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MODULO: 4TO GENETICA Y ENFERMEDADES

MOLECULARES DEL ORGANISMO HUMANOGENETICA DE LOS MICROORGANISMOS
NOMBRE: FATIMA JAZMINA AGUILAR BARRANCOS
FECHA: 21-06-16

PROTOCOLO DEL GEN STAFILOCOCUS AUREUS

El staphilococcus aureus forma parte de la flora habitual en humanos,
sin embargo es de gran importancia clnica, ya que coloniza e infecta
pacientes inmunosuprimidos o inmunocompetentes y se Manifiesta en
su mayora en pacientes hospitalizados y postoperatorios. Produce
patologas diversas desde un absceso de piel hasta septicemias mortales
y shock toxico estafiloccico.
GENOTIPIFICACIN DEL GEN NUC POR PCR.
Para la genotipificacin del gen se obtuvo productos de amplificacin del DNA
por PCR en un volumen final de 25 l.
Primer

Secuencia (5 3)

SANUC-F

GCGATTGATGGTGATACGGT
T

Tamao y
localizacin
279bp (kateete et al,
2010)

Procedimiento para la realizacin de la PCR:

Preparacin de reactivos: Volumen final 25 ul
Primer 1: 5 GCGATTGATGGTGATACGGTT 3
Primer 2: 5AACCGTATCACCATCAATCGG 3

Reactivos
Buffer PCR
Mg Cl 2
d NTPs
Polimerasa
Primer 1
Primer 2
H2O
ADN
muestra

Concentraci
n inicial
10 x
50 mM
10 Mm
5 UI/ul
100 Um
100 Um

Concentraci
n final
1x
1.5 mM
0.2 mM
0.1 UI/ul
0.5 uM
0.5 uM

Volumen /
tubo
2.5 ul
0.75 ul
0.5 ul
0.5 ul
0.125 ul
0.125 ul
18 ul
2.5 ul

Volumen
19 tubos
47.5 ul
14.25 ul
9.5 ul
9.5 ul
2.375 ul
2.375 ul
324 ul

15 pacientes
1 control positivo
1 control negativo
1 control de reactivos
ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA Y REGISTRO
DE IMGENES
Para la separacin y reolucin de los productos de PCR, se
realizaron electroforesis en geles de agarosa al 2%,
preparado con buffer Tris-Borato 0.5 X
Buffer TBE 100 ml al 0.5 X
Colocar: TRIS base pa 108 g
EDTA disodico.2 H2O 7.4 g
cido brico pa. 55 g
Mezclar y calentar suavemente
Hacer pocitos en el gel para la siembra
Colocar 2 ul de muestra en cada pocito y sus controles
Pasos:
1. Desnaturalizacin del ADN doble cadena: La muestra se calienta, en el
primer paso, hasta lograr la separacin de las dos cadenas que
constituyen el ADN.

2. Hibridacin de los iniciadores en zonas especficas de cada una de las

hebras patrn, la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento"
de cada una de dos cadenas cortas de nucletidos (oligonucleridos) con
cada una de las hebras separadas del ADN molde. Se trata de segmentos
de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseados de
manera tal que permiten definir los lmites del tramo de ADN que se desea
replicar

3.

En tercer lugar, una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el

espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias
complementarias de las hebras del ADN molde. Al cabo del primer ciclo de
tres reacciones (desnaturalizacin, apareamiento, extensin) el tramo de
ADN elegido ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de
la aplicacin de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificacin
geomtrica del segmento de ADN delimitado por los primers.

4. Su deteccin y visualizacin se realiza medianteel uso de bromuro de

etidio, fluorescencia o compuestos radioactivos.