UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS

DE APURMAC

FACULTAD DE INGENIERA

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Practica N 03

Tema

: determinacin de la actividad enzimatica.

Estudiantes

: Moina Villegas Roger

Docente

: Ing. Vctor Hugo Sarmiento Casavilca

Asignatura

: Biotecnologa Agroindustrial

ABANCAY APURMAC
2016-I

PRACTICA N 03 Determinacin de la actividad enzimtica.

Introduccin
Los hongos filamentosos son un grupo de inters industrial en la produccin de enzimas.
Aspergillus es un organismo ampliamente utilizado en la produccin de una gran variedad
de glucanasas con un espectro tal que puede lograrse la completa degradacin de la
celulosa. Muchos hongos filamentosos estn naturalmente adaptados al crecimiento sobre
superficies. Los hongos requieren un contacto cercano con el sustrato debido a su nutricin
hetertrofa, secrecin de enzimas extracelulares, absorcin de nutrientes a travs de la
pared celular y el crecimiento apical de sus hifas (Jones, 1994, citado por Izarra, L.,
Santayana, L., Villena, K., 2010). Sin embargo, algunos sistemas de produccin como la
fermentacin sumergida no consideran estos importantes aspectos de su fisiologa.
Las biopelculas bacterianas han sido ampliamente estudiadas desde el punto de vista
estructural y fisiolgico, y son consideradas estructuras complejas y heterogneas; en las
cuales las clulas adheridas difieren radicalmente de las planctnicas y muestran mayor
resistencia a compuestos biocidas, surfactantes y al desecado (OToole et al., 2000;
Blenkinsopp, 1991 citado por Villena, K., Gutierrez-Correa (2003).
Las principales morfologas desarrolladas en sistemas de fermentacin sumergida
corresponden al crecimiento miceliar o filamentoso y el crecimiento tipo pellet, este ltimo
caracterizado por ser una esfera de micelio. Existen tres tipos principales de pellets, los de
centro compacto y contorno laxo, los totalmente compactos, y los de interior vaco debido a
autolisis (Pazouki y Panda, 2000, citado por Villena, K., Gutierrez-Correa 2003).
El presente informe tiene como objetivos producir Biomasa en cultivo Sumergido,
Biopelicula a partir de Aspergillus niger y Evaluacin de la Actividad Enzimtica.

I.

Materiales y mtodos

3.1. Materiales
200ml de Agar Papa Dextrosa

(PDA)
2 litros de agua destilada estril
4 matraces vacos estriles
4 matraces con 70ml de agua
4 matraces con70ml de medio

Mandels
4 telas sintticas (3.1 x 3.1) Litro de

alcohol
10 botellas (de vidrio con tapa)
Rotuladores
Ligas
Papel reciclado

Para el PDA
200ml extracto de papa
3g de Agar Agar
2g de glucosa

Para Medio Mandels

10g/L de Lactosa
2.8g/L de NH4OH
1g/L de K2HPO4
0.5g/L de KCl
0.03g/L de FeSO4
0.05g/L de CaCl2
1g/L de Peptona
0.5g/L de Urea

3.2. Procedimiento
1)
Actividad enzimtica
A.

Agregar 4 ml

50 mlniger)
de PDA
Cua de hongo (Aspergillus
Siembra de esporas por incorporacin
B.

Incubar por 48 h

si de agua y agitar
40 ml
Adicionar

Cmara de New Bader

de esporas
C. Hacer dilucin para obtener 100 esporas y aforar aNmero
12 mltotal
y sacar
para176.5
sumergido y Biopelicula.

Contar esporas
100 X 104

D. Para sumergido, se realiz por duplicado

2.1ml

2.1ml

3%

Llevar
la estufa
Filtrar al vaco
en apapel
filtropara su posterior secado

Inoculo
12ml

Agitar
a 175 RPM por 72h en shaker
+70ml de agua estril para
ambos

Calcular la actividad enzimtica

Actividad Enzimatica= [ Glucosa ] X 0.38 X D

2)

Evaluacin de la actividad enzimtica

a. Curva patrn:
1. Preparar solucin madre a 1 mg/ml (glucosa - Bfer acetato, pH 4.8)

Diluir en

Glucosa
buffer acetato, pH 4.8

50 ml
50 mg

2. se hizo por duplicado de la siguiente manera:

Solucin madre

Bfer
Acetato
Bfer Acet
ato
0.1

1.4
+
Solucin madre
madre
Solucin
+

0.1
0.1

0.2
1.3
+
+
0.1
0.1

0.3
0.3
1.2
+
0.1
0.1

0.4
0.4
1.1
1.1
+
+
0.1
0.1

BM (Blanco muestra)
1.5 Solucin bfer

0.5
0.5
1
1
+
+
0.1
0.1

3. Adicionar 2 ml de DNS (a cada tuvo)

4. Llevar a ebullicin por 5 min A 100C
5. Enfriar en agua fra para cortar la reaccin

6. Adicionar 5 ml de agua destilada fra a cada tubo (es por duplicado)

4.5ml+5ml
9.4ml
7. Leer la absorbancia a 540 nm
8. Hallar la ecuacin de la curva Y=a + bx

b. Muestra:

BM (Blanco muestra)
1.5 Solucin bfer
4.5ml+5ml
9.4ml

1. Realizar diluciones de las dos enzimas (biopelicula y sumergido)

Biopelicula

Sumergido

1/5

1/10

1/20

1/5

1/10

1/20

2. Se realiz diluciones como se muestra en la figura.

3. Adicionar 1ml de buffer + 0.5ml de enzima por 5min a 50C

BM (Blanco Muestra) por duplicado

M (muestra) por
duplicado
BPF (Blanco Papel Filtro)
BR

4. Llevar 5 a ebullicin por 5 min a 50C.

5. Adicionar

el

papel

filtro

cortado
6. Incubar 60 min a 50C
7. Adicionar 3 ml de DNS
8. Llevar a ebullicin por 5 min

9. Enfriar la reaccin
10. Adicionar 5 ml de agua
11. Leer la absorbancia a 540 nm
12. Calcular la concentracin de
glucosa.

c.
d.

[ Glucosa ] =[ glucosa BM + glucosa BPF ] [ glucosa muestra ]

e.
f.
II. Resultados
a.
b. PRODUCCION DE ENZIMAS
c. biomas
a
d.

e.

f.

g.

h.

i.

j.

k.

l.
0.2
0.15
0.1
0.05
0
sumergido

m.
n.
o.
p.
q.
r.

biopelicula

s.
t.
u.
v. CURVA DE PATRON
w.
x.
4
3
f(x) = 6.72x - 0.44
R = 1

Linear ()

1
0
0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

y.
z.
aa.
ab.
ac.
ad.
ae. Entonces la ecuacin de la curva de patrn
af. Y= AX +B
ag.

B= - 0.436

ah. y = 6.715x - 0.436

R = 0.9976
ai.
aj.

A= 6.715

0.5

0.55

ak.

al.
am.
an. Calculo de actividad enzimtica
ao. [Glucosa] = [GPF] + [Enzima] - [Glucosa Muestra]
ap. [Glucosa] = [Glucosa Papel +Glucosa De La Enzima] - [Glucosa Muestra]
aq. A E= [GLUCOSA] * 0.38 *D
ar.
as. PARA LA DILUCION 1/10 BIOPELICULA

at.

X=

Y +B
A

X=

0.596+ 0.496
6.715

au.

av.

aw. X= 0.163
ax. [Glucosa] = [GPF] + [Enzima] - [Glucosa Muestra]
ay. [Glucosa] = [0+0.038] - [0.163]
az. [Glucosa] = 0.125mg/ml

ba. A E= [GLUCOSA] * 0.38 *D

bb. A E= [0.125mg/ml] * 0.38 *10
bc. AE= 0.478mg/ml
bd. PARA LA DILUCION 1/50 BIOPELICULA

be.

X=

0.03+ 0.496
6.715

bf. X= 0.078
bg. [Glucosa] = [GPF] + [Enzima] - [Glucosa Muestra]
bh. [Glucosa] = [0+0.038] - [0.078]
bi. [Glucosa] = 0.04 mg/ml
bj.
bk. A E= [GLUCOSA] * 0.38 *D
bl. A E= [0.04mg/ml] * 0.38 *50
bm.

AE= 0.76mg/ml

bn. PARA LA DILUCION 1/10 BIOPELICULA

bo.

X=

0.596+ 0.496
6.715

bp. X= 0.163
bq. [Glucosa] = [GPF] + [Enzima] - [Glucosa Muestra]
br. [Glucosa] = [0+0.038] - [0.163]
bs. [Glucosa] = 0.125mg/ml
bt. A E= [GLUCOSA] * 0.38 *D
bu. A E= [0.125mg/ml] * 0.38 *10
bv. AE= 0.478mg/ml

bw.
bx.
III. Bibliografa
a.
Izarra, L., Santayana, L., Villena, K., (2010) Influencia de la concentracin de
inculo en la produccin de celulasa y xilanasa por Aspergillus niger.
Villena, K., Gutierrez-Correa (2003). Biopelculas de Aspergillus niger para la
produccin de celulasas: algunos aspectos estructurales y fisiolgicos.
Laboratorio de Micologa y Biotecnologa, Universidad Nacional Agraria La

Molina.