PRACTICA DE LABORATORIO N 3

DIFERENCIACION BIOQUIMICA EN LA INOCULACIO DE AGAR

SALMONELLA SHIGELLA
I.

INTRODUCCION

Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos

aplicados a medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos
permiten identificar distintos microorganismos presentes.
Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar
la actividad de una va metablica a partir de un sustrato que se
incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer
incorpora o no.
Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de mltiples
medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del
microorganismo en estudio.
I.

II.

OBJETIVOS
Determinar la diferenciacin bioqumica en le inoculacin de
agar salmonella shigella
FUNDAMENTO TEORICO

El estudio bioqumico que se lleva a cabo como complemento de

otros estudios bacteriolgicos es posible gracias a las reacciones
fisiolgicas y qumicas que llevan a cabo los microorganismos. Para
esto se emplean medios de cultivo enriquecidos con productos
tiles para el metabolismo celular, los cuales adems contienen
algn indicador que hace cambiar el color del medio al efectuar
dichos microorganismos sus funciones.
Los organismos varan en su capacidad para utilizar diferentes
compuestos (por ejemplo: carbohidratos, urea, citrato, etc.) para
algunos microorganismos que se usan en su identificacin en el
laboratorio.
De acuerdo a los productos de su actividad qumica, las bacterias se
pueden clasificar como:
1. Zimgenas: las que fermentan los carbohidratos, desdoblndolos
en alcohol, cido lctico o actico.
2. Aergenas: las que producen gas como hidrgeno y dixido de
carbono como resultado de su actividad metablica.
3. Anaergenas: las que no producen cantidades visibles de gas
durante su actividad metablica.
4. Cromgenas: las que producen pigmentos solubles o insolubles.
5. Fotgenas: las que causan putrefaccin y producen una dbil
fosforescencia (algunas bacterias marinas)

Entre las pruebas bioqumicas ms comunes tenemos: Caldos de

carbohidratos con indicador de pH, rojo de fenol: Al fermentar
algunos carbohidratos, muchas bacterias producirn cido, y con un
medio con pH original alrededor de 7.4 al bajar ste a 6.8 por el
cido que produce un cambio de color gracias a la incorporacin de
un indicador de pH como es el rojo de fenol.
AGAR SALMONELLA-SHIGELLA

El medio Salmonella-Shigella preparado por MEDIBAC LAB en placa

de petri desechable, es utilizado principalmente para el aislamiento
e identificacin a nivel clnico de patgenos entricos
principalmente del gnero Salmonella. Adems este medio permite
la diferenciacin de microorganismos lactosa positivo y lactosa
negativos e inhibe los microorganismos gram-positivos por su
contenido de sales biliares.
TECNICA DE INOCULACION Y AISLAMIENTO DE BACTERIA
El crecimiento de los microorganismos no se puede estudiar
individualmente debido a su tamao tan pequeo, por lo que es
necesario recurrir a medios nutritivos artificiales, donde se puedan
desarrollar rpidamente y producir grandes poblaciones. En estas
condiciones se pueden manipular y efectuar las investigaciones
deseadas.
Los materiales nutritivos donde se desarrollan y multiplican los
microorganismos contienen los nutrientes necesarios para su
crecimiento, y se denominan medios de cultivo, cuyos componentes
son muy variados. La eleccin del medio se basa en el propsito del
estudio.
Los medios de cultivo pueden ser sintticos, es decir de
composicin qumica conocida, o pueden ser complejos, en los
cuales por lo menos hay un componente de composicin
desconocida.
En general, los medios son ricos en protenas no especficas, con el
fin de estimular el crecimiento de los microorganismos que se
desean aislar. La mayor parte de los microorganismos requieren un
medio enriquecido o suplementado por substancias como sangre,
suero, vitaminas, etc.
Los medios lquidos se pueden transformar en slidos, mediante la
adicin de agar. Esto significa que conservan la misma frmula
nutritiva
Las bacterias se cultivan en el laboratorio en materiales nutritivos
denominados medios de cultivo, cuyos componentes son muy
variados. La eleccin del medio se basa en el propsito del estudio.
El material que se inocula en el medio se denomina inculo. El
aislamiento de las especies bacterianas, es decir la separacin de
unas especies de otras, se logra mediante diferentes tcnicas. Por
ejemplo, por el mtodo de siembra por estra cruzada en placa,
las clulas quedan separadas individualmente, al inocular (al

