CURSO DE POSTGRADO DE MEDICINA

Tcnicas de Biologa Celular y Molecular Utilizadas

en Investigacin Cientfica Bsica y Aplicada

PROTOCOLOS

ACTIVIDAD PRCTICA N 1

INCLUSIN EN PARAFINA
Cortar el material en trozos pequeos
Fijacin
Este paso permite conservar la morfologa y la composicin de los tejidos. Se
sumergen los tejidos en solucin de formol al 4 % con buffer fosfato 0.05 M (PBS)
durante 6 horas, respetando la proporcin recomendada de fijador/muestra (20/1).
Lavar el material fijado con PBS.
Hacer bolsitas de gasa, colocar los tejidos con sus identificaciones y atarlas con hilo de
algodn.
Deshidratacin
La finalidad de este paso es eliminar el agua de los tejidos.
- Colocar las muestras en una serie de alcoholes de graduacin creciente de la
siguiente manera:
Alcohol 70%
30 min. a 1 h
Alcohol 90%
30 min. a 1 h
Alcohol 95%
30 min. a 1 h
Alcohol 100% (1)
30 min. a 1 h
Alcohol 100% (2)
30 min. a 1 h
(el tiempo depender del tamao del material)
Aclaracin
Consiste en embeber la pieza con una sustancia miscible con la parafina
- Clarificar las muestras en dos pasajes sucesivos por Xilol o Benzol durante 30
minutos a 1 hora en cada uno de ellos.
Pre-inclusin
La parafina penetra en los vasos, los espacios intercelulares e intracelulares
haciendo ms fcil la obtencin de cortes en el micrtomo.
- Sumergir las bolsitas en parafina fundida y se dejan 2 horas dentro de la estufa
a 60.
Inclusin
- Colocar en otra parafina fundida y dejar all aproximadamente 2 horas ms.
Confeccin del bloque
- Colocar la pieza en un molde rectangular que contiene parafina fundida, con su
correspondiente identificacin.
Corte
- Enfriar el bloque y la cuchilla
- Colocar en micrtomo y cortar de aproximadamente 4 o 5 m.
- Recoger los cortes con pincel de pelo de marta en una cpsula de Petri que
contenga agua destilada a temperatura ambiente.
- Echar agua caliente por los bordes de la placa de Petri para planchar los
cortes.
- Montar en portaobjetos.
- Dejar secar en estufa a 50 C.

COLORACIN CON HEMATOXILINA/EOSINA

Desparafinizacin e hidratacin
Sumergir los portaobjetos en distintos frascos de siguiente forma:

Xilol (1)
Xilol (2)
Etanol Absoluto (1)
Etanol Absoluto (2)
Etanol 95%
Etanol 70%
Agua destilada

5
5
5
3
3
3
3

minutos
minutos
minutos
minutos
minutos
minutos
minutos

Coloracin
- Colocar los portaobjetos en el frasco con hematoxilina resguardado de la luz
aproximadamente un 1minuto y medio.
- Retirar el exceso con agua destilada
- Virar en agua corriente durante 5 minutos.
- Sumergir en la eosina 30 segundos.
Deshidratacin y montaje
- Deshidratar en serie de alcoholes de graduacin creciente (70%, 90%, 95%)
- Hacer dos cambios en alcohol 100%
- Hacer dos cambios en Xilol.
- Montar con blsamo de canad o entelln.

INCLUSIN EN RESINAS EPOXI

ARALDITA
Cortar el material en trozos pequeos.
Fijar con solucin de Karnovsky modificada (Formol al 4% y Glutaraldehdo al 2%)
por lo menos 4 hs.
Solucin A: Formol al 8%
Formol 25 %
32 ml.
Buffer Cacodilato pH 7,3
68 ml.
Solucin B: Glutaraldehdo al 4%
Glutaraldehdo 10%
40 ml.
Agua destilada
60 ml.
Mezclar en partes iguales solucin A y B en el momento de usar.
Lavar el fijador con agua destilada, dos o tres lavados.
Postfijacin con Osmio
Embeber el material con Tetrxido de Osmio al 1 % diluido en cacodilato 2 horas a
temperatura ambiente en rotor. Este paso debe hacerse bajo campana pues el
Osmio es muy txico.
Hacer rtulos para cada taco con el nombre del material, estos rtulos deben ser
deshidratados juntos con la muestra.
Lavar el osmio con agua destilada.
Deshidratacin
- Colocar los materiales en frascos pequeos y sobre ellos se van haciendo
cambios de acetona de graduacin creciente
Acetona 50%
5 minutos
Acetona 75%
5 minutos
Acetona 90%
10 minutos
Acetona 100%
15 minutos
Acetona 100%
15 minutos

