Bombeo de Protones en Levaduras y sus Procesos

Inhibitorios
David Colorado - 10120042, Juan Sebastin Moncaleano
Universidad Icesi
Facultad de Ciencias Naturales
Laboratorio de Qumica General
Santiago de Cali, Colombia
Octubre 22 del 2012
Obituary07@hotmail.com, juan_mon_k@hotmail.com

OBJETIVOS:
Identificar y comprender los
factores por los cuales se inhibe
la
Cadena
de
Transporte
Electrnico.
Analizar, a partir de los cambios
en el pH, la manera en que el
inhibidor afecta al organismo en
su actividad metablico.
RESULTADOS:
Muestra de Levadura sin
Glucosa
pH
Tiempo
(minuto Contr Con
Con
s)
ol
DNP
Azida
0
6,45
5,68
6,3
3
6,32
5,65
6,27
6
6,3
5,66
6,26
Tabla #1: Medidas de pH obtenidos en una
disolucin de levadura con el efecto sobre
el
pH
de
factores
inhibidores
y
desacoplantes de la CTE.

Muestra de Levadura
Glucosa
pH
Tiempo
(minuto Contr
Con
s)
ol
DNP
5
6,37
5,63
10
6,25
5,58
15
6,23
5,6

con

Con
Azida
6,25
6,21
6,2

25
35

6,2
6,14

5,57
5,54

6,16
6,13

Tabla #2: Medidas de pH de una sln de

levadura con glucosa y el efecto de
factores desacoplantes e inhibitorios de
la CTE sobre el pH.

ANALISIS DE RESULTADOS:
El metabolismo puede incluir a
todas las reacciones enzimticas
que ocurren en una clula u
organismo; por lo que el
presente informe se centro
principalmente en el proceso de
fosforilacin oxidativa, en donde
esta
recluido
el
material
biolgico necesario para llevar a
cabo la mayor produccin de
energa, en forma de ATP, en los
organismos que lo emplea, la
gran mayora de los organismos
eucariotas.
Durante la fosforilacin oxidativa
intervienen
una
seria
de
trasportadores y de complejos
multiproteicos, estos trabajan
creando sinergia y acoplamiento
entre sus funciones individuales
creando
una
Cadena
de
Transporte Electrnico (CTE), en
la cual, como su nombre lo
indica, fluyen los electrones
gracias una serie de reacciones
redox a su vez impulsadas por la

diferencia entre los estados de

oxidacin de las molculas que
intervienen ntimamente con el
transporte de los electrones ,
como la Ubiquinona (Q). Es decir
que las reacciones consisten en
enviar los electrones de una
molcula a otra gracias a la
oxidacin de la primera y la
reduccin de la segunda, en
donde la tendencia a reducirse
de las molculas incrementa a
medida que avanza la cadena
favoreciendo la espontaneidad
de las reacciones; en donde el
ltimo aceptor es el O2.
Los complejos multiproteicos se
describen como:
I) NADH-Q Oxidoreductasa.
II) Succinato-Q Reductasa.
III)
Q-Citocromo
Oxidoreductasa.
IV) Citocromo c Oxidasa.
V) ATP sintasa.

Los electrones entran a la CTE

por medio de las molculas de
NADH y FADH2 que se producen
principalmente en la Glucolisis:

A grandes rasgos los electrones

pasan del NADH hacia el
complejo I y del FADH2 al
complejo II, luego, gracias a los
transportadores,
pasan
a
molculas como la Ubiquinona
que los transportan al complejo
III para terminar en el IV donde
finalmente se reduce el O2 a H2O.
Los complejos enzimticos son
protenas
integrales
de
la
membrana plasmtica interna de
la
mitocondria.
El
objetivo
principal del movimiento de los
electrones es crear un gradiente
de pH o fuerza protn-motriz1
entre las dos caras de la
membrana plasmtica interna.
As, el pH en el espacio
intermembrana es mas bajo
(acido) y por lo tanto con altas
concentraciones de H+ mientras
que en la matriz de la
mitocondria el pH oscila entre los
valores de 6 y 7. Como se
esquematiza en la siguiente
imagen:

1Glucosa + 2ADP + 2Pi + 2NAD+

2Piruvato + 2ATP+2NADH+2H++
2H2O
Y durante el Ciclo de Krebs o de
los cidos Tricarboxlicos:
AcetilCoA+3NAD+
+1FAD+1GDP+1Pi+2H2O
2CO2+CoASH+3NADH+1FADH2+1
GTP+3H+

Figura #1:
Electrnico.

