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DIU d’Hémostase – Lyon 2014

Diagnostic des anomalies de

l’ADAMTS13

Agnès Veyradier

Hôpitaux Universitaires Paris-Sud Service d’Hématologie biologique, site Antoine Béclère Inserm U770, site de Bicêtre

Universitaires Paris-Sud Service d’Hématologie biologique, site Antoine Béclère Inserm U770, site de Bicêtre
Universitaires Paris-Sud Service d’Hématologie biologique, site Antoine Béclère Inserm U770, site de Bicêtre

Etudes hémorhéologiques des années 1980

Le facteur Willebrand (VWF) est la protéine indispensable

à l’adhésion plaquettaire au sous-endothélium et à l’agrégation plaquettaires dans la microcirculation sanguine

Agrégation

plaquettaire

Adhésion

plaquettaire

Plaquette Plaquette fibrinogène VWF Plaquette Brèche vasculaire VWF Endothélium Matrice sous-endothéliale
Plaquette
Plaquette
fibrinogène
VWF
Plaquette
Brèche
vasculaire
VWF
Endothélium
Matrice
sous-endothéliale

VWF : structure multimérique

VWF : structure multimérique Dimère : 500 kDa Tetramère : 1000 kDa Hexamère : 1500 kDa
VWF : structure multimérique Dimère : 500 kDa Tetramère : 1000 kDa Hexamère : 1500 kDa

Dimère : 500 kDa

Tetramère : 1000 kDa

Hexamère : 1500 kDa

Dimère : 500 kDa Tetramère : 1000 kDa Hexamère : 1500 kDa Régulation physiologique de la
Dimère : 500 kDa Tetramère : 1000 kDa Hexamère : 1500 kDa Régulation physiologique de la
Régulation physiologique de la taille des multimères du VWF
Régulation physiologique
de la taille des multimères du VWF

Multimère > 20 000 kDa

VWF : sensibilité conformationnelle aux taux de cisaillement du flux sanguin

conformationnelle aux taux de cisaillement du flux sanguin Multimère de VWF déplié Multimère de VWF globulaire
conformationnelle aux taux de cisaillement du flux sanguin Multimère de VWF déplié Multimère de VWF globulaire
conformationnelle aux taux de cisaillement du flux sanguin Multimère de VWF déplié Multimère de VWF globulaire

Multimère de VWF déplié

Multimère de VWF globulaire

conformationnelle aux taux de cisaillement du flux sanguin Multimère de VWF déplié Multimère de VWF globulaire

La protéase de clivage du VWF : Historique

1996.

Purification partielle à partir du plasma humain

1997.

Méthode de dosage fonctionnel dans le plasma

1998.

Modèle de pathologie humaine : le PTT

2001.

Séquence peptidique (famille ADAMTS) : ADAMTS13

2001.

Gène

2001.

Lieu de synthèse

Depuis 2001.

.

Relations structure / fonction

.

Régulation

.

Rôle en physiologie et pathologie humaines

ADAMTS13

.

Gène : chromosome 9 - 29 exons - ARNm 4,6 kb (clonage 2001)

.

Biosynthèse : c de Ito du foie, c endothéliales, plaquettes

.

Sécrétion dans le plasma (conc : 1 µg/ml; demi-vie : 1 semaine)

.

Normes dans le plasma : 50 150 %

.

Structure :

Métalloprotéase de la famille ADAMTS

 

(A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin type 1 motifs)

Glycoprotéine monocaténaire de 190 kDa - 1427 ac am

.

Fonction :

Protéase spécifique de clivage du facteur Willebrand

La famille ADAMTS

La famille ADAMTS

Structure d’ADAMTS13

N

Site catalytique

Récepteurs cellulaires (CD36 endothélial)

(Ca ++) (Zn ++) Metalloprotease Desint. TSP Cys Spacer TSP TSP TSP 1 2 3
(Ca ++)
(Zn ++)
Metalloprotease
Desint.
TSP
Cys
Spacer
TSP
TSP
TSP
1
2 3
4
RGDS
TSP
5
Intégrines
TSP
6
TSP
Chaîne 3 des intégrines
7
TSP
8
CUB
CUB

?

C

Domaines d’interaction entre ADAMTS13 et son substrat

Partie N-terminale indispensable au clivage du VWF in vitro

ADAMTS13

TSP 1 métallo désint Cyst. spacer
TSP 1 métallo désint Cyst. spacer
TSP 1 métallo désint Cyst. spacer
TSP 1 métallo désint Cyst. spacer
TSP 1
TSP
1

métallo

désint

TSP 1 métallo désint Cyst. spacer
TSP 1 métallo désint Cyst. spacer

Cyst.

TSP 1 métallo désint Cyst. spacer
TSP 1 métallo désint Cyst. spacer

spacer

TSP 1 métallo désint Cyst. spacer
TSP 1 métallo désint Cyst. spacer CUB CUB Liaison en flux in vitro Tyr842-Met843 Facteur
CUB CUB
CUB
CUB
1 métallo désint Cyst. spacer CUB CUB Liaison en flux in vitro Tyr842-Met843 Facteur Willebrand

Liaison en flux in vitro

Tyr842-Met843

Facteur Willebrand (VWF) D’ D3 A1 A2 A3 D4 B1 B2 C1 C2 CK [monomère
Facteur Willebrand (VWF)
D’
D3
A1
A2
A3
D4
B1
B2
C1
C2
CK
[monomère = SU mature]
VWF73
842-843
EQAPNLVYM VTGNPASDEIKRLPGDIQVVPIG VGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQR
833
905

VWF73 = Substrat minimal pour ADAMTS13 in vitro

Fonction du couple VWF-ADAMTS13

Multimères de HPM de VWF Cellules endothéliales Sécrétion des multimères de THPM à partir des
Multimères de HPM de VWF
Cellules
endothéliales
Sécrétion des multimères
de THPM à partir des corps
de Weibel-Palade

Sujet Normal

Multimères de VWF clivés

CD 36 ?

