lo que la muestra
debi alcanzar una temperatura ambiente incrementando as el tiempo en
contacto con la enzima.
(*2). El tiempo de centrifugacin en la purificacin fue mayor (8 minutos) al
estipulado en el protocolo (5 minutos) porque a los 5 minutos de centrifugado
no se alcanz a obtener una separacin de las dos fases, impidiendo la
recuperacin de la fase acuosa en donde se encuentra el ADN.
(*3). Se mezclaron las dos muestras ya que al agregar el acetato de sodio y el
etanol a la muestra A, se obtena un volumen final de 2160 l los cuales
sobrepasan el volumen mximo (1500 l) del tubo eppendorf necesario para
poder observar la precipitacin del ADN; por lo tanto se mezclaron las muestras
y se dividieron en dos tubos en partes iguales, cada uno con un volumen de
520 l de ADN.
(*4). Se centrifug nuevamente durante 5 segundos para eliminar con mayor
facilidad los partculas liquidas que an quedaban en el tubo humedeciendo el
pellet que para su posterior conservacin deba encontrarse sin y sin residuos
de alcoholes.

Clculos

1. Solucin SDS 1%, NaCl 0,25 M

V1 =

1 x 9 ml
10

= 0,9 ml SDS

V2 =

0,2 x 9 ml
4

= 0,45 ml NaCl

2. Volumen de isopropanol
0,6 volumenes = 4,8 L de isopropanol frio

3. Volumen de fenol saturado

1 volumen

Muestra A = 930 L de fenol saturado

Muestra B = 773 L de fenol saturado

4. Volumen de fenolcloroformo-isoamilico
1 volumen
isoamilico

Muetsra

750

de

fenolcloroformo-

Muestra B = 650 l de fenolcloroformo-isoamilico

5. Volumen de cloroformoisoamilico
1 volumen

Muestra A = 650 l de cloroformoisoamilico

Muestra B = 550 l de cloroformoisoamilico

6. Volumen de acetato de sodio

0,1 volumen = 52 l de acetato de sodio
7. Volumen de etanol absoluto
2,5 volmenes = 1300 l de etanol absoluto