UNIVERSIDAD DE TALCA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA DE TECNOLOGA MDICA

DIFERENCIACIN DE 4 ESPECIES DE Haplopappus

MEDIANTE GC-MS

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE LICENCIADO EN

TECNOLOGA MDICA

ALUMNA: LAURA ANDREA LIZANA VARGAS

PROFESOR GUA: DR. IVN RAZMILIC BONILLA

TALCA-CHILE
2013

AGRADECIMIENTOS

A todos aquellos que me ayudaron a concretar este gran proyecto, smbolo de la

culminacin de mi formacin profesional, y que marca el inicio de una nueva etapa en mi
vida.

Agradezco a mi profesor gua, Dr. Ivn Razmilic Bonilla por la confianza y el apoyo
brindado durante este proceso y al profesor Luis Guzmn por su vocacin y ayuda.

Un agradecimiento especial se lo dedico a Don Sergio Reyes por la amistad creada, por sus
consejos, sus historias, y por el grato y cordial ambiente que generaba cada da en el
laboratorio del Instituto de Qumica de Recursos Naturales;
agradezco tambin a aquellos que de una u otra
forma son parte de este proyecto.

DEDICATORIA

A Dios y a la virgencita por darme los padres que tengo.

A mis padres: Laura Rosa Vargas Gonzlez y Juan Ramn Lizana Gonzlez (Mi Negri y
Dady Yanki), por ser los mejores padres del mundo. Les agradezco la lucha diaria
que realizan por ver a sus hijos siendo profesionales. Por eso y mucho ms GRACIAS, los
AMO con todo mi corazn.

A mis hermanos: Juan Marcelo, Claudia Alexandra

y Luis Alberto por darle sentido a mi existencia A
pesar de los obstculos que nos coloque la vida se
que siempre estaremos juntos.

A mi Xurrito -Gustavo Javier- el chico que rob mi

corazn desde el instante en que lo conoc.

A mi mami Talquina, Graciela Oses por cuidarme

como si fuera su propia hija.

A los CTM (Compaeros de Tecnologa Mdica), aquellos que no olvidar.

Especialmente a Valery Verdugo, Manuel Fuentes, Etiennette Guerrero, Anggela
Barrientos, Jaime Fuentes y Cristian Torres por apoyarme y aminarme cuando ms
los necesit.

INDICE DE CONTENIDO

1.

RESUMEN .....................................................................................................................1

2.

INTRODUCCIN ........................................................................................................2

3.

HIPTESIS ...................................................................................................................4

4.

OBJETIVOS ..................................................................................................................5
4.1 OBJETIVO GENERAL .................................................................................................... 5
4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS .............................................................................................. 5

5.

REVISIN BIBLIOGRFICA ...................................................................................6

5.1 PLANTAS MEDICINALES ............................................................................................... 6
5.1.1

Qu son las plantas medicinales ......................................................................... 6

5.1.2

Familia Asteraceae ............................................................................................. 6

5.2 METABOLITOS SECUNDARIOS ...................................................................................... 9

5.2.1

Metabolismo vegetal .......................................................................................... 9

5.2.2

Formacin de metabolitos secundarios. ........................................................... 10

5.2.3

Respuesta fisiolgica de las plantas frente a condiciones de estrs ................. 14

5.3 GNERO HAPLOPAPPUS ............................................................................................. 17

5.3.1

Distribucin geogrfica .................................................................................... 17

5.3.2

Caractersticas generales de las 4 Haplopappus spp estudiadas en esta

investigacin. ............................................................................................................... 17
5.3.3

Mercado............................................................................................................ 18

5.4 CROMATOGRAFA DE GASES - ESPECTROMETRA DE MASAS (GC-MS) ...................... 19

6.

MATERIAL Y MTODO..........................................................................................21
6.1 MUESTRA VEGETAL .................................................................................................. 21

6.2 EXTRACCIN DE RESINAS CON DICLOROMETANO (DCM). ........................................ 24

6.3 EXTRACCIN

DE ACEITES ESENCIALES

(AE)

VOLTILES MEDIANTE ARRASTRE DE

VAPOR ............................................................................................................................... 24

6.4 CROMATOGRAFA DE GASES-ESPECTROMETRA DE MASAS (GC-MS)........................ 26

6.5 IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE COMPUESTOS .............................................. 27
7.

RESULTADOS............................................................................................................28
7.1 EXTRACTOS RESINOSOS (ER) DE HAPLOPAPPUS SPP. ................................................. 28
7.1.1

Identificacin de los compuestos mayoritarios en ER de hojas de Haplopappus

spp ............................................................................ 28
7.2 ACEITES ESENCIALES (AE) DE HAPLOPAPPUS SPP. .................................................... 38
7.2.1

Identificacin de los compuestos mayoritarios en AE de hojas de Haplopappus

spp.. ...................................................................................................................... 38
7.3 ANLISIS INTERESPECIE E INTRAESPECIE EN EXTRACTOS RESINOSOS DE HAPLOPAPPUS
SPP.. .......................................................................................................................... 48

7.3.1

Anlisis interespecie en muestras de extracto resinoso (ER) ........................... 48

7.3.2

Anlisis intraespecie del extracto resinoso (ER) de 2 especies de

Haplopappus............................................................................................................. 50
7.4 ANLISIS

INTERESPECIE E INTRAESPECIE EN ACEITES ESENCIALES DE

HAPLOPAPPUS

SPP...... .......................................................................................................... 54

7.4.1

Anlisis interespecie en muestra de aceites esenciales (AE) ........................... 54

7.4.2

Anlisis intraespecie de aceites esenciales (AE) de 2 especies de

Haplopappus... ...................................................................................................... 57
8.

DISCUSIN ................................................................................................................61

9.

CONCLUSIN............................................................................................................64

10. BIBLIOGRAFA .........................................................................................................65

INDICE DE FIGURAS

FIGURA 1: REPRESENTACIN QUMICA DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS

UTILIZADO EN EL ESTUDIO DE FERREIRA ET AL. ............................................... 8
FIGURA

2:

METABOLISMO

CLULA

VEGETAL;

INTERACCIN

ENTRE

METABOLISMO PRIMARIO Y SECUNDARIO. ....................................................... 9

FIGURA

3: RUTAS

IMPLICADAS

EN

LA SNTESIS

DE

METABOLITOS

SECUNDARIOS EN LA CLULA VEGETAL .......................................................... 11

FIGURA 4: COMPORTAMIENTO DE LA SNTESIS DE TERPENOS EN CLULAS
VEGETALES. .............................................................................................................. 12
FIGURA

5: ESTRUCTURA QUMICA DE ISOPRENO.................................................. 12

FIGURA

6:

RGANOS

TEJIDOS

VEGETALES

QUE

MODIFICAN

SU

COMPOSICIN TERPENOIDE FRENTE A CONDICIONES ADVERSAS ........... 14

FIGURA 7: COMPUESTOS FENILPROPANOIDES EXPRESADOS SEGN LA
CONDICIN DE ESTRES A LA QUE SE SOMETEN LAS PLANTAS. .................. 15
FIGURA 8: MORFOLOGA DE LAS HOJAS DE HAPLOPAPPUS SPP. ............................. 21
FIGURA 9: SITIO DE RECOLECCIN DE LOS ESPECMENES DE HAPLOPAPPUS. ... 22
FIGURA

10:

REPRESENTACIN

ESQUEMTICA

DE

LA

METODOLOGA

UTILIZADA. ............................................................................................................... 25
FIGURA 11: CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE EXTRACTO RESINOSO
DE HAPLOPAPPUS BAYLAHUEN. ..................................................................................... 29
FIGURA 12: CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE EXTRACTO RESINOSO
DE HAPLOPAPPUS RIGIDUS. ........................................................................................... 31
FIGURA 13: CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE EXTRACTO RESINOSO
DE HAPLOPAPPUS TAEDA. ............................................................................................. 33
FIGURA 14: CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE EXTRACTO RESINOSO
DE HAPLOPAPPUS MULTIFOLIUS. ................................................................................... 35

FIGURA

15: DISTRIBUCIN DE LOS PRINCIPALES COMPUESTOS PRESENTES

EN EL EXTRACTO RESINOSO DE HAPLOPAPPUS SPP. ........................................... 37

FIGURA 16: CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE ACEITES ESENCIALES
DE HAPLOPAPPUS BAYLAHUEN. ..................................................................................... 39
FIGURA 17: CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE ACEITES ESENCIALES
DE HAPLOPAPPUS RIGIDUS. ........................................................................................... 41
FIGURA 18: CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE ACEITES ESENCIALES
DE HAPLOPAPPUS TAEDA............................................................................................... 43
FIGURA 19: CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE ACEITES ESENCIALES
DE HAPLOPAPPUS MULTIFOLIUS. ................................................................................... 45
FIGURA

