Aislamiento de levaduras degradadoras de petrleo crudo

Se utiliz un medio sinttico Bushnell Hass Sales minerales (BHMS) para

el aislamiento de levaduras degradantes del petrleo crudo. Medio BHMS
contiene lo siguiente: KH2PO4, 1g/l; K2HPO4, 0.2 g/l; MgSO4*7H2O, 0.2
g/l; CaCl2, 0.02 g/l; NH4NO3, 1g/l ; NaCl, 2 g/l; y 2 gotas de FeCl3 al
60%. El pH se ajust a 5. El BHMS medio fue suplementado con 1% (v /
v) de aceite crudo (petrleo crudo ligero iran) como nica fuente de
carbono y energa. Para inhibir el crecimiento de bacterias, se aadi 1%
(v / v) de cloranfenicol al medio BHMS. Una parte del sedimento (1 g) o
agua de mar (1 ml) se aadi a matraces Erlenmeyer de 250 ml que
contienen 100 ml del medio de BHMS; Los matraces se incubaron
durante 10 das a 30 C en un agitador rotatorio (INFORS AG, Suiza) que
opera a 180 rpm. Luego, alcuotas de 5 ml se transfirieron a medio BHMS
fresco. Despus de la serie de cuatro nuevas subculturas, inculo del
matraz se estras, y fenotpicamente diferentes colonias se purificaron
en medio de agar BHMS. El procedimiento se repiti y slo asla que el
crecimiento pronunciado exhibido en el petrleo crudo se almacenaron
para una caracterizacin adicional (Hassanshahian et al., 2012). La
levadura aislada tambin se cultiv en agar de dextrosa de patata (PDA)
para observar las colonias ms grandes para un mejor estudio.
Identificacin molecular de las levaduras
Se realiz un anlisis de 18S rRNA para caracterizar taxonmicamente
las cepas aisladas. El ADN genmico total de 20 ml fue aislado de
clulas en fase tarda exponencial utilizando el protocolo de miniprep
CTAB para preparaciones de ADN genmico de bacterias (Wilson, 1987).
La amplificacin por PCR de los genes 18S rRNA se realiz utilizando
cebadores generales eucarioticos EukA (5-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT3) y EukB (5-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3) (Petroni et al., 2002). La
reaccin de amplificacin se realiz en un volumen total de 50 l que
consta de 50 de la plantilla, 1 x solucin Q (Qiagen, Hilden, Alemania), 1
x Tampn de reaccin Qiagen, 1 M cada uno de adelante y cebador
inverso, dNTP 10 lM (Gibco, Invitrogen Co., Carlsbad, CA), 2,0 ml y 2,0 U
de Taq polimerasa Qiagen (Qiagen). La amplificacin se realiz en un
GeneAmp 5700 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) durante
35 ciclos thermacycler. El perfil de temperatura para el PCR fue el
siguiente:95 C durante 5 min (1 ciclo); 94 C durante 1 min, 50 C
durante 1 min y 72 C durante 2 min (35 ciclos); y 72 C durante 10 min
al final del ciclo final.
Resultados
3.1. Aislamiento e identificacin de levaduras de petrleo crudo
degradar
Seis cepas de levaduras se aislaron a partir de cultivos de

enriquecimiento que se establecieron a 30 C durante 2 semanas. Dos

de las cepas aisladas que mostraron mayor tasa de crecimiento en el
petrleo crudo se selecciona entre los seis aislamientos en estudio.
Estas cepas (PG-20 y PG-32) se identificaron por primera vez el uso de
pruebas bioqumicas clsicas. La identificacin molecular de los
aislamientos se realiz mediante la amplificacin y secuenciacin de las
secuencias del gen 18S rRNA y comparndolos con la base de datos de
secuencias conocidas de rRNA 18S. Los resultados del procedimiento de
identificacin mostraron que dos aislados de levadura pertenecen a la
especie Y. lipolytica. Todas las secuencias de dos levaduras se
presentaron a la base de datos de secuencia gentica en el Centro
Nacional para la Informacin Biotecnolgica (NCBI). Los identificadores
de los bancos de genes de estas cepas en NCBI son FM957527 (para PG32) y FM957528 (para PG-20).
Los rboles filogenticos de estas dos cepas aisladas se ilustran
fig. 1.

