Anti-HAV IgM ELISA (HEPAVASE MA-96) (TMB)

Code: 4AME3 / 4AME11

Testare ELISA pentru testarea calitativa a Anti-HAV IgM din ser sau plasma
SCOP
Trusa ELISA se foloseste pentru determinarea calitativa a Anti-HAV IgM din ser sau plasma.
INTRODUCERE
Virusul Hepatite A (HAV) este un virus ARN mono-catenar fara anvelopa, cu diametru de 27 nm, care aprtine familiei
Picornaviridae. HAV, forma cea mai raspandita de hepatita virala acuta, este o infectie la om cu transmiterea fecala sau orala, cu
o perioada medie de incubare de 28 zile (15-50 zile). Aceasta boala are o declansare abrupta a simptomelor, ce includ febra,
greata, anorexie, discomfort abdominal, urina inchisa la culoare, etc. Ag HAV poate fi detectat in scaun la scurt timp dupa
declansarea infectiei, devenind apoi nedetectabili in timpul fazei acute tarzii. Anticorpul specific HAV in timpul fazei acute a HAV
este tipul IgM (anti-HAV IgM), care scade, fiind apoi inlocuit cu tipul IgG, in timpul convalescentei. Anti-HAV IgM dispare dupa 3-4
luni de la faza acuta. Daca se detecteaza anti-HAV Ig M, se poate presupune o infectie acuta cu HAV. Anti-HAV IgM se dezvolta rar
dupa vaccinare. Testarile anti-HAV IgM se folosesc la diferentierea de alte tipuri de infectii.
Aceasta trusa este o testare calitativa a prezentei Anti-HAV IgM din probe de ser sau plasma. Testul utilizeaza godeuri tapetate cu
anti-HAV IgM pentru faza solida si, pentru faza lichida, conjugat enzimatic anti-HAV-peroxidaza. Probele care nu sunt reactive cu
aceasta trusa sunt considerate negative pentru Anti-HAV IgM, pe cand probele cu reactie pozitiva trebuie retestate in duplicat.
Probele care trebuie retestate in duplicat sunt cele care au valoarea absorbantei in intervalul de retestare (valoarea cut-off +10%)
DESCRIEREA TESTULUI
Trusa GBC se bazeaza pe principiul ELISA, captura IgM. Pentru faza solida de imobilizare se folosesc godeuri de polistiren tapetate
cu Anti-HAV IgM, in timp ce pentru faza lichida se foloseste conjugat Anti-HAV HRP. Atunci cand se adauga o proba de ser sau
plasma ce contine Anti-HAV IgM in godeurile tapetate cu anticorpi Anti-HAV IgM si se incubeaza, anticorpii IgM din proba se
leaga de godeurile cu anti-HAV IgM. Dupa adaugarea solutiei ce contine Ag HAV si o solutie conjugata de anti-HAV-peroxidaza si
se incubeaza, se formeaza un imunocomplex Anti-HAV IgM (Anti-HAV IgM-Ag HAV) (Anti-HAV-peroxidaza). Dupa spalare
pentru inlaturarea materialului nelegat, in godeuri se adauga o solutie substrat cu TMB si se incubeaza. Se dezvolta o culoare,
proportionala cu cantitatea de Anti-HAV IgM. Reactia este oprita prin adaugarea acidului sulfuric. Denzitatea optica a culorii se
citeste cu un spectrofotometru la 450 nm.
REACTIVI SI MATERIALE FURNIZATE
1. Placa tapetata cu anticorpi (1 placa cu 96 godeuri)
Godeuri de microtitrare tapetate cu anticorp purificat anti-HAV IgM. Dupa deschidere, este stabila 2 luni la 2-80 C.
2. Conjugat enzimatic (1 sticla, 7 ml)
Contine anticorp Anti-HAV IgM conjugat cu HRP, diluat in tampon, cu stabilizatori proteici. Contine conservanti: 0.003%
gentamicina si 0.01% tiomerosal. Dupa deschidere, este stabil 1 luna la 2-80 C.
3. Control pozitiv (1 sticla, 2 ml)
Contine ser pozitiv pentru Anti-HAV IgM, in tampon cu stabilizatori proteici. Contine conservanti: 0.003% gentamicina si 0.01%
tiomerosal. Dupa deschidere, este stabil 1 luna la 2-80 C.
4. Control negativ (1 sticla, 2 ml)
Tampon cu stabilizatori proteici. Contine conservanti: 0.003% gentamicina si 0.01% tiomerosal. Dupa deschidere, este stabil 1
luna la 2-80 C.

