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Goinia
2015
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bacteria,
] NO1
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________________________________________
Assinatura do (a) autor (a)
Neste caso o documento ser embargado por at um ano a partir da data de defesa. A extenso deste prazo suscita
justificativa junto coordenao do curso. Os dados do documento no sero disponibilizados durante o perodo de
embargo.
iii
Goinia
2015
iv
Membros:
Data: 14/10/2015
vi
vii
viii
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a DEUS, por estar sempre guiando e iluminando
minhas escolhas.
Universidade Federal de Gois (UFG) e ao Programa de PsGraduao em Cincias Ambientais (CIAMB), pela oportunidade de realizar este
trabalho.
Fundao Amparo Pesquisa do Estado de Gois (FAPEG) pelo
apoio financeiro.
Ao Prof. Dr. Jos Daniel Gonalves Vieira pela orientao, e por
me ensinar a ser uma pessoa dinmica, forte e confiante.
Ao Prof. Dr. Danns Pereira Barbosa, pelo apoio, crticas e
sugestes.
As professoras que aceitaram participar desta banca.
Aos amigos que fiz no LAMAB-Goinia e que ficaro para sempre:
Ariana, Aline, Bruno, Marcus, Thas, Renan, Igor, Petain, Camila, Raylane, Luann,
Lia pela fora, amizade e constante presena e incentivo.
Ao meu querido marido Marcio Lcio Rotta pelo carinho,
companheirismo, compreenso e pelos nossos momentos vividos ao longo dessa
jornada.
Aos meus pais Joo Aparecido de Almeida e Maria da Glria S.
Souza por tornar possvel a realizao deste sonho e pelo exemplo de vida, fora
e amor.
Aos meus sogros Luiz Rotta e Maria Aparecida Benatto Rotta por
apesar de pouco tempo juntos j so meus segundos pais e pelas vossas oraes.
Aos meus irmos Wallison Neves dos Santos e Fabrcio Almeida
Leite pelo carinho, torcida e companheirismo.
ix
SUMRIO
1.
INTRODUO
2.
OBJETIVOS
2.1
Objetivo Geral
2.2
Objetivos Especficos
REFERNCIAS
3.
CAPTULO I
REVISO DA LITERATURA
1.
REVISO BIBLIOGRFICA
1.1
Biomas
1.1.1
Cerrado
1.1.2
Manguezal
1.2
Xenobiticos
1.3
Compostos fenlicos
10
1.3.1
11
1.3.2
13
1.3.3
14
1.3.3.1
Rota aerbia
15
1.3.3.2
Rota anaerbia
15
1.4
Biorremediao
19
1.4.1
20
2.
REFERNCIAS
25
CAPTULO II
31
33
INTRODUO
34
METODOLOGIA
35
35
36
xi
sobre os isolados
Consumo do fenol e crescimento dos micro-organismos em cultivo
37
estacionrio
Identificao dos isolados bacterianos
37
37
38
38
38
de polimerase (PCR)
Purificao do produto da PCR e seu sequenciamento
39
RESULTADOS
40
DISCUSSO
43
CONCLUSES
46
AGRADECIMENTOS
46
REFERNCIAS
47
CONCLUSES GERAIS
50
APNDICES
51
xii
RESUMO
Rotta, Anna Paula S. Almeida, M.Sc., Universidade Federal de Gois, outubro de 2015.
DEGRADAO DE FENOL POR BACTRIAS DE DOIS BIOMAS BRASILEIROS.
Orientador: Jos Daniel Gonalves Vieira.
xiii
ABSTRACT
Rotta, Anna Paula S. Almeida, M.Sc., Federal University of Gois, October 2015. PHENOL
DEGRADATION IN TWO BRAZILIAN BIOMES BACTERIA. Advisor: Jos Daniel
Gonalves Vieira.