Cellules

endothéliales

Fonction du couple VWF-ADAMTS13

Sujet Normal Plaquettes
Sujet Normal
Plaquettes
Patient atteint de PTT Agrégation spontanée des plaquettes Libération de thrombi CD 36 ?
Patient atteint de PTT
Agrégation spontanée
des plaquettes
Libération
de thrombi
CD 36 ?

Variations physiologiques d’ADAMTS13

Conditions ayant en commun une augmentation physiologique du taux de VWF : diminution d’ADAMTS13

. Âges extrêmes de la vie : nouveau-nés et sujets âgés

ADAMTS13 plus basse de 10-20% p/r à la population générale

. Sujets noirs

ADAMTS13 plus basse de 10-20% p/r aux sujets blancs

. Au cours de la grossesse

ADAMTS13 diminue progressivement à partir de 12 SA pour atteindre à terme, des taux inférieurs de 15-20% p/r au taux de base de la patiente

Déficits fonctionnels en ADAMTS13

I- Déficits partiels en ADAMTS13 (Activité entre 10 et 45%)

. Non spécifiques, retrouvés dans de nombreuses pathologies :

sepsis sévère, hépatopathies, HTA maligne, paludisme, MAT

telles que SHU, HELLP syndrome, PTT « non classiques » associés

aux greffes d’organes, aux cancers, au VIH…

.

Pertinence clinique ???

.

Mécanismes : consommation par excès de substrat, diminution de

synthèse/sécrétion, inhibition catalytique par IL6, dégradation

protéolytique par enzymes protéolytiques (thrombine, élastases leucocytaires…)

II- Déficit sévère en ADAMTS13 (Activité <10%)

.

Pathognomonique du PTT

.

Marqueur diagnostique sensible et spécifique

.

Marqueur pronostique probable

.

Mécanismes : auto-anticorps ou mutations génétiques

PTT : définition

.

Anémie hémolytique mécanique (schizocytes)

.

Thrombopénie de consommation

. +/- ischémie multiviscérale (cerveau, rein…)

mécanique (schizocytes) . Thrombopénie de consommation . +/- ischémie multiviscérale (cerveau, rein…)

Thrombi de la microcirculation dans différents organes

d’un patient atteint de PTT

rein

colon

coeur

microcirculation dans différents organes d’un patient atteint de PTT rein colon coeur surrénale pancréas foie
microcirculation dans différents organes d’un patient atteint de PTT rein colon coeur surrénale pancréas foie
microcirculation dans différents organes d’un patient atteint de PTT rein colon coeur surrénale pancréas foie

surrénale

pancréas

foie

microcirculation dans différents organes d’un patient atteint de PTT rein colon coeur surrénale pancréas foie
microcirculation dans différents organes d’un patient atteint de PTT rein colon coeur surrénale pancréas foie
microcirculation dans différents organes d’un patient atteint de PTT rein colon coeur surrénale pancréas foie

PTT : historique, épidémiologie

.

Historique

.

Adulte : Syndrome de Moschcowitz (1924)

.

Enfant : Syndrome d’Upshaw-Schulman (1960)

.

Prévalence 4 à 10 cas / million d’habitants / an

-

(maladie rare)

.

Age de révélation (1ère poussée) Enfance (naissance -> adolescence) : <10% des cas Adulte : 30-40 ans, sex ratio 2F/1H : >90% des cas

.

Evolution par poussées (entrecoupées de rémission)

. sporadiques

. récurrentes (parfois familiales)

. Formes cliniques

. Idiopathiques (~50% des cas)

. Secondaires : infections, grossesse, MAI, médicaments… (~50% des cas)

Les grandes étapes de la

compréhension physiopathologique

du PTT de 1982 à 2001

Structure multimérique du VWF plasmatique

dans le PTT

- multimères de THPM - dimère
-
multimères
de THPM
- dimère

+

PTT

Normal

Moake et al, Blood 1982

Histopathologie du PTT

Microangiopathie thrombotique

Micro-

vaisseaux

Thrombi de plaquettes + VWF
Thrombi de
plaquettes + VWF
souffrance endothéliale
souffrance
endothéliale
thrombotique Micro- vaisseaux Thrombi de plaquettes + VWF souffrance endothéliale Asada et al, Thromb Res 1985

Asada et al, Thromb Res 1985

Physiopathologie du PTT (1)

Purification d’une protéase spécifique de clivage du VWF : VWF-CP

Furlan et al, Blood 1996

L’activité plasmatique de la VWF-CP est effondrée (<5%) chez les patients atteints de PTT

Furlan et al, Blood 1997

Le déficit fonctionnel sévère de la VWF-CP dans le PTT est :

. soit acquis par le biais d’auto-anticorps spécifiques . soit probablement constitutionnel (cas familiaux)

Furlan et al, NEJM 1998 Tsai et al, NEJM 1998

Physiopathologie du PTT (2)

Le clonage du gène de la protéase spécifique de clivage du facteur Willebrand a permis :

. de l’identifier comme le 13ème membre de la famille ADAMTS

(A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin

type 1 repeats) : ADAMTS13

. de montrer qu’il existe bien des cas héréditaires de PTT

par le biais de mutations récessives du gène d’ADAMTS13 :

maladie orpheline = Syndrome d’Upshaw-Schulman

Levy et al, Nature 2001

Physiopathologie du purpura thrombotique thrombocytopénique

Déficit fonctionnel sévère <10% en ADAMTS13

Acquis

(auto-anticorps anti-ADAMTS13)

Héréditaire

(mutations du gène d’ADAMTS13)

Héréditaire (mutations du gène d’ADAMTS13) Accumulation de très grands multimères du VWF très

Accumulation de très grands multimères du VWF très adhésifs

en circulation dans le plasma

Formation spontanée de thrombi plaquettaires

dans la microcirculation sanguine

Anémie hémolytique mécanique Thrombopénie de consommation

sanguine Anémie hémolytique mécanique Thrombopénie de consommation Ischémie multiviscérale Facteurs favorisants

Ischémie

multiviscérale

Facteurs favorisants

Le PTT lié à un déficit sévère

héréditaire en ADAMTS13

Syndrome d’Upshaw-Schulman

Syndrome d’Upshaw-Schulman

Epidémiologie

.