20: DISTRIBUCIN DE LOS PRINCIPALES COMPUESTOS PRESENTES

EN ACEITES ESENCIALES DE HAPLOPAPPUS SPP. ................................................. 47

FIGURA 21: ESPECTRO OBTENIDO AL INTERPOLAR LOS CROMATOGRAMAS
DE EXTRACTOS RESINOSOS ANALIZADOS EN CADA ESPECIE DE
HAPLOPAPPUS. .............................................................................................................. 48
FIGURA 22: AMPLIFICACIN DE LOS TIEMPOS DE RETENCIN EN QUE SE
ENCUENTRAN LOS POSIBLES COMPUESTOS MARCADORES. ..................... 49
FIGURA 23: CROMATOGRAMAS OBTENIDOS MEDIANTE GC-MS DE EXTRACTOS
RESINOSOS DE HAPLOPAPPUS RIGIDUS SEGN LUGAR DE RECOLECCIN. ... 51
FIGURA 24: CROMATOGRAMAS OBTENIDOS MEDIANTE GC-MS DE EXTRACTOS
RESINOSOS DE HAPLOPAPPUS TAEDA SEGN LUGAR DE RECOLECCIN. ..... 53
FIGURA 25: ESPECTRO OBTENIDO AL INTERPOLAR LOS CROMATOGRAMAS DE
ACEITES ESENCIALES ANALIZADOS EN CADA ESPECIE DE HAPLOPAPPUS. 54
FIGURA 26: AMPLIFICACIN DE LOS TIEMPOS DE RETENCIN EN QUE SE
ENCUENTRAN LOS POSIBLES COMPUESTOS MARCADORES. ..................... 55
FIGURA 27: CROMATOGRAMAS OBTENIDOS MEDIANTE GC-MS DE ACEITES
ESENCIALES DE HAPLOPAPPUS RIGIDUS SEGN LUGAR DE RECOLECCIN. 58
FIGURA 28: CROMATOGRAMAS OBTENIDOS MEDIANTE GC-MS DE ACEITES
ESENCIALES DE HAPLOPAPPUS TAEDA SEGN LUGAR DE RECOLECCIN. ... 60

INDICE DE TABLAS

TABLA

1:

METABOLITOS

SECUNDARIOS

PRESENTES

EN

17

TRIBUS

PERTENECIENTES A LA FAMILIA ASTERACEAE ................................................. 7

TABLA

2: CARACTERSTICAS

MORFOLGICAS

AMBIENTALES

DE

DESARROLLO EN HAPLOPAPPUS SPP. ...................................................................... 18

TABLA 3: UBICACIN GEOGRFICA DEL SITIO DE RECOLECCIN DE
HAPLOPAPPUS SPP ......................................................................................................... 23
TABLA 4: COMPUESTOS

VOLTILES

IDENTIFICADOS

PARTIR

DEL

CROMATOGRAMA DE EXTRACTO RESINOSO DE UN ESPCIMEN DE

HAPLOPAPPUS BAYLAHUEN............................................................................................. 30
TABLA 5: COMPUESTOS

VOLTILES

IDENTIFICADOS

PARTIR

DEL

CROMATOGRAMA DE EXTRACTO RESINOSO DE UN ESPCIMEN DE

HAPLOPAPPUS RIGIDUS. ................................................................................................. 32
TABLA 6: COMPUESTOS

VOLTILES

IDENTIFICADOS

PARTIR

DEL

CROMATOGRAMA DE EXTRACTO RESINOSO DE UN ESPCIMEN DE

HAPLOPAPPUS TAEDA. .................................................................................................... 34
TABLA 7: COMPUESTOS

VOLTILES

IDENTIFICADOS

PARTIR

DEL

CROMATOGRAMA DE EXTRACTO RESINOSO DE UN ESPCIMEN DE

HAPLOPAPPUS MULTIFOLIUS. ......................................................................................... 36
TABLA 8: COMPUESTOS

VOLTILES

IDENTIFICADOS

PARTIR

DEL

CROMATOGRAMA DE ACEITES ESENCIALES DE UN ESPCIMEN DE

HAPLOPAPPUS BAYLAHUEN............................................................................................. 40
TABLA 9: COMPUESTOS

VOLTILES

IDENTIFICADOS

PARTIR

DEL

CROMATOGRAMA DE ACEITES ESENCIALES DE UN ESPCIMEN DE

HAPLOPAPPUS RIGIDUS. ................................................................................................. 42

TABLA 10: COMPUESTOS VOLTILES IDENTIFICADOS A PARTIR DEL

CROMATOGRAMA DE ACEITES ESENCIALES DE UN ESPCIMEN DE
HAPLOPAPPUS TAEDA. .................................................................................................... 44
TABLA 11: COMPUESTOS VOLTILES IDENTIFICADOS A PARTIR DEL
CROMATOGRAMA DE ACEITES ESENCIALES DE UN ESPCIMEN DE
HAPLOPAPPUS MULTIFOLIUS. ......................................................................................... 46

1.

RESUMEN

En esta investigacin se identificaron y cuantificaron compuestos qumicos mayoritarios

presentes en extractos resinosos y aceites esenciales de 4 especies de Haplopappus nativas
de nuestro pas; posteriormente, se compar los patrones cromatogrficos de estos
ejemplares con el objetivo de establecer patrones qumicos que permitan diferenciar las
especies en estudio. Las muestras se analizaron mediante cromatografa gas masa (GCMS).

Se observ que los compuestos mayoritarios presentes en los extractos resinosos (ER)
correspondan a hidrocarburos y terpenoides; los aceites esenciales (AE) en cambio,
estaban compuestos mayoritariamente por terpenoides. La muestra de ER result ser la que
proporcion mayor evidencia visual al momento de diferenciar las 4 especies de
Haplopappus, sin embargo, su uso no fue factible debido a la similitud de los compuestos,
y al grado de variacin en la expresin tanto a nivel interespecie como intraespecie. En los
patrones cromatogrficos obtenidos a partir de AE se observ una gran cantidad de
compuestos muy similares entre las especies, por ende, su uso para la diferenciacin de
especies no es recomendable.

En sntesis, se concluye que no es posible diferenciar estas 4 especies de Haplopappus

mediante GC-MS utilizando las tcnicas empleadas en esta investigacin.

2.

INTRODUCCIN

La familia Asteraceae es una de las ms numerosas del reino vegetal, est compuesta
por 28.000 especies aproximadamente, las que se caracterizan por ser muy heterogneas
desde el punto de vista morfolgico y ecolgico. Las especies de esta familia son de gran
relevancia en el mbito econmico por su uso medicinal, alimenticio y ornamental.

Las especies del gnero Haplopappus pertenecen a esta familia. En Amrica existen
aproximadamente 160 especies, de las cuales 61 crecen en nuestro pas y se distribuyen
exclusivamente en la Cordillera de los Andes, en provincias del norte de Chile y regiones
prximas a Argentina (Roldan et al., 2007). Antiguamente, esta planta fue utilizada por
Aymaras y Mapuches con fines teraputicos y se le asociaba un gran poder hepatoprotector;
en la actualidad, Haplopappus baylahuen Remy forma parte de las hierbas medicinales ms
conocidas del pas y figura en el Listado de Medicamentos Herbarios Tradicionales.

El Dr. Jos San Martn determin la presencia de 17 especies diferentes de Haplopappus

que son utilizadas comnmente como Bailahun (Faini, 2012); de este complejo,
Haplopappus baylahuen, H. taeda, H. villanuevae y H. multifolius son las especies ms
consumidas (Muoz et al., 1981; Torres et al., 2004; Vogel et al., 2005a). En Chile, el
consumo de Haplopappus equivale a 23.322 kg al ao, siendo H. multifolius la especie ms
comercializada (80%), el 20% restante recaera en las especies H. baylahuen y H. taeda
(Vogel et al., 2007).

Faini (2012) plantea que la revisin de lo publicado sobre el gnero en nuestro pas, da
cuenta de una gran confusin taxonmica existente en la literatura, lo que se traduce en
notorios errores en la descripcin de la composicin qumica y, por ende, de la posible
actividad biolgica de la especie H. baylahuen. Para resolver este dilema es necesario
estudiar diversas tcnicas analticas que permitan diferenciar inequvocamente las especies
aludidas.

