Vas Metablicas Compartidas en una Simbiosis coevolucionada Insecto-bacteriana

La bacteria simbitica Buchnera aphidicola no posee genes claves para la

biosntesis de aminocido esenciales (aaE), y sin embargo sus hospederos
animales (pulgones) dependen en la simbiosis para la sntesis de estos aaE
(isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina y valina). Nosotros probamos la
hiptesis, derivada de anotacin genmica, que las reacciones faltantes de la
Buchnera son mediadas por las enzimas del hospedero, con el intercambio de
intermediarios metablicos entre ambas partes. Las clulas hospederas
especializadas que se encuentran en Buchnera en una fraccin Buchnera y
una fraccin de la clula hospedera (FH) Buchnera libres. La adicin de FH a
los preparativos Buchnera aislados aument significativamente la produccin
de leucina y fenilalanina, y las enzimas recombinantes mediado las reacciones
finales de cadena ramificada de sntesis de aminocidos y fenilalanina se
rescat la produccin de estos AAE por las preparaciones Buchnera sin FH.
Los probables precursores para las reacciones proximales faltantes en la
sntesis de isoleucina y metionina fueron identificados, y se diferenciaban de
las predicciones basadas en anotacin genmica : sntesis de 2-oxobutanoato
, el fido-derivado precursor de la sntesis de isoleucina , fue estimulada por
homoserina y no treonina a travs de treonina deshidratasa , y la produccin
del precursor de la homocistena en metionina fue impulsado por cistationina
, no cistena, va transulfuracin reversa.
La evolucin de las rutas metablicas compartidos en esta simbiosis se puede
atribuir a la compensacin por el deterioro genmico del hospedero en el
simbionte, que implican cambios en las redes de expresin gnica del
hospedero para reclutar enzimas especficas para la clula hospederas.
La capacidad de los diversos grupos de insectos para utilizar nutricionalmente dietas
desequilibradas se correlaciona con la posesin de forma verticalmente transmitido,
obligando a los microorganismos simbiticos con genomas reducidos (1-3).
Inesperadamente, los genomas de simbiontes bacterianos de fidos y otros insectos
sternorrhynchan (pulgones, cochinillas, mosca blanca, y pslidos) son los genes
desaparecidos en las rutas biosintticas para los aminocidos esenciales (AAE)
requeridos por el hospedero (4-6). El genoma del pulgn del guisante, al igual que
otros genomas de insectos, contiene genes que codifican enzimas con funciones
equivalentes a las de las enzimas codificada por genes perdidos por los simbiontes
bacterianos obligados (7). La propuesta de que las vas metablicas son
compartidos entre el pulgn del guisante Acyrthosiphon pisum y su bacteria
simbitica Buchnera aphidicola no tena precedentes (7, 8) ya que las vas
metablicas son tradicionalmente definida como la propiedad de los organismos
individuales.
Buchnera carece de los genes que codifican para la reaccin terminal en la sntesis
de aminocidos de cadena ramificada aminocidos (AACR) y fenilalanina y
reacciones proximales en isoleucina y la biosntesis de metionina (4). Se ha