Maladie orpheline :

moins de 10% de tous les cas de PTT

prévalence <0,5 pour 1 million

.

Une centaine de patients décrits dans la littérature

.

Répartition mondiale ubiquitaire :

Amérique du Nord (USA, Canada)

Europe (UK, France, Allemagne, Autriche, Suisse, Italie, Portugal, Yougoslavie, Suède)

Asie (Japon, Chine, Iran, Koweit, Turquie)

Australie

Afrique (Maghreb)

Peu de mutations d’ADAMTS13 communes entre les différents pays

Syndrome d’Upshaw-Schulman Phénotype clinique variable

.

Age de révélation

. à la naissance +++ (ictère, hémolyse, thrombopénie)

. dans la petite enfance ++

. à l’âge adulte : mutation R1060W, grossesse

.

Sévérité des poussées . bicytopénie hématologique … … ischémie multiviscérale parfois irréversible (insuffisance rénale terminale, séquelles d’AVC, d’IDM…)

. Fréquence des poussées :

. périodes de rémission de durée variable (mois, années)

. ou maladie chronique (rémission < 1 mois)

Syndrome d’Upshaw-Schulman

Phénotype biologique invariable

. Activité plasmatique ou sérique d’ADAMTS13 < 10%

. Antigène d’ADAMTS13 le plus souvent indétectable < 65 ng/ml

. Autoanticorps anti-ADAMTS13 négatifs . Titre d’IgG anti-ADAMTS13 < 15 UI/dl . Activité inhibitrice circulante anti-ADAMTS13 indétectable

Syndrome d’Upshaw-Schulman

Génotype

.

Une centaine de mutations d’ADAMTS13

.

Transmission autosomique récessive (maladie orpheline) :

. Les patients sont double hétérozygotes ou homozygotes

. Parmi les homozygotes (~15 mutations) : consanguinité

.

Répartition sur toute la longueur du gène

.

Mutations faux-sens : 70% / Mutations de terminaison : 30%

.

Pas de délétion totale du gène (létale ?)

Mutations d’ADAMTS13 dans le syndrome d’Upshaw-Schulman

I79M R1206X P671L V88M* C1213G* T673F* A95P C1213Y R692C H96D I1217T C695W R102C R1219W* A732V
I79M
R1206X
P671L
V88M*
C1213G*
T673F*
A95P
C1213Y
R692C
H96D
I1217T
C695W
R102C
R1219W*
A732V
S119F
C1239V*
C311Y
A900V
R193W*
W1245X*
C322G
Q448E
A596V
S903L
T196I
W1016X
K1256F
T323R
Q449X*
P618A
C908Y*
S203P
C1024G
K1256S
F324L
P457L
R625H
C908S
L232Q
W390C*
A1033T
R328G
P475S
A631V
R910X
H234Q
R1336W
W390X
R1034X
C347S
R507Q
P671L
C951G
D235H
R1060W*
D1362V
R398H
P353L
C508Y*
I673F
A250V*
E444G
C365X*
R528G
S263C
R1095W
H960D
R268P
E812X
R1096X
Q44X*
C977W
R1123C*
Métalloprotéase
Desint.
TSP
Cys
Spacer
TSP
TSP
TSP
TSP
TSP
TSP
TSP
CUB1
CUB2
1
2
3
4
5
6
7
8
Splice :
In22 :
2861 +55C>T
Splice :
Splice :
Splice :
Frameshift:
Splice :
In8 : 987
+ 11C>T
or +69C>T
Int/ex8 :
In10 :
Ex20 :
In3 : G>A
In15 :
1244 -2T>G
2549delAT
1787 -26G>A
In4 : 414+1 G>A
1245 -32C>G
In6 : 686+1>A 686+1T>G
Frameshift :
8 bp del
1783-1784 TT del
Splice :
Ex 9 : G>A
In28 :
Frameshift :
Splice :
4077 +32T>C
In 13 :
Ex7 : 718-724 del G+C
+2T >A
Frameshift :
1584
+5G>A
4143insA
1584
+106C>G
1584
+236T>C
Ex12 :
G>A

R7W

1584 +106C>G 1584 +236T>C Ex12 : G>A R7W Mutations de novo Mutations françaises Mutations

Mutations de novo Mutations françaises Mutations exprimées dans des recombinants*

Le PTT lié à un déficit sévère acquis

en ADAMTS13

(Syndrome de Moschcovitz)

PTT par déficit sévère acquis en ADAMTS13

. 90% de tous les PTT lié à déficit sévère en ADAMTS13

. Prévalence : 4 à 10 cas par million d’habitants / an

. Age : adultes +++ (âge de la 1ère poussée : 30-40 ans)

.

Sex ratio : 2F / 1H

.

Contexte : idiopathique / contexte clinique associé

.

Mécanismes

. autoimmunité (IgG anti-ADAMTS13) : 90% des cas . autres (défaut de synthèse/sécrétion, dégradation, inhibition …) : 10% des cas

PTT par déficit sévère acquis en ADAMTS13

Phénotype clinique variable

. Age de révélation de la maladie : adulte >>>>> enfant (rares cas chez grands

enfants et adolescents)

. Caractère idiopathique = contexte clinique associé (maladies auto-immunes

LED SAPL…)

. Degré de l’atteinte ischémique (thrombopénie -> ischémie multiviscérale)

.