5. Diluent pentru probe (1 sticla, 11 ml)

Tampon cu stabilizatori proteici. Contine conservanti: 0.003% gentamicina si 0.01% tiomerosal. Dupa deschidere, este stabil 1
luna la 2-80 C.
6. Solutie antigen HAV (1 sticla, 7 ml)
Antigen HAV in tampon cu stabilizatori proteici. Contine conservanti: 0.003% gentamicina si 0.01% tiomerosal. Dupa deschidere,
este stabil 1 luna la 2-80 C.
7. Solutie substrat A TMB (1 sticla, 10 ml)
Contine 0.6 mg/ml 3, 3, 5, 5 Tetrametilbenzidina (TMB) in solutie organica. Dupa deschidere, este stabila 1 luna la 2-80 C.
8. Solutie substrat B TMB (1 sticla, 10 ml)
Contine tampon citrat acid, cu 0.03% H2O2. Dupa deschidere, este stabila 1 luna la 2-80 C.
9. Solutie concentrata de spalare (1 sticla, 52 ml)
Contine tampon fosfat concentrat 20x cu Tween-20. Dupa diluare, este stabila 2 zile la temperatura camerei sau 1 saptamana la
2-80 C.
10. Solutie stop (H2SO4 2N) (1 sticla, 12 ml)
Contine acid sulfuric 2N. Dupa deschidere, este stabila 1 luna la temperatura camerei.
MATERIALE NECESARE, DAR NEFURNIZATE
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Pipete automate, cu volume de 5 l, 50 l, 100 l, 1 ml.

Varfuri detasabile.
100 ml solutie salina normala 0.15M.
Baie de apa sau incubator cu 370 C.
Tuburi pentru diluarea probelor.
Echipament de spalare.
Apa distilata sau deionizata.
Spectrofotometru capabil sa citeasca absorbanta la 450 nm.

ATENTIONARI SI PRECAUTII
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Trusa se foloseste doar pentru diagnosticul in vitro.

Inainte de utilizare, aduceti toti reactivii la temperatura camerei.
Nu folositi reactivi peste data de expirare.
Nu folositi reactivi din loturi diferite.
Nu pipetati reactivii cu gura.
Nu fumati sau mancati in zona in care lucrati.
Toti reactivii si probele trebuie considerate potential infectante.
Aruncati reactivii in containere speciale de desuri.
Acidul sulfuric este irritant pentru piele, ochi, tract respirator si mucoase. Evitati contactul cu pielea si mucoasele. In
cazul contactului, spalati cu volum mare de apa.
10. Solutia A TMB contine un solvent organic, care este inflamabil. Solutia A contine dimetil sulfoxid, irritant in contact cu
pielea si mucoasele.
RECOLTAREA SI PREGATIREA PROBELOR
1.
2.
3.

Inainte de recoltare, pacientul nu trebuie pregatit in mod special.

Se pot folosi atat probe de ser, cat si cele de plasma. Sangele trebuie separat cat mai repede dupa recoltare, pentru
evitarea hemolizei.
Inainte de testare, probele pot fi pastrate la 2-80 C sau la -200 C pentru perioade indelungate.

4.
5.
6.
7.

Inainte de testare, probele congelate trebuie dezghetate si omogenizate.

Evitati ciclurile dezghet-inghet.
Probele nu trebuie sa contina azida de sodiu, care inhiba activitatea peroxidazei.
Nu se folosesc probe hemolizate, lipemice sau contaminate.
CONDITII DE PASTRARE SI STABILITATEA REACTIVILOR

1.
2.
3.
4.

Dupa deschidere, pastrati kit-ul la 2-80 C 1 luna. Nu congelati.

Stripurile nefolosite se pastreaza in folie de aluminiu.
Imediat dupa folosire, returnati reactivii la 2-80 C.
Solutia concentrata de spalare (20x) poate fi pastrata la temperatura camerei pentru evitarea cristalizarii. Daca apar
cristale, incalziti solutia in baie de apa la 370 C pana la dizolvarea lor.
PREGATIREA REACTIVILOR

1.
2.
3.

Pregatirea solutiei de spalare de lucru: Diluati 1:20 solutia concentrata de spalare (20x) cu apa distilata sau deionizata.
Spalarea placii: Pentru spalator cu functie de aspirare, faceti 6 cicluri cu minim 0.5 ml tampon de spalare pentru fiecare
ciclu. Pentru spalator fara functie de aspirare, faceti 8 cicluri cu minim 0.35 ml tampon de spalare pentru fiecare ciclu.
Indepartati excesul de tampon de spalare, folosind o hartie absorbanta. Spalarea incorecta duce la obtinerea
rezultatelor fals pozitive.
MOD DE LUCRU

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
a)
b)

15.
16.
17.

