Vous êtes sur la page 1sur 13

DETERMINACIN DE LA ANTIGLOBULINA DIRECTA O COOMBS DIRECTO.

OBJETIVO
Llevar al estudiante de microbiologa a determinar en un donante o receptor la sensibilizacin in vivo o in vitro de
los hemates por anticuerpos o por fracciones del complemento, al ejecutar el procedimiento, analizar el
fundamento e interpretar los resultados de la prueba.
DEFINICIN:
Se cree que el principio de la prueba de Antiglobulina fue inicialmente descrito por Moreschi en 1908. En
medicina transfusional esta prueba solo fue introducida en el ao 1945 cuando Coombs, Mourant y Race
demostraron que por medio de esta se poda detectar anticuerpos no aglutinantes anti Rh en el suero.
Posteriormente los mismos autores demostraron la utilidad de la prueba para determinar la sensibilizacin In Vivo
de los hemates por anticuerpos, en nios con enfermedad hemoltica. En 1957 Dacie y colaboradores demostraron
que la prueba era igualmente buena para determinar la sensibilizacin de los hemates por fracciones del
complemento.
El suero antiglobulina Humana se obtiene inyectando conejos con purificados de IgG humana y fracciones del
complemento (C3d); el conejo as sensibilizado con las globulinas humanas producir anticuerpos contra la IgG
humana y contra el componente C3d del complemento.
El suero antiglobulina puede ser adquirido comercialmente con diferentes especificidades, el mas usado es el
poliespecifico, es decir, que contiene tanto actividad anti IgG como antiC3d; la actividad anti IgG del reactivo est
dirigida contra la porcin Fc de la IgG humana, de igual forma se puede conseguir el reactivo con especificidad
anti-IgG o anti-C3d por separado.
Por su parte si hemates humanos son sensibilizados IN VIVO o IN VITRO con IgG o C3d y posteriormente son
puestos a reaccionar con el suero antiglobulina, estos sern aglutinados evidenciando la reaccin Ag-Ac.
METODOS
La determinacin de la prueba de antiglobulina directa o coombs directo puede hacerse por los mtodos en tubo.
FUNDAMENTO
El principio de la prueba de antiglobulina directa o coombs directo es determinar la sensibilizacin de los hemates
in vivo o in Vitro por anticuerpos no aglutinantes (IgG) y/o fracciones del complemento, especficamente C3d; en
otras palabras, consiste en detectar la presencia de anticuerpos sobre la superficie eritrocitaria a travs de la
globulina polivalente o antiglobulina de coombs. A nivel de Laboratorio, consiste en mezclar los glbulos rojos del
paciente, donante o receptor con el suero de coombs o antiglobulina para observar la aparicin o no de
aglutinacin; si la superficie eritrocitaria posee los anticuerpos, la presencia de aglutinacin indica positividad.
La sensibilizacin de los hemates puede ocurrir In Vivo o In Vitro.
Cuando la sensibilizacin ocurre In Vivo, la reaccin Ag-Ac ocurre dentro del organismo humano, tal es el caso de
la anemia hemoltica autoinmune (AHAI), la enfermedad hemoltica del recin nacido (EHRN), La anemia
hemoltica inducida por drogas y las reacciones transfusionales debidas a anticuerpos.
Por su parte, la sensibilizacin In Vitro ocurre en el Laboratorio, en donde los hemates son manipulados para
facilitar su sensibilizacin con los anticuerpos y esta a su vez es determinada por el suero antiglobulina.
Como se mencion anteriormente esta prueba es til para confirmar el diagnstico de la anemia hemoltica
autoinmune (AHAI), la enfermedad hemoltica del recin nacido (EHRN), La anemia hemoltica inducida por
medicamentos y en la investigacin de reacciones transfusionales.