Las tcnicas cromatogrficas suelen ser una herramienta til para realizar
caracterizaciones qumicas de diversas especies; estas tcnicas se basan en la separacin e
identificacin de compuestos (presentes en mezclas complejas) de acuerdo a las
propiedades fsico-qumicas de cada uno de ellos. Si a esto agregamos el acoplamiento a un
sistema de espectrometra de masas se obtiene una tcnica analtica de alta complejidad;
que permite identificar y cuantificar inequvocamente los analitos presentes en la muestra.

La identificacin de compuestos diferenciadores entre las especies es un paso crucial

para el futuro de esta planta medicinal, siendo posible generar un plan de comercio
sustentable del verdadero Haplopappus baylahuen; ya que factores como el pastoreo, los
incendios y la extraccin inapropiada de estas especies ponen en riesgo la biomasa y
disponibilidad de estos ejemplares en nuestro pas.

Finalmente mencionar que una base cientfica slida y la justificacin para la seleccin
correcta de especies vegetales permitira su cultivo industrial, el procesamiento y la
obtencin de esencias, con miras a satisfacer los mercados nacionales e internacionales con
productos de calidad garantizada y alto valor agregado (Stashenko et al., 2003).

3. HIPTESIS

Es sabido que el comercio de la planta medicinal Bailahun corresponde a un Complejo

Bailahun que es comercializado en forma indistinta en el mercado nacional. No obstante,
no existen estudios que avalen el uso de la totalidad de estas plantas con un mismo fin
medicinal, por ende, es necesario implementar tcnicas que permitan diferenciar e
identificar cada una de estas especies de Haplopappus con el objetivo de utilizar el
verdadero Bailahun para consumo humano.

En base a estos antecedentes planteo que:

Patrones cromatogrficos obtenidos a partir de extractos resinosos y aceites esenciales de

hojas de Haplopappus baylahuen, H. rigidus, H. taeda y H. multifolius analizadas mediante
GC-MS pueden ser utilizados para diferenciar estas especies.

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Diferenciar cuatro especies chilenas de Haplopappus en base a los compuestos

qumicos detectados en exudado resinoso y aceites esenciales mediante
cromatografa gas masa (GC-MS).

4.2 Objetivos especficos

Obtener extractos resinosos (ER) y aceites esenciales (AE) de hojas secas de

Haplopappus mediante extraccin con diclorometano y por arrastre de vapor
respectivamente.
Identificar y cuantificar los compuestos mayoritarios presentes en ER y AE de las
especies de Haplopappus.
Establecer similitudes y/o diferencias entre patrones cromatogrficos a nivel
interespecie e intraespecie en ER y AE.

5. REVISIN BIBLIOGRFICA

5.1 Plantas medicinales

5.1.1

Qu son las plantas medicinales

Segn la OMS se define planta medicinal como cualquier planta que en uno o ms de
sus rganos contenga sustancias que pueden ser utilizadas con finalidad teraputica o que
son precursores para la hemisntesis qumico-farmacutica.

5.1.2

Familia Asteraceae

Las asterceas comprenden ms de 1700 gneros y unas 24.000-30.000 especies

distribuidas por todo el mundo -excepto en la Antrtida-, e incluyen desde pequeas hierbas
de 1 centmetro de altura hasta rboles de ms de 30 metros. (Katinas et al., 2007). Algunas
han sido domesticadas y cultivadas desde la antigedad, mientras que otras forman parte de
vastas extensiones de vegetacin natural (Del Vitto et al., 2009). Esta familia es
considerada un grupo altamente evolucionado, y recibe el nombre alternativo Compositae.
(Del Vitto et al., 2009).

Morfolgicamente se caracterizan por poseer inflorescencias racimosas en captulos, con

flores individuales epginas rodeadas de una o varias hileras de brcteas involcrales, sobre
el receptculo comn en que remata el escapo o rama florfera (Weberling, 1989).
6

Esta familia es conocida por poseer numerosas especies con actividad medicinal;
hecho que se ve avalado por un activo metabolismo secundario capaz de generar
compuestos con propiedades beneficiosas para el ser humano (Raal et al., 2011). Los
metabolitos secundarios aislados de asterceas son muy variados (Del Vitto et al.,
2009); en el ao 2001 Alvarenga y colaboradores identificaron 11 metabolitos
secundarios presentes en 17 tribus pertenecientes a la familia Asteraceae; en la tabla N
1 se destaca la expresin y la diversidad de compuestos presentes en la tribu Astereae;
tribu a la cual pertenecen las especies de Haplopappus.

Tabla 1: METABOLITOS SECUNDARIOS PRESENTES EN 17 TRIBUS

PERTENECIENTES A LA FAMILIA ASTERACEAE (ALVARENGA et al., 2001)

Cuatro aos ms tarde, se propuso una nueva clasificacin para diferenciar las tribus
pertenecientes a la familia Asteraceae (Ferreira et al., 2005); utilizando 9 de los 11
metabolitos secundarios mencionados anteriormente (Figura 1).

Donde: GLC: Glucosa

XLY: Xilopiranosil

Me: Metil

MeAcr: Metilacrilato

Figura 1: REPRESENTACIN QUMICA DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS

UTILIZADO EN EL ESTUDIO DE FERREIRA et al.
8

5.2 Metabolitos secundarios

5.2.1

Metabolismo vegetal

La distincin entre los compuestos primarios y secundarios del metabolismo vegetal se

ha basado principalmente en el conocimiento de la funcin y distribucin de estos en la
naturaleza (Tapiero, 2001). Los metabolitos primarios se caracterizan por ser
indispensables para la supervivencia, desarrollo, crecimiento, y reproduccin vegetal;
ejerciendo funcin en la estructura celular, el metabolismo energtico, y la regulacin del
metabolismo (Bourgaud et al. 2001; Tapiero, 2001). Adems actan como precursor en la
formacin de metabolitos secundarios (Figura 2).

Figura 2: METABOLISMO CLULA VEGETAL; INTERACCIN ENTRE

METABOLISMO PRIMARIO Y SECUNDARIO (valos et al., 2009).
9

El trmino secundario fue introducido por Kossel en 1891 e implicaba que estas
sustancias tenan una menor importancia y muchas veces se les atribuy la propiedad de
productos de desecho del metabolismo primario (Edreva et al., 2008). Actualmente se sabe
que los metabolitos secundarios tienen funciones ecolgicas especficas de proteccin en
las plantas; actuando como repelentes de animales, defensa frente a diferentes patgenos,
atrayentes de ciertos microorganismos (valos et al., 2009) y de adaptacin al medio
ambiente (Bourgaud et al., 2001; Cicci et al., 2010).

Los metabolitos secundarios se caracterizan por sus diferentes usos y aplicaciones como
medicamentos, insecticidas, herbicidas, perfumes o colorantes; y son producidos por
determinados gneros, familias, o incluso algunas especies del reino vegetal (valos et al.,
2009).

5.2.2

Formacin de metabolitos secundarios.

La sntesis de metabolitos secundarios desprende de 4 rutas metablicas diferentes; ruta

del cido mevalnico, cido shikmico, cido malnico y por medio del ciclo de Krebs
(Figura 3). La sntesis especfica de cada compuesto suele estar restringida a estados
especficos del desarrollo respectivo de cada tipo de organismo, clulas especializadas y
perodos de estrs causados por la deficiencia de nutrientes o por el ataque de
microorganismos (Garca, 2004).

10

Figura 3: RUTAS IMPLICADAS EN LA SNTESIS DE METABOLITOS

SECUNDARIOS EN LA CLULA VEGETAL. (Azcn et al., 2000)

A continuacin se realiza una breve descripcin de los principales grupos de metabolitos

secundarios asociados al metabolismo secundario de los vegetales.

Terpenos:

Los terpenos corresponden a estructuras lipdicas formadas por tomos de carbono e

hidrogeno, cuyo nico precursor es el isopentenil difosfato (IPP). Estos compuestos se
sintetizan a travs de 2 vas metablicas diferentes al interior de la clula vegetal (Figura
4); los terpenos se asocian con la toxicidad, accin repelente y propiedades antimicrobianas
presentes en las plantas; sin embargo se cree que la mezcla de terpenos puede ser ms
efectiva en su rol protector para la planta que cada compuesto por separado (Tholl, 2006).
11

Donde: Metileritritol (MEP), Isopentenil difosfato (IPP), Dimetilalil difosfato

(DMAPP), Geranil difosfato (GPP), Geranilgeranil difosfato (GGPP) y Farnesil
difosfato (FPP) son los sustratos utilizados para genetar los diversos tipos de terpenos.