Inainte de testare, aduceti toti reactivii si probele la temperatura camerei. Aduceti baia de apa sau incubatorul la 370 C.
Pe placa, lasati 2 godeuri pentru Blank. Adaugati 100 l din fiecare control si diluent pentru probe in godeurile specifice
(3 controale negative si 2 controale pozitive).
Diluati probele 1:200: Adaugati intr-un tub 1.0 ml solutie salina si 5 l proba si omogenizati.
Adaugati 5 l din probele diluate in godeurile in care s-a pus diluent pentru probe.
Omogenizati usor placa.
Sigilati placa cu hartie adeziva.
Incubati placa la 370 C in baia de apa sau incubator timp de 1 ora.
La sfarsitul incubarii, indepartati hartia adeziva si spalati placa urmand modul de lucru de mai sus.
Adaugati 50 l solutie Ag HAV si 50 l conjugat enzimatic in fiecare godeu, cu exceptia Blank.
Omogenizati usor placa.
Sigilati placa cu hartie adeziva.
Incubati placa la 370 C in baia de apa sau incubator timp de 1 ora.
La sfarsitul incubarii, indepartati hartia adeziva si spalati placa urmand modul de lucru de mai sus.
Alegeti una din cele doua metode de dezvoltare a culorii:
Puneti volume egale de solutie substrat TMB A si B intr-un recipient. Adaugati 100 l amestec in fiecare godeu, inclusiv
in Blank. Omogenizati cu atentie.
Adaugati 50 l solutie substrat TMB A, apoi 50 l solutie substrat TMB B in fiecare godeu, inclusiv in Blank. Omogenizati
cu atentie.
Nota: Solutia substrat A trebuie sau fie incolora sau bleu. Daca are alta culoare, trebuie aruncata. Amestecul de solutii A
si B trebuie folosit in 30 minute dupa pregatire. Amestecul trebuie ferit de lumina puternica.
Acoperiti placa cu o folie neagra si incubati la temperatura camerei timp de 30 minute.
Opriti reactia prin adaugarea 100 l solutie stop in fiecare godeu, cu exceptia Blank.
Determinati absorbanta controalelor si a probelor la 450 nm in 15 minute, cu un spectrofotometru. Blank trebuie sa fie
incolor sau usor galben. Daca are alta culoare, testul este invalid. Substrat Blank: valoarea absorbantei trebuie sa fie mai
putin de 0.100.

CALCULAREA REZULTATELOR
1.
2.
3.
4.
5.

Calculati NCx (absorbanta medie a controlului negativ). Valoarea absorbantei controlului negativ trebuie sa fie < 0.200
dupa scaderea Blank. Valoarea NCx trebuie sa fie < 0.2, altfel testul este invalid.
Calculati PCx (absorbanta media a controlului pozitiv). Valoarea PCx trebuie sa fie > 0.5, altfel testul este invalid.
Calculati valoarea P-N: P-N = PCx NCx. Valoarea P-N trebuie sa fie > 0.3, altfel testul este invalid.
Calculati valoarea Cut-off: Cut-off = NCx + (PCx)/4.
Calculati intervalul de retestare: Interval de retestare = Valoarea Cut-off + 10%
INTERPRETAREA REZULTATELOR

1.
2.
3.

Probele cu absorbanta mai mica decat valoarea Cut-off sunt non-reactive si sunt considerate NEGATIVE pentru Anti-HAV
IgM.
Probele cu absorbanta mai mare sau egala cu valoarea Cut-off sunt reactive si sunt considerate POZITIVE pentru AntiHAV IgM.
Probele cu absorbanta in intervalul de retestare trebuie retestate in duplicat si interpretate dupa regulile de mai sus.
Probele cu rezultate repetate in intervalul de retestare se recomanda sa se urmareasca periodic.
PROBLEME

Daca rezultatele nu sunt reproductibile, identificati problemele aparute:

1. Etapa de spalare incorecta.
2. Contaminare cu probe pozitive.
3. Volum gresit de proba sau reactivi.
4. Contaminarea godeurilor cu conjugat.
5. Folosirea probelor hemolizate sau probe sedimentare.
6. Timpi de incubare si temperaturi gresite.
7. Insuficienta aspiratie.
LIMITARI ALE TESTULUI
1.
2.
3.
4.

Trusa foloseste numai probe de plasma sau ser.

Trusa nu se foloseste la testarea probelor provenite de la cadavre.
Cu o trusa de testare imunoenzimatica se pot obtine rezultate fals-pozitive nerepetabile, datorate erorilor tehnice fie din
partea operatorului, fie din partea aparatului.
Probele care contin substante potential interferente (trigliceride, hemoglobina, bilirubina, imunoglobuline, anticorpi
autoimuni RF, ANA, AMA) si probele de la femeile insarcinate nu interfereaza cu aceasta trusa.
CARACTERISTICILE PERFORMANTEI

1.
2.
3.
4.
5.

Specificitate: 100%.
Sensibilitate: 98%.
Sensibilitate analitica: Limita minima de detectie este de < 100 GBU/ml.
Precizia intra-testare: CV% < 15; inter-testare: CV% < 20.
Trasabilitate: concentratia controlului pozitiv a fost stabilita ca fiind 800 + 200 GBU/ml.