In recent decades, the growth of industrial activity and agriculture has been responsible for
environmental contamination due to the presence of organic and inorganic substances. Phenol
and its derivatives are an important class of environmental contaminants by their presence in
many industrial effluents. The seeking of biological alternatives to mitigate the environmental
pollution has motivated researches to find microorganisms that combine the capacity to
degrade phenol with a sustainable focus. Therefore, bacteras capable of degrading xenobiotics
are been used in soil, sediment and water treatment. This study has aimed to evaluate the
biodegradation of phenol by bacterial isolates isolated from two Brazilian biomes (Cerrado
Goiano and Mangrove of Guarapary, ES), whereupon the influence of pre-adaptation of the
bacteria was checked, as well as the effects of growth parameters in different concentrations
and the tolerance to this chemical compound. One isolated from Cerrado was identified as
Staphylococcus aureus (BF 2.5), and the other one as a gram-positive rod (\BF 2.3.2), and the
mangrove bacteria were identified as Bacillus circulans (MF-2) and Bacillus sp. (MF-1). All
of the isolates consumed phenol in the approximated of 500mg.L-1 when cultivated in liquid
Busnell-Hass (BH) medium and 1.500mg.L-1 in Nutrient Agar medium (NA). The
consumption of phenol as carbon source by BF-2.5 isolated was 2,78; 4;79 and 0,35% for
concentrations of 100, 200 and 300 mg.L-1 of phenol, respectively. The isolated BF-2.3.2
results were 11, 04; 19,13 and 16,02%, respectively. For the mangrove isolated the results
were 22,43; 11,52 and 3.33% to 21,54; 20;54 and 28.85% for the MF-1 and MF-2 isolates,
respectively in the same phenol concentrations tested. These results suggest a higher phenol
consumption capacity of MF-2 isolated from mangrove.
xiv
LISTA DE TABELAS
CAPTULO I
REVISO DA LITERATURA
Tabela 1
10
Tabela 2
16
CAPTULO II
40
Tabela 2
Tabela 3
xv
LISTA DE FIGURAS
CAPTULO I
REVISO DA LITERATURA
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
10
Figura 3
xvi
E OS
XILENO).
P-
xvii
LB LURIA-BERTANI.
MF BACTRIA DE MANGUE DEGRADADORA DE FENOL.
MgCl2 CLORETO DE MAGNSIO.
NaCl CLORETO DE SDIO.
O2 OXIGNIO GASOSO.
PCR REAO EM CADEIA DE POLIMERASE.
PH POTENCIAL HIDROGENINICO.
1.
INTRODUO
Embora sendo biodegradvel tanto na via aerbia como na anaerbia o fenol e seus derivados
so txicos para a maioria dos micro-organismos, principalmente no aclimatados, em
concentrao de apenas 10mg.L-1, podendo ser inibidor do crescimento mesmo para as
espcies que o utilizam como substrato, causando problemas em estaes de tratamento de
efluentes (SANCINETTI et al; 2003).
A bioaumentao por micro-organismos autctones selecionados constitui uma boa
alternativa para a biodegradao do fenol. Diversos autores tm mencionado o uso de microorganismos visando remoo de fenol em efluentes industriais como, por exemplo,
Penicillium (SANTOS; LINARDI, 2004), Candida (YAN et al.; 2005) & (CHEN et al.;
2002), Pseudomonas (GONZLEZ et al., 2001) e Rhodococcus (HIDALGO et al., 2002)
dentre outros. No entanto, a prospeco de novas linhagens degradadoras, adaptadas a
condies ambientais locais, e sua caracterizao quanto capacidade biodegradativa e
tolerncia toxidade constituem aspectos importantes a serem ainda explorados. Para a
avaliao da toxicidade e biodegradabilidade, os ensaios em escala laboratorial como o
crescimento e resistncia dos isolados nos diferentes meios de cultura e nas diferentes
concentraes de fenol so teis para testar variveis importantes, verificando seus efeitos no
desempenho do micro-organismo durante o processo biodegradativo in vitro.