Figura 4: COMPORTAMIENTO DE LA SNTESIS DE TERPENOS EN CLULAS

VEGETALES (Tholl, 2006).

Su clasificacin se realiza en base al nmero de molculas de isoprenos (IP) que

contienen (Figura 5). Los monoterpenos estn compuestos por 2 IP, sesquiterpenos por 3
IP, diterpenos por 4 IP, sesterpenos por 5 IP, triterpenos por 6 IP, tetraterpenos por 8 IP,
etc.

Figura 5: ESTRUCTURA QUMICA DE ISOPRENO.

12

Los terpenos ms comunes en los aceites esenciales son aquellos de menor peso
molecular, y por lo tanto ms voltiles, es decir, monoterpenos y sesquiterpenos. Cuando la
estructura qumica de estos compuestos sufre modificaciones como por ejemplo oxidacin,
hidroxilacin, metilacines o cualquier otro tipo de reorganizacin estructural de su
esqueleto hidrocarbonado se pasan a denominar terpenoides (Tholl, 2006; Wink, 2010).

Compuestos fenlicos:

Se caracterizan por tener en su estructura un anillo aromtico con uno o ms grupos

hidroxilos; se sintetizan a partir de cido shikmico y en menor cantidad por la ruta del
acido malnico (Taiz et al, 2006). Debido a su fitotoxicidad son almacenados en forma
glucosilada en las vacuolas o bien pueden conjugarse con otros componentes de la pared
celular (Seplveda et al, 2003).

Alcaloides y otros compuestos nitrogenados:

Son compuestos heterocclicos que generalmente se sintetizan a partir de aminocidos,

tales como triptfano, tirosina, lisina, arginina y ornitina. Tambin pueden derivar del
metabolismo de purinas y del acetato de los polictidos (Seplveda et al, 2003).

El efecto txico de los alcaloides radica en su capacidad de bloquear neuroreceptores,

intermediarios de la transduccin de la seal neuronal y canales inicos de insectos y
vertebrados. Adems, se le asocia efecto inhibitorio del crecimiento debido a la capacidad
de intercalarse en el DNA, detener la sntesis de protenas, inducir la apoptosis e inhibir
enzimas del metabolismo de los carbohidratos (Seplveda et al, 2003).
13

5.2.3

Respuesta fisiolgica de las plantas frente a condiciones de estrs

Factores biticos como abiticos suelen ser elementos gatillantes en la variacin de los
metabolitos secundarios expresados por las plantas en respuesta al estrs ocasionado en el
medio en que se desarrollan (Figura 6 y 7).

Figura 6: RGANOS Y TEJIDOS VEGETALES QUE MODIFICAN SU

COMPOSICIN TERPENOIDES FRENTE A CONDICIONES ADVERSAS
(Tholl, 2006).
14

Figura 7: COMPUESTOS FENILPROPANOIDES EXPRESADOS SEGN LA

CONDICIN DE ESTRES A LA QUE SE SOMETEN LAS PLANTAS.

En 1985, Steinmller y colaborador Tevini determinaron que la radiacin UV-B altera el

metabolismo de las plantas; ya que genera un aumento de ceras y un cambio en la
15

composicin de stas en la superficie foliar. Por otra parte, se ha descrito que la radiacin
UV-B provoca una disminucin de la fotosntesis y la produccin de biomasa (Carrasco,
2009).

En respuesta a las condiciones ambientales mencionadas anteriormente se puede

provocar la generacin de quimiotipos (Celiktas et al., 2007), los cuales se manifiestan
cuando individuos de una misma especie y morfolgicamente iguales, se diferencian entre
s en la composicin qumica del aceite (Zoghbi et al., 1998; Soria et al., 2008); este hecho
responde a 2 factores principales:

Ecolgicos: Capacidad de la especie para responder a diversas condiciones

extrnsecas del medio ecolgico; como lo son las coordenadas geogrficas, el
clima, el suelo, la exposicin solar, entre otros factores. (Cicci et al., 2010).

Respuesta a condiciones genticas de la especie: Caractersticas genticas propias

de los individuos, las que se mantienen al ser trasladadas a un nuevo sitios
biogeogrficos. (Cicci et al., 2010).

Para hablar de quimiotipo, las variaciones de composicin observadas entre individuos

deben estar asociadas a factores edficos, estacionales o climticos y no a factores propios
de la toma de muestra, preparacin y anlisis de los especmenes (Soria et al., 2008).

En el mbito morfolgico, la generacin de biotipos se produce mediante un mecanismo

adaptativo que permite a un espcimen adaptarse con mayor facilidad a las condiciones
adversas de cada sitio geogrfico (Cabrera 2002; Cicci et al., 2010).
16

5.3 Gnero Haplopappus

5.3.1 Distribucin geogrfica

El gnero Haplopappus es exclusivamente americano y crece en las provincias del norte

de Chile y regiones prximas a Argentina (Roldan et al., 2007).

En Chile, se encuentra en pocos lugares del pas (III, IV, V, VII y RM) y su distribucin
abarca principalmente la Cordillera de los Andes (Vogel et al., 2007); entre las latitudes
26S y 29 S para Haplopappus baylahuen y Haplopappus villanuevae; entre 32S y 33S
para Haplopappus multifolius y 35S a 36S en Haplopappus taeda (Gonzlez et al., 2003).
En Argentina se distribuye en la regin andino-patagnica.

5.3.2

Caractersticas generales de las 4 Haplopappus spp estudiadas en esta

investigacin.

Cada especie de Haplopappus se desarrolla en condiciones ambientales y geogrficas

muy semejantes; sin embargo, la principal diferencia recae en la capacidad de resistir
condiciones climticas extremas (Tabla 2).

17

Tabla 2: CARACTERSTICAS MORFOLGICAS Y AMBIENTALES DE

DESARROLLO EN Haplopappus spp.

Estudios de propagacin realizados por Vogel y colaboradores (2005a) demostraron que

semillas viables de Haplopappus germinan sin mayor dificultad, hecho que permite
garantizar la viabilidad de los cultivos de esta especie.

5.3.3

Mercado

Chile es un pas rico en especies vegetales endmicas que durante siglos han sido
utilizadas por los pueblos indgenas para fines medicinales; algunas de ellas se conocen y
exportan a todo el mundo, como es el caso del quillay y el boldo, mientras que otras slo
son utilizadas a nivel nacional (Vogel et al., 2005a).
18

El comercio internacional de plantas medicinales y aromticas se ha transformado en un

negocio de creciente magnitud, con ventas que han aumentado de US$ 12.500 millones en
1994 a US$ 30.000 millones en el 2000 (FIA, 2002). Un estudio de mercado chileno, revel
que el consumo anual de Bailahun equivale a 23 toneladas (Vogel et al., 2007; Gonzlez
et al., 2012), donde el 80% de las especies de comercializadas corresponden a H.
multifolius y el 20% restante se asocia a H. baylahuen y H. taeda (Roldan et al., 2007;
Vogel et al., 2007); este complejo Bailahun es comercializado indistintamente en el
mercado nacional (Roldan et al., 2007)

5.4 Cromatografa de gases - espectrometra de masas (GC-MS)

Mikhail Tswett (1903) aplic por primera vez el uso de la cromatografa (del griego
cromos, color y graphos, escritura); y fue quien acuo ste trmino para explicar la
forma en que eran separados los pigmentos vegetales que estaba purificando. Esta tcnica,
se fundamenta en la separacin de molculas basndose en la disolucin de una muestra
compleja en una fase mvil que puede ser lquida o gaseosa.

La fase mvil se hace pasar por un fase inmvil -una matriz que es inmiscible con la
anterior y en la que los compuestos a separar tienen distinta movilidad-; segn la matriz
escogida su separacin se realizar principalmente de acuerdo a la carga y el tamao de las
partculas de la muestra (Valpuesta, 2008).

La cromatografa de gases fue descrita por Martin y James en 1952; y en la actualidad es

un mtodo ampliamente utilizado para la separacin componentes voltiles y semivoltiles
19

de una muestra. Esta tcnica tiene la particularidad de conseguir la separacin, deteccin e

inclusive la cuantificacin de los componentes presentes en mezclas muy complejas; sin
embargo, el nico dato que se dispone es el tiempo de retencin de cada compuesto (Atkins
et al,. 2006). A menudo el empleo de esta tcnica es para confirmar la presencia o ausencia
de compuestos en una muestra determinada, mediante la comparacin de los perfiles
cromatogrficos siempre y cuando se realice en las mismas condiciones. Por otra parte, la
espectrometra de masas, es una poderosa herramienta para estudiar las masas de tomos,
molculas o fragmentos de molculas (Harris, 2007) de manera casi inequvoca en
cualquier sustancia pura, pero normalmente no es capaz de identificar los componentes
individuales de una mezcla sin separar previamente sus componentes (Skoog et al., 2008).

