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ANALIZADOR DE ELISA

El analizador de ELISA es un espectrofotmetro especializado, se utiliza


para determinar la presencia de anticuerpos o antgenos especficos
presentes en una muestra. Esta tcnica se le conoce tambin con el
nombre de Lector de ELISA.
El analizador de ELISA se utiliza para leer el resultado de las pruebas
efectuadas, la cual tiene aplicacin directa en inmunologa y en
serologa; permite confirmar la presencia en el organismo de anticuerpos
o antgenos de un agente infeccioso, vacunal o autoanticuerpos.
PRINCIPIOS DE OPERACIN
El analizador de ELISA permiten efectuar lecturas en un rango amplio de
longitudes de onda, este dispone de filtros o rejillas de difraccin que
limitan el rango de longitudes de onda a aquellas que se utilizan en la
tcnica ELISA, la cual generalmente se realiza con longitudes de onda
comprendidas entre los 400 y los 750 nm ; la luz que atraviesa la
muestra tiene un dimetro que vara entre 1 y 3 mm. Un sistema de
deteccin recibe la energa lumnica, proveniente de la muestra, la
amplifica, determina la absorbancia y, a travs de un sistema de lectura,
la convierte en datos que permiten interpretar el resultado de la prueba.
Tambin hay analizadores de ELISA que emplean sistemas lumnicos de
doble haz. Las muestras del ensayo de ELISA se colocan en placas de
diseo especial, son comunes las placas de 8 columnas por 12 filas, con
un total de 96 pozos. Tambin existen placas con un mayor nmero de
pozos como por ejemplo 384 pozos.
En la actualidad, los analizadores de ELISA disponen de controles
regulados por microprocesadores, interfases de conexin a sistemas de
informacin, programas de control de procesos y control de calidad que,
a travs del computador, permiten la automatizacin completa de los
ensayos requeridos.
Para desarrollar la tcnica de ELISA se requiere disponer al menos de los
siguientes equipos:
1.
2.
3.
4.

Un analizador de ELISA.
Un lavador de ELISA.
Un sistema dispensador de lquidos.
Una incubadora especializada para las placas.

Cuando se realiza una prueba de ELISA, generalmente se siguen estos


pasos:

1. Utilizando el lavador de ELISA o microplacas, se efecta un primer


lavado de la placa.
2. Mediante el dispensador de lquidos o las pipetas multicanal, se
llenan los vasos o pozos de las placas con las soluciones
preparadas para ser utilizadas en el ensayo.
3. A continuacin, se coloca la placa en la incubadora donde, a
temperatura controlada, se lleva a cabo un conjunto de
reacciones.
4. 4. Finalmente, cuando se han completado las reacciones qumicas,
se lleva la placa al analizador de ELISA y se efectan las lecturas
que permiten emitir un diagnstico.
Se presenta a continuacin un breve resumen de cmo funciona la
tcnica de ELISA, desde el punto de vista qumico
1. Se recubren los pozos de una placa con anticuerpos o antgenos.
2. Se aaden las muestras, controles y estndares a los pozos de la
placa y se incuban a temperaturas que oscilan entre la
temperatura ambiente y 37 C, por un perodo de tiempo
determinado, segn caractersticas de la prueba.
3. Se aade un anticuerpo secundario, denominado el cual tiene una
enzima que reaccionar con un sustrato para producir un cambio
de color.
4. Se inicia entonces un segundo perodo de incubacin, durante el
cual el conjugado se unir al complejo antgeno-anticuerpo en los
pozos de la placa.
5. Se realiza un nuevo lavado para retirar de los pozos de la placa
cualquier vestigio del conjugado no unido.
6. La enzima reaccionar con el sustrato y causar un cambio de
color en la solucin, brindando un medio para medir la cantidad de
conjugado que a la vez dir cunto complejo antgeno- anticuerpo
est presente.
7. Cumplido el tiempo de incubacin, se aade un reactivo para
detener la reaccin sustrato-enzima y prevenir cambios
adicionales de color.
8. Finalmente, se efecta la lectura de la placa en el analizador de
ELISA. Los valores de los resultados se usan para determinar las
cantidades de antgeno o anticuerpo especficos presentes en la
muestra.
Algunos de los pozos en la placa se destinan para colocar estndares y
controles. Los estndares permiten definir los puntos de corte.
SERVICIOS REQUERIDOS