Este trabalho teve como objetivo avaliar a biodegradao do fenol por isolados
bacterianos recuperados de dois biomas brasileiros, verificando a influncia da bactria aos
efeitos de crescimento em diferentes concentraes, assim como a tolerncia da exposio dos
micro-organismos a esse composto qumico.
2.
OBJETIVOS
2.1
Objetivo geral
2.2
Objetivos especficos
3.
REFERNCIAS
SANCINETTI, S. T.; FLIX, J. P. L.; NETO, M. A. F.; Anais do XIV Simpsio Nacional de
Bioprocessos, Florianpolis, Brasil, 2003.
SANTOS, V. L.; LINARDI, V. R. Biodegradation of phenol by a filamentous fungi isolated
from industrial effluents-identification and degradation potential. Process Biochemistry, v.
39, n. 8, p. 1001-1006, 2004.
SIMES, N. G.; CARDOSO, V. V.; FERREIRA, E.; BENOLIEL, J.; ALMEIDA, C. M. M.
Experimental and statistical validation of SPME-GC-MS analysis of phenol and
chlorophenols in raw and treated samples. Chemosphere, v. 68, p. 501-510, 2007.
YAN, J.; JIANPING, W.; HANGMEI, L.; SOLIANG, Y.; TONGDING, H.; The
biodegradation of phenol at high initial concentration by the yeast Candida tropicalis.
Biochemical Engineering Journal, v. 24, p. 243-247, 2005.
CAPTULO I
REVISO DE LITERATURA
1.
REVISO BIBLIOGRFICA
1.1
Biomas
1.1.1 Cerrado
principalmente na litosfera (CHU et al., 2010; LAUBER et al., 2009; TIEDJE et al., 2001;
TORSVIK et al., 2002; TYSON et al., 2004).
Em amostras de solo podem-se detectar bactrias que so tidas como generalistas,
por que so capazes de colonizar diferentes ambientes ou mesmo bactrias especialistas por
serem encontradas unicamente em um ambiente. Em estudo recente, Nemergut e
colaboradores (2011) examinaram a distribuio global do gene do 16S rRNA a partir de uma
grande variedade de ambientes. Os dados demonstraram que, as bactrias mais abundantes
podem ser confinadas em ambientes especficos, e que uma frao significativa da variao
encontrada na distribuio de bactrias pode ser relacionada com o tipo do ambiente
analisado.
Nos ltimos anos, estudos realizados no bioma Cerrado sobre a composio da
comunidade bacteriana dos solos tm avanado consideravelmente. Quirino e colaboradores
(2009) demonstraram que reas nativas de uma das fitofisionomias do bioma, o Cerrado sensu
stricto, apresentam maior diversidade em relao rea de Cerrado sensu stricto convertido
para pastagem. Bresolin e colaboradores (2010), comparando a comunidade bacteriana do
solo de uma rea de Cerrado nativa com uma rea de Cerrado convertida plantao de soja,
demostram que a comunidade microbiana do solo pode ser afetada devido modificao na
cobertura original do solo e/ou ao desenvolvimento da cultura de soja.
Devido seu alto poder de diversidade, os solos do Cerrado vm sendo atualmente
analisados por tcnicas de sequenciamento mais refinadas como o pirosequenciamento
(ARAJO et al., 2012; SILVA, 2012). A tecnologia do pirosequenciamento gera quantidades
de dados sem precedentes, fornecendo novas oportunidades de abordagens para descrever,
analisar e comparar a comunidade microbiana presente nos solos do bioma Cerrado.
