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IDENTIFICACIN DE
SECUENCIAS ESPECFICAS
Mnica Bullejos
OBJETIVOS
-
OBJETIVO 1
SABER DETECTAR MOLCULAS DE AANN CON UNA
SECUENCIA CONCRETA A PARTIR DE UN GRUPO
HETEROGNEO DE MOLCULAS,
INDEPENDIENTEMENTE DE CUAL SEA EL MATERIAL DE
PARTIDA
1. INTRODUCCIN
PROBLEMA
grupo
de
molculas
de
AANN
con
secuencias diversas
1. INTRODUCCIN
MATERIAL DE PARTIDA
1. INTRODUCCIN
PASOS A SEGUIR
OBJETIVO 2
CONOCER DISTINTOS MTODOS DE TRANSFERENCIA
DE AANN A UN SOPORTE SLIDO EN FUNCIN DEL
MATERIAL DE PARTIDA
Dot-blot
Slot-blot
*
Gel agarosa
Membrana de nylon
Capilaridad
Vaco
Electrotransferencia
El t t
f
i
Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 13
1 Kg
Soporte de vidrio
Papel absorbente
Solucin
de
transferencia
Soporte
Papel de filtro
Membrana nylon
Gel agarosa con ADN
Papel de filtro
Contenedor
Sol. de transferencia
Gel agarosa + ADN
Mscara impermeable
Membrana nylon
Material poroso
Cmara de vaco
Vaco
Electro-transferencia
Voltaje
+
Sol. de transferencia
Membrana nylon
Gel agarosa + ADN
Papel de filtro
Material poroso
Cassette
Cubeta electroforesis
vertical
DOT-BLOT
O
O
TRANSFERENCIA DE COLONIAS
TRANSFERENCIA A MEMBRANA
SOUTHERN
NORTHERN
WESTERN
CORTES (TEJIDO)
TEJIDOS COMPLETOS
Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 18
3. OBTENCIN DE LA SONDA
Qu es una sonda?
marcada,
d
con
secuencia
i
complementaria
p
a la secuencia q
que q
queremos
detectar
OBJETIVO 3
SER CAPACES DE GENERAR SONDAS MARCADAS
(ADNcs ADNcd,
(ADNcs,
ADNcd ARN)
ARN), TANTO EN FRO COMO EN
CALIENTE
3. OBTENCIN DE LA SONDA
Tipos de marcaje
- CALIENTE: Radioactividad
([32P]-dNTP)
- FRO: Antgeno
(digoxigenina, biotina, fluoresceina)
3. OBTENCIN DE LA SONDA
Mtodos de marcaje
A.
B.
C.
Adicin
de
colas
marcadas
en
3
3
(Oligonucleotide tailing)
D
D.
M
Marcaje
j en 3 (3-End-filling)
(3 E d filli )
E.
Marcaje en 5 (5-End-labeling)
F.
G. Marcaje
G
a caje po
por transcripcin
a sc pc in vitro
to
Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 22
3. OBTENCIN DE LA SONDA
MARCAJE DE LA SONDA - MTODOS
Marcaje en 3 (3-End-filling)
Marcaje en 5 (5-End-labeling)
3. OBTENCIN DE LA SONDA
3. OBTENCIN DE LA SONDA
3. OBTENCIN DE LA SONDA
C. Adicin de colas marcadas en 3
(Oligonucleotide tailing)
3. OBTENCIN DE LA SONDA
D. Marcaje en 3 (3-End-filling)
3. OBTENCIN DE LA SONDA
E. Marcaje en 5 (5-End-labeling)
3. OBTENCIN DE LA SONDA
F. Marcaje por PCR
3. OBTENCIN DE LA SONDA
3. OBTENCIN DE LA SONDA
ARN*
PROMOTOR
SECUENCIA A MARCAR
3. OBTENCIN DE LA SONDA
5
5
3
3
ARN
AAAAAAAAAAAA
**********************
+ POLI-A POLIMERASA
+ ATP*
4. HIBRIDACIN
- Temperatura
- Fuerza inica del medio
- Concentracin de sonda
- Bloqueo
4. HIBRIDACIN
OBJETIVO 4
SABER CMO SE PONE DE MANIFIESTO LA PRESENCIA
DE UNA SONDA MARCADA (FRA O CALIENTE) QUE HA
HIBRIDADO CON SU SECUENCIA COMPLEMENTARIA
INMOVILIZADA SOBRE UN SOPORTE SLIDO
5. REVELADO
Deteccin de la sonda:
- Directa: contador radioactividad
- Indirecta: mediante AUTORRADIOGRAFA
Deteccin de la sonda:
- Indirecta:
5. REVELADO
Revelado inmunolgico
5. REVELADO
Revelado inmunolgico
5. REVELADO
5. REVELADO
C S
5. REVELADO
5. REVELADO
5. REVELADO
5. REVELADO
5. REVELADO
R
Resultado
lt d del
d l revelado
l d inmunolgico:
i
l i
ADN sobre cromosomas (FISH)
5. REVELADO
5. REVELADO
5. REVELADO
Resultado del
revelado
inmunolgico:
g
ARN en cortes
6. RESUMEN SOUTHERN-BLOT
OBJETIVOS
-
BIBLIOGRAFA