en la

La velocidad 1de crecimiento y la extraccin de petrleo crudo

por
cepas
Dos cepas de Y. lipolytica (PG-20 y PG-32) fueron cultivadas en el
petrleo crudo 1% en dos medios diferentes (BHMS y ONR) y en dos
niveles de pH diferentes (5 y 7) por 1 semana con agitacin. Despus de
1 semana, el crecimiento microbiano y la biodegradacin de petrleo
crudo se analizaron utilizando un mtodo de espectrometra. Como se
inform en la Tabla 1, la cepa de Y. lipolytica PG-20 podra degradar
hasta un 80% para el petrleo crudo en un medio a pH ONR 5. La
velocidad de biodegradacin en el medio BHMS fue menor que en el
medio ONR; Adems, el nivel de pH ms cido era mejor para la
biodegradacin que el nivel de pH neutro. Sin embargo, en todos los
casos la capacidad de biodegradacin de la cepa de Y. lipolytica PG-20
fue mayor que la cepa de Y. lipolytica PG- 32. La Cromatografa de Gases
(GC) grficas de estas dos cepas en comparacin con los espacios en
blanco se muestran en la figura. 2. Como se muestra en esta figura, la
cepa PG-20 disminuy las picas del componente aliftico de petrleo
crudo mejor que la cepa PG-32; Sin embargo, que dos cepas igualmente
remediadas las picas de los componentes alifticos.
La degradacin de los n-alcanos por cepas de levadura
El porcentaje de degradacin de los n-alcanos (C9-C25) presentes en el
petrleo crudo se calcul mediante la comparacin de los
cromatogramas de gas de los controles no degradadas con los de las
pruebas para cada cepa (Tabla 2). Los datos obtenidos muestran que las
dos cepas completamente degradado longitud de cadena media nalcanos (C9-C16) (100%), pero no completamente degradada longitud
de cadena larga (C16-C25) n-alcanos; En este caso, la cepa PG-20 era

mejor en la degradacin que la cepa PG-32. Cuando se aument la

longitud de cadena de n-alcanos, la tasa de degradacin se redujo, ya
que las longitudes de cadena larga de n-alcanos son slidas y tienen una
baja solubilidad para la degradacin por levaduras.
Biodegradacin de algunos hidrocarburos por cepas de levadura
Dos cepas de levadura se cultivaron en una concentracin del 1% de los
hidrocarburos puros que contenan los siguientes: n-alcanos (C8, C11,
C13, C14, C15, C16), Diesel, naftaleno, Phenanterne y Pyrn. Algunos
factores relacionados con la biodegradacin se analizaron despus de 1
semana. Los datos se muestran en la Tabla 3 Como se muestra en esta
tabla, hidrocarburos alifticos (n-alcanos) apoyar mejor el crecimiento de
cepas de levadura que los hidrocarburos aromticos (naftaleno,
Phenanterene y Pyrn). Adems, hubo relaciones directas entre tanto la
actividad de emulsificacin (E24) y la disminucin de la tensin
superficial con el aumento de la tasa de crecimiento de los
hidrocarburos. Sin embargo, para todos los compuestos de
hidrocarburos, la capacidad de crecimiento de la cepa de Y. lipolytica PG20 fue mayor que la de la cepa de Y. lipolytica PG-32.
Actividad de emulsificacin y de disminucin de la tensin
superficial por cepas de levadura en diferentes medios
Algunos de los factores relacionados con la hidrofobicidad de la
superficie celular se analizaron para las dos cepas de levadura. Los
resultados se presentaron en la Tabla 1. La Y. lipolytica cepas PG-20 y
PG-32 tienen la misma hidrofobicidad de la superficie celular (BAO:
75%). Adems, no hay diferencias en la disminucin de la tensin
superficial entre las dos cepas, los dos niveles de pH diferentes y los dos
medios diferentes (ONR y BHMS) examinaron. Pero, la actividad de
emulsificacin de las cepas es mayor en el medio ONR a pH 5; Adems,
la actividad de emulsificacin de la cepa de Y. lipolytica PG-20 fue mayor
que la de la cepa de Y. lipolytica PG-32.
Discusin
Y. lipolytica es una de las levaduras ms estudiadas '"no convencional"'
que se utiliza actualmente como un modelo para el estudio de la
secrecin de la protena, el dimorfismo, la degradacin de sustratos de
hidrocarburos (HS), y varios campos nuevos (Barth y Gaillardin , 1997).
La biodegradacin del SA, tales como alcanos, es bastante complejo
metablica proceso que involucra varias vas metablicas que tienen
lugar en diferentes compartimentos subcelulares. Debido a que estos
sustratos no son miscibles con agua, su captacin requiere
modificaciones morfolgicas y fisiolgicas, en particular en las
propiedades de adhesin celular (hidrofobicidad de la superficie) o en la
produccin de emulsionantes (tensioactivos) (Sinigaglia et al., 1994).