predicho que las reacciones de terminales para AACR y la sntesis de fenilalanina

esta mediada por el enzimas del hospedero, aminotransferasa de cadena
ramificada (ATCR) y un aspartato aminotransferasa (OTG2 [oxaloacetato
transaminasa glutamato 2]), respectivamente (8). Estas enzimas estn presentes
generalmente en los animales, incluyendo insectos. En consonancia con esta
expectativa, la transcripcin y protenas de las enzimas de fidos candidato que
contribuyen a estas vas metablicas se enriquecen en las clulas especializadas
del hospedero (bacteriocitos) que nicamente albergan el simbionte bacteriano,
Buchnera (9-11). En contraste con el consenso entre data genmica,
transcriptmica y protemica para las enzimas que realizan las reacciones
terminales, hay mltiples precursores candidatos y enzimas hospederas para las
reacciones proximales contribuyendo a la produccin de isoleucina y metionina (9,
10). Adems, estas predicciones no excluyen la explicacin alternativa para la
sntesis sostenida de AAE: que las reacciones catalizadas normalmente por los
productos de genes que faltan en Buchnera estn mediadas por otras enzimas
Buchnera (y no enzimas del anfitrin) con una mayor o diferente rango de sustrato
que la indicada por su anotacin.
La respuesta a la pregunta de si algunos AAE se sintetizan por vas metablicas
compartidos o en su totalidad por Buchnera es fundamental para nuestra
comprensin de las interacciones coevolutivos en esta relacin porque los AAE
Buchnera derivados son requeridos por el pulgn para utilizar la savia del floema de
la planta, una dieta muy deficiente en estos nutrientes (13). Este problema tambin
es pertinente para la simbiosis bacteriana en otros insectos que se alimentan del
floema que subsecuentemente han sido invocados para haber compartido vas de
biosntesis de AAE, basado en anlisis de contenido del gen bacteriano (5, 6, 11).
Para probar la hiptesis de AAE rutas biosintticas compartidos en la simbiosis del
pulgn del guisante y Buchnera, iniciamos un estudio para investigar si clulas
lisiadas del hospedero podran complementar las deficiencias metablicas de
Buchnera. Nuestros objetivos especficos fueron determinar (I) si las reacciones de
transaminasas terminales que median la sntesis de AACR (leucina, isoleucina, y
valina) y fenilalanina estn localizados en la Buchnera o clulas hospederas y (ii) la
identidad de los sustratos para reacciones, de hospederos es candidatos, de
mediacin de reacciones proximal en la sntesis de isoleucina y metionina.
MATERIALES Y MTODOS
Crianza de pulgones. Los pulgones fueron criados por una sola hembra
partenogentica recogida de un campo en junio de 2009 de alfalfa en Freeville,
Nueva York, en junio de 2009. La lnea del pulgn, CWR09 / 18, se visualizado por
PCR y microscopa para bacterias simbiontes y se encontr que contena Buchnera
aphidicola y no simbiontes secundarias. La lnea se mantuvo en prefloracin Vicia
faba cv. Windsor en 20C con un ciclo de luz-oscuridad 16:8.
Liberacin de aminocidos y anlisis. Bacteriocitos fueron disecados de fidos
larvarios de 7 das de edad en medio de extraccin (glucosa 28 mM, NaCl 8,6 mM
, MgSO4 1mM, CaCl2 0.1mM, sacarosa0.25M, NaH2PO4 50mM, K2H2PO4 13mM [pH
7,5]), se lisaron pipeteando 4 a 6 veces, y se centrifug a 1.000 X g durante 5 min

a 4C para separar el sobrenadante de Buchnera-libre (referido como la fraccin del

hospedero [FH]) a partir del "pellet" que contiene clulas de Buchnera. Las clulas
de Buchnera en el "pellet" se cuantificaron por cuentas de hemocitmetro y se diluy
a 4x 108 Buchnera ml-1 en medio de extraccin.
Para iniciar el experimento de liberacin, se aadi 5,5 l del medio de reaccin a
8 replicar muestras de 5,5 l de suspensin bacteriana. EL medio de reaccin
estndar compuesto por el medio de extraccin suplementado con glutamato,
glutamina, serina, aspartato, y 2-oxobutanoato, cada uno a 2 mM, pero 2oxobutanoato fue reemplazado por homoserine2mM, treonina 2mM, cistationina
2mM, cistena 2mM, o homocistena 2mM donde se indique. Para la determinacin
de ATCR y fenilalanina actividad transaminasa en la fraccin del hospedero, el
medio de reaccin estndar fue suplementado con 2 mM 4-metil-2-oxopentanoato
o fenilpiruvato y se aaden a la FH. A intervalos de 5 min durante 40 min, un tubo
se centrifug a 1000 X g durante 70 s, y 11 l de sobrenadante fue inmediatamente
congelado en nitrgeno lquido y se almacena a -80C. Los experimentos se llevaron
a cabo en 22.5C y se repitieron 3 a 5 veces en diferentes ocasiones con diferentes
conjuntos de pulgones.
El contenido de cido amino del sobrenadante se cuantific usando elkit de
derivacin Tag (Waters) AccQ mediante cromatografa lquida de ultra rendimiento
(CLUR) con un detector (Waters Acquity) de matriz de fotodiodos (MFD). Se aadi
un volumen igual de 40mMHCl a 10 l de cada sobrenadante. Seguido de una
incubacin en hielo durante 30 min, la muestra se centrifug a 18.000 X g durante
10 min a 4C, y el sobrenadante se filtr a travs de un filtro placa de 0,45-m
(Millipore) por centrifugacin a 1500 g durante 10 min. El filtrado (2.5 l) fue derivado
con AccQ Tag (Waters), siguiendo el protocolo del fabricante, y se inyectaron en
una Waters Acquity CLAR con un detector PDA y AccQ-Tag Ultra 2.1- por Columna
de 100 mm. El gradiente fue el siguiente, donde A es 10% AccQ-Tag Ultra Eluyente
A en agua y B es AccQ-Tag Ultra Eluyente B: 0 a 0,54 min, 99,9% de A y 0,1% de
B; 0,54 a 5,74 min, 90,9% de A y 9,1% de B; 5,74 a 7,74 min, 78,8% de A y 21,2%
de B; 7,74 a 8,04 min, 40,4% de A y el 59,6% de B; 8.04 a 8.64 min, 10% de A y
90% de B; 8.05 a 8.64 min, 10% de A y 90% de B; 8.64 a 8,73 min, 99,9% de A y
0,1% de B; y 8.73 a 9.50 min, 99,9% de A y 0,1% de B (lineal entre cada punto de
tiempo). Los aminocidos se determinaron por comparacin con los estndares: 1,
5, 10, 50, y 100 pmol de los aminocidos l-1 (Waters aminocido estndar
hidrolizado 088 122, complementada con asparagina, triptfano, y glutamina).
Inmunotransferencia. Anticuerpos policlonales hecho a la medida contra el
glutamato oxaloacetato transaminasa 2 (OTG2; NCBI identidad del gen [ID],
100144899; tamao predicho, 48 kDa), aminotransferasa de cadena ramificada
(ATCR; NCBI ID de genes, 100167587; tamao predicho, 49 kDa), y treonina
deshidratasa (TD; NCBI ID del gen, 100165866; tamao predicho, 40 kDa) fueron
producido por GenScript (Piscataway, NJ). Conejos fueron inmunizados cuatro
veces usando los pptidos purificados CNPTGVDPKPEQWKE (OTG2),
enfermedades
cardiovasculares
ERPHLYESQNYK
(ATCR),
y
CMEHGSPITVDGKST (TD) conjugado con hemocianina de lapa californiana (KLH).
El antisuero policlonal obtenido a partir del ltimo sangrado fue purificado por
afinidad y probado por un ensayo de unin de enzima de inmunoabsorcin (EUNIS),