La prueba es sencilla de realizar y para tener resultados de calidad solo basta con lavar escrupulosamente los
hemates para remover las inmunoglobulinas y el complemento no unidos a las clulas ya que puedan interferir en
las prueba.
MUESTRA:
Sangre anticoagulada con EDTA, ACD, CPD, CPDA-1
Glbulos rojos lavados 3-4 veces y suspendidos en solucin salina.
Sangre coagulada puede utilizase siempre y cuando del coagulo logren desprenderse suficientes hemates, los
cuales sern lavados y suspendidos en SSF.
Las muestras deben ser procesadas inmediatamente.
Los tubos que contienen gel de silicona no deben usarse para esta prueba debido a que los resultados obtenidos son
Falsos Positivos, porque las partculas de gel al desprenderse pueden simular una reaccin de aglutinacin.
MATERIALES Y REACTIVOS
Pipetas pasteur o de transferencia.
Lmpara.
Solucin salina fisiolgica 0.9%
Tubos de 10 o 12 x 75
Gradillas
Centrfuga serolgica.
Suero de antiglobulina humana o coombs el cual puede ser de tres tipos:
Suero antiglobulina humana IgG + C3d (Poliespecifico) mas comnmente utilizado.
Suero antiglobulina IgG : contiene anti IgG sin actividad anticomplemento.
Anti C3d: contiene anticuerpos que reaccionan contra el complemento.
Clulas reactivas O positivas.
Clulas sensibilizadas con IgG (Clulas contrl de coombs) Controlan la actividad del suero antiglobulina y la
calidad del lavado de las clulas.
PROCEDIMIENTO
En caso de utilizar muestra coagulada, centrifugar la muestra x 10 min. a 3000 rpm, separar de la muestra
en estudio, el suero de los glbulos rojos. El suero debe colocarse en otro tubo debidamente identificado.
Colocar en un tubo aparte, identificado, una alcuota de los glbulos rojos en estudio y lavarlos 3-4 veces
con solucin salina fisiolgica para eliminar protenas anormales y anticuerpos indeseables y complemento.
Despus del ltimo lavado eliminar el sobrenadante y preparar una suspensin celular al 5% con SSF.
Marcar tres tubos as,
Paciente
Suero Antiglobulina 1 gota
Humana - Coombs
Clulas del paciente 1 gota
lavadas al 5%
Clulas Sensibilizadas
Clulas Reactivas O+

Control Positivo
1 gota

Control Negativo
1 gota

1 gota
1 gota

Mezclar cada tubo, centrifugar por 15 a 30 segundos


Resuspenda suavemente el botn de clulas y observe la presencia o ausencia de aglutinacin con la ayuda
de una lmpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado.
Si no observa aglutinacin, incube el tubo 5-10 minutos a temperatura de laboratorio y centrifugue para
volver a leer. Este procedimiento es adecuado cuando se quiere evidenciar la sensibilizacin de los hemates

por fracciones del complemento (C3d) puesto que la incubacin incrementa la sensibilidad de la reaccin.
Sin embargo, es conveniente tener en cuenta que cuando se observan reacciones dbiles de aglutinacin
debidas a actividad anti IgG , la incubacin y recentrifugacin puede negativizar la reaccin, arrojando un
falso resultado negativo.
El contrl positivo debe aglutinar 2+ , el no observar aglutinacin en este paso invalida la prueba, ya que
sugiere un mal lavado de las clulas o la inactivacin del reactivo.

INTERPRETACIN.
La aglutinacin de los hemates por el Suero Antiglobulina Humana Coombs indica que estos fueron
sensibilizados In Vivo con anticuerpos no aglutinantes (IgG) y/o con fracciones del complemento C3d.
El resultado ser reportado como Coombs Directo o Prueba de la Antiglobulina Directa: Positiva, indicando el
grado de aglutinacin ( D a 4+)
La no aglutinacin indica que no hubo sensibilizacin In Vivo de los hemates o que a pesar de haberla, la
sensibilidad de la prueba no es suficiente para detectarla ya que es conocido que se necesitan ms de 120 molculas
de IgG sensibilizando el GR para que este pueda ser aglutinado por el suero antiglobulina.
Si el coombs directo resulta positivo se debe realizar un Coombs Directo Fraccionado para determinar si la
sensibilizacin es por IgG o C3d utilizando sueros antiglobulina monoclonales especficos para cada uno.
COOMBS DIRECTO FRACCIONADO:
Marcar tres tubos as,
Anti IgG
Anti C3d
Control Negativo
Suero
antiglobulina 1 gota
IgG
Suero anti C3d
1 gota
Clulas del paciente
1 gota
1 gota
1 gota
Solucin salina
1 gota
Mezclar cada tubo, centrifugar por 15 a 30 segundos
Resuspenda suavemente el botn de clulas y observe la presencia o ausencia de aglutinacin con la ayuda de una
lmpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado.
Si no observa aglutinacin en el tubo marcado C3d , incube el tubo 5-10 minutos a temperatura de laboratorio y
centrifugue para volver a leer puesto que la incubacin incrementa la sensibilidad de la reaccin.
Interpretacin:
Se debe leer como positivos los tubos que presenten aglutinacin definiendo as la caracterstica del anticuerpo que
esta sensibilizando los GR y se interpretara de la siguiente manera:
IgG

