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Universidad Diego Portales

Facultad de Tecnologa Mdica


Caso Clnico Microbiologa

Identificacin de carbapenemasas por


Test de Hodge Triton
Mejoras al Test de Hodge Modificado

Integrantes:

Tutor:

I. Resumen

Rafael Coronado
Daisy Friz
Daniela Troncoso
Jennifer Yaez
Pedro Corts

En el presente informe se analizar el artculo Test de Hodge Triton para mejorar la


deteccin de metalo -lactamasa de tipo Nueva Deli (NDM) y otros productores de
carbapenemasa (2016) publicado en la Revista Journal of Clinical Microbiology. Por otra
parte, en este informe se pretende comparar los mtodos ya existentes empleados para la
deteccin de este tipo de -lactamasas, carbapenemasas, con el nuevo mtodo propuesto
para discutir la eficacia de estos mtodos establecidos en los laboratorios. Finalmente, se
reflexionar acerca del rol del Tecnlogo Mdico frente a este tipo de actualizaciones y la
toma de decisiones de los nuevos mtodos a implementar en los laboratorios.

II. Introduccin
En los ltimos aos la resistencia a los carbapenmicos ha aumentado
considerablemente, esto debido a diversos mecanismos de resistencia por parte de la familia
Enterobacteriaceae y en general en los Bacilos Gram Negativos. El principal mecanismo es
la produccin -lactamasas, enzimas capaces de hidrolizar distintos antibiticos lactmicos. Dentro de la amplia gama de -lactamasas, las carbapenemasa, que se
encuentran en el grupo 2, 3 y 4 de Bush y Jacob y que corresponden a diferentes clases
moleculares de Ambler,
Descritas en Japn en el ao 1991 en Pseudomonas aeruginosa y posteriormente en
diversas especies de enterobacterias como Serratia marcescens. La carbapenemasa
corresponde a una metalo -lactamasa del grupo 3 de clase B denominada IMP. El gen
encargado de este mecanismo es capaz de transferirse a travs de plsmidos. Esta enzima se
ha descrito con mayor frecuencia en P. aeruginosa que en enterobacterias. En el ao 1997
se detect otra enzima con las mismas caractersticas, VIM, en P. aeruginosa,
posteriormente se detect en S. marcescens, E. coli y K. pneumoniae distribuida en distintos
pases de Europa.
Las enzimas IMP y VIM son capaces de hidrolizar a todos los -lactmicos a
excepcin del aztreonam y adems no se inhiben con inhibidores -lactmicos (cido

clavulnico, sulbactam y tazobactam), pero si se inhiben por agentes quelantes de cationes


divalentes

(EDTA) y compuestos

tiolticos

(cido

2-mercaptopropinico, cido

dipicolnico).
Hoy en da hay descritas otras enzimas con similares caractersticas como SPM,
GIM, SIM, AIM, DIM, KHM y NDM-1, las cuales crean un perfil multirresistente o
panresistente en los aislados bacterianos. El descubrimiento de una Klebsiella pneumoniae
que expresaba la enzima NDM fue encontrada en un paciente sueco proveniente de la India.
Hoy en da esta enzima se ha encontrado en otros pases Europeos y en otras especies de
enterobacterias (Escherichia coli) y en Bacilos no Fermentadores (Acinetobacter spp.).
Otro grupo importante de carbapenemasas son las de clase A (dentro del grupo 2).
La primera enzima de esta clase era de origen cromosmico, SME, se encontr por primera
vez en Serratia marcescens, luego en Enterobacter cloacae. De esta enzima existen al
menos 3 variantes capaces de hidrolizar a los carbapenems incluyendo al aztreonam, y en
menor medida a las cefalosporina de tercera y cuarta generacin. Estas no son inhibidas por
EDTA pero frente a los inhibidores de -lactamasas como el tazobactam son capaces de
inhibirlas parcialmente. Otras enzimas, IMI y NMC, fueron encontradas en Enterobacter
sp. Pero la enzima con mayor importancia y que se encuentra en la Clase A es la KPC ( K.
pneumoniae carbapenemasa), primeramente descrita en Estados Unidos en 1996, tambin
se ha aislado en pases Europeos, India y Amrica del Sur. Esta enzima es de naturaleza
plasmdica. No solo se ha descrito en Enterobacteriaceae sino que tambin en otros Bacilos
No Fermentadores (Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumanii).
La enzima KPC es capaz de hidrolizar eficientemente penicilinas, cefalosporinas y
carbapenmicos, en menor medida a las cefamicinas (cefoxitina), no son inhibidas por los
inhibidores -lactmicos pero si por el cido bornico (utilizado fenotpicamente).
El principal mecanismo de resistencia a los antibiticos -lactmicos en
enterobacterias es el enzimtico, debido a la produccin de -lactamasas. stas, debido a su
potencial expansivo y prevalencia han tenido una mayor relevancia clnica en la primera

dcada del siglo XXI, son las que generan resistencia a las cefalosporinas de tercera
generacin, como las -lactamasas de espectro extendido (BLEE), quedando como
alternativa teraputica los antibiticos carbapenmicos, como imipenem, meropenem,
doripenem y ertapenem.
Sin embargo, durante los ltimos aos se ha producido la aparicin y diseminacin
de enterobacterias productoras de enzimas que confieren resistencia a todos los antibiticos
-lactmicos, incluyendo los antibiticos carbapenmicos, lo cual limita de manera
importante el arsenal teraputico frente a estas bacterias. Las enzimas -lactamasas se
dividen en 4 grupos, segn la clasificacin molecular de Ambler, estando presente las
carbapenemasas en 3 de ellos (tabla 1).
Tabla 1. Grupos de -lactamasas y carbapenemasas
Grupo Ambler