Fréquence des poussées (récurrentes sporadiques -> chroniques)

.

Exigences thérapeutiques (plasmathérapie +/- immunosuppresseurs)

Phénotype biologique variable

IgG anti-ADAMTS13 : détectables dans ~70% des cas

Auto-anticorps anti-ADAMTS13 dans le PTT acquis (1)

. Dans 75% des PTT acquis : IgG combinant une activité inhibitrice et une complexation à l’antigène

. Rarement : IgM et/ou IgA

. Polyclonaux et toujours dirigés contre le domaine Cys-rich d’ADAMTS13

. Associés d’emblée ou précèdent l’apparition d’autres auto-Ac (FAN)

Auto-anticorps anti-ADAMTS13

dans le PTT acquis (2)

. Induisent le déficit sévère acquis de l’activité d’ADAMTS13 retrouvé en poussée de PTT

. Le plus souvent, disparaissent en rémission clinique, parallèlement à une normalisation de l’activité d’ADAMTS13

. Parfois, persistent en rémission clinique :

- à un titre élevé, parallèlement à une ADAMTS13 indétectable - à un titre moindre, parallèlement à une ADAMTS13 détectable

ADAMTS13 dans les MAT

Expérience 1999-2012 du CNR-MAT

(Centre National de Référence des MicroAngiopathies Thrombotiques)

ADAMTS13 en France : historique

U143 Inserm/

Hématologie A. Béclère (D. Meyer)

Méthode originale de mesure d’ADAMTS13 activité (ELISA VWF full-length) et application aux MAT

Thèse de Sciences A. Veyradier

1999

application aux MAT Thèse de Sciences A. Veyradier 1999 2000 2002 U143 Inserm/ Hématologie A. Béclère

2000

2002

U143 Inserm/ Hématologie A. Béclère (D. Meyer/A.Veyradier)

Nouvelles méthodes d’investigation

d’ADAMTS13

FRETS-VWF73

IgG anti-A13 Séquençage gène A13

FRETS-VWF73 IgG anti-A13 Séquençage gène A13 2005 2006 U770 Inserm (C. Denis) Souris KO ADAMTS13

2005

2006

U770 Inserm

(C. Denis)

Souris KO ADAMTS13

Laboratoire de génétique, CHU Nantes (P. Boisseau, S. Bezieau) Génotypage d’ADAMTS13

Nantes (P. Boisseau, S. Bezieau) Génotypage d’ADAMTS13 2010 2011 2012 Réseau clinico- biologique d’étude des

2010

2011

2012

S. Bezieau) Génotypage d’ADAMTS13 2010 2011 2012 Réseau clinico- biologique d’étude des MAT Cliniciens:
S. Bezieau) Génotypage d’ADAMTS13 2010 2011 2012 Réseau clinico- biologique d’étude des MAT Cliniciens:

Réseau clinico-biologique d’étude des MAT

Cliniciens: réanimateurs, hématologues, néphrologues, internistes

Biologistes:

ADAMTS13 : Hémato A. Béclère/U143 Inserm Complément: Immunologie HEGP

Thèse d’exercice médecine P. Coppo

Immunologie HEGP Thèse d’exercice médecine P. Coppo PNMR 1: 3 è m e vague de labellisation

PNMR 1: 3 ème vague de labellisation Centre National de Référence des MicroAngiopathies Thrombotiques (CNR-MAT)

Coordonnateur : P. Coppo

50 Équipes cliniques (sites CNR + CC)

Labos référents:

ADAMTS13 : A. Veyradier Complément : V. Frémeaux-Bacchi

référents: ADAMTS13 : A. Veyradier Complément : V. Frémeaux-Bacchi Expertise HAS Renouvellement CNR-MAT (PNMR2)

Expertise HAS Renouvellement CNR-MAT

(PNMR2)

CNR-MAT : maillage territorial

Lille Amiens Rouen Caen Reims Paris Strasbourg Rennes Angers Nantes Tours Dijon Lyon Limoges Clermont-
Lille
Amiens
Rouen
Caen
Reims
Paris
Strasbourg
Rennes
Angers
Nantes
Tours
Dijon
Lyon
Limoges
Clermont-
Ferrand
Bordeaux
Toulouse
Montpellier
Marseille
La Réunion

CNR-MAT

Assistance Publique-Hôpitaux de Paris Saint Antoine Saint Louis Pitié Salpêtrière Tenon… Antoine Béclère HEGP

19

Centres

de

Compétences

Laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT

Laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT Service d’Hématologie biologique S. Thouzeau-Benghezal, S. Savigny, S. Capdenat, Dr M.

Service d’Hématologie biologique

S. Thouzeau-Benghezal, S. Savigny, S. Capdenat, Dr M. Wolf, Pr A. Veyradier

Etude phénotypique

(ADAMTS13 activité FRETS-VWF73,

IgG anti-ADAMTS13 titrage et inhibiteur)

FRETS-VWF73, IgG anti-ADAMTS13 titrage et inhibiteur) Inserm U770, Le Kremlin Bicêtre P. Legendre Dr C. Denis,

Inserm U770,

Le Kremlin Bicêtre

P. Legendre Dr C. Denis, Dr P. Lenting, Dr A. Stepanian, Pr A. Veyradier

Etude phénotypique

(ADAMTS13 activité ELISA

VWF full-length)

Recherche fondamentale

activité ELISA VWF full-length) Recherche fondamentale Service de génétique moléculaire Dr P. Boisseau, Pr S.