C3d

Tipo de Acs

IgG
complemento
IgG
No
complemento
IgM
complemento

Realizar
fija Eluado
fija Eluado
fija No Eluado

ELUADO: Desprender del estroma del GR los anticuerpos que lo estn sensibilizando.

PRUEBA DE COOMBS DIRECTA POSITIVA


Anemias hemolticas autoinmunes.
Enfermedad hemoltica del recin nacido.
Anemia hemoltica por medicamentos.
Reacciones transfusionales.
PRUEBA DE COOMBS DIRECTA NEGATIVA
Anemias Hemolticas por defectos intrnsecos del GR.
CAUSAS DE ERROR O DIFICULTADES EN LA DETERMINACIN DE LA PRUEBA DE
ANTIGLOBULINA DIRECTA O COOMBS DIRECTO
Falsos positivos:
Hemates contaminados por manejo y almacenamiento inadecuado.
Tiempo de centrifugacin excesiva.
Sensibilizacin in Vitro producida por anticuerpos o por el complemento cuando se deja reposar la muestra
a 4oC durante algn tiempo.
Suero de coombs que contenga Acs inespecficos que reaccionan con clulas no sensibilizadas.
Presencia de albmina en el suero de coombs
Reaccin con slice coloidal de los tubos de vidrio.
Falsos negativos:
Lavado deficiente de los hemates., trazas de Igs y complemento no fijados pueden inactivar el reactivo de
antiglobulina.
Cuando el anticuerpo se eluye de las clulas durante la incubacin o el lavado. Para evitarlo se debe
adicionar el suero antiglobulina una vez se terminen los lavados de los hemates.
Deterioro del suero antiglobulina por contaminacin o almacenamiento inadecuado.
Cuando el suero antiglobulina no se aade al sistema.
Centrifugacin inadecuada.
GR viejos.
Agitacin vigorosa durante el proceso de lectura, desvanece las reacciones dbiles.
PRUEBA DE ANTIGLOBULINA INDIRECTA O COOMBS INDIRECTO
La prueba de coombs es un mtodo serolgico que consiste en la demostracin de la presencia de anticuerpos
antiglobulinas, las cuales pueden estar unidas a los GR sensibilizndolos (coombs directo) o libres en el suero o
plasma sanguneo (coombs indirecto).
La prueba de antiglobulina indirecta o coombs indirecto puede ser dividida en cuatro fases:
Fase de sensibilizacin: En esta los hemates son incubados in vitro con el suero, la sensibilizacin depende de
variables como la temperatura, el medio de reaccin, la proporcin clulas/suero y el tiempo de incubacin.
Fase de lavado: Tiene como propsito eliminar los anticuerpos y/o el complemento no unido a los hemates. Las
variables que la afectan son: tiempo de lavado, volumen de la salina utilizada, residuo de salina entre lavado y
lavado, velocidad y tiempo de centrifugacin.
Fase de antiglobulina y lectura: en la cual se trata de evidenciar si los hemates fueron sensibilizados in vitro con
anticuerpos tipo IgG y/o complemento C3d. Las variables que pueden afectar esta fase son el volumen del suero
antiglobulina, la velocidad y tiempo de centrifugacin y el modo de realizar la lectura de la prueba.
Fase de contrl: Al igual que para la prueba de antiglobulina directa, cuando no se observa aglutinacin de los
hemates con el suero antiglobulina, debe controlarse la prueba con clulas sensibilizadas (Contrl de coombs)