Nombre Comn

Serin carbapenemasas

Resistencia a
Carbapenmicos,

Ejemplos Subtipos
KPC, GES, SME1

Penicilinas,
Cefalosporinas,
Aztreonam
B

Metalo

Todos los -lactmicos,

carbapenemasas

excepto Aztreonam

Cefalosporinasas

Penicilinas,

IMP, NDM, VIM, IND

AmpC

Cefalosporinas, incluido
Cefoxitin,

Cefotetan,

Ceftriaxona, Cefotaxima
D

Oxacilinasas

Carbapenmicos,

OXA

Penicilinas,
Cefalosporinas,
Aztreonam

III. Situacin epidemiolgica

En Chile no se haban reportado casos de infecciones por enterobacterias


productoras de carbapenemasas hasta marzo del ao 2012 en que el Instituto de Salud
Pblica de Chile (ISP) confirm el primer caso importado de infeccin causada por
Klebsiella pneumoniae productora de carbapenemasa KPC en un paciente procedente de
Italia. En Abril del ao 2012, se confirma la deteccin del primer caso autctono de
enterobacterias productoras de carbapenemasas, mediante la confirmacin de dos
aislamientos (K. pneumoniae y E. coli) KPC positivas y BLEE positivas, en un paciente de
la Regin Metropolitana, desde esa fecha el ISP ha mantenido la vigilancia de este
mecanismo de resistencia. La diseminacin de la resistencia antimicrobiana representa un
problema de Salud Pblica global, el establecimiento de sistemas de vigilancia y de
confirmacin de mecanismos de resistencia con potencial epidmico constituyen una
valiosa herramienta en las estrategias de control y prevencin frente a esta problemtica
mundial.
La vigilancia de carbapenemasas en enterobacterias, en los laboratorios pblicos y
privados del pas que detecten cepas de Klebsiella pneumoniae, E. coli o Enterobacter spp.
con halos de inhibicin a Imipenem o Meropenem 22 mm o CIM 2 g/mL, deben
enviar estos aislamientos al Laboratorio de Referencia de IAAS del ISP para su
confirmacin microbiolgica y caracterizacin desde el punto de vista fenotpico y
molecular. Se incluyen desde 2014 (Ord. C/160 del 28 de enero de 2014) cepas de
Klebsiella spp. que presenten nivel local pruebas de screening para carbapenemasas
positivas y con algn grado de resistencia a cualquier carbapenmico incluido ertapenem.
Se realiza el estudio de susceptibilidad a -lactmicos por mtodo de difusin y
microdilucin en caldo y/o epsilometra. El tamizaje fenotpico para carbapenemasas
incluye: Test de Hodge Modificado establecido por la CLSI, Test de cido Bornico segn
recomendaciones OPS-ANLIS RELAVRA y mtodo CIM para metalo -lactamasas segn
estndar de la CLSI y a partir del ao 2015 se incorpora el Test Blue-Carba como
screening. Una vez realizado el tamizaje fenotpico, se realiza la bsqueda de genes de
resistencia por mtodos moleculares como la PCR, segn las recomendaciones de OPSANLIS RELAVRA. Los genes blancos incluidos son blakpc, blavim, blages, blasme,
4

blaimp, blaspm, blandm, entre otros. Las cepas que presenten carbapenemasas son
sometidas a un estudio de caracterizacin molecular, el cual incluye la subtipificacin
gentica por electroforesis de campo pulsado (PFGE) y determinacin de tipo de secuencia
(ST) a travs de tipificacin de multilocus (MLST) de acuerdo a protocolos estandarizados.
En el periodo comprendido entre Enero de 2012 y Diciembre de 2014 el laboratorio
de referencia de IAAS recibi 2.557 cepas para la vigilancia de carbapenemasas en
enterobacterias, el 67,9% (1.736) de las cuales procedan de establecimientos de salud de la
Regin Metropolitana, principalmente pertenecientes al SS Metropolitano Sur, que
representa el 15,5% (396) del total de cepas recibidas. Klebsiella pneumoniae representa el
88% (2.249) de las cepas recibidas. De las cepas recibidas en el periodo de estudio se
confirm el 1,3% (34) con presencia de carbapenemasas. Como informacin
complementaria a este boletn, desde el inicio de la vigilancia en el ao 2012 hasta fines de
Abril del 2015, se han confirmado en total 40 cepas con presencia de carbapenemasas. El
94,1% (32) de las cepas confirmadas con presencia de carbapenemasas corresponden al tipo
KPC, 1 al tipo NDM y 1 cepa al tipo OXA. En la tabla 2 se presentan las cepas confirmadas
segn tipo de carbapenemasa y agente.
Las cepas confirmadas con presencia de carbapenemasas tipo KPC presentaron el
siguiente fenotipo: -lactamasa positiva BLEE, Test de Hodge positivo, Test de cido
Bornico positivo y prueba de Blue- Carba positivo.