En consecuencia, las mejores tcnicas de anlisis cualitativo son aqullas que combinan
la capacidad de separacin de la cromatografa con la capacidad de la identificacin de la
espectrometra de masas. Por esta razn, los qumicos han perfeccionado mtodos en los
que el espectro de masas esta acloplado a varios dispositivos; obtenindose asi los
denominados mtodos acoplados (Skoog et al., 2008).

Un claro ejemplo de mtodo acoplado es la asociacin de cromatografa de gases y

espectrometra de masas (GC-MS) que permite la identificacin inequvoca de los distintos
componentes separados sin necesidad de disponer de patrones qumicos (Atkins et al,
2006). Debido a esto, GC-MS se convirti en una de las ms poderosas herramientas para
el anlisis de mezclas orgnicas y bioqumicas complejas (Skoog et al., 2008). Soria y
colaboradores (2008) plantean que esta tcnica es especialmente adecuada para
proporcionar de una forma rpida la informacin necesaria (cualitativa y cuantitativa) sobre
los componentes voltiles de una planta.

20

6. MATERIAL Y MTODO

6.1 Muestra vegetal

Hojas secas de Haplopappus baylahuen, H. rigidus, H. taeda y H. multifolius (Figura 8)

recolectadas entre la tercera y le sptima regin de Chile (Figura 9, Tabla 3) entre los meses
de Enero a Marzo del ao 2005 y 2006 en periodo de floracin. Las especies recogidas
fueron identificadas in situ por Don Jos San Martn, botnico de la Universidad de Talca.
Posteriormente fueron comparadas con especmenes certificados del herbario de la
Universidad de Concepcin y del Museo de Historia Natural de Santiago de Chile.

Figura 8: MORFOLOGA DE LAS HOJAS DE Haplopappus spp.

21

Figura 9: SITIO DE RECOLECCIN DE LOS ESPECMENES DE Haplopappus.

22

Tabla 3: UBICACIN GEOGRFICA DEL SITIO DE RECOLECCIN DE

Haplopappus spp

ESPECIE

REGIN

UBICACIN

H. rigidus

Camino a Salar de Pedernales km 107

H. rigidus

Camino a Salar de Pedernales km 107

H. rigidus

Camino a Salar de Pedernales km 90

H. rigidus

Camino a Salar de Pedernales km 90

H. rigidus

Camino a Salar de Pedernales km 90

H. rigidus

Quebrada de Acerillos

H. rigidus

Cerro Blanco-Los Piques

H. rigidus

Cerro Blanco-Los Piques

H. rigidus

Cerro Blanco-Los Piques

H. rigidus

Camino Internacional Copiap-Tinogasta

H. rigidus

Camino Internacional Copiap-Tinogasta

H. baylahuen

Las Vizcachas

H. baylahuen

Las Vizcachas

H. multifolius

Portillo

H. taeda

RM- 6

H. taeda

Las Vegas-Termas del Flaco

H. taeda

Las Vegas-Termas del Flaco

H. taeda

Pichoante-Los Quees

H. taeda

Pichoante-Los Quees

H. taeda

Pichoante-Los Quees

Altos de Cantillana

Donde:
* RM: Regin Metropolitana.
23

Post recoleccin e identificacin de los especmenes se procedi a deshidratar la muestra

en un cuarto oscuro a temperatura ambiente por dos semanas.

6.2 Extraccin de resinas con diclorometano (DCM).

Un gramo (gr) de muestra, se remoj durante un minuto en 20 mililitros (ml) de DCM a

temperatura ambiente ((Vogel et al., 2005b) modificado). La solucin obtenida se filtr
inmediatamente a otro recipiente y se trasvasij a un baln para Rotavapor R-200, donde
fue sometido a presin reducida 2 minutos a 40C.

Luego, se extrajeron 0,05 gr aproximadamente del extracto resinoso (ER) obtenido y se

disolvi en 1000 microlitros (L) de DCM para ser utilizado como muestra. Por otra parte,
el ER restante se diluy en 1500 l de DCM, se coloc en un bao termorregulado a 40C
para evaporar el solvente, y finalmente se conserv a 4C para futuras investigaciones.

6.3 Extraccin de aceites esenciales (AE) voltiles mediante arrastre de vapor

Se deposit aproximadamente 150 gramos (gr) de hojas secas en un baln de vidrio de

dos salidas; la salida lateral se conect a otro baln que posea piedras de porcelana y agua
en constante ebullicin (a). La salida superior en cambio, se acopl a una cabeza de
destilacin -tipo clevenger- (b) conectado a un condensador en espiral (c) que mediante un
sistema de refrigeracin externa (flujo de agua fra circulante) (d) permiti la recoleccin
de los compuestos voltiles (e) (Figura 10).
24

Figura 10: REPRESENTACIN ESQUEMTICA DE LA METODOLOGA

UTILIZADA.

El proceso de extraccin de AE mediante arrastre de vapor se realiz de acuerdo al

mtodo descrito en 1990 por la Associations of Official Analytical Chemits (AOAC). En
nuestro caso, se estandariz el proceso de extraccin en 45 minutos por muestra.
Transcurrido el tiempo se recopil el lquido obtenido en un embudo de separacin;
adems, se agreg 3 mililitros (ml) de Hexano pro-anlisis para solubilizar y extraer trazas
de aceites adheridos en la pared de la bureta receptora; solucin que tambin fue
recepcionada en el embudo.

La solucin obtenida se homogeniz cuidadosamente, luego se dej en reposo con el

objetivo de separar la fase orgnica de la acuosa. Una vez que las fases estaban claramente
separadas se desech la fase acuosa, y la fase orgnica se deposit en un recipiente limpio,
25

seco, rotulado y con tapa rosca para su posterior anlisis. Las muestras que no fueron
procesadas dentro de 10 minutos se almacenaron a 4C hasta su anlisis. Posterior al
anlisis se mantuvieron a 4C para futuras investigaciones.

6.4 Cromatografa de gases-espectrometra de masas (GC-MS)

Un L de muestra procesada se inyect en un cromatgrafo GC-MS marca PERKIN

ELMER modelo AUTOSYSTEM XL. La columna capilar marca ZEBRON de
PHENOMENEX

mide 30 metros de longitud, su dimetro interno (D.I) es de 0,25

milimetros (mm) y 0,25 m de espesor de la fase estacionaria; esta ltima, est compuesta
por dimetilpolisiloxano (95%) y fenilarileno (5%). La fase mvil utilizada fue helio 5.0. La
temperatura del inyector fue de 250C.

Las muestras de extracto resinoso se trabajaron en un programa denominado Ceras

cuya duracin de anlisis corresponde a 66 minutos desde la inyeccin de la muestra, inicia
en 100C para llegar a los 250C con una gradiente de variacin de 10C por minuto. Los
aceites esenciales en cambio, se trabajaron en un programa denominado Aceites
Esenciales cuya duracin es de 45 minutos; la lectura de los compuestos inicia a los 40C
y la gradiente de variacin es de 5C por minuto hasta llegar a 260C.

En caso de que las muestras estuviesen refrigeradas antes de inyectarla al GC-MS, se

mantuvieron 10 minutos a temperatura ambiente y alejada de la luz.

26

6.5 Identificacin y cuantificacin de compuestos

Las muestras procesadas se inyectaron en el cromatgrafo gas masa (GC-MS) de

acuerdo al tipo de muestra y programa designado a utilizar. Este equipo report los perfiles
cromatogrficos de cada especie y los respectivos espectros de masa para cada tiempo de
retencin.

El tipo de estructura se identific en base al in molecular y al patrn de fragmentacin

de cada compuesto. Adems, se compar con los resultados arrojados por la librera NIST
2005. En los casos que se contaba con estndares, se utiliz el tiempo de retencin de cada
uno de ellos para corroborar las estructuras identificadas.

La cuantificacin porcentual de los compuestos mayoritarios se calcul en base a las

reas relativas arrojadas por el equipo en cada cromatograma analizado.

27

7. RESULTADOS

7.1 Extractos resinosos (ER) de Haplopappus spp.

Al inyectar la muestra de ER al cromatgrafo GC-MS en al programa Ceras y de

obtener el cromatograma respectivo, detectamos que el programa utilizado no nos permiti
evidenciar claramente los compuestos presentes en la muestra ya que todos se concentraron
en los primeros 25 minutos. En consecuencia, se utiliz el programa Aceites Esenciales.
De las muestras procesadas se escogi un cromatograma por especie; los que finalmente se
utilizaron como gua para la identificacin de los compuestos mayoritarios en cada una de
las especie de Haplopappus.