FUNDAMENTO:
La prueba de antiglobulina indirecta o coombs indirecto detecta la especialidad de un anticuerpo incompleto que al
unirse a un antigeno celular correspondiente, In Vitro, no es capaz de aglutinarlo directamente sino, que se necesita
la antiglobulina humana para conseguir la aglutinacin y as comprobar la existencia del anticuerpo. En otras
palabras, lo que se quiere detectar es la presencia de anticuerpos libres en el suero.
Por lo tanto, el principio de la prueba de antiglobulina indirecta o coombs indirecto es determinar la sensibilizacin
In Vitro de los hemates con molculas de anticuerpos no aglutinantes IgG y/o fracciones del complemento( C3d).
En otras palabras es detectar en el suero de los donantes la presencia de anticuerpos irregulares de tipo IgG e IgM,
mediante el uso de glbulos rojos que poseen antgenos conocidos. La caracterstica fisicoqumica de los
anticuerpos en estudio hace necesario la utilizacin de temperaturas y medios de reaccin diferentes para su optima
deteccin.
En la prueba los hemates y el suero que contiene los anticuerpos y el complemento son incubados(tiempo y
temperatura adecuados) bajo la accin de un potenciador que generalmente es albmina, soluciones de bajo poder
inico o policationes.
Posteriormente los hemates son lavados para eliminar las inmunoglobulinas y/o el complemento unido.
Paso seguido se hacen reaccionar los hemates con el suero antiglobulina.
Si los hemates son aglutinados por el suero antiglobulina humano, indica que han sido sensibilizados In Vitro por
anticuerpos tipo IgG y/o por complemento ( C3d).
En la prueba de antiglobulina indirecta o coombs indirecto puede estar involucrado uno de los tres eventos
siguientes:
1. Que los hemates utilizados sean de composicin antignica conocida, mientras que el suero corresponda a
un individuo en quien la presencia de anticuerpos contra los antgenos eritrocitarios es desconocida. Las
clulas de composicin antignica conocida se obtienen comercialmente como clulas pantalla (clulas
I y II) y panel de clulas para la identificacin de anticuerpos inesperados. Ej: Rastreo de anticuerpos
irregulares.
2. Los hemates utilizados son de composicin antignica desconocida, es decir, pertenece a un individuo al
cual queremos determinar la presencia de un antgeno especfico, por su parte el suero es comercial y de l
se sabe la especificidad del anticuerpo que contiene.
3. Los hemates son de composicin antignica desconocida y en el suero no sabemos si existen anticuerpos
inesperados o irregulares contra los antigenos eritrocitarios. Ej. Cuando se realizan las pruebas cruzadas, en
la cual se hace reaccionar hemates del donante con suero o plasma del receptor (prueba cruzada mayor) .
MUESTRA:
Sangre anticoagulada con EDTA , ACD, CPD, CPDA-1
Glbulos rojos lavados 3-4 veces y suspendidos en solucin salina.
Sangre coagulada puede utilizase siempre y cuando del coagulo logren desprenderse suficientes hemates, los
cuales sern lavados y suspendidos en SSF.
Las muestras deben ser procesadas inmediatamente.
MATERIALES Y REACTIVOS
Pipetas pasteur o de transferencia.

Lmpara.
Solucin salina fisiolgica 0.9%
Tubos de 10 o 12 x 75
Gradillas
Centrfuga serolgica.
Suero de antiglobulina humana o coombs el cual puede ser de tres tipos:
Suero antiglobulina humana IgG + C3d (Poliespecifico) mas comnmente utilizado.
Suero antiglobulina IgG : contiene anti IgG sin actividad anticomplemento.
Anti C3d: contiene anticuerpos que reaccionan contra el complemento.
Clulas reactivas O positivas.
Potenciador de baja concentracin inica, lo-ion albumina.
Clulas sensibilizadas con IgG (Clulas contrl de coombs) Controlan la actividad del suero antiglobulina y la
calidad del lavado de las clulas.
PROCEDIMIENTO COOMBS INDIRECTO CUALITATIVO:
Centrifugar la muestra x 10 min. a 3000 rpm, separar de la muestra en estudio, el suero o plasma de los
glbulos rojos y colocarse en otro tubo debidamente identificado.
Marcar tres tubos as,

Suero del paciente


Anti D dil1/10 en SS
Solucin salina
Clulas Reactivas O+

Paciente
2 gota

Control Positivo

Control Negativo

2 gota
1 gota

1 gota

2 gota
1 gota

Mezclar cada tubo, y centrifugue por 5 segundos.