Tabla 2. Nmero de cepas confirmadas con presencia de Carbapenemasas en


Enterobacterias segn agente. Chile 2012 - 2014.
Agentes

Ao

Total

2012

2013

2014

Klebsiella pneumoniae

12

25

Klebsiella oxytoca

Enterobacter cloacae

Citrobacter freundii

Serratia marcescens

Escherichia coli

Total

13

14

34

Fuente: Laboratorio de Referencia de Agentes de Infecciones Asociadas a Atencin en


Salud, Instituto de Salud Pblica de Chile.

Tabla 3. Caracterizacin Fenotpica de cepas confirmadas con presencia de


Carbapenemasas en Enterobacterias. Chile 2012 - 2014.
Carbapenemasas

BLEE

Test

Tipo

positivo

de

EDTA positivo

cido

Blue Carba

Hodge

Bornico

positivo

positivo

positivo

KPC

32

32

32

32

NDM

OXA

1*

1*

*Positivo dbil. Fuente: Laboratorio de Referencia de Agentes de Infecciones Asociadas a


Atencin en Salud, Instituto de Salud Pblica de Chile.
La cepa de K. oxytoca confirmada en el ao 2013, con presencia de carbapenemasas
present un perfil de resistencia a antimicrobianos inusual, con valores bajos de CIM para

imipenem y meropenem, en el rango de categora sensible, segn CLSI. Este hecho motiv
la recomendacin del ISP para la inclusin de pruebas de screening para carbapenemasas en
Klebsiella sp. aisladas en pacientes de riesgo y que presenten algn grado de resistencia a
cualquier carbapenmico incluido ertapenem (Ord. C/160 del 28 de enero de 2014). No
obstante los valores de CIM obtenidos en este caso, las cepas se informaron como
resistentes a carbapenmicos. Este fenmeno tambin ha sido observado en una de las
cepas de E. cloacae KPC positivo, en la cepa K. pneumoniae OXA positivo y las 3 cepas de
K. oxytoca KPC positivo confirmadas en el ao 2014.
El estudio de caracterizacin molecular en las cepas de K. pneumoniae portadoras
de carbapenemasas, revel un carcter policlonal a travs de la subtipificacin por
electroforesis de campo pulsado. El estudio de tipo de secuencia (ST) detect la presencia
en nuestro pas del ST-258, tipo de secuencia ampliamente reportado en el mundo y con un
marcado componente epidmico. Adems, el estudio de MLST confirm la presencia de un
ST de carcter nacional denominado ST-1161, el cual no haba sido reportado previamente
en la base de datos internacional de MLST.
Existe la presencia de un nuevo tipo de carbapenemasa denominada Nueva Delhi
(metalo -lactamasa), que corresponde a un tipo de carbapenemasa que confiere resistencia
a todos los antibiticos -lactmicos excepto aztreonam. Por ello, los microorganismos
productores de NDM son considerados multi resistentes, dejando muy pocas opciones
teraputicas para tratar a pacientes infectados con estas bacterias. adems, los grmenes
productores de NDM son capaces de lograr una profusa diseminacin tanto a nivel
nosocomial como as tambin en el ambiente extra hospitalario. A diferencia de KPC donde
la dominacin por un nico tipo clonal es lo ms frecuente reportado, los pases que han
documentado la presencia de NDM sobrellevan simultneamente diseminacin vertical
como as tambin horizontal. Este mecanismo de resistencia fue detectado en Guatemala.
Desde 2012 a la fecha se ha detectado en distintos tipos bacterianos como, Klebsiella
pneumoniae, Acinetobacter pittii, Providencia rettgeri. Acinetobacter baumannii,
Escherichia coli y Enterobacter cloacae.

En el ao 2013 el Laboratorio de Referencia de Infecciones Asociadas a la Atencin


en Salud del ISP confirm la primera cepa de Klebsiella pneumoniae portadora de la
carbapenemasa tipo Nueva Delhi metalo -lctamasa 1 en nuestro pas.