7.1.1 Identificacin de los compuestos mayoritarios en ER de hojas de Haplopappus

spp.

A continuacin se muestran los patrones cromatogrficos y se indican los tiempos de

retencin pertenecientes a los compuestos mayoritarios estudiados en cada especie de
Haplopappus. Adems, se adjunta una tabla en la que se reporta el tiempo de retencin en
el cual aparece el compuesto, su frmula y peso molecular y la concentracin en que se
encuentra en cada espcimen.

28

Figura 11: CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE EXTRACTO RESINOSO DE Haplopappus baylahuen.

29

Tabla

4:

COMPUESTOS

VOLTILES

IDENTIFICADOS

PARTIR

DEL

CROMATOGRAMA DE EXTRACTO RESINOSO DE UN ESPCIMEN DE

Haplopappus baylahuen.

N TR

COMPUESTO

FM

PM

% REA

15,09

BORNEOL

C10 H18 O

154

23,07

18,42

BORNIL ACETATO

C12 H20 O2

196

11,29

18,84

1 TETRADECENO

C14 H28

196

4,51

19,44

UNDECANO 5,7 DIMETIL

C13 H28

184

3,27

23,97

N.I

---

--

2,54

25,14

N.I

---

--

5,34

25,41

2-ETIL 1-DODECANOL

C14 H30 O

214

2,88

25,65

2 HEXIL 1 OCTANOL

C14 H30 O

214

2,59

C20 H42

282

4,26

HEXADECANO 2,6,11,15
9

30,20

TETRMETIL

Donde:
TR: Tiempo de retencin.

FM: Frmula molecular.

PM: Peso molecular.

N.I: No identificado.

30

Figura 12: CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE EXTRACTO RESINOSO DE Haplopappus rigidus.

31

Tabla

5:

COMPUESTOS

VOLTILES

IDENTIFICADOS

PARTIR

DEL

CROMATOGRAMA DE EXTRACTO RESINOSO DE UN ESPCIMEN DE

Haplopappus rigidus.

N TR

COMPUESTO

FM

PM

% REA

12,04

1 UNDECENO 5 METIL

C12 H24

168

2,03

18,08

UNDECANO 3,8 DIMETIL

C13 H28

184

3,72

18,82

1 TETRADECENO

C14 H28

196

6,19

19,06

ISOTRIDECANOL

C13 H28 O

200

7,23

19,29

LIMONENO DIOXIDO

C10 H16 O2

168

6,14

19,42

DODECANO 4,6 DIMETIL

C14 H30

198

5,07

23,95

DODECANO 2,7,10 TRIMETIL

C15 H32

212

4,03

PENTADECANO 2,6,10
8

25,12

TRIMETIL

C18 H38

254

9,28

25,62

2 HEXIL 1 OCTANOL

C14 H30 O

214

5,27

C20 H42

282

5,76

HEXADECANO 2,6,11,15
10

30,17

TETRMETIL

Donde:
TR: Tiempo de retencin.

FM: Frmula molecular.

PM: Peso molecular.

32

Figura 13: CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE EXTRACTO RESINOSO DE Haplopappus taeda.

33

Tabla

6:

COMPUESTOS

VOLTILES

IDENTIFICADOS

PARTIR

DEL

CROMATOGRAMA DE EXTRACTO RESINOSO DE UN ESPCIMEN DE

Haplopappus taeda.

N TR

COMPUESTO

FM

PM

% REA

18,08

UNDECENO 3,8 DIMETIL

C13 H28

184

2,96

18,82

1 TETRADECENO

C14 H28

196

4,64

19,07

ISOTRIDECANOL

C13 H28 O

200

5,42

19,28

LIMONENO DIOXIDO

C10 H16 O2

168

34,67

19,42

DODECANO 4,6 DIMETIL

C14 H30

198

4,20

19,93

N.I

---

--

2,79

23,95

DODECANO 2,7,10 TRIMETIL

C15 H32

212

3,23

24,66

- CADINENO

C15 H24

204

3,12

PENTADECANO 2,6,10
9

25,12

TRIMETIL

C18 H38

254

6,70

10

25,37

N.I

---

--

3,46

11

25,62

2 HEXIL 1 OCTANOL

C14 H30 O

214

2,95

C20 H42

282

3,59

HEXADECANO 2,6,11,15
12

30,17

TETRAMETIL

Donde:
TR: Tiempo de retencin.

FM: Frmula molecular.

PM: Peso molecular.

N.I: No identificado.

34

Figura 14: CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE EXTRACTO RESINOSO DE Haplopappus multifolius.

35

Tabla

7:

COMPUESTOS

VOLTILES

IDENTIFICADOS

PARTIR

DEL

CROMATOGRAMA DE EXTRACTO RESINOSO DE UN ESPCIMEN DE

Haplopappus multifolius.

N TR

COMPUESTO

FM

PM

% REA

18,09

UNDECANO 3,8 DIMETIL

C13 H28

184

1,56

18,83

1 TETRADECENO

C14 H28

196

2,44

19,08

ISOTRIDECANOL

C13 H28 O

200

2,46

19,43

UNDECANO 5,7 DIMETIL

C13 H28

184

1,89

21,00

COPENO

C15 H24

204

0,82

24,68

- CADINENO

C15 H24

204

11,05

24,89

N.I

---

--

4,16

PENTADECANO 2,6,10
8

25,12

TRIMETIL

C18 H38

254

3,82

26,31

(-) ESPATULENOL

C15 H24 O

220

4,41

10

27,89

TAU- CADINOL

C15 H26 O

222

5,71

DIHIDRO-CIS--COPAENO-811

28,22

OL

C15 H26 O

222

10,61

12

29,84

- EUDESMOL

C15 H26 O

222

9,83

13

30,29

BENCENO

C17 H28

232

8,57

Donde:
TR: Tiempo de retencin.

FM: Frmula molecular.

PM: Peso molecular.

N.I: No identificado.

36

Para hacer un anlisis ms acabado, se agrup cada compuesto segn el tipo de

metabolito secundario al cual perteneca (Figura 15); encontrando: hidrocarburos (HC),
hidrocarburos oxigenados (HC Ox), monoterpenos (MT), monoterpenos oxigenados (MT
Ox), sesquiterpenos (SQT), sesquiterpenos oxigenados (SQT Ox), adems se agreg la
categora de compuestos no identificados (N.I).

N de compuestos

6
5

4
3
2
1
0
HC

HC OX

H. baylahuen

MT

MT OX

H. rigidus

SQT

H. taeda

SQT OX

NI

H. multifolius

Figura 15: DISTRIBUCIN DE LOS PRINCIPALES COMPUESTOS PRESENTES EN

EL EXTRACTO RESINOSO DE Haplopappus spp.

En base a estos parmetros se estableci que los extractos resinosos de las 4 especies
estaban compuestos principalmente por hidrocarburos.

37

7.2 Aceites esenciales (AE) de Haplopappus spp.

Luego de inyectar los aceites obtenidos de cada muestra al cromatgrafo GC-MS, en el

programa Aceites esenciales y de obtener los respectivos perfiles cromatogrficos se
escogi un representante por especie; los que fueron utilizados como gua en la
identificacin de los compuestos mayoritarios.

7.2.1 Identificacin de los compuestos mayoritarios en AE de hojas de Haplopappus

spp.

A continuacin se muestran los patrones cromatogrficos y tiempos de retencin en que

aparecen los compuestos mayoritarios de AE de Haplopappus spp. Adems, se adjunta una
tabla en la que se reporta el tiempo de retencin de compuesto mayoritario junto con su
frmula y peso molecular y la disponibilidad en que se presenta en cada espcimen.

38

Figura 16: CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE ACEITES ESENCIALES DE Haplopappus baylahuen.

39

Tabla

8:

COMPUESTOS

CROMATOGRAMA

VOLTILES

DE ACEITES

IDENTIFICADOS

ESENCIALES

PARTIR

DEL

DE UN ESPCIMEN DE

Haplopappus baylahuen.