Resuspenda suavemente el botn de clulas y observe la presencia o ausencia de aglutinacin con la ayuda
de una lmpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado.
Adicione a cada tubo una gota del potencializador.
Mezclar cada tubo, incubar a 37 oC, dependiendo del potencializador, as ser el tiempo de incubacin: Loion:15 minutos, albmina 30 minutos.
Centrifugar por 5 segundos.
Resuspenda suavemente el botn de clulas y observe la presencia o ausencia de aglutinacin con la ayuda
de una lmpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado.
Si no observa aglutinacin o sea dan negativos, realice 3-4 lavados con solucin salina 0.85% ; decantando
en el ltimo lavado toda la solucin salina.
Adicione a cada tubo una gota de suero antiglobulina de coombs.
Mezclar cada tubo, y centrifugue por 5 segundos.
Resuspenda suavemente el botn de clulas y observe la presencia o ausencia de aglutinacin con la ayuda
de una lmpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado.
Si el resultado de los tubos despus de la fase de coombs es negativo, debe proseguir a la realizacin del
contrl de coombs, adicionando a cada tubo una gota de clulas sensibilizadas. Centrifugar 5 segundos y
leer por aglutinacin.
Todos los tubos deben aglutinar 2+ , el no observar aglutinacin en este paso invalida la prueba, ya que
sugiere un mal lavado de las clulas o la inactivacin del reactivo.

INTERPRETACIN.

La ausencia de aglutinacin de los hemates por el suero del donante o paciente al adicionar el Suero Antiglobulina
Humana Coombs indica que estos no fueron sensibilizados In Vitro con anticuerpos no aglutinantes (IgG) y/o con
fracciones del complemento C3d y se informa como Prueba de Coombs Indirecta Cualitativa Negativa
La aglutinacin de los hemates por el suero del donante o paciente al adicionar el Suero Antiglobulina Humana
Coombs indica que estos fueron sensibilizados In Vitro con anticuerpos no aglutinantes (IgG) y/o con fracciones
del complemento C3d y se informa como Prueba de Coombs Indirecta Cualitativa Positiva
Si la prueba de antiglobulina indirecta o coombs indirecto cualitativo da positivo se debe realizar el coombs
indirecto cuantitativo.
PROCEDIMIENTO COOMBS INDIRECTO CUANTITATIVO
La cuantificacin del coombs indirecto es importante para saber los ttulos en que estn los anticuerpos presentes y
el Score que es la interpretacin de las cruces de las diluciones positivas en la prueba cuantitativa: para la parte
medica una titulo de 64 tal vez no es tan peligroso pero si lo puede ser un un Score de 32.
Resultado
4+
3+
2+
1+
W

Score
12
10
8
5
2

Realizar diluciones seriadas del suero del paciente (Ac IgG Libres); con solucin salina 0.85% de acuerdo
al grado de aglutinacin.
Marcar 11 tubos; desde 1/1 hasta 1/1024.
Al tubo 1/1 y adicionar 100 lambdas de suero del paciente.
A partir del tubo hasta el ultimo tubo adicionar 100 lambdas de solucin salina 0.85%.
Mezclar el tubo , sacar 100 lamdas y adicionarla al tubo ; luego mezclar el tubo y sacar 100 lambdas
de la dilucin y adicionarla al tubo 1/8 y as sucesivamente .
Agregar a todos los tubos 100 lambdas de clulas reactivas O positivas, desde el tubo 1/1 hasta 1/512.
Centrifugar cada tubo 5 segundos y leer por aglutinacin. En caso de dar positivos anotar el grado de
aglutinacin de cada dilucin positiva. Esto constituye la fase salina de la prueba y detecta la presencia de
anticuerpos tipo IgM Acs fros.
Si todos los tubos son negativos adicionar 1 gota del potencializador (albmina, Lo-ion, Liss etc) incubar a
37oC el tiempo estipulado dependiendo del potencializador.
Mezclar, centrifugar 5 segundos cada tubo y leer. En caso de dar positivos anotar el grado de aglutinacin
de cada dilucin positiva. Esta constituye la fase proteica y detecta anticuerpos tipo IgG
Si todos los tubos son negativos realizar 3-4 lavados a cada tubo con solucin salina, despus del ltimo
lavado decantar toda la solucin salina.
Adicionar a cada tubo 1 gota de suero antiglobulina de coombs.
Mezclar, centrifugar 5 segundos cada tubo y leer. En caso de dar positivos anotar el grado de aglutinacin
de cada dilucin positiva. Esto constituye la fase de coombs de la prueba y detecta la presencia de
anticuerpos especiales.
Realizar el contrl de coombs a los tubos negativos adicionando 1 gota de clulas sensy
Centrifugar y leer. Deben aglutinar.
INTERPRETACIN.