Cadena

de

Transporte

Como se explico, los electrones

viajan de un complejo a otro en
el orden seguido por la flecha en
negrita de la siguiente imagen:

Figura #2: Flujo de electrones dentro

de la CTE.

Al final, la fuerza protnmotriz es aprovechada para la

liberacin y sntesis de ATP a
partir de ADP y Pi, por medio de
la accin cataltica de la ATP
sintasa o complejo V. Todo ello
debido a que la fuerza protnmotriz impulsa la entrada de los
protones (H+) a la matriz de la
mitocondria desde el espacio
intermembrana a travs de la
ATP sintasa, lo que tambin
ocasiona que el ATP sea
sintetizado dentro de la matriz
de la mitocondria y luego deba
trasladarse,
mediante
unos
traslocadores, al citosol de la
clula para su uso.
El ATP es la moneda energtica
de la gran mayora de clulas
eucariotas por que su hidrlisis
es
una
reaccin
lo
suficientemente
exergonica
como para que al acoplarla con
otras reacciones endergonicas,
estas
se
de
de
manera
espontanea. Por lo tanto en
procesos como la glucolisis, el

ciclo de Krebs y la CTE

corresponden
a
un
G<0.
Aunque no es la nica molcula
de la cual se puede aprovechar
la energa liberada en su
hidrolisis,
su
potencial
de
transferencia
de
grupos
fosforilo2 es casi que intermedio
dentro de todas las molculas
involucradas en estos procesos
metablicos,
hacindola
reutilizable o reciclable. Su
importancia es tal que los
organismos suelen medir su
carga energtica y controlar
muchos
de
sus
procesos
anablicos y catablicos segn
el balance ATP/ADP que oscila
entre 0 y 1; donde los procesos
anablicos se llevan a cabo con
un balance elevado, igual o
cercano 1 (mas ATP que ADP) y
los catablicos en un balance
disminuido, menor que 1 (mas
ADP que ATP).
Para el presente informe se
parti desde un organismo
eucariota comnmente llamado
levadura, el cual es un hongo
microscpico
unicelular,
presenta
todas
las
vas
metablicas
explicadas
anteriormente y otras vas mas
por las cuales se pueden adaptar
a otros ambientes, por ejemplo
el emplear alcoholes como el
etanol como fuente de carbono,
especialmente
la
especie
Saccharomyces cerevisiae.
Gracias
a
esa
versatilidad
metablica,
este
tipo
de
levadura es capaz de producir
etanol
durante
la
glicolisis
anaerobia de los azucares que

degrada, como la glucosa y la

fructosa, es decir, que es capaz
de producir ATP en ausencia de
oxigeno; aunque sea en menor
proporcin en comparacin con
la Fosforilacin Oxidativa y su
CTE:

Figura #3: Fermentacin alcohlica.

Durante este proceso anaerobio

se producen 2ATPs por molcula
de glucosa, a diferencia de los
36
ATPs
producidos
por
molcula de glucosa en su
degradacin aerobia, que incluye
glucolisis, formacin de AcetilCoA, Ciclo de Krebs y finalmente
fosforilacin
oxidativa,
que
incluye a la CTE.
Es por tanto, la fermentacin
alcohlica, una va alterna por la
cual los organismos como la
levadura
pueden
producir
energa en equivalentes de
ATP sin la presencia de O2;
aunque en menor medida que
los
procesos
aerobios.
Sin
embargo,
la
fermentacin
alcohlica es mucho menos
exigente a comparacin de los
procesos aerobios por cuanto

corresponde a las enzimas y

metabolitos necesarios para su
funcionamiento. Es decir que
aunque
produzca
menos
cantidad de ATP, en la clula no
ser necesario el empleo de
tanta energa, como la que es
necesaria para codificar el
material gentico y sintetizar las
enzimas
de
los
procesos
dependientes de O2.
En
otras
palabras,
los
organismos como la levadura
empleada durante la practica,
optaran por una fermentacin
alcohlica
en
ambientes
carentes de O2 y en ambientes
ricos en glucosa3, y por el
contrario,
realizaran
un
catabolismo
aerobio
de
la
glucosa
cuando
esta
se
encuentre en concentraciones
moderadas o bajas, y en la
presencia de O2.
Durante
la
practica,
las
disoluciones
de
levadura
estuvieron todas expuestas a el
O2, por lo tanto, en principio, en
todas
las
muestras
los
organismos pudieron realizar
tanto catabolismo aerobio como
fermentacin alcohlica.
Para la recoleccin de datos de
la Tabla#1, las muestras con las
disoluciones
de
levadura
carecan de glucosa en el
sistema (ambiente) convirtiendo
como
principal
fuente
de
carbono
las
reservas
de
glucgeno en estos organismos.
Se infiri que en una situacin
como esta, el organismo optara
por un catabolismo aerobio de la