1.1.2 Manguezal
1.2
Xenobiticos
xenobiticos,
introduzidos
para
uso
industrial,
so
importantes
10
1.3
Compostos fenlicos
Fenol
m-Cresol
o-Clorofenol
Catecol
Ponto de Fuso
C
Ka .1010
Ponto de Ebulio
Solubilidade
C
(g/100g H2O, 25C)
Fenol
41
182
9,3
1,1
m-Cresol
l1
201
2,6
0,63
o-Clorofenol
173
2,8
77
l04
246
45
Catecol
(1.1)
(1.2)
11
Monteiro (1998) relatou que os fenis so cidos mais fracos que o cido carbnico.
Devido a esta caracterstica peculiar possvel verificar se determinado composto fenlico
procedendo ao seguinte teste: se for pouco solvel em gua e for solubilizado em uma soluo
aquosa de hidrxido de sdio, mas no numa soluo aquosa de bicarbonato, esse composto ,
com grande probabilidade, um composto fenlico. Uma caracterstica particular do fenol
que este reage com o cloreto de ferro III, formando um complexo de colorao violeta. Alm
disto, o fenol (hidroxi-benzeno) ao mesmo tempo um composto aromtico sinttico e natural
(BASHA et al., 2010).
Possui uma grande aplicao na produo de resinas sintticas, as poliamidas
fenlicas (materiais de construo para automveis e eletrodomsticos) e epxicas (adesivos,
policarbonatos para a fabricao de vasilhames de refrigerantes) (ROJAS, 2001). Est entre os
50 produtos qumicos mais produzidos em grande escala, nos Estados Unidos da Amrica
(ATSDR, 2006). Em geral, suas concentraes em efluentes industriais est situado entre 10 e
17x103mg.L-1, variando, principalmente, de acordo com o tipo de indstria. Na grande
maioria, a contribuio da Demanda Qumica de Oxignio (DQO) dos compostos fenlicos
nestes efluentes est na faixa de 40% a 80% da DQO total (VEREESH; KUMAR;
MEHROTRA, 2005).
Uma caracterstica geral do fenol ser txico. Esta toxidade se torna prejudicial aos
micro-organismos, podendo causar a morte celular (HEIPIEPER et al., 1992), pois possui
habilidade de romper a membrana lipdica, sendo esta uma barreira responsvel pela
integridade osmtica da clula microbiana (VAN SCHIE; YOUNG, 2000).
Diante disto, a eliminao dos compostos fenlicos pode ser feita atravs de diversos
processos fsico-qumicos, tais como: adsoro com carvo ativado, extrao por solventes,
oxidao qumica, tratamentos enzimticos (THOMAS et al., 2002). No entanto, processos
biolgicos so preferveis em funo da economia e da baixa probabilidade de formao de
subprodutos perigosos (BAI et al., 2007).
12
por meio de extrao com gua. Por possuir grande quantidade de anis fenlicos em sua
constituio qumica so considerados polifenis (HOIANACK, 1994).
A indstria do couro a principal atividade econmica responsvel pela utilizao
dos taninos no curtimento do mesmo em larga escala, pois, o tanino interage via forte ligao
de hidrognio com protenas, principalmente com colgeno, tornando-as insolveis,
melhorando a estabilidade dimensional do material, e diminuindo a suscetibilidade frente a
ataques biolgicos (PIZZI, 2004).
Os taninos so divididos em dois grupos: hidrolisveis e condensados (Figura 2). Os
primeiros so passveis de hidrlise pela ao de cidos minerais diludos, lcalis e certas
enzimas, devido presena de ligaes ster, originando glucose e cido glico e seus
derivados (cidos fenolcarboxlicos). Tambm apresentam anis do tipo D-glucose no centro
da estrutura, sendo que as hidroxilas destas unidades de acar so parcial ou totalmente
esterificadas, tendo anis fenlicos ligados s carbonilas (PIZZI, 2004; NDAZI et al., 2006).
(a)
(b)
Figura 2. Representao de parte da estrutura dos taninos: (a) hidrolisveis e (b) condensados
(adaptado de OLIVEIRA, 2008).