Informar positivos hasta la mxima dilucin donde exista aglutinacin. Ejemplo si el Coombs indirecto positivo 32
Dils se debe informar el Score teniendo en cuenta los valores a que corresponde cada grado de aglutinacin as:
Prueba de Coombs Indirecta Cuantitativa Positiva 32 Dils, Score: 55.
Score con valores superiores a 32 se
consideran de mal pronstico.
APLICACIONES:
Deteccin e identificacin de anticuerpos anti-eritrocitarios en los sueros.
Determinacin de antgenos eritrocitarios ya que muchos antgenos precisan antisueros especficos seguidos
de la prueba de antiglobulinas.
Determinacin de incompatibilidad.
Estudios especiales para definir anticuerpos contra leucocitos y plaquetas.
En anemias hemolticas de origen inmediato, con el fin de conocer la especificidad de los Ac unidos al GR.
Pruebas cruzadas en transfusiones.
Anticuerpos incompletos anti- Brucella, se usa suspensin de Brucella como antigeno.
Falsos positivos:
Contaminacin bacteriana de muestras de sangre, reactivos y material de vidrio.
Hemates sensibilizados In Vivo. Se debe realizar elusin de los anticuerpos fijados a las clulas
Contaminacin de la solucin salina fisiolgica con slice coloidal.
Por aglutinacin antes de aadir el suero de coombs debido a: Presencia de clulas poliaglutinables,
Incubacin prolongada con clulas tratadas enzimticamente. Presencia de anticuerpos inesperados en el
suero de coombs.
Exceso de centrifugacin
Coagulo de fibrina en la suspensin celular.
Falsos negativos:
Contaminacin con protenas sericas.
Destruccin de anticuerpos por lavado excesivo.
No adicionar el suero antiglobulina.
Centrifugacin inadecuada o mal empleo de los reactivos.
Lavados deficientes, no se eliminan las protenas y neutralizan el suero de coombs.
COOMBS INDIRECTO: RASTREO DE ANTICUERPOS IREREGULARES
En el suero de los donantes y receptores se debe estudiar la presencia de anticuerpos irregulares de tipo IgG e IgM
mediante el uso de Glbulos Rojos que poseen antgenos conocidos y que son distribuidos comercialmente como
panel de clulas I y II ( clulas pantalla), cada una de ellas con una gran variedad de antigenos. Estas clulas son
preparadas a partir de sangre donada por personas de grupo sanguneo O. Una vez determinada la presencia de los
antgenos D,E,C,k.Ketc, las clulas son preservadas con agentes que retardan la hemlisis y mantienen el poder
antigenico durante el tiempo de almacenamiento.
El objetivo de realizar la deteccin de anticuerpos inesperados o irregulares en los donantes es prevenir la
transferencia pasiva de anticuerpos al receptor, disminuyendo el riesgo de reacciones post-transfusionales.
Por otro lado, cuando se realiza el rastreo o investigacin de anticuerpos inesperados a los donantes y se obtienen
resultados negativos, se acortan en tiempo las pruebas cruzadas, dado que se obvia la realizacin de la prueba
cruzada menor.
Para la determinacin de anticuerpos irregulares se realiza el mtodo de coombs indirecto como se describi
anteriormente utilizando los medios de reaccin: Salino. Albumina o proteico y Antiglobulina o Suero de Coombs.