Acetona 100%

15 minutos

Las Acetonas 100% deben ser destiladas y deshidratadas sobre tamiz molecular N
3 (Merk).
Preparacin de la Araldita
La mezcla est compuesta de:
- Araldita 506 (48,5%)
- Anhdrido dodecenilsuccnico(DDSA)(48,5%)
- Diobutilftalato (DBP) (0,5%)
- Acelerador dimetilaminobenceno (BDMA)(2,5%)

5 ml.
5 ml.
0,125 ml.
0, 25 ml.

Infiltracin con plstico-acetona

- Embeber en una mezcla de partes iguales del medio de inclusin y acetona 100%
y dejar en rotor 3 horas como mnimo.
Pre-inclusin plstico puro
- Realizar en mezcla completa de Araldita a temperatura ambiente durante 6-8
horas.
Inclusin
- Incluir en un molde plstico con Araldita, colocando el rotulo de cada material en
la parte central. El material debe ir en la parte distal de cada taco.
- Dejar el molde en estufa de 60 por 48 horas por lo menos.
Corte semifino
- Tallar el extremo del taco en forma de pirmide bajo lupa del ultramicrtomo.
- Colocar en el porta espcimen del ultramicrtomo y ajustarlo.
- Realizar cortes semifinos de aproximadamente entre 240 a 280 nm. de espesor.
- Recoger los cortes con un pelo y colocarlos sobre una gota de agua destilada en
un portaobjeto.
- Desecar en una platina trmica para lograr la adhesin del corte al vidrio.
- Colorear los cortes montados con Azul de toluidina al 1% sobre una platina a 70
C.
Corte fino
- Cortar los tacos con un espesor entre 90 a 120 nm. (color oro plido).
- Montar los cortes con una grilla sostenida con una pinza.
- Guardar las grillas con los cortes finos en un porta-grillas.
- Contrastar con Acetato de Uranilo y Citrato de Plomo.

TCNICA INMUNOHISTOQUMICA PARA DETECCIN DE PROSTATIC

BINDING PROTEIN (PBP)
Desparafinizacin e hidratacin.
Bloqueo de la actividad de la peroxidasa endgena
- Colocar una gota de H2O2 al 3% en metanol por 5 min.
- Realizar 2 lavados con en PBS durante 5 minutos
Bloqueo de uniones no especficas
- Tratar los cortes con suero normal de cabra al 5% en PBS leche al 1,5%,
incubando durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Secar el excedente sin lavar.
Incubacin con anticuerpo primario

- En este caso se utilizar anticuerpo anti PBP. Para ello se realiza una dilucin
1/6000 en PBS-BSA al 1%.
- Colocar 50 l sobre el corte y cubrir con film.
- Incubar 1 hora a temperatura ambiente en cmara hmeda y luego toda la
noche a 4 C.
- Lavar bien con PBS
Sistema de revelado
Antisuero secundario
- Se utiliza un anticuerpo secundario anti-conejo biotinilado en una dilucin de
1:150 en PBS
- Incubar 1 hora a temperatura ambiente
- Lavar bien con PBS.
Sistema amplificador de seal ABC
- Realizar una dilucin de 1/100 en PBS
- Colocar sobre el corte e incubar 30 minutos a temperatura ambiente.
- Lavar con PBS y luego con TRIS-HCl 0,2 M pH 7,6.
Revelado
- Incubar con DAB- H2O2 (2,5 mg. de DAB en 4 ml. de TRIS-HCl 0,2 M pH 7,6 al
que se le agrega 50 l de H2O2 al 3% diluido en agua destilada.) en oscuridad y hasta que
aparezca la marca.
- Frenar la reaccin lavando con agua destilada.
Contracoloracin
- Tratar los portaobjetos con hematoxilina durante 30 segundos.
- Lavar con agua destilada
- Poner los vidrios en agua corriente
- Lavar con agua destilada.
Deshidratacin y montaje
- Deshidratar los cortes en alcoholes de graduacin creciente
- Sumergir luego en 2 Xiloles
- Agregar solucin de montaje y montar con cobre-objetos.