incluyendo la confirmacin de que cada suero pre inmune no reaccion a las

protenas de los pulgones. La especificidad de los anticuerpos fue confirmada
mediante espectrometra de masas (EM). Brevemente, la banda reactante del
Western blot fue manualmente removida del correspondiente gel de acrilamida,
digerida y sometida a un sistema de cromatografa lquida de alto rendimiento
(CLAR) (Dionex Ultimate 300 configurado para "nanobore), conectados en lnea a
un ion lineal hbrido triple cuadrupolo espectrmetro de masas de trampa, 4000 Q
Trap (ABI / MDS Sciex) equipado con un pulverizador inica de una fuente de iones.
Se presentaron los datos de EM resultantes para la base de datos de la bsqueda
con el motor de bsqueda MASCOT, versin 2.3, contra una base de datos que
contiene el genoma del pulgn del guisante con 34.834 "proteincoding" modelos de
genes (www.AphidBase.com).
Para el anlisis de protenas, cuerpos enteros y bacteriocitos disecados de pulgones
larvales de 7 das de edad fueron homogeneizaron en un "buffer" enfriado con hielo
que contiene 35 mM Tris, 25 mM KCl y MgCl2 10 mM, pH 7,4. Seguido de una
centrifugacin a 10.600 X g durante 5 min, el contenido proteico del sobrenadante
se cuantific usando el kit de ensayo RCDCprotein (Bio-Rad, Hercules, CA) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante, con suero de albmina bovina como
un estndar. SDS-PAGE (14) se realiz con 2,5 g de protena por muestra en un
gel de poliacrilamida al 12% que contiene 0,1% de SDS. Para el Western blotting,
las protenas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se bloqueado en
una solucin salina "buffer" con fosfato (PBS) que contiene 0,5% de Tween (PBST) y 5% de leche en polvo. La membrana se incub sucesivamente en PBS-Tween
que contiene un anticuerpo policlonal diluido 1/200 (BCAT y GOT2) o a 1 / 1.000
(TD), con una IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa (Sigma) diluido 1 / 20.000,
y luego sustrato ECL (Bio-Rad), seguido por la visualizacin con XRS Molecular
Imager ChemiDoc (Bio-Rad). La intensidad de las bandas se analiz con el software
Quantity One (Bio-Rad).
Generacin de enzimas recombinantes. Escherichia coli se utiliz como una
fuente de enzimas que median en las reacciones de terminales en la sntesis de
aminocidos de cadena ramificada (Ilve), sntesis de fenilalanina (tyrB), y la sntesis
de una homocistena precursor de la metionina (MetC). Los genes se amplificaron
a partir de E. coli JM109 ADN genmico con los siguientes cebadores: ilvE_forward,
5-TTTAGGATCCACCACGAAGAAAGCTG-3;
ilvE_
reverse,
5TTTAGGTACCGTGTCTGTCTCGTAAA-3;
tyrB_forward,
5TTTAGGATCCCAAAAAAGTTGACGCCT-3;
tyrB_reverse,
5TTTAGGTACCTTACATCACCGCAGCA-3;
metC_forward,
5TTTAGGATCCGCGGACAAAAAGCTTG-3;
y
metC_reverse,
5TTTAGGTACCTTATACAATTCGCGCAA-3. Cada primer directo incluye un sitio
BamHI, y cada primer reverso un sitio de KpnI, para la ligacin en el vector de
expresin pProExHT a p6His-Ilve para producir, p6His-tyrB, y p6His-METC. El xito
de la construccin del plsmido fue confirmado por digestiones de restriccin y
secuenciacin de Sanger.
La enzima recombinante fue expresada y purificada a partir de clulas de E. coli
BL21, esencialmente como se describe previamente (15). Brevemente, 1 ml de
cultivo durante la noche se aadi a 350 ml de LB y se cultiv con agitacin a 120