glucosa debido a que de esta

manera puede obtener mas
energa,
no
obstante
la
fermentacin
sigue
siendo
factible en estas condiciones.
De las muestras de las diluciones
de glucosa, una contena un
factor inhibitorio de la CTE y otra
muestra un factor desacoplantes
de la CTE, estos factores eran la
Azida y el 2,4-Dinitrofenol (DNP),
respectivamente.
Como primero tenemos a la
Azida, que acta como un
inhibidor, se une fuertemente al
complejo IV, especficamente,
en la subunidad que contiene a
la forma oxidada del grupo hemo
a3 (Fe3+) y esto impide la
transferencia
de
electrones
desde el hemo a al centro
binuclear4.

Figura #4: Complejo IV de la CTE,

tambin llamado Citocromo c Oxidasa.

Lo anterior quiere decir que

indirectamente la Azida evita

que el O2 sea reducido, y no solo

eso, si no que se pierda parte de
esa fluidez de las reacciones
redox
debido
a
que
los
constituyentes del complejo IV
(hemo a3) no se pueden volver a
oxidar
para
su
posterior
reduccin. Lo que finalmente
desencadena en un decremento
de la capacidad de crear y
mantener
el
gradiente
de
protones, y por lo tanto se
produce una disminucin en la
tasa de ATP producido por cada
par de electrones que se
trasporta.
Termodinmicamente el G<0
se aproximara entonces a cero,
indicando equilibrio y por tanto
inactividad. Sin embargo, cada
levadura
posee
varias
mitocondrias y cada mitocondria
contiene varias CTE y el resto de
material biolgico necesario para
llevar a cabo el catabolismo de
varias molculas de glucgeno
simultneamente. Es por eso
que, y adems de que el tiempo
de exposicin a la Azida no fue
mayor a 6 minutos, se considero
que el efecto de la Azida fue una
inhibicin parcial del catabolismo
aerobia
en
las
levaduras
contenidas en las muestras.
A partir de lo anterior se infiri
entonces que aunque es ms
conveniente para la levadura
obtener energa del glucgeno
por la va aerobia, si esta no esta
funcionando al ritmo que debera
y si con el tiempo esa situacin
empeora, el organismo ah de
llegar al punto en que su
demanda de ATP es mayor que

la cantidad que produce a partir

de la va aerobia debido a su mal
funcionamiento
progresivo;
obligndolo a recurrir a otras
vas, como por ejemplo la
fermentacin alcohlica.
Al analizar la Tabla #1 y
comparar los valores de pH entre
la muestra control y la muestra
con Azida, se pudo observar que
el pH en la muestra con Azida es
menor que el de la muestra
control para todos los intervalos
de tiempo; lo que permiti, al
hacer la correlacin con la
necesidad de la levadura de
emplear
la
fermentacin
alcohlica,
concluir
que
al
incrementarse la produccin de
Etanol y ser liberado al medio
extracelular, el alcohol en el
medio acuoso del sistema se
comportara
como
acido
disminuyendo el pH de la
muestra, en relacin con la
muestra control.
Como segundo tenemos al DNP,
que acta como un desacoplante
de la CTE. Su efecto viene dado
por su capacidad de fijar y
liberar protones de manera
reversible y transportarlos a
travs de la membrana interna
desde el espacio intermembrana
hacia
la
matriz
de
la
mitocondria. Esto resulta en una
disipacin de la fuerza protnmotriz realizando una especie
de cortocircuito en el gradiente
de pH transmembrana y por
ende en su potencial elctrico.
Todo ello se traduce en la
supresin de la sntesis de ATP