sembrar) un medio slido con agar, contenido en cajas de Petri; en

esta tcnica, durante la incubacin, las clulas microbianas
individuales al reproducirse rpidamente, en 18 a 24 horas
producen masas visibles a simple vista, denominadas colonias.
Cada colonia que se observe diferente, presumiblemente es un
cultivo puro de una sola especie de bacterias. Si dos clulas
microbianas procedentes del inculo original quedan muy cerca una
de la otra sobre el medio de agar, las colonias que resultan quedan
mezcladas o muy juntas. Posteriormente, transfiriendo una sola
colonia aislada a un medio nuevo, se obtiene el desarrollo de un
cultivo puro bacteriano.
La inoculacin de medios lquidos permite el desarrollo de las
bacterias mezcladas, por lo que sirve para otros propsitos
diferentes al aislamiento.
II.1.
TSA (AGAR SOJA Y TRIPTICASA)
El TSA Agar es un medio de uso general que permite el
crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no
exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias. Permite
visualizar reacciones hemolticas que producen muchas especies
bacterianas.
Tiene por base una fuente proteica (digeridos trpticos, digeridos
proteicos de soja) con una pequea cantidad de hidratos de
carbono naturales, cloruro sdico y 5% de sangre.
Es un medio recomendado para la deteccin y recuento de una
amplia gama de microorganismos. La presencia de Lectina y
Tween permite neutralizar la actividad antibacteriana, facilitando
la investigacin de los grmenes en productos o superficies que
contengan:
Aldehdos,
derivados
fenlicos,
o
amonio
cuaternario.
La aportacin de casena y peptonas de soja al Agar de
Tripticasa-soja hace el medio muy nutritivo por el suministro de
nitrgeno orgnico, particularmente aminocidos y pptidos de
cadena ms larga. La presencia de estas peptonas en el medio
permite el cultivo de una gran variedad de grmenes aerobios y
anaerobios que crecen rpidamente, as como los del gnero
Candida. Tambin permite el crecimiento de algunos grmenes
exigentes
como
estreptococos,
pneumococos,
Brucella,
corinebacterias, Erysipelothrix y Pasteurella.
II.2.
TSI (AGAR DE HIERRO Y TRIPLE AZUCAR)
El agar TSI es uno de los ms usados para ver la fermentacin
de carbohidratos en la familia Enterobacteriaceae. Se pueden
tener varias posibilidades de fermentacin de acuerdo a las
caractersticas metablicas del microorganismo como son:
Utilizacin de glucosa sola. Los microorganismos que fermentan
solo la glucosa provocan en este medio una reaccin alcalina en

la superficie (roja) sobre un fondo cido (amarillo, k/a) debido a

que realizan una degradacin aerbica de la glucosa en la
superficie, convirtiendo el piruvato en agua y dixido de
carbono. Despus de 18 a 24 horas de incubacin como la
concentracin de glucosa es baja (0.1%), los microorganismos
empiezan a utilizar las peptonas que se encuentran en el medio,
causando la liberacin de amoniaco y produciendo un pH
alcalino (rojo) gracias al rojo de fenol que tiene el medio como
indicador de pH. En el fondo, como no hay oxgeno, se realiza
una degradacin anaerbica y el piruvato se convierte en lactato
con lo cual el pH disminuye quedando el pH cido (amarillo).
II.3.
CITRATO DE SIMMONS
El citrato de sodio es la nica fuente de carbono. El cloruro de
sodio mantiene el equilibrio osmtico del medio. Cuando las
bacterias utilizan el citrato, el medio se alcaliniza y cambia el
color inicial verde (neutro), que est dado por la presencia del
azul de bromotimol a color azul (alcalino, prueba positiva). La
reaccin negativa se manifiesta por ausencia de crecimiento y
no hay cambio de color. Salmonella typhi, Salmonella paratyphi
y Shigella se pueden diferenciar de S. schottmuelleri, S.
enteritidis y S. typhimurium siendo este ltimo grupo capaz de
utilizar el citrato, mientras que el primero no puede hacerlo. El
medio se puede emplear de la misma forma que el Citrato de
Koser para realizar la prueba de utilizacin del citrato como una
de las reacciones del IMVIC.
Inocular el medio de cultivo a partir de una colonia estriando la
superficie. Incubar 24 48 h a 35C.
III.

MATERIALES Y METODOS

III.1.
MATERIALES
III.1.1. MATERIALES DE LABORATORIO
Placas Petri esterilizados
Balanza analtica
Papel metlico
Autoclave
Alcohol
Azas
Salmonella Shigella Agar
Agua de masa
Solucin fisiologica
Probeta
Mechero a gas
Tubos con tapa rosca

III.2.
METODOS
III.2.1. PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO
Primeramente antes de empezar la preparacin del medio de
cultivo se esteriliza todos los materiales o instrumentos a
utilizar.
Luego se acondiciona la autoclave con la finalidad de evitar la
contaminantes
Despus se pone 100 ml de agua de mesa a una botella
En seguida la balanza se tara para pesar el salmonella
shigella agar
Inmediatamente se pasa a echar el salmonella shigella agar
en la botella para ser disuelto
A continuacin se pone en el autoclave
Seguidamente se pasa a enfriar
posteriormente se lleva pasa a separar el medio en las placas
Petri
al instante se pasa a sembrar el medio de cultivo
Finalmente se contabiliza el desarrollo de las colonias

IV.

ANEXOS

preparacion
de autoclave

preparacion
de agua de
mesa en una
botella

enfriado de
la mezcla de
ban conkey
agar
autoclavado

autoclavado
de la mezcla
del ban
conkey agar

separacion
de la
mezclaa en
placas petri

siembra de
los medios

calentado de
la mezcla del
ban conkey
agar

pesado del
ban conkey
agar

mezclado del
ban conkey
agar

contado
de los
medios
de cultivo