13
14
15
Figura 3. Esquema da rota metablica aerbia da degradao do fenol (adaptado de SCHIE; YOUNG,
2000).
16
mais ou menos energia poder ser conservada na respirao anaerbia. Isto causa uma forte
hierarquia, alm de um gradiente espacial de organismos que competem pelo aceptor de
eltrons que tem maior potencial redox. O oxignio o aceptor inorgnico com maior
potencial (+818mV) porm no utilizado nesta rota. Em seguida encontra-se o nitrato
(+433mV), estendendo-se para, ons metlicos oxidados, como Fe3+ ou Mn4+ (+200mV), at
sulfato (-200mV) (HEIDER; FUCHS, 1997).
Tabela 2. Micro-organismos capazes de degradar fenol pela via anaerbia (adaptado de VAN SCHIE;
YOUNG, 2000).
Tipo do micro-organismo
Espcies e linhagens microbianas
Redutor de nitrato
Redutor de nitrato
Redutor de nitrato
Redutor de sulfato
Desulfobacterium phenolicum
Redutor de sulfato
Redutor de sulfato
Desulfovibrio sp.
Redutor de ferro
A primeira medida para a degradao do fenol utilizando nitrato como aceptor final
de eltrons a carboxilao na posio para, produzindo 4-hidroxibenzoato (Tschech; Fuchs,
1987). O processo realizado por uma enzima denominada de fenol carboxilase (VAN
SCHIE; YOUNG, 2000).
No entanto, Lack e Fuchs (1994) observaram que a enzima fenol carboxilase
responsvel pela carboxilao do fenol foi inativa, constatando que apenas o fenilfosfato
(cido fosfrico monofenil ster) foi realmente carboxilado. Os autores demonstraram que o
primeiro produto formado detectado atravs do fenol foi o fenilfosfato e que, concomitante ao
consumo deste, havia formao de 4-hidroxibenzoato (4-OHBz). O experimento foi realizado
in vitro, sob condies desnitrificantes, utilizando Pseudomonas (Figura 4).
17
18
19
1.4
Biorremediao
e por destrurem
ou transformarem
os
contaminantes
considerados
20
21
22
ter a capacidade de transformar os compostos a uma taxa razovel e baixar suas concentraes
a nveis que estejam dentro de normas estabelecidas; 3) no devem gerar produtos ainda mais
txicos durante a remediao; 4) o local no deve apresentar concentraes ou combinaes
de qumicos notoriamente inibitrios s espcies biodegradantes, ou existir meios de diluio;
5) os componentes alvos devem estar disponveis aos micro-organismos; 6) condies locais
de campo devem ser criadas para conduzir o crescimento microbiano ou sua atividade como,
por exemplo, um suplemento adequado de nutrientes inorgnicos, O2 suficiente ou outro
aceptor de eltrons, umidade favorvel, temperatura estvel e uma fonte de carbono e energia
para o crescimento caso o poluente seja cometabolizado; 7) os custos desta tecnologia devem
ser menores ou, pelo menos no mais caras que outras tecnologias que possam tambm
destruir os qumicos. Nenhum destes critrios trivial. Dificuldades em se entender qualquer
um destes itens pode resultar em falhas nos processos de biodegradao de compostos
aromticos.
A biodegradao tem sido um dos aspectos do catabolismo microbiano mais explorado
recentemente. As tendncias na biodegradao de compostos aromticos em ambientes
salinos ou no consiste no isolamento de novas linhagens capazes de metabolizar, a exemplo
de compostos fenlicos e a identificao de vias metablicas alternativas, bem como a
clonagem molecular dos genes envolvidos nesse processo (FAIRLEY et al., 2002). Alm
disso, o conhecimento da microbiota pode auxiliar quando necessrio o uso da melhor tcnica
de biodegradao do ambiente.
O objetivo da biorremediao no de incio a diminuio da concentrao de
poluentes abaixo dos valores limites, mas sim a reduo do potencial de risco de maneira
eficaz e com custos economicamente viveis (HOFFMANN; VIEDT, 1998).