Esto fue

pesquisado a travs de pruebas de screening como (test de EDTA para metalo -lactamasas,
test de Hodge y cido Bornico) y pruebas moleculares PCR. Esta cepa fue aislada de un
paciente hospitalizado en un centro asistencial de la regin Metropolitana.
La deteccin exacta de Bacilos Gram Negativos productores de carbapenemasas es
de importancia para el control nosocomial de infecciones y para la pronta iniciacin de una
terapia antimicrobiana correcta. Actualmente la CLSI ha normado diferentes tipos de
screening para detectar este tipo de mecanismos de resistencia, algunos de ellos se
explicarn posteriormente.
IV. Mtodos de screening para bsqueda de Carbapenemasas
EDTA (monodisco)
Mtodo simple y sencillo, utilizado en las pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos para detectar fenotpicamente enzimas metalo -lactamasas (MBLs), estas
enzimas tienen la caracterstica de ser inhibidas por agentes quelantes de zinc, como el
EDTA (cido etilendiamino tetracetico) y el SMA (Mercaptoacetao de sodio).
Llamado doble difusin de discos, segn normas de la CLSI, en el cual se utilizan discos de
imipenem, meropenem y disco de EDTA. El disco de EDTA va colocado al centro y los
otros discos de carbapenem van ubicados uno a cada lado del disco de EDTA con una
distancia de 15 mm (de borde a borde de ambos discos).
Un resultado positivo consiste en la formacin de un conocido efecto huevo, este
se observa al darse agrandamiento de la zona de inhibicin del desarrollo alrededor del
disco de imipenem o meropenem hacia el disco de EDTA.
Test de Hodge Modificado

El test de hodge modificado (THM) es una prueba de seleccin fenotpica para


identificar las cepas productoras de carbapenemasas, recomendada por la CLSI. Esta
prueba se basa en la inactivacin de un carbapenem por cepas productoras de
carbapenemasas, que permite desde una cepa indicadora susceptible el crecimiento hacia un
disco que contiene este antibitico, a lo largo de la estra de inculo de la prueba.
El THM se debe realizar cuando la cepa en estudio presenta un halo de inhibicin
del ertapenem es entre 19-21 mm y/o meropenem es entre 16-21 mm o con una CIM de
ertapenem de 2 ug/ml y/o de meropenem de 2-4 ug/ml, o cuando se presenta resistencia a
una o ms cefalosporina de tercera generacin.
Para este mtodo se utiliza ertapenem o meropenem ya que son antibiticos ms
sensibles pero menos especficos en cuanto a la deteccin de cabapenemasas.
Un resultado positivo para este ensayo indicara la presencia de la enzima, la cual es
capaz de hidrolizar al antimicrobiano favoreciendo as el crecimiento bacteriano e
inhibiendo el efecto de la droga.
Algunas limitaciones que presenta este test:
Considerar que no todas las Enterobacteriaceae que producen carbapenemasas dan positivo
al Test de Hodge Modificado. Puede ser positivo pero por un mecanismo distinto.
Las cepas que den Test de Hodge Modificado positivo deben ser evaluadas con una CIM
antes de informar un resultado de susceptibilidad a carbapenem. De igual forma no se debe
modificar el resultado de la CIM basados en el Test de Hodge Modificado.
Proteus spp, Providencia spp, Morganella spp pueden tener CIM elevadas a imipenem por
mecanismos diferentes al de la produccin de carbapenemasas, por lo tanto el uso del
imipenem por CIM no se ha establecido, adems el uso del disco de imipenem en el test
tiene un pobre rendimiento en la deteccin de carbapenemasas.

Este test no est recomendado por el EUCAST por su baja especificidad y por la dificultad
en la interpretacin de los resultados en bacterias con otros mecanismos de resistencia a lactmicos.
La sensibilidad y especificidad del test en la deteccin de otras carbapenemasas
distintas de la KPC puede variar. Este test ha demostrado tener poca sensibilidad en la
deteccin de la metalo--lactamasa de tipo Nueva Delhi (Clase B), con una sensibilidad por
debajo del 50% debido a que esta carbapenemasa es serino-dependiente, componente
crucial para la resistencia a los antibiticos. Incluso la adicin en medios de cultivo de
sulfato de zinc no pudo revertir los falsos negativos. Estudios realizados indican que la
NDM-1 es una lipoprotena anclada a la membrana externa de las bacterias Gram negativas,
caracterizada como una enzima periplsmica soluble. Esta localizacin celular es
consistente con la presencia de una secuencia de lipidacin cannica, denominada el
lipobox, que se encuentra en una posicin proximal al pptido seal de la NDM-1. Por lo
que esta -lactamasa de anclaje a membrana se opone a la deteccin en el THM.
En este estudio presentado se trata de mostrar que estos falsos negativos del THM pueden
ser atribuibles a la caracterstica de anclaje de NDM-1 .
Test de cido bornico
El cido bornico es un inhibidor selectivo de las carbapenesas tipo A
serincarbapenemasas (KPC, Sme, NMCA), observndose una sinergia entre los discos de
cido bornico y el antibitico carbapenmico. Sin embargo, el cido bornico presenta una
baja especificidad en detectar la presencia de carbapenemasas en cepas que presentan altos
niveles de AmpC como ocurre en Enterobacter sp, Citrobacter sp.
Otros mtodos de bsqueda de carbapemasas:
Carba Blue
Prueba bioqumica para la deteccin rpida de la produccin de carbapenemasas en
Bacilos Gram Negativos directamente de un cultivo bacteriano. Su principio es la hidrlisis