rpm y 37C durante 4,5 horas. Despus de 4,5 h, isopropil--D-tiogalactopiransido

(IPTG) se aadi a una concentracin de 0,5 mM. y el cultivo se cambi a25C
durante un perodo adicional de 18 a 20 h de incubacin. Las clulas se
sedimentaron, rpidamente congeladas, y se almacenaron a -80C hasta la
purificacin de la enzima.
Para la purificacin, 5 ml de buffer de equilibraran (20 mM de NaH2PO4, 300 mM
de NaCl, 10 mM imidazol [pH 7,4]) y 50 l de cctel inhibidor de la proteasa Halt
(Thermo Scientific) se aadieron al sedimento celular congelado, y las clulas
fueron lisiadas por sonicacin. Los restos celulares se eliminan por centrifugacin
en 4500 X g durante 10 min a 4C. El sobrenadante se aadi a 1 ml de resina
equilibrada HisPur-nquel cido nitrilotriactico (Ni-NTA) (Thermo Scientific) y se
incub a 4C durante 1,5 h con agitacin suave para permitir unin de la protena
marcada con His. Despus, la resina se lav 5 veces con 5 ml de buffer de lavado
(20 mM de NaH2PO4, NaCl 300 mM, imidazol 25 mM [pH 7,4]) durante 10 min a
4C. La resina unida a la protena se eluy en tres pasos con buffer de elucin
(20mMNaH2PO4, 300mMNaCl, 250mMimidazole [pH 7,4]), y la tercera elucin se
dializ durante la noche a 4C en un 7,000-peso molecular de corte (PMC) de la
membrana contra 1 litro de buffer de extraccin libre de glucosa (vase arriba). Se
confirm la presencia de protena pura por SDS-PAGE, y la actividad enzimtica se
demostr por la incubacin con sustrato y la deteccin del producto predicho por
UPLC (Ilve, isoleucina, leucina, y valina a partir del cido oxo cognado; TyrB,
fenilalanina a partir de fenilpiruvato; y MetC, homocistena de cistationina).
Para cuantificar el efecto de la enzima recombinante en la produccin de
aminocidos por Buchnera, el medio de reaccin (descrito anteriormente) se
complement con 0,2 mM de piridoxal-5-fosfato y 20 g de protena enzimtica
recombinante ml-1. El medio de reaccin para los experimentos METC tambin
contena cistationina 2 mM.
Anlisis estadstico. La velocidad de liberacin de los aminocidos desde las
preparaciones de Buchnera se cuantific a partir de la regresin de contenido de
aminocidos en el medio en el tiempo. La variacin en las tasas de liberacin con
el tratamiento fue analizados por anlisis de varianza (ANDVA), la prueba t, o
prueba t pareada, siguiendo transformacin logartmica para obtener distribuciones
normales (prueba Sha-piro-Wilk) con varianza homognea (prueba de Levene), con
la menor diferencia significativa (MDS) post hoc para determinar diferencias de
pares significativa en el ANDVA. Los datos que fallaron la prueba de Levene se
analizaron con una prueba de Kruskal-Wallis, con diferencias por parejas
determinadas con Mann-WhitneyUtests (valores de P determinados con una
correccin de Bonferroni).
Figura 1. Liberacin de leucina y fenilalanina por los preparativos Buchnera
aislados. (A) mapa metablico de las reacciones de terminales para la biosntesis
de leucina y fenilalanina (caja sombreada representa Buchnera). (B) Western blot
de 5 g de protenas de pulgn completo (WB) y bacteriocitos (BC) utilizando
anticuerpo policlonal contra ATCR. (C) Western blot de 5 g de protenas de WB
BC utilizando anticuerpos policlonales contra OTG2. (Para los paneles B y C, las
masas moleculares se muestran a la derecha [34 a 72 kDa].) (D) La liberacin de