Para que el analizador de ELISA opere correctamente, es necesario


verificar los siguientes puntos:
1. Un ambiente limpio, libre de polvo.
2. Una mesa de trabajo estable. Lo recomendable es que la misma
est alejada de equipos que generen vibraciones.
3. Una fuente de suministro elctrico de acuerdo con las normas y
estndares implementados en el pas.
La calibracin de un analizador de ELISA es un proceso especializado
que debe realizar
Para efectuar la calibracin se requiere disponer de un juego de filtros
grises, los cuales se encuentran montados en una placa de igual
geometra a las utilizadas para efectuar los anlisis.
Los filtros de calibracin disponen de al menos tres valores de densidad
ptica, reestablecidos dentro de los rangos de medicin; uno bajo, uno
medio y el ltimo, un valor alto.
Para efectuar la calibracin se realiza el siguiente proceso:
1. Colocar el filtro de calibracin en el equipo.
2. Efectuar una lectura completa con el filtro de calibracin. Verificar
si se presentan diferencias en las lecturas obtenidas de canal a
canal
3. Verificar si el lector est descalibrado.
4. Si no se dispone de filtro de calibracin, verificar la misma
colocando una solucin de color en los pozos de una placa y
efectuando en seguida una lectura completa. Luego invertir la
placa 180 y efectuar una nueva lectura. Si ambas lecturas
presentan valores promedio idnticos en cada fila, el analizador se
encuentra calibrado.
5. Verificar si el desplazamiento de la placa se encuentra calibrado,
columna por columna.
Colocar una placa vaca y efectuar las lecturas.
Si no se observan diferencias medias entre las lecturas de columna a
columna de la primera a la ltima, podra asumirse que el avance se
encuentra calibrado.
RUTINAS DE MANTENIMIENTO
Las rutinas que se describen a continuacin
exclusivamente al analizador de ELISA.

estn

enfocadas

1. Revisar que los sensores pticos de cada canal estn limpios. Si se


detecta suciedad, limpiar con un pincel la superficie de las
ventanas de los emisores de luz y de los sensores.
2. Confirmar que el sistema de iluminacin est limpio.
3. Verificar que la calibracin del analizador es adecuada.
1. Las lecturas deben ser idnticas. Si no lo son, invertir el mdulo y
repetir la lectura, a fin de determinar si la desviacin se origina en
el mdulo o en el lector.
4. Examinar el avance automtico de la placa.
Mantenimiento preventivo
1. Verificar la estabilidad de la lmpara. Usar el filtro de calibracin,
efectuando lecturas con intervalos de 30 minutos o una misma
placa. Comparar las lecturas. No deben existir diferencias.
2. Limpiar los sistemas pticos de los detectores y los sistemas de
iluminacin.
3. Limpiar el mecanismo de avance de la placa.
4. Verificar la alineacin de cada pozo con los sistemas emisores y
detectores de luz.

LAVADOR DE ELISA
Est diseado para efectuar las operaciones de lavado que se requieren
cuando se utiliza la tcnica de ELISA. El equipo efecta el lavado de los
pozos que contienen las placas de ELISA, durante las diferentes etapas
de la tcnica.
El lavador de ELISA ha sido diseado para realizar las operaciones de
lavado que se encuentran involucradas en la tcnica de ELISA.
El equipo dispone de al menos los siguientes subsistemas que varan en
diseo dependiendo del fabricante:

Subsistema de control. Por lo general, es controlado por


microprocesadores y permite programar y controlar las actividades
que debe realizar el lavador como el nmero de ciclos de lavado
requeridos3 (1-5), los tiempos de espera, las presiones de
suministro y de extraccin, el tipo de placa utilizada (96 384pozos); ajusta la funcin de succin segn la forma del pozo4
fondo plano, fondo en V, fondo redondo o tiras utilizadas; regula
los volmenes dispensados y/o aspirados, los tiempos de remojo y
agitacin, entre otros.
Subsistema de suministro. Por lo general, est compuesto por un
depsito para la solucin de lavado, una o varias bombas,
usualmente de desplazamiento positivo tipo jeringa y una cabeza
dispensadora.
Subsistema de extraccin. Requiere de un mecanismo de vaco y
de un sistema de almacenamiento para recolectar los fluidos y
desechos retirados de los pozos de las placas.
Subsistema de avance. Est compuesto por un mecanismo que
desplaza horizontalmente la cabeza de suministro y extraccin,
para poder llegar en la placa de ELISA a cada uno de los pozos;
cuando se ha efectuado el desplazamiento horizontal a la
siguiente fila, se realiza un movimiento vertical hacia los pozos,
con el fin de dispensar y/o extraer la solucin de lavado.

Calibracin del lavador


El lavador de ELISA resulta crtico para garantizar que la tcnica de
ELISA funciona de forma apropiada.
Posicin de las agujas (cabeza de suministro y aspiracin).
Se debe verificar con cuidado el ajuste de la posicin
horizontal y vertical respecto de los pozos. Si la placa tiene
pozos de fondo plano, se debe verificar que la aguja de
aspiracin se encuentre ubicada
Tiempo de aspiracin. Ajustar el tiempo de aspiracin de
forma que resulte adecuado, para que la pelcula de solucin
adherida a la pared del pozo pueda fluir hasta el fondo del
mismo. Volumen dispensado. Verificar que el volumen
dispensado est lo ms cerca posible del volumen mximo
del pozo; confirmar que todos los pozos se llenen de forma
homognea
Vaco. El sistema de succin debe estar graduado de forma
adecuada. Si el vaco es muy alto, puede alterarse la prueba,
pues
podran
secarse
los
pozos
y
debilitar
considerablemente la actividad de la enzima en los pozos,

alterando por completo el resultado de la prueba. La


mayora de los lavadores funcionan bien con un vaco que
oscila entre el 60 y 70 % de la presin atmosfrica. En
algunos lavadores, el vaco se produce en una bomba
externa que opera como un accesorio del lavador y su
operacin es controlada desde el lavador, lo que implica que
la bomba de vaco opera nicamente cuando se requiere.
Verificacin del proceso de lavado
Para verificar si el proceso de lavado se realiza de acuerdo con las
especificaciones exigidas por la tcnica de ELISA, los fabricantes de
pruebas de ELISA han desarrollado procedimientos que deben ser
efectuados de forma regular. Uno de los controles5 se basa en la
utilizacin del reactivo Peroxidasa, el cual se dispensa mediante una
pipeta en los pozos de la placa para ser ledo a 405, 450 y 492 nm.
La intensidad del color resultante est directamente relacionada con la
eficiencia del proceso de lavado.
1.
2.
3.
4.
5.

Verificar el volumen dispensado.


Comprobar la uniformidad del llenado.
Verificar la eficiencia del subsistema de aspiracin.
Confirmar la limpieza de las agujas de suministro y extraccin.
Limpiar el lavador con agua destilada despus de haberlo
utilizado, para remover cualquier vestigio de sal en los conductos
de los subsistemas de suministro y extraccin.
6. Verificar la limpieza del cuerpo del lavador.
Si es del caso, limpiar las superficies exteriores con una pieza de tela
humedecida, con un detergente suave.
Mantenimiento preventivo
Frecuencia: Trimestral
1. Desensamblar y limpiar los conductos y conectores. Verificar la
integridad de los mismos. Si de detectan fugas o vestigios de
corrosin, ajustar o reemplazar.
2. Verificar la integridad de los componentes mecnicos. Lubricar de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Comprobar el ajuste de cada uno de los subsistemas. Calibrar de
acuerdo a las recomendaciones del fabricante.
4. Confirmar la integridad del conector elctrico y el cable de
interconexin.
5. Verificar la integridad del fusible, y que sus puntos de contacto
estn limpios.