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in vitro de imipenem detectado por el cambio de color del indicador de pH Azul de


Bromotimol, este es 100% sensible y especfico para enterobacterias, Pseudomonas spp y
Acinetobacter spp.
Este test es capaz de detectar carbapenemasas de clase A, incluyendo la enzima KPC de K.
pneumoniae, GES y Sme, con una CIM de imipenem de 0,25 g/ml. Es capaz de detectar a
la enzima OXA (clase D) presente en Acinetobacter y Enterobacteriaceae. Por lo tanto, este
test tiene una especificidad y sensibilidad alta para detectar carbapenemasas y metalo lactamasas con una CIM baja.
Carba NP
La prueba de Carba NP Test (CNPT) es un nuevo protocolo diseado para la
deteccin carbapenemasa a partir de cultivos bacterianos, este es ms fcil de realizar
debido a la utilizacin directa de colonias y ofrece una deteccin ms robusta de las
bacterias productoras de carbapenemasa y reduccin de costes por reaccin.
El CNPT es una prueba bioqumica, un test colorimtrico rpido (2 horas), para la
deteccin rpida de la produccin carbapenemasa en Bacilos Gram Negativos, este test est
basado en la deteccin colorimtrica de la hidrlisis in vitro del imipenem, por un lisado
bacteriano, que se detecta por los cambios en los valores de pH utilizando el indicador Rojo
Fenol (rojo a naranja/amarillo). Cuando se produce esta hidrlisis, hay un cambio de pH y,
en consecuencia, un cambio de color que confirma la produccin de carbapenemasa.
El CNPT se inform ser muy sensible para la deteccin de Klebsiella pneumoniae
productora de carbapenemasa (KPC) y metalo -lactamasas (MBL)

Limitaciones

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Se reportan problemas consistentes para la deteccin de los productores de carbapenemasas


distintas de KPC como OXA-48. Este test tiene una buena especificidad pero baja
sensibilidad para la deteccin del enzima OXA-48
Las carbapenemasas de tipo OXA ms frecuentemente identificados en Acinetobacter spp
requieren condiciones de lisis modificados y un inculo bacteriano aumentado con respecto
a los establecidos por el CLSI para una ptima deteccin de esta actividad.
La limitacin producida ha llevado a la bsqueda de nuevas tcnicas para que se exprese de
mejor manera fenotpicamente, proponiendo una mejora simple y barata denominado Test
de Hodge Triton, que permitira la deteccin de este tipo de carbapenemasas unidas a
membrana.
V. Test de Hodge Triton
La deteccin de carbapenemasas se podra mejorar mediante la adicin de Triton X100 durante la prueba. El Triton X-100, es un surfactante no inico, agente humectante,
emulsificador o detergente suave, usado para desnaturalizar membranas de clulas sin
desnaturalizar la protena, rompiendo el conglomerado de protenas para promover la
actividad enzimtica.
Esta prueba utiliza el mismo principio que el test de hodge modificado, es decir, la
hidrlisis del carbapenems, ya sea ertapenem o meropenem. La diferencia que presenta es
la preparacin de las placas de mueller hinton, en donde se le agrega Triton X-100.
Se realiz un estudio en donde se compar la rendimiento del Test de Hodge
Modificado y el Test de Hodge Triton. Se utiliz una cepa de E. coli con distintas enzimas,
NDM-1 y VIM-2, con variantes de enzima unida a la membrana y soluble. Los resultados
en el THM fueron negativos con las enzimas que estn unidas a la membrana, pero
positivos con las variantes soluble. Por lo tanto, la adicin de TritonX-100, que es capaz de
extraer la metalo--lactamasa de la membrana de la bacteria, mejora el rendimiento del Test
de Hodge, revirtiendo los falsos negativos.

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Test de Hodge Triton


Materiales y Mtodos
Aislamiento bacteriano, cepa de Escherichia coli DH5alfa isognica (isognica, significa
que tiene la misma composicin gentica y del origen), estas cepas isognicas de E.coli
portadoras de variantes nativas (naturales) y quimricas (hbridos de genes de
diferentes microorganismos) de la NDM-1 y VIM-2. Son genes con diferentes
localizaciones celulares que se utilizaron para explorar los efectos del anclaje a la
membrana de estas metalo -lactamasa (MBLs) para as evaluar el rendimiento del test
estudiado.
La cepa de E. coli DH5 fue utilizada para la expresin y propagacin de plsmidos
con el origen de replicacin o pptido nativo de la -lactamasa, su funcin es la de
transferir los plsmidos desde la cepa donadora DH5 a una cepa receptora resultante como
metalo -lactamasa Nueva Delhi (MBL NDM-1) C26A mutante, en donde el lipobox se
interrumpi mediante la sustitucin de algunos aminocidos.
La cepa VDNM-1 y N-VIM-2, fueron creadas con sustitucin en sus cadenas de
aminocidos y fueron sub clonadas en el plsmido pMBLe. Estos plsmidos permitieron la
expresin de variantes unidas a la membrana, es decir nativos NDM-1 y N-VIM-2 y
variante periplsmicas solubles, osea la existencia de VIM-2 nativo, NDM-1 C26A y VNDM-1.