TCNICA DE WESTERN BLOT

Dosaje de protenas
Dosar la cantidad de protenas presentes en la muestra mediante el mtodo
de Bradford.
Tratamiento de la muestra
Colocar 100 l de muestra con 20 l de buffer muestra en un tubo
eppendorff. Calentar en bao de agua a 95 C durante 5 minutos.
Composicin del buffer muestra:
- SDS
- ditiotreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol
- azul de bromofenol
- Buffer Tris-HCl pH: 6.8 (4x)
Preparacin de los geles de poliacrilamida

Las cantidades expresadas son suficientes para preparar 2 geles de 1,5 mm

de espesor empleando vidrios de 8.2 cm x 10 mm (vidrio externo) y 7.2 cm x 10
cm (vidrio externo).

Gel de corrida (15 %)

-

H2O bidestilada: 6.025 ml

2.5 ml Tris-HCl pH:6.8: 3.75 ml
SDS 10 %: 150 l
acrilamida (29.2%)-bis/acrilamida (0.8 %): 5 ml
persulfato de amonio 1 % (preparado en el momento de usar): 112.5 l
TEMED: 11.25 l

Una vez preparado el gel se coloca entre los vidrios (hasta aprox. 5 cm de altura)
y se agrega isopropanol (200 l por gel) para una correcta polimerizacin.
Esperar 20 minutos hasta observar la aparicin de la fase gel y proceder al lavado
del alcohol. Secar y preparar el stacking gel.
Stacking gel (4 %)
- H2O bidestilada: 6.1 ml
- 2.5 ml Tris-HCl pH:6.8: 2.5 ml
- SDS 10 %: 100 l
- acrilamida (29.2%)-bis/acrilamida (0.8 %): 1.33 ml
- persulfato de amonio 1 % (preparado en el momento de usar): 75 l
- TEMED: 15 l
Antes de preparar el gel colocar los peines con la cantidad de calles a sembrar (en
general 10).
Electroforesis
Colocar los geles en la cuba electrofortica y agregar buffer de corrida en cantidad
necesaria.
Sembrar el volumen de muestra correspondiente a la cantidad de protenas
calculada, sembrar marcador de peso molecular y aplicar una corriente constante
(30 mA). Controlar el frente de corrida y detener la electroforesis antes de llegar al
borde inferior del gel.
Transferencia
Eliminar el stacking gel y colocar los geles de corrida en el panel de transferencia
entre dos papeles de filtro con la membrana de nitrocelulosa (o PVDF) de manera
que quede orientada hacia el polo positivo.
Cerrar el panel de transferencia y aplicar una corriente constante de 300 mA
durante 60 minutos. Una vez transcurrido el lapso de tiempo programado quitar
la membrana de nitrocelulosa y realizar un lavado con buffer fosfato salino (PBS).
Para verificar una correcta transferencia colorear las protenas utilizando una
solucin de rojo ponceau (0.3 % en actico al 1 %). Remover el colorante con
lavados sucesivos empleando PBS.
Inmunodeteccin de la protena en estudio

- Bloqueo: Incubar las membranas en un recipiente adecuado durante 1h en

solucin de PBS-Tween 0.1 %-Leche descremada 5 % (buffer de bloqueo) a
temperatura ambiente.
- Incubacin con anticuerpo primario: Incubar las membranas durante 2h en
una dilucin adecuada de anticuerpo primario en buffer de bloqueo a
temperatura ambiente.
- Lavado: Lavar las membranas con PBS-Tween 0.1 % durante 30 minutos
(aproximadamente 5 cambios de solucin de lavado).
- Incubacin con anticuerpo secundario: Incubar con una dilucin adecuada de
anticuerpo secundario acoplado a enzima (generalmente peroxidasa) diluido en
buffer de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavado: Lavar las membranas con PBS-Tween 0.1 % durante 30 minutos
(aproximadamente 5 cambios de solucin de lavado).