Cuando se detecta un anticuerpo irregular se debe identificar o determinar la especificidad del anticuerpo
utilizando un panel de clulas o de glbulo rojos Panoscreen cuya composicin antignica es conocida, se
consiguen comercialmente y constan de 8 a 16 viales separados en los que vienen clulas de un donante en
particular cuya composicin antignica es conocida, su presencia es similar a las clulas pantalla I y II; para su
deteccin se utilizan cuatro medios de reaccin: Salino. Albumina, Enzimas y Antiglobulina o Suero de Coombs.
El panel es preparado de tal forma que existe en l suficientes clulas positivas y negativas para cada antgeno en
medicina transfusional.
En general los antgenos que se consideran son:
Del sistema Rh los antgenos. D,C,E,e,c,v,f,cw
Del sistema Kell los antgenos K,k,Kpa,Kpb,Jsa,Jsb.
Del sistema Duffy los antgenos Fya y Fyb
Del sistema Kidd los antgenos Jka y Jkb
Del sistema Lewis los antgenos Lea y Leb
Del sistema P los antgenos PI
Del sistema MN los antgenos M,N,S,s
Del sistema Lutheran los antgenos Lua y Lub
Del sistema Xg los antgenos Xga
La importancia de identificar el anticuerpo hallado en el suero de un individuo radica en que si se trata de un
receptor de sangre, conocer la identidad del anticuerpo que posee permite seleccionar sangre negativa para el
antgeno brindndole mayor seguridad a la transfusin.
El rastreo de anticuerpos nos gua sobre la presencia en el suero de aloanticuerpos o de autoanticuerpos o una
combinacin de ambos. Adems nos permite evidenciar:
La fase en que ocurre la reaccin de aglutinacin y /o hemlisis.
Si la reaccin de aglutinacin varia de una fase a otra.
Si el autocontrol es positivo o negativo.
Las caractersticas de los paneles de clulas son:
Suspendidas en soluciones preservativas y nutrientes.
Fecha de vencimiento 35 das.
Conservacin 1-10oC
Contrl de apariencia antes de su uso.
Loa Ag P1, Lea , fy a se deterioran durante el almacenamiento.
La investigacin de anticuerpos irregulares se debe realizar en:
Donantes de sangre.
Candidatos a recibir transfusiones.
Mujeres embarazadas.
Reacciones hemolticas transfusionales.
Anemia hemoltica autoinmune.
Aclarar discrepancias sericas en ABO.
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA CRUZADA
OBJETIVO
Llevar al estudiante de microbiologa a determinar la compatibilidad serolgica entre la sangre del paciente o
receptor y del donante , al ejecutar el procedimiento , analizar el fundamento e interpretar los resultados de la
pruebas cruzadas mayor y menor.