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En la figura se observan, el NDM-1 C26A mutante (creado en el laboratorio) se gener a


partir de estos genes implementados mediante mutagnesis dirigida al sitio de aminocidos,
con los cebadores externos. todas estas construcciones genticas fueron verificadas por
secuenciacin del ADN. posteriormente el plsmido pMBLe se introdujo en la E.coli
DH5alfa.
Recogida de las muestras
Se incluyeron 185 aislamientos clnicos, de las cuales 145 cepas poseen genes que
codifican para carbapenemasas y 40 aislamientos sin produccin de carbapenemasas. Se
identificaron carbapenemasas de los aislamientos tanto de clase A, B y D. los aislamientos
fueron corroborados previamente en equipo MALDITOF MS y solo las cepas que
cumplieron con los valores de corte recomendados por el fabricante para identificacin de
especies fueron integrados al estudio. (estas cepas se aislaron de distintas muestras clnicas:
orina, sangre, respiratorias y otras).
Las CIM utilizadas para la pesquisa de carbapenemasas fueron de imipenem,
meropenem, y ertapenem y se desarrollaron por el mtodo de microdilucin en caldo segn
la CLSI .
Caracterizacin de los mecanismo de resistencia
Se realiz anlisis por PCR seguido de una secuenciacin de ADN para la
caracterizacin de -lactamasas. Adems mediante SDS-PAGE se verificaron los perfiles de
porina de las cepas resistentes a carbapenem pero no productoras de carbapenemasas y, por
otro lado la sobre expresin cromosmica de AmpC se evalu mediante espectrofotometra,
para tener la certeza de que los mecanismos de resistencia a los carbapenem fueran
exclusivamente por carbapenemasas y no haya algn otro mecanismo interferente en el
ensayo.
Adems se realizaron ensayos confirmatorios fenotpicos, donde se utiliz el Agar
Muller Hinton con diferentes concentraciones de Zn (II), debido a que la carbapenemasa

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nueva Delhi es dependiente de Zn, y se llevaron a cabo pruebas con distintas cepas que
producen diferentes clases de metalo -lactamasa.
Resultados
Las metalo -lactamasas que tienen la caracterstica de estar ancladas a la
membrana (NDM-1) da lugar a falsos negativos en el Test de Hodge Modificado. Con el fin
de demostrar el impacto de las MBL que se encuentran ancladas a la membrana y el
rendimiento del THM ante este aspecto. se realiz el THM con una cepa de E.coli DH5alfa
que posee variantes solubles y con la caracterstica de anclaje a la membrana de NDM-1 y
VINM-2

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Resultados del Test de Hodge modificado (THM), representacin A y el Test de


Hodge Triton (THT), representacin B. Se probaron cepas de E. coli DH5-alfa que
expresan variantes solubles periplsmicas y NDM-1 con anclaje a la membrana y la VIM-2
en placas MHA tratadas con el agente tensioactivo no inico Triton X-100. Se utiliz a la
Escherichia coli DH5-alfa con cepas portadoras del tipo nativo y la variante mutada de los
genes NDM-1 y VIM-2. El meropenem (10 g) se utiliz como antimicrobiano. La
localizacin celular (membrana o periplsmica) de las metalo -Lactamasas se representa

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en parntesis. Representada con una p (positivo), indica la hidrlisis del meropenem.


Representada con una n (negativo), indica que no se hidrolizo el meropenem. La flecha
que apunta hacia la invaginacion de la estra indica a las cepas con un Test de Hodge
Modificado negativo que se convirti en positivo al realizar el Test de Hodge Triton.
En el Test de Hodge modificado, el resultado fue negativo para la cepa con NDM-1
nativo unido a la membrana. Pero en el Test de Hodge Triton los resultados fueron positivos
tanto para las variantes periplsmicas, anclada a la membrana y las cepas mutadas.
En la imagen se evidencia la diferencia entre ambos test realizados, pues, la
extraccin de las distintos tipos de metalo -lactamasas unidas a la membrana con un
agente tensioactivo no inico mejora considerablemente el rendimiento del Test de Hodge
Modificado.
VI. Discusin
El Test de Hodge Modificado posee un mal desempeo en la deteccin de
carbapenemasas tipo NDM-1 en comparacin al Test de Hodge Triton. El primero obtuvo
una sensibilidad de 20% al utilizar meropenem y un 32,5% de sensibilidad usando
ertapenem mientras que por el Test de Hodge Triton la sensibilidad fue de un 92,5% con
meropenem y un 100% con ertapenem.
Adems el Test de Hodge Triton obtuvo tambin mejores resultados frente a los
organismos productores de otros tipos de metalo -lactamasas en comparacin con el Test
de Hodge Modificado. y solo una cepa de Pseudomonas aeruginosa con carbapenemasa
tipo IMP-13 mostr un resultado no interpretable con la prueba de Test de Hodge Triton.
El Test de Hodge Triton tambin mostr un rendimiento de sensibilidad comparable
anteriormente pero con las carbapenemasas de clase A, siendo un 100% sensible al utilizar
ambos antibiticos, para otros tipo de metalo -lactamasas como los de clase B, fue de un
98% para meropenem y 97% para ertapenem a diferencia del 75% para meropenem y un
80% para ertapenem en el Test de Hodge Modificado.