Service de génétique moléculaire

Dr P. Boisseau, Pr S. Bezieau

Etude génétique d’ADAMTS13

Laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT : activité

Nombre de tests ADAMTS13 phénotypiques Soins courants Labellisation Recherche (PHRC) 3000 CNR-MAT 2000 1000 1999
Nombre de tests ADAMTS13
phénotypiques
Soins courants
Labellisation
Recherche (PHRC)
3000
CNR-MAT
2000
1000
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012

. Total sur 14 ans : environ 15 000 tests -> recrutement national -> 1 à 3 séries d’ADAMTS13 activité / semaine -> compte rendus spécialisés experts -> avis spécialisé (tel, email) dans 30% des cas

Cohorte du CNR-MAT de PTT lié à un déficit sévère d’ADAMTS13

(645 patients)

adultes enfants
adultes
enfants

PTT héréditaires

PTT acquis

Age de révélation :

.

adulte (93%)

.

pédiatrique (7%)

Etiologie (tous âges):

.

Acquise (94%)

.

Héréditaire (6%)

Etiologie (enfants):

. Acquise (44%)

. Héréditaire (56%)

Etiologie (adultes):

.

Acquise (98%)

.

Héréditaire (2%)

mais ……

Cohorte du CNR-MAT de PTT lié à un déficit sévère d’ADAMTS13 révélé en contexte obstétrical (42 patientes)

(20%) PTT acquis (80%)
(20%)
PTT acquis
(80%)

PTT héréditaires

Moatti-Cohen et al, Blood 2012

Exploration biologique

d’ADAMTS13

I- Etapes pré-analytiques

II- Méthodes biologiques

.

Activité d’ADAMTS13

.

Antigène d’ADAMTS13

. Auto-anticorps anti-ADAMTS13

. Gène d’ADAMTS13

Exploration biologique d’ADAMTS13

I- Etapes pré-analytiques

. Etude phénotypique (activité, antigène, recherche d’auto-Ac)

- Plasma citraté ou serum

- Si absence de ttt extemporané : congélation à -20 ° C ou -80 ° C

- Si ttt sur un site extérieur, envoi dans la carboglace

- Limites :

communes à toutes les techniques

. EDTA : inactivation d’ADAMTS13 in vitro . Hémolyse : inactivation d’ADAMTS13 in vitro

propres aux méthodes VWF full-length

. Taux de VWF:Ag > 300 UI/dl

propres aux méthodes fluorimétriques

.

Autofluorescence de certains plasma/serum ?

.

Hyperbilirubinémie

. Etude génétique

- Sang total EDTA ou citraté conservés à +4 ° C pdt 72 h ou -20 ° C

- Consentement éclairé du patient

Exploration biologique d’ADAMTS13

II- Méthodes biologiques : Activité d’ADAMTS13 (1)

Principe

Dégradation d’un substrat exogène (VWF full-length ou courts peptides de VWF) par l’ADAMTS13 du plasma testé.

Les produits de dégradation du VWF clivé par ADAMTS13 sont mesurés par des techniques :

- électrophorétiques (multimères ou fragments)

- immunologiques (CBA, VWF:Ag, Chr-VWF73)

- d’agrégation plaquettaire (VWF:RCo)

- fluorimétriques (FRETS-VWF73)

- de spectrométrie de masse (SELDI-TOF)

Normes : 50 150 %

Objectif

Détection des déficits fonctionnels sévères: activité d’ADAMTS13 <10%

Exploration biologique d’ADAMTS13

II- Méthodes biologiques : Activité d’ADAMTS13 (2)

Indications pour le diagnostic médical

. Devant une suspicion de MAT en phase aiguë, confirmation ou infirmation du diagnostic de PTT (paramètre sensible et spécifique)

- dans 95% des cas : non urgent ! Délai préconisé < 10 jours.

- dans 5% des cas : urgent car nécessité d’ajustement thérapeutique rapide

. confirmation diagnostique de PTT pour indication traitement immuno-modulateur si intolérance à la plasmathérapie ou flare-up

. diagnostic d’exclusion de PTT pour indication d’eculizumab

. Suivi biologique en rémission des patients ayant un(des) ATCD de poussées de PTT (paramètre ayant une valeur pronostique quant au risque de rechute)

Mesure de l’activité d’ADAMTS13

Méthodes électrophorétiques (VWF full-length)

Multimères du VWF (SDS-agarose)

Dilutions

plasmatiques

(SDS-agarose) Dilutions p l a s m a t i q u e s 1/20 1/40
(SDS-agarose) Dilutions p l a s m a t i q u e s 1/20 1/40

1/20

1/40

1/80

1/160

1/320

1/640

Tp

Sujet normal

Activité d’ADAMTS13 100%

1/320 1/640 Tp Sujet normal Activité d’ADAMTS13 100% 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 Patient PTT
1/320 1/640 Tp Sujet normal Activité d’ADAMTS13 100% 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 Patient PTT

1/20

1/40

1/80

1/160

1/320

1/640

Patient PTT

Activité d’ADAMTS13 <10%

Furlan et al, NEJM 1998

Mesure de l’activité d’ADAMTS13

Méthodes électrophorétiques (VWF full-length)

Fragments de dégradation du VWF (SDS-PAGE)

full-length) Fragments de dégradation du VWF (SDS-PAGE) 300 250 kDa - kDa - SU - VWF

300

250

Fragments de dégradation du VWF (SDS-PAGE) 300 250 kDa - kDa - SU - VWF clivage

kDa -

kDa -

SU - VWF

dégradation du VWF (SDS-PAGE) 300 250 kDa - kDa - SU - VWF clivage par ADAMTS13

clivage par

ADAMTS13

Sujet normal

Activité d’ADAMTS13 100%

Patient PTT

Activité d’ADAMTS13 <10%

Tsai HM, NEJM 1998

Mesure de l’activité d’ADAMTS13

Méthodes immunologiques (VWF full-length)

ELISA VWF:Ag

   

Protéolyse

 