23
24
25
2.
REFERNCIAS
26
06
de
setembro
de
2015.
Disponvel
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<
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31
CAPTULO II
DEGRADAO DE FENOL POR BACTRIAS DE DOIS BIOMAS BRASILEIROS
(Manuscrito de artigo cientfico)
32
33
RESUMO
Nas ltimas dcadas, a crescente atividade industrial e a agropecuria tm sido as
responsveis pela contaminao do meio ambiente devido presena de substncias orgnicas
e inorgnicas. O fenol e seus derivados constituem uma importante classe de contaminantes
ambientais pela sua presena em muitos efluentes industriais. A busca por alternativas
biolgicas para combater a poluio ambiental tem motivado pesquisas por micro-organismos
que aliem a capacidade de degradar o fenol com enfoque sustentvel. Nesta vertente, bactrias
degradadoras de xenobiticos, esto sendo utilizadas como inculo nos diversos tipos de
tratamento biolgico para a minimizao de contaminao de guas, solos e sedimentos. Este
trabalho teve como objetivo avaliar a biodegradao do fenol por isolados bacterianos de dois
biomas brasileiros (Cerrado Goiano e Manguezal de Guarapar, ES), no qual, verificou-se a
influncia da adaptao bacteriana perante as diferentes concentraes de fenol e a tolerncia
a esse composto qumico. Das bactrias de Cerrado uma foi identificada como Staphylococcus
aureus (BF 2.5) e a outra somente como bastonete gram-positivo (BF 2.3.2) e entre as
bactrias de manguezal uma foi identificada como Bacillus circulans (MF-2) e a outra
Bacillus sp. (MF-1) Todos os isolados consumiram fenol na concentrao aproximada de
500mg.L-1 quando crescidos em meio de Bushnell-Haas (BH) lquido e em 1.500mg.L-1
quando em meio gar Nutriente (AN). Quanto utilizao do fenol como fonte nica de
carbono observamos que o consumo de fenol pelo isolado BF-2.5 foi de 2,78; 4,79 e 0,35%
para as concentraes de 100, 200 e 300mg.L-1 de fenol, respectivamente. J para o isolado
BF-2.3.2 os resultados foram de 11,04; 19,13 e 16,02%, respectivamente. Para os isolados de
manguezal os resultados foram 22,43; 11,52 e 3,33% e 21,54; 20,54 e 28,85% para os
isolados MF-1 e MF-2, respectivamente nas mesmas concentraes de fenol testadas. Estes
isolados sugerem uma maior capacidade de utilizao pelo isolados MF-2 de manguezal.
34
INTRODUO
35
conta
com
versatilidade
metablica
das
bactrias
denominadas
METODOLOGIA
36
37
38
39
de
dados
do
NCBI
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LI
NK_LOC=blasthome).
40
RESULTADOS
Reao de
Ryu
BF 2.3.2
Cerrado
Bacilo
BF 2.5
MF-1
Cerrado
Manguezal
Coco
Bacilo
+
+
+
+
MF-2
Manguezal
Bacilo
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 1. Microfotografia dos isolados de Cerrado e Mangue corados pela metodologia de Gram. a)
BF 2.3.2, b) BF 2.5., c) MF-1 e d) MF-2. Aumento de 1.000X.
41
NI
BF 2.5
S. aureus
100
HK3KJ1B3016
MF-1
Bacillus sp.
84
YEKJZMAX015
MF-2
Bacillus circulans
99
YEKTEDYU014
NI: no identificado.
Tabela 3. Tolerncia e utilizao dos isolados nos diferentes meios de cultura e nas diferentes
concentraes de fenol.