leucina de Buchnera con y sin FH y la liberacin de Buchnera con y sin Ilve

recombinante. (E) Liberacin de fenilalanina de Buchnera con y sin FH y liberacin
de Buchnera con y sin TyrB.ht recombinante, tratado trmicamente. Los valores son
medias SEs. P<0.01 por la prueba LSD post hoc (diferentes letras se refieren a
valores medios significativamente diferentes).
RESULTADOS
Reacciones de transaminacin Terminal en la sntesis de la leucina y
fenilalanina. Buchnera carece de genes reconocibles que median las reacciones
terminales en la sntesis de fenilalanina y AACR en bacterias relacionadas (4). Las
enzimas de fidos OTG2 (que se anotada con la actividad aminotransferasa de la
fenilalanina) y ATCR se han planteado la hiptesis de mediar en las reacciones que
faltan en la biosntesis de fenilalanina y aminocidos de cadena ramificada,
respectivamente (Fig. 1A) (8-11).
Se detectaron las protenas ATCR y GOTG2 en el bacteriocito cuando se pone a
prueba por inmunotransferencia con anticuerpos policlonales (Fig. 1B y C). Si estas
enzimas solubles contribuyen a la sntesis de AACR y fenilalanina, a continuacin
la produccin de estos aminocidos por preparaciones de Buchnera se prev que
ser estimulada por la FH. (Se espera que las preparaciones Buchnera sin FH
produzcan estos AAE a bajo ritmo debido a que no se pueden separar de todo
contaminante proteico de fidos, incluyendo ATCR y OTG2 [10].) Consistente con
estas expectativas, leucina y fenilalanina se liberan a bajos ritmos de las
preparaciones incubadas sin HF y la liberacin de estos aminocidos es
significativamente elevada por un componente sensibles al calor de HF (Fig. 1D y
E).
Como un enfoque complementario para investigar el origen de la reacciones
terminales en la sntesis de AACR y fenilalanina, investigamos si la produccin de
estos AAE por FH Buchnera libre puede ser restaurada por la adicin de las
transaminasas recombinantes (Ilve y tyrB). Consistente con el rol previsto de
enzimas de transaminacin mediada del hospedero, estos tratamientos resultaron
en aumentos significativos en la velocidad de liberacin de leucina y fenilalanina
(Fig. 1D y E). An ms, FH tambin se prob para las actividades de amino
transferencia de ATCR y fenilalanina. Especficamente, FH mostr un aumento
significativo en la produccin de leucina y fenilalanina (9 veces y 135 veces,
respectivamente) cuando el medio fue complementado con, ya sea, 4-metil-2oxopentanoato o fenilpiruvato, y esta actividad se perdi cuando la FH fue el tratada
con calor (Fig. 2).
Figura 2. Actividades enzimticas en la FH. (A) Produccin de leucina por la FH con
sustrato de 4-metil-2-oxopentanoato. (B) Produccin de fenilalanina por la FH con
sustrato de fenilpiruvato. Los tres tratamientos en cada experimento son FH con el
sustrato (HF), sustrato menos HF, HF y tratada trmicamente con el sustrato (htHF).
Fuente metablica de 2-oxobutanoato, el precursor de isoleucina. Produccin
de isoleucina es una funcin esencial de la simbiosis pulgn-Buchnera, aunque la
fuente del intermediario clave, 2-oxobutanoato, queda por definir. La reconstruccin