Algunos investigadores han aislado levaduras degradan hidrocarburos

de diferentes entornos, incluidos los entornos terrestres y marinos
(Manee et al, 1998;. Zinjarde y Pant, 2002a). Mateo et al. (2008) aislado
y caracterizado cepas de levadura degradador de hidrocarburos en el
agua de la laguna de Nigeria. Informaron dos cepas de Candida, C.
albicans y Candida maltosa, como las levaduras de degradacin (Mateo
et al., 2008). En el presente estudio, algunas levaduras degradantes del
petrleo crudo fueron aisladas del Golfo Prsico. Entre estas cepas, dos
cepas fueron identificadas como Y. lipolytica. Nuestros resultados son
similares a los de Zinjarde et al. (1997), que aisl Y. lipolytica del agua
de mar de aceite contaminado cerca de Mumbai, India (Zinjarde et al.,
1997).
Se ha observado que la levadura Y. lipolytica es predominante durante
la degradacin de alcanos y produccin emulsionante (Zinjarde y Pant,
2002b). Las dos cepas de Y. lipolytica que se describen en este trabajo
pueden degradar hidrocarburos alifticos con eficacia, pero no crecer lo
suficiente en hidrocarburos aromticos. Levaduras degradadores de
hidrocarburos son conocidos por producir sustancias emulsionantes para
formar micelas o microgotas de aceite. Y. lipolytica se ha sabido para
producir sustancias emulsionantes extracelulares (Torabizadeh et al.,
1996). En este estudio, se analizaron algunos factores relacionados con
la hidrofobicidad de la superficie celular. Los resultados demuestran que
estas dos cepas tienen alta hidrofobicidad de la superficie celular y
puede disminuir significativamente la tensin superficial; Adems, estas
cepas tienen un nivel aceptable de actividad de emulsificacin en
sustratos de hidrocarburos. Amaral et al. (2006) estudiaron la actividad
de emulsificacin en medio de cultivo de una cepa brasilea salvaje de Y.
lipolytica aislado a partir de agua de ro; encontraron que esta cepa
tiene un alto nivel de actividad de emulsificacin en el intervalo de pH
de 3-5, similar a nuestros resultados (Amaral et al., 2006).
La relacin entre la hidrofobicidad de la superficie celular y la
biodegradacin de petrleo crudo por microorganismos ha sido
reportado por algunos investigadores (Ijah, 1998). Hasanshahian y
Emtiazi (2008) describen una relacin directa entre la hidrofobicidad de
la superficie celular y la degradacin de alcanos en las bacterias que
degradan el petrleo crudo que se aislaron desde el Golfo Prsico. Los
resultados de este estudio sobre la levadura confirman los resultados
anteriores de bacterias. Chrzanowski et al. (2005) ilustra una relacin
entre hidrofobicidad C. maltosa y la biodegradacin de hidrocarburos,
similar a nuestros resultados (Chrzanowski et al., 2005). Debido a la
capacidad de los dos aislamientos de la cepa de Y. lipolytica estudi aqu
para degradar y oxidar los hidrocarburos y petrleo crudo de manera
muy eficiente, estas levaduras se pueden utilizar para los procesos de
biorremediacin para disminuir la contaminacin por hidrocarburos en el

Golfo Prsico. Sin embargo, como es de esperar, los resultados obtenidos

en el laboratorio no pueden escalar hasta el entorno natural; por tanto,
hay que analizar el comportamiento de estas cepas en experimentos de
mesocosmos para determinar la forma en que pueden actuar en el
entorno natural para la biorremediacin de ambientes marinos
contaminados.
Conclusin
En este estudio, dos cepas que degradan el petrleo crudo de Y.
lipolytica se aislaron desde el Golfo Prsico. Estas cepas tienen altos
niveles de degradacin del aceite crudo y un crecimiento suficiente en
algunos hidrocarburos alifticos. Se encontr una relacin directa entre
tanto la hidrofobicidad celular de las cepas de levadura y su actividad de
emulsificacin y la biodegradacin de petrleo crudo y una disminucin
de la tensin superficial.