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Electroforesis
en
geles
de
gradientes.
El uso de geles de poliacrilamida que tienen
un gradiente creciente de concentracin de
archilamida
+
bisacrilamida,
y
en
consecuencia un gradiente decreciente en
el tamao del poro, pueden tener ventajas
sobre
los
geles
de
concentraciones
uniformes de acrilamida. En un gel en gradiente la protena migra hasta
alcanzar una zona donde el tamao de poro impida cualquier avance. Una vez
se alcanza el lmite del poro no se produce una migracin apreciable aunque no
se detiene completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que
resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones ms estrechas,
adems de incrementar el rango de pesos moleculares que se pueden resolver
en un mismo gel comparado con los de una concentracin fija. (Diapositiva n 9)
1.2.4
en
Electroforesis
geles
de
agarosa.
La agarosa es un
polisacrido
(originalmente
obtenido de algas,
como el agar-agar,
pero de composicin
homognea), cuyas
disoluciones
(tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por
encima de 50 grados C y formar un gel, semislido al enfriarse. Este gel est
constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimricas
embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las
molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor
20.000 nucletidos.
1.2.5 Electroforesis capilar.
La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las tcnicas
electroforticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnologa distinta
que nos permiten obtener una serie de ventajas al respecto, Esta separacin
de pptidos realizada sobre un
capilar de silica fundida a
potenciales elevados 20 a 30 Kv
en un campo de 400 a 500 v/cm
refrigerados por aire.
La corriente electroendosmtica
(FEO) generada por los grupos
silanol de la superficie interna del
capilar da como resultado una
corriente plana del frente del
lquido que contrasta con el frente
parablico de la cromatografa lquida de alta resolucin.
La ventaja de esta tcnica es que el capilar de silica fundida que generalmente
se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene
una ventaja a travs de ella que permite el pasaje de la luz UV de tal manera
que
la
visualizacin
es
on-line.
Con esta tcnica descripta es posible separar cationes, aniones, protenas,
macromolculas y sustancias no cargadas en forma simultnea.
1.2.6. Isoelectroenfoque.
Esta tcnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el
desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH. Las molculas
anfotricas, como los aminocidos, se separan en un medio en el que existe
una diferencia de potencial y un gradiente de pH. La regin del nodo es cida
y la del ctodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal
que las molculas que se han de separar tenga su punto isoelctrico dentro del
rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH
inferior a su punto isoelctrico estarn cargadas positivamente y migraran
hacia el ctodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH ms
bajos que su punto isoelctrico tendrn carga negativa y migraran hacia el
nodo. La migracin les conducir a una regin dnde el pH coincidir con su
punto isoelctrico, tendrn una carga neta nula y se detendrn. De esta forma
las molculas amfotricas se sitan en estrechas bandas donde coincide su
punto isoelctrico con el pH.
1.2.7 Electroforesis bidimensional.
La electroforesis bidimensional se basa en
separar las protenas en una mezcla segn
sus dos propiedades moleculares, una en
cada dimensin. El procedimiento ms usado
se basa en la separacin en una primera
dimensin mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensin segn peso
molecular mediante electroforesis
en poliacrilamida.
1.3 Fuentes de
electroforesis.
error
en
la
Electroforesis
La mayora de las biomolculas
poseen una carga elctrica,
cuya magnitud depende del pH
del medio en el que se
encuentran.
Como
consecuencia, se desplazan
cuando se ven sometidas a un
campo elctrico.
Se denomina electroforesis a la tcnica mediante la cual se separan las
biomolculas en disolucin cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Se
trata de una tcnica fundamentalmente analtica, aunque tambin se puede
realizar con fines preparativos.
En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de
cada molcula definir su separacin en el espacio; al ir transcurriendo el
tiempo, se van separando progresivamente unas de otras.
Al ser el medio de soporte a su vez un polielectrolito, est constituido por
iones, que son atrados y as recubren los iones de la muestra, lo que altera el
comportamiento de stos en el campo. Todo ello hace que el tratamiento
terico cuantitativo de la electroforesis sea muy difcil y que esta tcnica
resulte poco til para obtener informacin precisa sobre la estructura de las
molculas. Sin embargo, es enormemente til como tcnica analtica y
preparativa.
Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis:
De frente mvil: los componentes de la muestra estn presentes en toda la
disolucin y se determina pticamente la posicin del frente de avance o
frontera con el disolvente.
Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes
migran a travs de un disolvente, utilizando adems un medio que da soporte
a ste. En este caso no se determina la movilidad, sino que el nico objetivo de
la tcnica es separar los componentes de la muestra.
Continua: la muestra se aplica tambin en una zona, pero se suministra
continuamente a lo largo del proceso (para ms informacin, vanse las
pp.250-2 de Freifelder, 1999).
Medios de soporte para realizar la electroforesis
Separacin
principalmente por
Separacin por carga, tamao y forma
carga
Papel: sencillo, pero con elevada adsorcin debido a los grupos hidroxilo de la
celulosa.
Acetato de celulosa: los grupos OH estn acetilados, lo que reduce la
adsorcin; baja tincin de fondo; es posible transparentarla o disolverla para
detectar y recuperar, respectivamente, los componentes separados.
Almidn: pasta de almidn cuyos granos se han disgregado en un tampn
caliente (se hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la
poliacrilamida.
Agarosa: polisacrido, producto purificado de algas (composicin similar al
agar-agar). Se disuelve en caliente (50-60C) y al enfriar solidifica formando un
gel, de alta porosidad.
Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerizacin qumica de una
mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentracin de ambas y
su proporcin se consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de
los geles de agarosa.
acrilamida y bisacrilamida
SDS
Inmunoensayo (Western)
En caso de disponer de ellos, los anticuerpos permiten la deteccin selectiva
del componente de inters (protena o grupo marcador unido qumicamente a
la protena o al cido nucleico antes de la electroforesis). La permeabilidad de
los geles para el acceso del anticuerpo es limitada, por lo que se hace una
transferencia de las molculas separadas en el gel hacia una membrana de
nitrocelulosa o de nailon, la cual se somete luego a la disolucin que contiene
el anticuerpo. Los detalles de esta tcnica de inmunotransferencia o ensayo
Western blot se tratarn en un tema posterior.
Deteccin de cidos nucleicos con sondas (Southern y Northern)
Las molculas con una secuencia determinada de nucletidos se pueden
detectar mediante hibridacin con sondas especficas, pequeas molculas de
cido
nucleico
monocatenario
(oligonucletidos)
con
la
secuencia
complementaria a la buscada y marcadas con un istopo radiactivo, un grupo
fluorescente, etc. Para llevar a cabo con xito la hibridacin se requiere
tambin la transferencia desde el gel a una membrana de nitrocelulosa o
nailon. Los detalles de estos ensayos (Southern blot para DNA y Northern blot
para RNA) se estudian en un tema posterior.
Tcnicas especiales
Isoelectroenfoque
(Tambin se llama enfoque isoelctrico o IEF, de isoelectrofocusing). Se trata
de una variante de electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un
gradiente de pH fijado en su estructura. Esto se consigue incluyendo en su
preparacin molculas ionizables con valores de pK diferentes. Como
consecuencia, al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se
encuentran en entornos de pH diferente, y eventualmente alcanzan una regin
en la cual el pH local es igual al punto isoelctrico de la molcula muestra y, en
consecuencia, sta detiene su avance. Se alcanza, pues, un equilibrio y se
consigue la separacin de los componentes de la muestra de acuerdo con su
punto isoelctrico, que adems se puede medir, pues se conoce la geometra
del gradiente de pH fijado al gel.
Electroforesis bidimensional
Tras realizar una primera separacin su resultado se somete a otra de diferente
mecanismo en direccin perpendicular. Generalmente la primera es un
isoelectroenfoque en un gel cilndrico estrecho que luego se coloca como
muestra para una SDS-PAGE. Se obtienen as mapas complejos de bandas, muy
caractersticos de cada muestra, cuya utilidad principal es la comparacin con
el obtenido de otra muestra similar pero conocida.