del genoma concluy que la treonina deshidratasa del pulgn transforma treonina a
2-oxobutanoato, con la expectativa de que la protena treonina deshidratasa en
bacteriocitos de fidos (Fig. 3A) (8). Contrario a esta prediccin, se encontr que la
treonina deshidratasa era indetectable en los bacteriocitos, aunque se detecta
fcilmente en fidos de cuerpos enteros (Fig. 3B). Una fuente alternativa de 2oxobutanoato podra ser homoserina por la cistationina--liasa, una posibilidad
apoyada por el enriquecimiento de cistationina--liasa en el proteoma del
bacteriocito (10).
Para investigar la fuente metablica del 2-oxobutanoato, Buchnera preparaciones
con FH fueron suplementadas con 2-oxobutanoato o compuestos metablicamente
relacionados (Fig. 3C). Slo 2-oxobutanoato y homoserina se tradujeron en un
aumento significativo en la velocidad de liberacin de isoleucina, en comparacin
con medios sin fuentes de 2-oxobutanoato. Estos hallazgos sugieren que el
precursor de 2-oxobutanoato es homoserina y no treonina, que no estimula la
liberacin de isoleucina.
Figura 3. Liberacin de isoleucina de las preparaciones de Buchnera con FH. (A)
Mapa metablico ilustrando las fuentes potenciales de 2-oxobutanoato basadas en
enzimas candidatas: treonina y homoserina (caja sombreada representa Buchnera).
(B) Western blot de 5 g de protenas de pulgn entero (BM) y bacteriocitos (BC)
utilizando anticuerpo policlonal contra treonina deshidratasa. (C) Isoleucina liberada
de Buchnera ms FH incubada con diferentes precursores: -2ox, menos 2oxobutanoato (sin sustrato); +2ox, 2-oxobutanoato; Hser, homoserina; Thr, treonina;
Cys, cistena; Cysta, cistationina; Hcys, homocistena. Los valores son medias SEs.
P<0.01 por la prueba LSD post hoc.
Fuente metablica de la homocistena, el precursor de la metionina. El
precursor inmediato para la sntesis de metionina es homocistena, al que se aade
un grupo metilo para formar metionina. Buchnera posee el gen para la enzima
terminal, MetE, pero carece de genes para los otros pasos en la biosntesis de la
metionina. Como un Como consecuencia, Buchnera se prev que requiera un
suministro exgeno de homocistena para apoyar la produccin de metionina. Se ha
hiptetizado de que el hospedero provee a Buchnera con homocistena por una
inversin de la va de transulfuracin, utilizando cistationina--liasa (como
cistationina--sintetasa) y cistationina--sintetasa (como cistationina--liasa) para
formar cistationina de cistena y homocistena de cistationina, respectivamente (Fig.
4A) (8, 9). La inversin de la va de transulfuracin en animales nunca ha sido
experimentalmente demostrada en ningn sistema hasta la fecha.
Para investigar la fuente de homocistena, preparaciones de Buchnera con FH se
incubaron con homocistena o uno de varios posibles precursores para la
homocistena. Como era de esperar, la homocistena promovi la produccin de
metionina por Buchnera (aument 73 veces solo por el control del medio), sin
embargo, slo cistationina y no cistena, promovi la produccin de metionina
(aument 25 veces en comparacin con ningn aumento [Fig. 4B]). Estos resultados
confirman que la homocistena del pulgn es el precursor de la sntesis de metionina
mediada por Buchnera, pero son inconsistente con la prediccin de que las
funciones de la va de transulfuracin en reversa (8), con la metionina producida en

ltima instancia a partir de cistena. En lugar de ello, sugieren que cistationina es el

