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14: ELISA

La technique de dosage dimmunoabsorption par enzyme lie (en anglais Enzyme-Linked


Immuno Assay) ou ELISA est principalement utilise en immunologie afin de dtecter
et/ou doser la prsence de protines, danticorps ou dantignes, dans un chantillon. Elle
est notamment utilise pour le dpistage du HIV, et permet de dterminer la
concentration srique danticorps dirigs contre le virus.
Il existe plusieurs types de tests ELISA mais le plus couramment utilis et celui que nous
proposons pour ce TP est le test ELISA indirect.
Test ELISA
Le principe de lELISA indirect consiste dtecter la prsence dun anticorps spcifique
dans un chantillon. Pour cela nous avons besoin :
-

Dun antigne connu spcifique lanticorps recherch


Dun chantillon analyser
Dun anticorps secondaire anti IgG coupl une peroxydase (cet anticorps va
reconnaitre spcifiquement les anticorps IgG)
Du substrat spcifique lenzyme, ici du TMB.

Le test comporte quatre tapes principales :


1) Fixation de lantigne : Lantigne connu, spcifique lanticorps recherch, est
incub sur une plaque de microtitration. Lantigne va se fixer de manire
lectrostatique au fond des puits. Ils sont ensuite lavs pour enlever les antignes
non fixs.
2) Fixation de lanticorps doser : On incube notre chantillon doser (srum
contenant lanticorps), ainsi que nos standards (solution contenant des
concentrations connues danticorps). Les anticorps spcifiques vont se fixer aux
antignes. Un lavage des puits est ncessaire pour enlever les anticorps non fixs.
3) Fixation de lanticorps de dtection : On incube ensuite un anticorps secondaire
coupl une peroxydase. Cest un anti IgG qui va donc reconnaitre lanticorps
primaire. Un lavage des puits est ncessaire pour enlever les anticorps secondaires
non fixs.
4) Rvlation : On incube un substrat spcifique lenzyme qui, si la raction est
positive (prsence de lanticorps recherch), va tre transform et induire une
coloration bleue. Lintensit de la coloration est proportionnel la quantit
denzyme prsente et donc la concentration danticorps recherchs.

Dans cette exprience les anticorps titrer vont tre des IgG anti-BSA. Lantigne sera
donc la BSA (albumine de srum de bovin). Lenzyme conjugue lanticorps secondaire
est une peroxydase.

Peroxydase :
La peroxydase est une enzyme de type oxydase, permettant la dgradation des peroxydes.
Loxydation de divers substrats permet dobtenir un compos chromognique comme
produit final.

Cest en 1810, avant mme que la notion denzyme eut t avance, quon constatait que
des extraits de certaines racines de plantes avaient la proprit doxyder (donc de
recolorer) la teinture de gaac (incolore ltat rduit) en prsence deau oxygne.
Actuellement, la source la plus commune de peroxydase est la racine de radis ou de
raifort.

Thmes: anticorps, antignes, peroxydase,

Lexprience
Pour une classe vous recevez une plaque de 96 puits dtachable en colonne de 8 tubes.
Chaque binme fera lexprience avec une barrette de 8 tubes
Protocole
1) Fixation de lantigne
effectuer par lenseignant ou le prparateur la veille de lexprience
Vous recevez une solution de BSA 5g/l

Ajouter 100 l dans les puits (autant de colonne que de binmes)


Placer un film plastique sur la plaque et incuber la nuit 4 (rfrigrateur)
Le lendemain dtacher les colonnes de 8 et les distribuer chaque binme
Prparer les dilutions des standards et de lanticorps secondaire selon le tableau
ci-dessous :

Dilution des anticorps


Les dilutions sont effectuer par lenseignant. Le volume final de chaque dilution est
calcul pas classe. Il convient donc ensuite de faire des aliquots pour chaque binme.

Courbe standard
C1

C2

C3

C4

C5

C6

Anticorps anti-BSA

10 l

2 l

1 l

1 l

1 ml de C4

200 l de C5

PBS

990 l

998 l

1999 l

5 ml

1 ml

1800 l

1 ml

2 ml

2 ml

4 ml

2 ml

2 ml

Total par classe

Distibuer 100 l de chaque standard par binme

Anticorps secondaire:

Anticorps anti-rabbit
PBS

Par classe
1 l
10 ml

Prparer des aliquots de 1 ml par binme

2) Fixation de lanticorps anti-BSA (anticorps primaire)


Les puits 1 6 sont utiliss pour la courbe standard, le puits 7 est le tmoin ngatif et
enfin le puits 8 sera pour notre chantillon doser.

Jeter le reste de liquide lvier ou dans un bcher.


Rincer les puits avec 100 l de PBS 0.02% Tween. Rpter lopration 3 fois.
Ajouter 80 l de chacun des 6 standards, respectivement C1 C6 dans les puits 1
6.
Ajouter 80 l dH2O dans le puits 7 (tmoin ngatif) et 80 l de lchantillon
inconnu dans le puits 8.
Incuber 30 minutes RT

3) Fixation de lanticorps de dtection (anticorps secondaire conjugu la


peroxydase)

Jeter le reste de liquide lvier ou dans un bcher.


Rincer les puits avec 100 l de PBS 0.02% Tween. Rpter lopration 3 fois.
Ajouter 80 l de lanticorps secondaire dans chacun des puits.
Incuber 20 minutes RT

4) Rvlation

Jeter le reste de liquide lvier ou dans un bcher.


Rincer les puits avec 100 l de PBS 0.02% Tween. (3x) puis 1 fois avec PBS.
Ajouter 80 l de TMB dans chacun des puits.
Laisser incuber 5 minutes puis interprter les rsultats.

5) Analyse des rsultats


Daprs lintensit de la coloration bleue dterminer le titre danticorps anti-BSA dans
votre chantillon.
Concentration de la courbe standard
C1
1/100

C2
1/500

C3
1/2000

C4
1/5000

C5
1/10000

C6
1/100000

6) Matriel
Notes : -Le point 1 du protocole est effectuer la veille du TP par lenseignant ou le
prparateur.
-Prparation des standards (C1 C6) et la dilution de lanticorps secondaire
doivent tre prpars par lenseignant ou le prparateur.

P200 et pointes jaunes


Plaque de microtitration (en strip de 8)
Solution de BSA 5 g/l
Anticorps primaire (anti-BSA)
Anticorps secondaire coupl peroxydase
Echantillon doser
TMB (substrat de la peroxydase)
PBS 1x
Tween 20
Falcon 15 ml

Stockage du matriel :

Les anticorps sont stocks -20, dgel sur glace puis remis -20 aprs
utilisation.
Le TMB se garde 4.
La solution de BSA se garde -20.

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