Revelado con quimioluminiscencia

El revelado con quimioluminiscencia se lleva a cabo en un laboratorio fotogrfico
en oscuridad siguiendo los siguientes pasos:
1- Preparar reactivo quimioluminiscente (ECL o SuperSignal) de acuerdo a lo
indicado por el fabricante.
2- Colocar reactivos de revelado fotogrfico (revelador, cido actico al 5-8 % y
fijador) en recipientes adecuados.
3- Escurrir la membrana a revelar e incubar con reactivo quimioluminiscente
durante 1 minuto a temperatura ambiente.
4- Colocar la membrana entre dos films transparentes dentro de la caseta de
revelado.
5- Colocar placa fotosensible sobre la membrana (que se halla bajo el film
transparente) y cerrar la caseta; dejar en la misma el tiempo necesario
(dependiendo del antgeno a analizar)
6- Quitar la placa de revelado con cuidado y colocarla en el reactivo revelador, al
observar la aparicin de bandas detener la reaccin con solucin de cido actico
y colocar en fijador de 2 a 5 minutos.
7- Lavar la placa de revelado con agua corriente y dejar secar a temperatura
ambiente.
NOTA: Los pasos 1 a 4 se llevan a cabo con luz natural. Los pasos 5-6 con
ilumincacin de lmpara roja.
Densitometra
Sobre las bandas obtenidas (por triplicado para cada experimento) se hace un
anlisis densitomtrico aplicando el software Scion Image. El valor obtenido
corresponde a un rea debajo de la curva, proporcional a la intensidad de la
banda (y por lo tanto a la concentracin de protena en la muestra).
Finalmente, con los datos obtenidos aplicamos un mtodo estadstico acorde al
diseo experimental ejecutado y expresamos los resultados grficamente
empleando un software apropiado (Sigma Plot o Infostat).

TECNICA DE CULTIVO DE CLULAS ADENOHIPOFISARIAS

-Decapitar los animales, extraer las hipfisis y colocarlas enteras en una cpsula
de petri con medio de cultivo, SMEM. Hasta 30 hipfisis por cpsula.
-Trasvasar las hipfisis con pinza estril a un vial siliconado con 5 ml. de medio
SMEM.
-Pasar con pinza estril a una cpsula de petri plstica y cortar el conjunto de
glndulas en varios sentidos, varias veces.
-Transferir a un tubo de centrfuga con pipeta pasteur
-Centrifugar a 1000 rpm durante 1 min.
-Agregar la tripsina con pipeta pasteur e incubar en dubnoff a 37 C durante 20
min. con agitacin.
-Agregar el inhibidor de tripsina e incubar en dubnoff 3 min.
-Transferir a uno de los tubos de centrfuga con pasteur el material incubado con
tripsina del vial.
Centrifugar a 1000 rpm durante 3 min.
-Decantar y agregar 5 ml. de SMEM (sin resuspender)
-Centrifugar a 1000 r.p.m. durante 3 min.
-Dispersin mecnica con pipetas Pasteur:
Aspirar y expeler con pasteur flameadas de calibre cada vez menor
cinco a seis veces con cada pipeta.
Transferir con la ltima pasteur al tubo de centrfuga con medio
Dulbecco.
-Centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. (el sobrenadante queda turbio por
lpidos)
-Decantar y resuspender en SMEM, aspirar y expeler nuevamente con pipetas
pasteur. Transferir al vial.
-Preparar un tubo de Khan para analizar el rendimiento y la viabilidad celular:
Suspensin celular.........................50 uL
SMEM...........................................250 uL
Trypan Blue..................................200 uL
-Cargar en una cmara de Neubauer una gota de la suspensin. Se cuentan los 4
campos grandes y se saca un promedio. Este nmero se lo multiplica por
100.000 y por los mililitros de la suspensin obteniendo el N total de clulas.
-Suspender las clulas con medio SMEM para tener una concentracin final de
106 clulas/ml.

-Sembrar 0,5 ml. de suspensin de clulas en cada well de 35 mm.

-Agregar 2 ml. de Dulbecco a cada well.
-Cambiar el medio de cultivo a las 72 horas y luego cada 24 horas hasta finalizar
los experimentos.

tripsina 0.4%
20` 37 C

Hipfisis
anterior

Dispersin
enzimtica

Dispersin
mecnica

Siembra

5 x 10 5 clulas
2 ml Dulbecco

Dispersin
celular