precursor metablico de la metionina.
Para investigar an ms la contribucin de las enzimas del hospedero en la sntesis
de metionina, las preparaciones de Buchnera se complementaron con homocistena
o cistationina e incubadas con o sin FH, y se midi la velocidad de produccin de
metionina. Ninguna diferencia en la produccin de metionina se obtuvo entre las
preparaciones de Buchnera en medio suplementado con homocistena e incubadas
con y sin HF (Fig. 4C), tal como se predijo con la enzima terminal siendo una enzima
de Buchnera. Sin embargo en medio complementado con cistationina, la produccin
de metionina por Buchnera aument significativamente por la adicin de FH
(aumento 14 veces [Higo. 4D]). Para probar actividad enzimtica generadora de
homocistena es externa a la bacteria, preparaciones de Buchnera se incubaron con
MetC recombinante (convierte cistationina a la homocistena). La Buchnera tratados
con MetC y cistationina mostr un aumento significativo en la produccin de
metionina (aumento 8 veces) en comparacin con un medio libre de enzimas (Fig.
4D). Tomados en conjunto, estos hallazgos indican que la homocistena puede ser
producida a partir de cistationina exgeno y se puede convertir en metionina por
Buchnera MetE.
Figura 4. Liberacin de metionina por los preparativos aislados de Buchnera. (A)
Mapa metablico de la reversin de la va transulfuracin para producir
homocistena. El cuadro sombreado representa Buchnera. Los elementos marcados
con asteriscos fueron anotados como cistationina--liasa y cistationina--sintetasa.
(B) Liberacin de metionina de Buchnera con FH incubadas con diferentes
precursores: -2ox, menos 2-oxobutanoato (sin sustrato); +2ox, 2-oxobutanoato;
Hser, homoserina, Thr, treonina; Cys, cistena; Cysta, cistationina; Hcys,
homocistena. (C) Liberacin de metionina Buchnera con y sin FH en medio con
homocistena. (D) Liberacin de metionina de Buchnera con y sin FH en medio con
cistationina y liberacin de metionina de Buchnera con y sin MetC recombinante. ht,
tratado trmicamente. Los valores son medias SEs. P<0.01 por la prueba LSD post
hoc.
DISCUSIN
Vinculado a su reducido contenido de genes, Buchnera es nutricionalmente
exigente. El crecimiento de Buchnera se infiere que requiere 33 metabolitos
derivados del hospedero (11, 16), y no hay perspectivas razonables de cultivar esta
bacteria. A pesar de esto, clulas de Buchnera viables y metablicamente activas
persisten en un medio definido por algunas horas (17-19), facilitando la investigacin
directa de sus capacidades metablicas. En este estudio, probamos las funciones
metablicas de preparaciones aisladas de Buchnera y se obtuvo evidencia directa
de que las vas metablicas se comparten entre el hospedero y el simbionte.
Especialmente, hemos demostrado (i) produccin neta de leucina y fenilalanina por
Buchnera suplementada con ya sea enzima recombinante mediadoras de la
reaccin terminal de biosntesis (Ilve y tyrB, respectivamente) o bien de FH que
contienen enzimas de fidos funcionalmente equivalentes y (ii) que las
preparaciones de Buchnera requieren el suministro exgeno de, ya sea, del sustrato

o bien del producto de reacciones del hospedero para la produccin de isoleucina y

la metionina, lo que indica la compensacin del hospedero por la falta de Buchnera
Ilva y MetC.
Adems de validar las reacciones terminales mediados por el hospedero en la
sntesis de leucina y fenilalanina, este estudio proporciona identificacin basada en
el metabolismo de los sustratos utilizados por reacciones proximales mediadas por
el hospedero. Llegamos a la conclusin de que el 2-oxobutanoato, derivado del
hospedero, precursor de la sntesis de isoleucina se sintetiza de homoserina y no
de treonina. Esto va en contra de la prediccin a partir de la anotacin del genoma
de fidos (8), pero es totalmente congruente con la evidencia metablica que los
fidos del guisante no metabolizan dietticamente [14C] treonina a isoleucina (20),
y cistationina--liasa, una enzima que est enriquecido en los bacteriocitos del
pulgn del guisante, ha sido previamente sugerido que media en la sntesis de 2oxobutanoato desde homoserina (10).
Tambin contrariamente a las predicciones basadas en va metablica va
reconstruccin (8), nuestros resultados sugieren que el sustrato de la homocistena
para la sntesis de metionina mediada por Buchnera puede derivarse de cistationina
y no cistena. Se previ que la enzima hospedera mediadora de la sntesis de
homocistena de cistationina, cistationina--sintetasa (NCBI Identidad del gen, 100
166 111), es indetectable en bacteriocitos de pulgn (10), y la enzima mediadora de
esta reaccin se mantiene a sin ser identificado; anlisis detallado del proteoma del
bacteriocito no ha identificado candidatos potenciales (CW Russell, datos no
publicados).
Una consideracin importante en la interpretacin de los experimentos en
microorganismos simbiticos aislados es su relevancia para la funcin en la
simbiosis. Cuando ciertos simbiontes son separados de sus hospederos, rasgos
simbiticos clave, en particular la liberacin selectiva de nutrientes ventajosa para
el hospedero, son abolidos (21). Varias lneas de evidencia sugieren que los
preparativos aislados de Buchnera conservan propiedades simbiticas metablicas
relevantes. En particular, la constante liberacin de los penltimos metabolitos en
los AACR y vas de biosntesis de fenilalanina se pueden deducir con confianza
debido a que estos AAE son producidos por las preparaciones de Buchnera
incubadas con las enzimas recombinantes que median las reacciones terminales,
pero se requiere un suministro exgeno de estos precursores para la produccin de
AAE por Buchnera libre de FH. Las clulas de Buchnera aisladas aparentemente no
liberan el sustrato de las reacciones proximales del hospedero para la sntesis de
isoleucina y metionina (homoserina y cistationina, respectivamente), lo que sugiere
ya sea que stos sustratos son derivados del hospedero o bien que su liberacin
desde clulas de Buchnera se pierde en el aislamiento. De estos dos compuestos,
Buchnera tiene la capacidad gentica de sintetizar solamente homoserina (a travs
la ruta biosintticas de la treonina) y no tiene los genes necesario para hacer
cistationina. Otra consideracin es el transporte de estos compuestos entre la
Buchnera y el pulgn del guisante. El pulgn del guisante tiene un conjunto ampliado
de transportadores aminocidicos que podra cumplir el papel del transporte de
intermediarios (22), sin embargo, Buchnera tiene relativamente pocos transportistas
de especificidad incierta (4). Se necesitar llevar a cabo ms estudios para