N TR

COMPUESTO

FM

PM

% REA

7,77

PINENO

C10 H16

136

1,57

8,25

CAMFENO

C10 H16

136

1,55

13,74

CAMFOLENAL

C10 H16 O

152

1,03

14,42

TRANS PINOCARVEOL

C10 H16 O

152

5,76

14,93

N.I

---

--

1,53

15,86

BORNEOL

C10 H18 O

154

42,94

16,14

(1R)-(-)- MIRTENAL

C10 H14 O

150

1,37

18,84

BORNIL ACETATO

C12 H20 O2

196

28,42

26,47

(-)- ESPATULENOL

C15 H24 O

220

1,78

Donde:
TR: Tiempo de retencin.

FM: Frmula molecular.

PM: Peso molecular.

N.I: No identificado.

40

Figura 17: CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE ACEITES ESENCIALES DE Haplopappus rigidus.

41

Tabla

9:

COMPUESTOS

CROMATOGRAMA

VOLTILES

DE ACEITES

IDENTIFICADOS

ESENCIALES

PARTIR

DEL

DE UN ESPCIMEN DE

Haplopappus rigidus.

N TR

COMPUESTO

FM

PM

% REA

12,93

3,4 DECADIENO

C10 H18

138

3,70

17,18

3 OCTANOL 2,6 DIMETIL

C10 H22 O

158

3,16

18,07

2,7,10 DODECANO TRIMETIL

C15 H32

210

2,55

20,83

YLANGENO

C15 H24

204

2,41

21,02

COPANO

C15 H24

204

5,64

22,76

CARIOFILENO

C15 H24

204

13,86

23,37

N.I

---

--

4,79

23,67

- MUUROLENO

C15 H24

204

2,65

24,81

CADINENO

C15 H24

204

2,81

DIHIDRO-CIS--COPAENO-810 25,33

OL

C15 H26 O

222

2,26

11 26,34

(-)- ESPATULENOL

C15 H24 O

220

4,48

12 26,76

N.I

---

--

4,02

13 27,97

TAU MUUROLOL

C15 H26 O

222

4,52

Donde:
TR: Tiempo de retencin.

FM: Frmula molecular.

PM: Peso molecular.

N.I: No identificado.

42

Figura 18: CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE ACEITES ESENCIALES DE Haplopappus taeda.

43

Tabla

10: COMPUESTOS

CROMATOGRAMA

VOLTILES

DE ACEITES

IDENTIFICADOS

ESENCIALES

PARTIR

DEL

DE UN ESPCIMEN DE

Haplopappus taeda.

N TR

COMPUESTO

FM

PM

% REA

10,64

D- LIMONENO

C10 H16

136

2,86

15,46

p- MENT 1-EN-4-OL

C10 H18 O

154

7,63

15,58

BORNEOL

C10 H18 O

154

5,70

15,90

p- MENT 1-EN-8-OL

C10 H18 O

154

2,33

16,51

N.I

---

--

16,30

17,31

p- MENT 6,8-DIEN-2-ONA

C10 H14 O

150

2,62

2 METIL 4
7

18,30

HIDROXIACETOFENONA

C9 H10 O2

150

4,05

22,06

- BERGAMOTENO

C15 H24

204

2,33

24,35

CADINA 1,3,5 TRIENO

C15 H22

202

2,26

10 24,95

TAU CADINENO

C15 H24

204

2,77

11 25,81

N.I

---

--

2,35

12 25,99

- FARNESENO

C15 H24

204

7,37

13 28,00

TAU MUUROLOL

C15 H26 O

222

2,00

14 28,72

N.I

---

--

3,18

Donde:
TR: Tiempo de retencin.

FM: Frmula molecular.

PM: Peso molecular.

N.I: No identificado.

44

Figura 19: CROMATOGRAMA OBTENIDO A PARTIR DE ACEITES ESENCIALES DE Haplopappus multifolius.

45

Tabla 11: COMPUESTOS VOLTILES IDENTIFICADOS A PARTIR DEL

CROMATOGRAMA DE ACEITES ESENCIALES DE UN ESPCIMEN DE
Haplopappus multifolius.

N TR

COMPUESTO

FM

PM

% REA

15,51

p- MENTH 1-EN-4-OL

C10 H18 O

154

13,68

18,64

BORNIL ACETATO

C12 H20 O2

196

7,34

23,23

CARIOFILENO

C15 H24

204

2,08

24,93

TAU CADINENO

C15 H24

204

5,38

25,13

CADINA 1,3,5

C15 H22

202

2,80

DIHIDRO-CIS--COPAENO-86

25,62

OL

C15 H26 O

222

5,06

26,65

(-)- ESPATULENOL

C15 H24 O

220

4,69

27,73

DI-EPI, CEDRENO

C15 H24

204

2,54

28,16

TAU-CADINOL

C15 H26 O

222

3,73

10 28,62

ALFA CADINOL

C15 H26 O

222

6,22

11 30,13

N.I

C14 H20 O2

220

6,70

12 30,65

N.I

C14 H20 O2

220

5,86

Donde:
TR: Tiempo de retencin.

FM: Frmula molecular.

PM: Peso molecular.

N.I: No identificado.

46

Para el anlisis cualitativo, de los aceites esenciales se agruparon segn el tipo de

metabolito secundario al que perteneca; obteniendo: hidrocarburos (HC), hidrocarburos
oxigenados (HC Ox), monoterpenos (MT), monoterpenos oxigenados (MT Ox),
sesquiterpenos (SQT), sesquiterpenos oxigenados (SQT Ox);

y compuestos no

identificados (N.I).

En la figura 20 se puede apreciar a simple vista la variedad de compuestos

expresados en aceites esenciales de Haplopappus spp. Por otra parte, se observa un leve
predominio de compuestos oxigenados sobre los no oxigenados.

N de compuestos

4
3
2
1
0
HC

HC OX

H.baylahuen

MT

MT OX

H. rigidus

SQT

H. taeda

SQT OX

NI

H. multifolius

Figura 20: DISTRIBUCIN DE LOS PRINCIPALES COMPUESTOS PRESENTES

EN ACEITES ESENCIALES DE Haplopappus spp.

47

7.3 Anlisis interespecie e intraespecie en extractos resinosos de Haplopappus spp.

7.3.1

Anlisis interespecie en muestras de extracto resinoso (ER)

Para realizar el anlisis interespecie se interpolaron los cromatogramas utilizados en

la identificacin de los compuestos mayoritarios (Figura 21). Posteriormente, se
amplificaron las zonas donde se observ la presencia de compuestos que slo se
repetan en 1 de las 4 especies estudiadas (Figura 22); denominndoles compuestos
marcadores.

Figura 21: ESPECTRO OBTENIDO AL INTERPOLAR LOS CROMATOGRAMAS DE

EXTRACTOS RESINOSOS ANALIZADOS EN CADA ESPECIE DE Haplopappus.
48

Figura 22: AMPLIFICACIN DE LOS TIEMPOS DE RETENCIN EN QUE SE

ENCUENTRAN LOS POSIBLES COMPUESTOS MARCADORES.
49

Para corroborar lo sealado, se procedi a establecer la presencia de este compuesto en

los especmenes de la misma especie y la ausencia en las dems especies. Una vez
analizados la totalidad de los cromatogramas se estableci que los compuestos marcadores
propuestos no cumplen el requisito de exclusividad de especie.

De este anlisis se desprende que las cuatro especies tienen muchos compuestos en
comn que varan su concentracin segn especie. Hecho que se contradice con lo
establecido en primera instancia al identificar los compuestos mayoritarios de cada especie.

7.3.2

Anlisis intraespecie del extracto resinoso (ER) de 2 especies de Haplopappus.

El anlisis intraespecie se realiz slo para Haplopappus rigidus y H. taeda, ya que

contaban con una mayor cantidad de ejemplares por especie; hecho que permite hacer una
comparacin significativa de los datos obtenidos.

En el caso de H. rigidus (Figura 23) se puede observar que los patrones cromatogrficos
varan de acuerdo el rea y lugar de recoleccin de los especmenes. En Pedernales ocurre
un caso muy peculiar ya que se observan variaciones intrapoblacionales muy marcadas
entre los especmenes recolectados en el kilmetro 90 (muestras 11 y 19) y kilmetro 107
(muestras 13 y 20) a diferencia de los ocurrido con los especmenes extrados en Cerro
Blanco donde se mantiene un mismo compuesto mayoritario.

50

Figura 23: CROMATOGRAMAS OBTENIDOS MEDIANTE GC-MS DE EXTRACTOS

RESINOSOS DE Haplopappus rigidus SEGN LUGAR DE RECOLECCIN.
51

Continuacin Figura 23

Donde:

Figura 23: CROMATOGRAMAS OBTENIDOS MEDIANTE GC-MS DE EXTRACTOS

RESINOSOS DE Haplopappus rigidus SEGN LUGAR DE RECOLECCIN

En el caso de H. taeda (Figura 24), a diferencia de lo observado con H. rigidus, se

observa la existencia de perfiles cromatogrficos muy similares entre los especmenes,
observndose un compuesto mayoritario y una serie de compuestos minoritarios que varan
en su concentracin.