Plasma + BaCl 2

+

rvWF WT

(substrat)

Plasma + BaCl 2 + rvWF WT (substrat) ou
Plasma + BaCl 2 + rvWF WT (substrat) ou
Plasma + BaCl 2 + rvWF WT (substrat) ou
Plasma + BaCl 2 + rvWF WT (substrat) ou
Plasma + BaCl 2 + rvWF WT (substrat) ou

ou

Plasma + BaCl 2 + rvWF WT (substrat) ou
Plasma + BaCl 2 + rvWF WT (substrat) ou
Mesure du VWF:Ag résiduel par ELISA Acm anti-vWF N-term Acm anti-vWF C-term
Mesure du VWF:Ag résiduel par ELISA
Acm
anti-vWF
N-term
Acm
anti-vWF
C-term
Patient PTT Sujet normal

Patient PTT

Sujet normal

Obert et al, Thromb Haemost 1999

Mesure de l’activité d’ADAMTS13

Méthode Fluorimétrique (VWF-73)

FRETS-VWF73

Mesure de l’activité d’ADAMTS13 Méthode Fluorimétrique (VWF-73) FRETS-VWF73 Kokame et al, Br J Haematol 2005

Kokame et al, Br J Haematol 2005

Mesure de l’activité d’ADAMTS13

Avantages et inconvénients des méthodes

selon le substrat VWF utilisé

Méthodes

Avantages

Inconvénients

Méthodes VWF full-length

Méthodes de référence, évaluées

Longues (plusieurs jours)

Sensibles à ~toutes les

Interférence du VWF:Ag

mutations d’ADAMTS13

endogène du patient

 

Non adaptables en kit commercial

 

Méthodes de référence,

 

Méthodes

évaluées

Interférence selon mode de

révélation (autofluorescence spontanée)

VWF-73

Rapides (1 journée)

Home-made

Pas d’interférence du VWF:Ag endogène du patient

Non sensible à certaines mutations d’ADAMTS13

Adaptables en kit commercial

Mesure de l’activité d’ADAMTS13

Corrélation des différentes méthodes

Méthodes « home made » de référence entre elles (littérature 2006-2010)

(full-length vs full-length

et

full-length vs VWF-73)

Littérature -> bonne corrélation inter-méthodes pour le diagnostic des déficits sévères mais discordances pour les déficits partiels et les valeurs normales

Méthodes «home made» versus kits commerciaux récents

. Etude multicentrique nationale en 2011 pilotée par le CNR-MAT (12 labos des Centres de Compétences du CNR-MAT, ~10 échantillons) -> nécessité d’évaluer les kits commerciaux ADAMTS13 act. pour aider les Laboratoires des Centres de Compétences du CNR-MAT à choisir le meilleur kit si volonté de développer la technique sur site pour les urgences

. Publication récente : Mackie et al, Thromb Haemost janvier 2013 Evaluation des Kits American Diagnostica (Fret-VWF86) et Technoclone (Chr-VWF73) versus méthode home made frets-VWF73 : 159 échantillons

-> assez bonne corrélation inter-méthodes pour le diagnostic des déficits sévères mais

discordances pour les déficits partiels et les valeurs normales

Evaluations menées par le CNR-MAT en 2013

. Projet initial : Evaluation en parallèle du kit Genprobe et du kit Technoclone … mais rupture de stock du kit technoclone pendant 6 mois

. Finalement :

. Evaluation du kit Genprobe au 1 er trimestre 2013 Publication en septembre 2013

. Evaluation du kit Technoclone au 3 ème trimestre 2013 Publication prévue début 2014

. NB : auto-financement des réactifs (pas de conflit d’intérêt)

Evaluation du kit Genprobe pour la mesure de l’activité d’ADAMTS13 (1)

Principe de la méthode

Dégradation d’un substrat frets-VWF73 par l’ADAMTS13 du plasma testé.

Révélation par fluorimétrie.

Calibrants et CQ du kit (bas : 16-26% / haut : 47-57%)

CQ internes (PTT < 10%, pool 50%, pool 100%)

Echantillons testés : n = 209

. 13 PTT héréditaires (USS)

.

38 PTT acquis en poussée

.

31 PTT acquis en rémission

.

97 MAT diverses (SHU, sepsis, cancers, MAI et autres)

ADAMTS13 activity (ATS-13 ® Activity Assay)

ADAMTS13 activity (ATS-13 ® Activity Assay) Limite de sensibilité : 15% Evaluation du kit Genprobe ADAMTS13

Limite de sensibilité : 15%

Evaluation du kit Genprobe ADAMTS13 (2)

120

100

80

60

40

20

0

du kit Genprobe ADAMTS13 (2) 120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 [51]
0 20 40 [51] [86]
0
20
40
[51]
[86]
60 80 100
60
80
100

[72]

Seuil de relevance

clinique : 10%

Limite de sensibilité : 10%

de relevance clinique : 10% Limite de sensibilité : 10% ADAMTS13 activity (In-house FRETS-VWF73) 120 [Number]

ADAMTS13 activity (In-house FRETS-VWF73)

120

[Number] of tested samples Total = 209

Evaluation du kit Genprobe pour la mesure de l’activité d’ADAMTS13 (3)

Synthèse des discordances avec le frets-VWF73 de référence

. Parmi les 51 échantillons <10% : 3 discordants (sur-estimés)

. Parmi les 86 échantillons entre 11 et 49% : 65 discordants dont 17 sous-estimés (<10% !) et 48 sur-estimés

. Parmi les 72 échantillons entre 50 et 100% : presque tous surestimés

Evaluation du kit Genprobe pour la mesure de l’activité d’ADAMTS13 (4)

Conclusion

. Limites techniques :

Seuil de détection (15%) trop élevé et > seuil de relevance clinique Calibrants non optimaux

. Bonne sensibilité pour détecter les taux d’ADAMTS13 < 10%

. Défaut de spécificité

-> sur-diagnostic de déficit sévère (!) dans 17 cas/65 (~1 cas / 4)

. Surestimation quasi-systématique des valeurs détectables -> problème de suivi des patients en rémission +++

(sous-diagnostic d’un début de rechute biologique qui pourrait justifier une

Injection préventive de rituximab ?)