por
vas
respiratorias
(dependientes de O2).
En otras palabras, el DNP trae de
vuelta los protones a la matriz
mitocondrial sin la produccin de
ATP, pues a su entrada evitan la
ATP sintasa; quitndole as
fuerza al gradiente de pH.
No obstante, la CTE no se ve
afectada en cuanto a su
funcionamiento, caso contrario a
lo que sucede con la Azida; se
infiri
entonces
que
el
organismo, en este caso debe de
contrarrestar esta deficiencia del
gradiente con la produccin de
ms
H+
en
el
espacio
intermembrana
por
cada
molcula de DNP que entra a la
matriz. Eso quiere decir quede
debe de acelerar la maquinaria
metablica
aumentando
la
produccin de los enzimas
claves de la glucolisis y el ciclo
de Krebs para aumentar el
numero de molculas de FADH 2 y
NADH que participaran el la CTE
y contrarrestar el efecto de el
DNP.
En la Tabla #1 se ve una
disminucin del pH de la
muestra con DNP en relacin a la
muestra control, lo que sugiere
un comportamiento similar al
observado en la muestra con
Azida, es decir, la incorporacin
de la fermentacin alcohlica
para la obtencin de ATP por
parte del organismo. Aun as, el
cambio de pH es mas notable
que el obtenido en la muestra
con Azida, siendo la Azida un
factor mas influyente en la

inhibicin
del
catabolismo
aerobio de la glucosa; por lo cual
se planteo la posibilidad de que
el DNP, al ser un alcohol, en un
medio acuso como el de la
muestra, tambin actu como
acido adems de entrar en las
clulas
de
levadura,
disminuyendo
considerablemente el pH de la
solucin.
Por cuanto corresponde a las
muestras con la disolucin de
glucosa (Tabla #2) presente en
el
medio,
se
obtuvieron
comportamientos muy similares
en comparacin a los datos
analizados de la tabla #1. Lo que
quiere decir que con respecto a
la muestra control, la muestra
con Azida presenta un pH mas
acido debido a que el organismo
opto por el uso de la va de la
fermentacin alcohlica para la
obtencin de ATP y la muestra
con DNP reporta los cambios en
valores
de
pH
considerablemente
menores
debido a que de pro si el DNP
disminuye el pH de la muestra.
Lo que se considero ms
relevante como punto de anlisis
en la tabla #2 son los intervalos
de tiempo en los que cambian
los valores y en que medidas
cambia; es decir, en que
muestras el valor del pH cambia
ms
drsticamente
en
un
intervalo de tiempo.
Se encontr que los cambios
mas fuertes de pH en un
intervalo de tiempo se dan en la
muestra control, lo que apoya la

hiptesis de que en un medio

con exceso de glucosa la
levadura
optara
por
una
fermentacin alcohlica debido a
que el consumo energtico de
esta va es menor que el de la
va aerobia, y puede compensar
la demanda de ATP abusando del
uso de la glucosa en el medio
extracelular;
produciendo
adems etanol, que tambin
puede llegar a ser metabolizado
si es necesario para obtener
energa en equivalentes de ATP,
mediante:

Figura #4: Catabolismo aerobio del

Etanol en levaduras.

El proceso anterior requiere de la

presencia de O2.
Adems, debido a que tanto la
Azida como el DNP tiene su
efecto adverso sobre la CTE, el

gradiente de pH y que por otro

lado el exceso de glucosa
promueve
la
fermentacin
alcohlica; tanto en la muestra
con Azida como en la que
contiene DNP, la disminucin del
pH viene dada por la produccin
de Etanol por parte de las
levaduras. Siendo esta la va
metablica mas factible en las
condiciones
dadas
por
el
experimento.

menor maquina biolgica; pero

en menor proporcin.
Los proceso metablicos como la
glucolisis, el ciclo de Krebs y le
fosforilacin oxidativa, se dan
gracias al acoplamiento entre
sus reacciones. Si se rompe la
sinergia entre estas reacciones,
todo el sistema se vera afectado,
hasta el punto de colapsar.
REFERENCIAS:

CONCLUSIONES:
Los factores desacoplantes e
inhibidores de la CTE pueden ser
contrarrestados por los procesos
metablicos anaerobios.
La fermentacin alcohlica no
solo
confiere
diversidad
metablica al organismo, si no
una va por la cual puede
producir energa mas rpido, con

1) J. M. Berg, J. L. Tymoczko, l.
Stryer;
Bioquimica;
6ta
Edicion;
Revert;
2007;
Barcelona; pp. 502 522.
2) S. Santos de Jess; Anlisis
Cuantitativo y Modelizacin del
Metabolismo de la Levadura
Pichia pastoris; Tesis Doctoral;
2008; Bellaterra Barcelona; pp.
48.