52

Donde:

Figura 24: CROMATOGRAMAS OBTENIDOS MEDIANTE GC-MS DE EXTRACTOS

RESINOSOS DE Haplopappus taeda SEGN LUGAR DE RECOLECCIN.
53

7.4 Anlisis interespecie e intraespecie en aceites esenciales de Haplopappus spp.

7.4.1

Anlisis interespecie en muestra de aceites esenciales (AE)

Para realizar el anlisis interespecie se interpolaron los cromatogramas utilizados para la

identificacin de los compuestos mayoritarios de AE (Figura 25); estos fueron amplificados
en las zonas donde se reportaron posibles compuestos marcadores (Figura 26).

Figura 25: ESPECTRO OBTENIDO AL INTERPOLAR LOS CROMATOGRAMAS DE

ACEITES ESENCIALES ANALIZADOS EN CADA ESPECIE DE Haplopappus.
54

Figura 26: AMPLIFICACIN DE LOS TIEMPOS DE RETENCIN EN QUE SE

ENCUENTRAN LOS POSIBLES COMPUESTOS MARCADORES.
55

Continuacin Figura 26

Figura 26: AMPLIFICACIN DE LOS TIEMPOS DE RETENCIN EN QUE SE

ENCUENTRAN LOS POSIBLES COMPUESTOS MARCADORES.

56

Tal cual se realiz anteriormente con los extractos resinosos, se evaluaron los dems
especmenes para establecer si los compuestos identificados previamente tenan validez en
su uso como compuesto marcador o si este hecho solo se produca entre estos ejemplares;
concluyendo (al igual que en los extractos resinosos) que no es factible utilizar estos
compuestos como marcadores ya que no se cumple el requisito de exclusividad de especie.

7.4.2

Anlisis intraespecie de aceites esenciales (AE) de 2 especies de Haplopappus.

El anlisis intraespecie se realiz slo para H. rigidus y H. taeda, debido a que contaban
con una mayor cantidad de ejemplares por especie; hecho que permite una comparacin
ms significativa entre los datos obtenidos.

En H. rigidus se observ diferencias intraespecficas en los perfiles cromatogrficos

(Figura 27); y al igual que lo ocurrido anteriormente con la muestra de extracto resinoso se
volvi a observar variaciones intrapoblacionales entre los ejemplares recolectados en
Pedernales, kilmetro 90 (muestras 2 y 6) y kilmetro 107 (muestras 1 y 4).

En el caso de H. taeda, se obtuvieron perfiles muy similares entre individuos de esta

especie (Figura 28).

57

Figura 27: CROMATOGRAMAS OBTENIDOS MEDIANTE GC-MS DE ACEITES

ESENCIALES DE Haplopappus rigidus SEGN LUGAR DE RECOLECCIN.
58

Continuacin Figura 27.

Figura 27: CROMATOGRAMAS OBTENIDOS MEDIANTE GC-MS DE ACEITES

ESENCIALES DE Haplopappus rigidus SEGN LUGAR DE RECOLECCIN.

59

Donde:

Figura 28: CROMATOGRAMAS OBTENIDOS MEDIANTE GC-MS DE ACEITES

ESENCIALES DE Haplopappus taeda SEGN LUGAR DE RECOLECCIN.
60

8. DISCUSIN

El objetivo central de esta investigacin fue diferenciar 4 Haplopappus spp nativas de

nuestro pas en base a sus metabolitos secundarios. La obtencin de patrones
cromatogrficos tpicos de especie (Vogel et al., 2005b; Retta et al. 2010) y/o la presencia
de compuestos marcadores (Soria et al., 2008) juegan un rol importante para lograr el
objetivo.

Al momento de caracterizar qumicamente las especies, determinamos que los

compuestos mayoritarios presentes en extractos resinosos y aceites esenciales de
Haplopappus spp estaban compuestos por hidrocarburos, terpenos y terpenos oxigenados
(terpenoides), a diferencia de lo registrado en otros estudios. Vogel et al (2005b) mediante
cromatografa en capa fina (TLC) report que Haplopappus baylahuen estaba compuesto
mayoritariamente por terpenos, algunas cumarinas y flavonoides; mientras que en H. taeda
predominaban los flavonoides y en H. multifolius las cumarinas. Esta diferencia detectada
entre nuestros compuestos y los reportados por Vogel se avala con lo mencionado por
Valverde (2000) y Stashenko et al. (2003) quienes recalcan que la composicin qumica de
las esencias es inconstante y depende de variables como el mtodo de extraccin, la
duracin, la temperatura, el estado y la procedencia de la planta; adems de las condiciones
geobotnicas y agrcolas de su cultivo. Snchez et al. (2009) adiciona otras variables, que
estn asociadas a la cantidad de solvente empleado y el tiempo programado para la
extraccin de los compuestos.

En el anlisis interespecie propusimos la bsqueda de compuestos marcadores

compuestos qumicos ausentes en otros individuos de la especie y que alcanzan una
61

determinada concentracin (Soria et al. 2008). En nuestro estudio no fue posible encontrar
dichos compuestos marcadores, producto de la similitud en la composicin de las muestras
procesadas y a la variacin en la expresin de cada uno de ellos (anlisis intraespecie).

Por otra parte, en el anlisis intraespecie observamos que la composicin qumica de

extracto resinosos y aceites esenciales de Haplopappus rigidus, presentaba diferencias
asociadas al lugar de recoleccin de cada individuo. Un caso similar fue reportado por
Faini y colaboradores (2011), quienes proponen el descubrimiento de quimiotipos en la
especie que estaban estudiando.

La existencia de diferencias intraespecficas est ampliamente representada en plantas

de las familias Asteraceae y Lamiaceae (Cicci et al., 2010) y se caracterizan por la
existencia de plantas morfolgicamente iguales con diferencias en la composicin qumica
de sus aceites. Gonzlez et al. (2012) plantea que la variacin entre poblaciones de la
misma especie sugiere un buen pronstico para futuras selecciones y mejoramiento
gentico. Es importante recalcar que la correlacin quimiotipo-hbitat no se manifiesta en
todas la especies (Soria et al., 2008; Cicci et al., 2010) ya que tambin puede asociarse a
un fenmeno de plasticidad (Celiktas et al., 2007) o simplemente a errores en la
identificacin de los ejemplares producto de la generacin de hbridos especialmente
cuando estas plantas se desarrollan es estado salvaje.

Finalmente, planteamos que el empleo de tcnicas cromatogrficas ms sofisticadas para

diferenciar especies de un mismo gnero no siempre arrojan mejores resultados que las
tcnicas ms bsicas; ya que como se observ en esta investigacin la cromatografa GCMS result tener un menor rendimiento en la diferenciacin de las especies en comparacin
con los resultado obtenidos con cromatografa en capa fina (TLC) aplicada por Vogel et al.
62

(2005b). Por ende, proponemos que el uso de cromatografa en capa fina (TLC) parece ser
la tcnica ms efectiva a la hora de diferenciar Haplopappus spp en base a los metabolitos
secundarios expresados por cada especie.

63

9. CONCLUSIN

Identificacin y cuantificacin de los compuestos mayoritarios presentes en extracto

resinosos (ER) y aceites esenciales (AE):
o Los compuestos mayoritarios detectados en ER fueron hidrocarburos y
terpenoides (terpenos y terpenos oxigenados); mientras que para AE fueron
casi exclusivamente terpenoides.
o Tanto para ER como para AE, se estableci la presencia de compuestos
qumicos comunes en las 4 Haplopappus spp, sin embargo, se observ la
presencia de variaciones en la expresin segn especie e incluso entre
ejemplares de una misma especie.

Anlisis interespecie ER y AE:

o No existen compuestos marcadores que permitan diferenciar estas 4 especies
de Haplopappus.

Anlisis intraespecie ER y AE:

o Haplopappus rigidus no consta de patrones cromatogrficos caractersticos
de especie puesto que los patrones cromatogrficos obtenidos varan de
acuerdo al rea geogrfica de donde fueron recolectados los especmenes.
o Haplopappus taeda posee patrones cromatogrficos similar entre los
ejemplares de la especie.

En base a los resultados expuestos se rechaza la hiptesis planteada; ya que no fue

posible diferenciar las 4 especies de Haplopappus mediante cromatografa GC-MS.
64

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