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La deteccin eficaz de los productores de carbapenemasa en microbiologa clnica


requiere del desarrollo de mtodos de alta sensibilidad y bajo costo. El ampliamente
utilizado Test de Hodge Modificado falla en la deteccin de la carbapenemasa Nueva Delhi,
que se ha ido convirtiendo en un mecanismo de resistencia temido a nivel mundial. donde
los falsos negativos obtenidos dificultan la pesquisa, identificacin y el trabajo
epidemiolgico del mismo, ello dado la caracterstica de esta carbapenemasa que se
encuentra unida a la membran externa a travs de un resto lipdico unido covalente a un
aminocido, que la hace diferente a las otras carbapenemasas que su unin es a travs del
periplasma.
Se hizo la observacin de que todos los resultados negativos mediante el Test de
Hodge Modificado con la NDM-1, se convirtieron positivos despus de la adicin del
agente tensioactivo no inico Triton X-100 cuya funcin es la de solubilizar las
lipoprotenas de membrana sin desnaturalizarlas. Estos resultados son consistentes con
otros estudios analizados que sugieren que el Triton X-100 es capaz de liberar la NDM-1
preservando en el tiempo la actividad de la -lactamasa para luego ser identificada
mediante el Test de Hodge Triton .

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La adicin de este agente tensioactivo no inico es una estrategia simple y de bajo


costo para mejorar el rendimiento, especificidad y sensibilidad del Test de Hodge
Modificado para la deteccin de NDM. Adems esta modificacin al Test de Hodge
Modificado es capaz de mejorar la deteccin de otras enzimas productoras de
carbapenemasas como las de clase B, A y D. Por otra parte, la deteccin mejorada se
observ tambin en bacterias que no estn incluidas por el CLSI para el tratamiento
mediante Test de Hodge Modificado como las que no son Enterobacteriaceae. Tambin, la
aparicin de una falsa deteccin de la produccin de carbapenemas en el Test de Hodge
Triton que se produjo debido a un doble mecanismo (BLEE/AmpC) fue similar a las
observadas con el Test de Hodge Modificado, por lo tanto el Test de Hodge Triton no es
capaz de discriminar estas cepas productoras de BLEE/AmpC pero siempre ser mejor la
aparicin de un falso positivo que un falso negativo y perder la opcin de pesquisa de una
carbapenemasa.
Segn el estudio, el ertapenem es el mejor sustrato para la deteccin de productores
de carbapenemasa entre las enterobacterias, el uso de meropenem como segundo sustrato,
en un enfoque alternativo para el nmero reducido de aislamientos que requieren
confirmacin por otros mtodos
En base al estudio, podramos realizar recomendaciones a los laboratorios para
mejorar la pesquisa a travs del Test de Hodge Triton. Por un lado la estabilidad de las
placas inoculadas con Triton es de hasta 12 semanas lo que permitir la preparacin
temprana y el correcto almacenaje de alcuotas para la preparacin de las placas previas a
su utilizacin. Tambin, el Test de Hodge Triton se puede realizar sin problemas en placas
de agar Mueller Hinton ya que es lo que se recomienda por la CLSI e incluso en placas con
adicin de Zn para garantizar la actividad de las metalo -lactamasas.

VII. Conclusin

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Las carbapenemasas representan un gran problema en los hospitales de nuestro pas


ya que interfieren en la terapia antimicrobiana, le otorgan a las bacterias capacidad de
resistir la accin de antibiticos como los carbapenem generando as un problema sanitario.
Es por ello que se hace necesaria la pesquisa temprana y efectiva de este tipo de resistencia
puesto que de no hacerlo genera complicaciones y retrasos en la recuperacin de la salud
del paciente.
Con el pasar del tiempo se han desarrollado tcnicas que permiten la deteccin
temprana de estas carbapenemasas y representan una gran ayuda en el laboratorio aunque a
veces su especificidad y sensibilidad no es la adecuada, algunas siguen siendo utilizadas. un
ejemplo es la prueba con EDTA para la pesquisa de carbapenemasas, este es un test rpido,
simple y sencillo en la bsqueda de carbapenemasas, tambin tenemos el Test de cido
bornico que presenta baja especificidad para la pesquisa de -lactamasa tipo AmpC, Por
otra parte, el Carba-Blue es otro de los mtodos utilizados que presenta una alta
sensibilidad y especificidad para la deteccin de carbapenemasas y metalo -lactamasas
con una CIM baja. Sin embargo el Test de Hodge Modificado es el test que ms se realiza
en los distintos laboratorios pero presenta falencias en la deteccin de algunas
carbapenemasas como las NDM que han ido en aumento dentro de los ltimos aos y
generan un dolor de cabeza en cuanto a su pesquisa, es por eso que existe el desafo de
generar tcnicas que entreguen una alta sensibilidad y especificidad para las distintas clases
de carbapenemasas; a raz de esto surge el Test de Hodge Triton que otorga un mejor
rendimiento en cuanto a la sensibilidad y especificidad a la hora de detectar estos
mecanismos de resistencia.
La adicin del Triton X-100 al test de Hogde Modificado representa una forma
simple y barata que permite la deteccin de NDM-1 y al mismo tiempo proporciona una
mejor sensibilidad y especificidad en la pesquisa de otros tipos de carbapenemasas.
Tomando en cuenta la situacin epidemiolgica de las carbapenemasas y su
aumento en los ltimos aos nos alerta a nosotros, como Tecnlogos Mdicos para tomar
medidas e implementarlas en nuestros laboratorios, nos insta a participar y colaborar en el