Isolados bacterianos
-1
BF 2.3..2
AN BH
BF 2.5
AN
BH
+
+
+
0
+
+
+
100
+
+
+
200
+
+
+
300
+
+
+
400
+
+
+
500
+
+
600
+
+
700
+
+
800
+
+
900
+
+
1000
+
+
1100
+
+
1200
+
+
1300
+
+
1400
+
+
1500
1600
Legenda: * meio de cultura acrescido 1,8% (m/v) de NaCl (m/v).
+
+
+
+
+
+
-
MF 1
AN* BH*
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
MF 2
AN* BH*
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
42
O consumo nas trs concentraes diferentes de fenol 100, 200 e 300mg.L-1 (m/v)
estudadas e o crescimento com 96 horas a 30C podem ser observados nas Figuras 4 e 5,
respectivamente.
35
30
25
20
BF - 2.3.2
15
BF - 2.5
MF-1
10
MF-2
5
0
100
200
Diferentes concentraes de fenol
300
(mg.L-1)
Figura 2. Percentual do consumo de fenol pelas morfo-espcies BF-2.3.2; BF-2.5; MF-1 e MF-2 em
relao aos cinco dias de incubao.
Crescimento microbiano em
Absorbncia (=600nm)
2,000
1,800
1,600
1,400
1,200
BF - 2.3.2
1,000
BF -2.5
0,800
MF - 1
0,600
MF - 2
0,400
0,200
0,000
100
200
Diferentes concentraes de fenol
300
(mg.L-1)
Figura 3. Crescimento bacteriano das morfo-espcies BF-2.3.2; BF-2.5; MF-1 e MF-2 em relao aos
cinco dias de incubao.
43
DISCUSSO
44
45
46
CONCLUSES
AGRADECIMENTOS
47
REFERNCIAS
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<
49
50
CONCLUSES GERAIS
O isolamento e caracterizao mostraram-se efetivos na obteno de bactrias
degradadoras do fenol;
Os isolados demonstraram tolerncia e consumiram fenol nas concentraes de at
1.500mg.L-1 para os biomas estudados e consumiram o fenol nas respectivas
concentraes de 500mg.L-1 para os isolados de cerrado e na concentrao de 600mg.L1
51
APNDICES
5,0
Extrato de levedura
1,5
1,5
NaCl
5,0
gar
5,0
2. gar BHI (Brain Heart Infusion BD) Frmula grama por Litro de gua
purificada
Crebro-corao, infuso de (slidos)
8,0
5,0
16,0
Cloreto de sdio
5,0
Glucose
2,0
2,5
gar
13,5
52
1,0
K2HPO4
1,0
NH4NO3
1,0
MgSO4
0,2
CaCl2
0,2
FeCl3
0,05
10,0
Extrato de levedura
5,0
Extrato de levedura
10,0
5. Tris-HCl
Tris-base
H2O pura q.s.p.
121,1g
121,1g
9,3g
1,0g
50mL
53
7. Tampo TE
Tris-HCl 10mM
1mL
EDTA 1mM
200L
100mL
10g
100mL
10. Clorofil
A soluo clorofila feita a partir de clorofrmio e lcool isoamlico, na proporo de 24:1
(v/v).
54g
cido Brico
27,5g
20mL
500mL
54
2,0g
Tampo TBE 1X
B. NORMAS
200mL
PARA
PUBLICAO
DO
AFRICAN
JOURNAL
OF
MICROBIOLOGY RESEARCH
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Involving Human Subjects.
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1993, The EU parliament directive on the protection of animals used for scientific
purposes, ARRP policies and guidelines, etc.
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and timely account of what was done and what was found during a research study, is an
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55
56
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Baumert J, Kunter M, Blum W, Brunner M, Voss T, Jordan A, Klusmann U, Krauss S,
Neubrand M, Tsai YM (2010). Teachers` mathematical knowledge, cognitive activation in the
classroom, and student progress. Am. Educ. Res. J. 47(1):133-180.
http://dx.doi.org/10.3102/0002831209345157
PMid:11334094
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57
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