Mesure de l’activité d’ADAMTS13

Recommandations du CNR-MAT en 2013

La mesure de l’activité d’ADAMTS13 (technique et interprétation) effectuée dans le cadre de la documentation biologique d’une suspicion de MAT :

. relève d’une activité biologique experte supraGH (plateforme biologique du CNR-MAT)

.

repose en 1 ère intention sur la technique home made FRETS-VWF73

.

doit être contrôlée par une 2 ème méthode utilisant un substrat VWF full-length . systématiquement pour les patients pédiatriques

. en cas de discordance avec la présentation clinique ou de pb (autofluorescence par ex.) pour les patients adultes

analytique

Les kits commerciaux mis sur la marché ne sont pas encore validés pour le diagnostic médical des MAT. Leur évaluation est en cours.

Exploration biologique d’ADAMTS13

II- Méthodes biologiques : Antigène d’ADAMTS13

. Principe

ELISA utilisant des Anticorps polyclononaux ou monoclonaux

anti-ADAMTS13

Méthodes home made et kits commerciaux

.

Normes : 700 1400 ng/ml

.

Indication pour le diagnostic médical

Caractérisation des déficits fonctionnels sévères héréditaires en ADAMTS13 (syndrome d’Upshaw-Schulman) :

Distinction déficit quantitatif / déficit qualitatif

Exploration biologique d’ADAMTS13

II- Méthodes biologiques :

Auto-anticorps anti-ADAMTS13 (1)

. Titrage des IgG anti-ADAMTS13

. Principe

ELISA utilisant de l’ADAMTS13 recombinante sauvage et une révélation par des Anticorps anti-IgG humaines. Méthodes home made et kits commerciaux.

. Seuil de positivité: ~15 UI/ml

. Sensibilité : le titre d’IgG anti-ADAMTS13 est positif dans ~75% des PTT acquis auto-immun en phase aiguë

. Spécificité : le titre d’IgG anti-ADAMTS13 peut être discrètement positif chez un très faible

pourcentage de sujets sains ayant une activité d’ADAMTS13 normale

. Indication pour le diagnostic médical

Test de 1 ère intention pour la recherche d’auto-Ac anti-ADAMTS13.

Si et seulement si l’activité d’ADAMTS13 est inférieure à 10%, le tirage des IgG anti-ADAMTS13 est indiqué afin d’objectiver une cause auto-immune au déficit sévère en ADAMTS13 (PTT acquis auto-

immun).

Exploration biologique d’ADAMTS13

II- Méthodes biologiques :

Auto-anticorps anti-ADAMTS13 (2)

. Recherche d’une activité inhibitrice circulante anti-ADAMTS13

. Principe

Mesure de l’activité ADAMTS13 résiduelle de mélanges, à différents ratios, de plasma testé + plasma

témoin. Méthodes home made.

.

Seuil de positivité: variable selon les méthodes

.

Sensibilité : une AIC anti-ADAMTS13 est retrouvée dans ~60% des PTT acquis auto-immun en phase

aiguë

.

Spécificité : une AIC anti-ADAMTS13 n’est jamais détectée si l’activité d’ADAMTS13 est >10%

.

Indication pour le diagnostic médical

Test de 2 ème intention pour la recherche d’auto-Ac anti-ADAMTS13.

Si et seulement si l’activité d’ADAMTS13 est inférieure à 10%, la recherche d’une AIC anti-ADAMTS13

est indiquée et permet :

. si les IgG anti-ADAMTS13 sont positives, d’objectiver leur éventuel caractère inhibiteur (~80% des cas) . si les IgG anti-ADAMTS13 sont négatives, une IAC anti-ADAMTS13 est rarement en évidence et pourrait alors être liée à la présence d’IgA/IgM anti-ADAMTS13

mise

Exploration biologique d’ADAMTS13

II- Méthodes biologiques :

Analyse génétique d’ADAMTS13

Principe

Séquençage des 29 exons et des jonctions exon/intron du gène d’ADAMTS13

Indication pour le diagnostic médical

Confirmation du diagnostic de PTT héréditaire (Syndrome d’Upshaw-Schulman) devant une histoire clinique et un phénotype biologique évocateurs :

- poussées de PTT récurrentes depuis l’enfance ou déclenchées par la grossesse

- activité d’ADAMTS13 (méthode full-length et méthode VWF-73) < 10% de manière constante (en poussée de PTT en en rémission) avec IgG anti-ADAMTS13 négatives

Sensibilité : des mutations bi-alléliques du gène d’ADAMTS13 sont retrouvées dans ~99% des USS

Spécificité : les mutations bi-alléliques du gène d’ADAMTS13 ont une spécificité de 100% dans le diagnostic de l’USS

Arbre décisionnel simplifié pour l’investigation d’ADAMTS13

à visée diagnostique dans le PTT : recommandation CNR-MAT

ADAMTS13 activité

dans le PTT : recommandation CNR-MAT ADAMTS13 activité effondrée non effondrée … IgG / inhibiteur anti-ADAMTS13

effondrée

PTT : recommandation CNR-MAT ADAMTS13 activité effondrée non effondrée … IgG / inhibiteur anti-ADAMTS13 positif
PTT : recommandation CNR-MAT ADAMTS13 activité effondrée non effondrée … IgG / inhibiteur anti-ADAMTS13 positif

non effondrée

CNR-MAT ADAMTS13 activité effondrée non effondrée … IgG / inhibiteur anti-ADAMTS13 positif négatif ADAMTS13