determinar transportadores responsables del flujo de los muchos metabolitos entre

las clulas de Buchnera y la clula husped que la rodean.
La cooperacin metablica se produce ampliamente entre los microorganismos,
generalmente en respuesta a la seleccin impuesta por los hbitats de escasos
recursos (23-25). La coevolucin de las vas metablicas compartidas en la
simbiosis pulgn-Buchnera muy probablemente tiene una evolucin de base
diferente. Debido a que las clulas de Buchnera de transmisin vertical tienen un
pequeo tamao efectivo de la poblacin, estn sujetos a la prdida de genes a
travs del deterioro genmico (26, 27), seleccionando para cambios evolutivos en
las redes de expresin gnica del hospedero para reclutar enzimas que compensan
por las reacciones enzimticas bacterianas que faltan en la clula hospedera.
La incidencia de las vas metablicas compartidas (es decir, vas metablicas en las
que el hospedero y simbionte contribuyen diferentes reacciones enzimticas) en
simbiosis microbiana-animal es en gran parte no estudiada pero puede ser
generalizada, aunque no universalmente, en asociaciones que involucran la
participacin de microorganismos con genomas reducidos. Por ejemplo, bacterias
simbiontes evolucionadas independientemente en las moscas blancas que se
alimentan de floemas y cochinillas del mismo suborden que los fidos, el
Sternorrhyncha, tiene la capacidad gentica incompleta para la biosntesis de AAE
(6, 28, 29), pero las vas de biosntesis estn aparentemente completas en las
bacterias simbiontes, por ejemplo, Sulcia, de los insectos (por ejemplo, cigarras,
salivazo y chicharritas) en el suborden relacionada, la Auchenorryncha (30-32).
Volviendo a diferentes simbiosis, la estimulacin de la produccin de AAE a partir
de preparaciones de Buchnera por la fraccin de clulas hospederas (FH) es una
reminiscente de un aumento de la liberacin fotosinttica por algas simbiticas
aislado de los corales u otros invertebrados marinos e incubadas con
homogeneizados de sus hospederos (33). La similitud puede, sin embargo, ser
superficial ya que el efecto homogeneizado del hospedero en clulas de algas se
interpreta generalmente como una seal qumica que induce a la sntesis y
exportacin de nutrientes especficos derivados de la fotosntesis (34, 35).
En conclusin, las vas metablicas compartidas en la simbiosis entre el pulgn del
guisante y la Buchnera es el producto de la coevolucin metablica, involucrando la
prdida de genes de Buchnera mediadores de reacciones tambin presentes en los
animales, as como el enriquecimiento compensador de la expresin de enzimas
animales en clulas del hospedero que contienen los simbiontes. Cambios
coevolutivos asociados a la regulacin de flujo a travs de las vas metablicas (por
ejemplo, por inhibicin de la retroalimentacin) o en transportadores del hospederos
y del simbiontes que median la transferencia de intermediarios metablicos entre
los socios tambin se anticipan (22). Es importante destacar que las enzimas del
hospedero implicadas en la biosntesis simbitica de AAE estn localizados en la
clula hospedera (10) y no deriva de transferencia lateral de genes de la Buchnera
ancestral u otras bacterias (36). A este aspecto, la trayectoria evolutiva de estos
simbiontes que muestran coevolucin metablica difiere notablemente de la de los
orgnulos derivados de bacteria cuyo metabolismo es mantenido por los productos
de genes derivados de orgnulos transferidos al ncleo del hospedero (2).