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desarrollo de nuevas metodologas que ayuden en la pesquisa de los nuevos mecanismos de


resistencia. Se nos invita a participar activamente en los comits de infecciones
intrahospitalarias y a formar parte de un equipo en donde podamos aportar nuestro
conocimiento microbiolgico respecto a los distintos agentes bacterianos y sus mecanismos
de resistencia, todo esto teniendo como objetivo el tratamiento y la recuperacin de la salud
de las personas. Sin duda, el Tecnlogo Mdico tiene un rol primordial que desempear en
este mbito.

VIII. Anexo
Protocolo de implementacin en laboratorio
Deteccin de carbapenemasas mediante Test de Hodge Triton
Este tipo de test permite de mejor manera la deteccin de carbapenemasas tipo Nueva Delhi
(NDM) y otras de importancia clnica como las conocidas KPC, MBLs y OXA48.
Para realizar este ensayo se requiere de los siguientes materiales
-

Triton X-100 (detergente de origen comercial).


Placa de agar Mueller-Hinton (4mm de espesor).
Hisopo estril
Ansa metlica
Suero salino (preparacin del caldo Mac Farland 0,5)
Sensidiscos de carbapenem (ertapenem o meropenem)
Estufa para incubar placas
Cepa de inculo o indicadora Escherichia coli ATCC 25922.
Cepa en estudio o incgnita.

Procedimiento:

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1. Antes de inocular la placa de MHA, se debe eliminar la humedad superficial de la placa,


para ellos se debe incubar a 35C por 10 min aproximado.
2. Luego se debe agregar 50 microlitros de Triton X-100 en la superficie de la placa de MHA.
Este componente debe distribuir rpidamente con el uso de un hisopo estril, por sobre toda
la superficie de la placa. Se debe esperar que se absorba completamente.
3. Se debe eliminar la humedad superficial del agar, incubandolo nuevamente por 10 minutos
a una temperatura de 35C.
4. Realizar una suspensin al 0,5 Mac Farland (turbidez) de la cepa Escherichia coli ATCC
25922
5. Mediante el uso de un hisopo estril se debe extender el inculo de la cepa Escherichia coli
ATCC 25922, por sobre toda la superficie de la placa, segn las recomendaciones indicadas
por la CLSI para el mtodo del antibiograma.
6. En el centro de la placa se colocar un disco de carbapenem (meropenem o ertapenem). El
carbapenem a utilizar vara segn la especie bacteriana a estudiar. Ej: Klebsiella y
Enterobacter ssp se prefiere el uso de meropenem. para Enterobacterias distintas de las
mencionadas anteriormente se recomienda el uso de ertapenem y para Bacilos No
Fermentadores se puede usar indistintamente cualquiera de los dos carbapenem.
7. Con un ansa estril tome de 3 a 5 colonias de un cultivo que est fresco de la muestra a
estudiar. Luego realice una estra desde el borde de la placa hacia el centro donde se
encuentra sensidisco de carbapenem. Puede aplicarse el estudio para 4 cepas por placa.
8. Se debe incubar la placa en atmsfera de aerobiosis a 35C durante 16 - 18 horas.
9. Interpretacin:
- Positivo THT: se observa un sobrecrecimiento de la cepa indicadora hacia el disco de
-

carbapenem en la interseccin de la estra con la zona de inhibicin.


Negativo THT: se observa la zona de inhibicin inalterada en su interseccin con la estra

de la cepa en estudio
Indeterminado THT: se observa una zona clara a lo largo de la estra de la cepa en estudio.
Esto se debe a que algunas cepas pueden producir sustancias que inhiben el crecimiento de
E. coli ATCC 25922.
IX. Referencias
Pasteran, F., Veliz, O., Ceriana, P., Lucero, C., Rapoport, M., Albornoz, E., Corso, A.
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Erwin Landskron, Pedro Cortes. (2014). Capitulo XII. Drogas antimicrobianas.
Clasificacin de antibioticos y quimioterapicos. En Manual de Microbiologa Clnica y
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