IgG / inhibiteur anti-ADAMTS13

effondrée non effondrée … IgG / inhibiteur anti-ADAMTS13 positif négatif ADAMTS13 activité non effondrée

positif

non effondrée … IgG / inhibiteur anti-ADAMTS13 positif négatif ADAMTS13 activité non effondrée effondrée (+

négatif

… IgG / inhibiteur anti-ADAMTS13 positif négatif ADAMTS13 activité non effondrée effondrée (+ auto-Ac

ADAMTS13 activité

inhibiteur anti-ADAMTS13 positif négatif ADAMTS13 activité non effondrée effondrée (+ auto-Ac anti-ADAMTS13 nég.)
inhibiteur anti-ADAMTS13 positif négatif ADAMTS13 activité non effondrée effondrée (+ auto-Ac anti-ADAMTS13 nég.)

non effondrée

effondrée (+ auto-Ac anti-ADAMTS13 nég.)

non effondrée effondrée (+ auto-Ac anti-ADAMTS13 nég.) Séquençage du gène d’ADAMTS13 pas de mutation

Séquençage du gène

d’ADAMTS13

auto-Ac anti-ADAMTS13 nég.) Séquençage du gène d’ADAMTS13 pas de mutation mutations ? PTT acquis PTT héréditaire
auto-Ac anti-ADAMTS13 nég.) Séquençage du gène d’ADAMTS13 pas de mutation mutations ? PTT acquis PTT héréditaire

pas de mutation

mutations

auto-Ac anti-ADAMTS13 nég.) Séquençage du gène d’ADAMTS13 pas de mutation mutations ? PTT acquis PTT héréditaire
?
?

PTT acquis

PTT héréditaire

Cas clinique N° 1

Un nouveau-né (fille) présentant un ictère développe à J2 de vie,

une thrombopénie à 20 giga/L associé à une anémie à 10 g/dL avec 3% de schizocytes. Il existe une protéinurie modérée sans insuffisance rénale. Il n’y a aucun contexte clinique particulier. Les parents sont cousins germains et il y a dans la fratrie de 4 enfants, un frère décédé à quelques jours de vie dans un tableau de défaillance multiviscérale inexpliqué (il y 10 ans) et 2 sœurs bien

portantes. Vous suspectez une MAT.

Cas clinique N° 1

1. Quels examens biologiques complémentaires demandez-vous ?

Réticulocytes : Coombs érythrocytaire : négatif LDH : Biliribine non conjuguée : Haptoglobine : effondrée

ADAMTS13 activité : effondrée <10% Fractions de la voie alterne du complément : C3, C4, CH50 : normaux

Cas clinique N° 1

2. Quel diagnostic suspectez-vous ? Pourquoi ?

. PTT héréditaire (syndrome d’Upshaw-Schulman)

. Tableau clinique évocateur : ictère néonatal + anémie hémolytique mécanique

+ thrombopénie profonde sans contexte clinique particulier

. Consanguinité parentale

. Probable atteinte d’un frère ainé décédé (ischémie systémique)

. Forme acquise de PTT rarissime voire inexistante à cet âge

Cas clinique N° 1

3. Quels examens biologiques complémentaires demandez-vous ? Selon quel protocole ?

. Contrôle de l’effondrement de l’activité d’ADAMTS13 sur un 2 ème prélèvement (Attention : préciser au clinicien de prélever avant l’initiation d’une plasmathérapie)

. Titrage des IgG anti-ADAMTS13 : négatives

.

Eventuellement : dosage de l’Antigène d’ADAMTS13

.

Séquençage du gène d’ADAMTS13 : mutations bi-alléliques du gène d’ADAMTS13

. Enquête familiale : phénotypique et génotypique

Cas clinique N° 2

Une femme de 38 ans arrive aux urgences d’un centre hospitalier

pour asthénie, dyspnée, pétéchies diffuses et céphalées. La NFS plaquettes retrouve une anémie à 8 g/dL avec 3% de schizocytes et une thrombopénie à 15 giga/L. La fonction rénale est normale. L’examen neurologique retrouve une discrète confusion mentale. Les beta-hCG sont négatives. La patiente n’a pas d’ATCD médical particulier et elle ne prend pas

de traitement. On retrouve la notion d’un lupus chez sa sœur.

Cas clinique N° 2

2. Quel diagnostic suspectez-vous ?

Quels examens biologiques complémentaires demandez-vous ?

. PTT acquis auto-immun idiopathique

. Bilan d’hémolyse : réticulocytes, coombs érythrocytaire, LDH, bilirubine C/NC,

Haptoglobine

. Mesure de l’activité d’ADAMTS13 : <10% . Titrage des IgG anti-ADAMTS13 : 100 UI/ml

Cas clinique N° 2

3. La patiente est traitée par plasmathérapie (EP) pendant

10 jours et entre en rémission clinique. Le contrôle de l’activité d’ADAMTS13 à 6 mois en rémission montre une activité toujours effondrée <10%. Qu’en pensez-vous ?

Quelle attitude préconisez-vous ?

. Risque de rechute important dans les 2 premières années

. Surveillance biologique systématique tous les 3 mois (en dehors de tout événement clinique intercurrent)

. Si l’activité d’ADAMTS13 reste <10% à 1 an, discuter avec les cliniciens du CNR-MAT l’indication d’un traitement préventif des rechutes par Rituximab

Bibliographie

A. Veyradier, M. Wolf, A. Stepanian, P. Coppo. ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur Willebrand. EMC (Elsevier Masson SAS, Paris), Biologie Médicale, 90-20-0003-A, 2011

A.Veyradier, P. Coppo.

ADAMTS13, von Willebrand factor specific cleaving protease.

Med Sci (Paris) 2011 Dec; 27(12): 1097-1105.