DEFINICIN:
Una vez se han seleccionando unidades de sangre de donantes de los tipos ABO y Rh adecuados para el receptor,
se hacen pruebas para determinar la compatibilidad serolgica entre la sangre del paciente y la del donante; a estas
pruebas se les denomina Pruebas Cruzadas; y fueron introducidas por Hektoen en 1907 para detectar
incompatibilidades ABO.
Las pruebas cruzadas son el estadio final en el que los en el que los hemates del donante y el suero del paciente se
prueban directamente en la prueba en tubo en unas condiciones que permitan que los antigenos y los anticuerpos
tengan todas las oportunidades razonables de interaccin y de producir un resultado demostrable; Los resultados
positivos, es decir, la aglutinacin o hemlisis de los hemates probados, indican incompatibilidad, mientras que los
resultados negativos indican compatibilidad.
Por lo tanto, las pruebas cruzadas tienen como propsito garantizar la compatibilidad serolgica entre la muestra
de sangre del receptor y la o las unidades de sangre o componentes que se le pretendan transfundir. Al ser el
objetivo de estas pruebas prevenir la transfusin de sangre incompatible ,las pruebas cruzadas deben garantizar:
La compatibilidad ABO y Rh entre el receptor y la unidad que se pretende transfundir.
Que en el suero del receptor no existan anticuerpos contra los antigenos eritrocitarios del donante.
Que en el plasma de la unidad de sangre no existan anticuerpos contra antgenos eritrocitarios del receptor.
Las pruebas cruzadas son un estadio final esencial antes de la transfusin por:
La posibilidad de detectar un error en la determinacin de grupos sanguneos del donante y receptor.
La posibilidad de que no se hallan detectado anticuerpos inesperados o irregulares en las pruebas
preliminares.
Las pruebas cruzadas han sido divididas en dos categoras:
La prueba cruzada mayor: Es la mas importante y tiene como propsito determinar que en el suero del
receptor no existan anticuerpos de importancia clnica contra los antgenos eritrocitarios del donante.
La prueba cruzada menor: Es la que pretende determinar que en el suero o plasma del donante (Unidad a
transfundir) no existan anticuerpos contra los hemates del receptor. Esta puede dejarse de realizar siempre
y cuando el banco de sangre realice deteccin o rastreo de anticuerpos irregulares a todos sus donantes.
METODOS
La ejecucin de las pruebas cruzadas requiere de la realizacin de unos procedimientos previos, entre los cuales se
cuentan:
La clasificacin ABO y RH del receptor y donante.
Rastreo de anticuerpos inesperados a los donantes.
La determinacin de la prueba cruzadas puede hacerse por los mtodos en tubo y consta de tres fases:
Fase salina: Pone en evidencia los anticuerpos contra los antgenos del sistema ABO.
Fase proteica: Pone en evidencia anticuerpos tipo IgG.
Fase de coombs: Pone en evidencia los anticuerpos incompletos e irregulares como el Kidd, Duffy, Kell etc.
FUNDAMENTO
Los anticuerpos irregulares presentes en el suero del receptor o donante se detectan, por combinacin de tcnicas,
ponindolas a reaccionar in vitro frente a determinantes antignicos presentes en los glbulos rojos del dador o del
receptor, utilizando varias fases o medios con diferentes temperaturas de incubacin.
MUESTRA:
La muestra del paciente o receptor debe ser:
Muestra anticoagulada con Edta o clulas la cual servir para rechequear los grupos sanguneos ABO y Rh
y para el autocontrol.
Muestra de suero (preferiblemente) o plasma que ser utilizada para la prueba cruzada mayor y el rastreo de
anticuerpos inesperados.
De la unidad de sangre se toma la muestra cortando un segmento del tubo piloto de que est provista la bolsa
plstica de recoleccin de sangre.
MATERIALES Y REACTIVOS

Pipetas pasteur o de transferencia.


Lmpara.
Solucin salina fisiolgica 0.9%
Tubos de 10 o 12 x 75
Gradillas
Centrfuga serolgica.
Bao Mara o bloque seco a 37 oC
Potenciadores: albmina o medios de bajo poder inico.
Suero de antiglobulina humana o coombs
Clulas reactivas O positivas.
Clulas sensibilizadas con IgG (Clulas contrl de coombs) Controlan la actividad del suero antiglobulina y la
calidad del lavado de las clulas.
Clulas pantalla I y II
PROCEDIMIENTO
Centrifugar las muestra del donante y receptor x 10 min. a 3000 rpm, separar de la muestra en estudio, el
suero o plasma de los glbulos rojos. El suero o plasma del donante y receptor deben colocarse en otro
tubo debidamente identificado.
Colocar en un tubo aparte, identificado, una alcuota de los glbulos rojos en estudio tanto del donante
como del receptor y lavarlos 3-4 veces con solucin salina fisiolgica para eliminar protenas anormales y
anticuerpos indeseables y complemento.
Despus del ltimo lavado eliminar el sobrenadante y preparar una suspensin celular al 5% con SSF.
Marcar cinco tubos as,
Prueba
mayor
Suero paciente o 2 gotas
receptor
Suero del
donante
Clulas lavadas 1 gota
bolsa o donante
Celulas R1
Celulas R2
Celulas lavadas
paciente o
receptor

CI
2 gotas

C II

Prueba
menor

2gotas

Ac
2 gotas

2 gotas

1 gota
1 gota
1 gota

1 gota

Rastreo de anticuerpos del receptor

Mezclar cada tubo, centrifugar por 15 segundos


Resuspenda suavemente el botn de clulas y observe la presencia o ausencia de aglutinacin o hemlisis
con la ayuda de una lmpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado.
Si no observa aglutinacin en los tubos, contine con la fase proteica.
A cada tubo adicione una gota del potenciador.
Incube por 15 o 30 minutos dependiendo del potencializador utilizado.
Centrifugar por 15 segundos

Resuspenda suavemente el botn de clulas y observe la presencia o ausencia de aglutinacin o hemlisis


con la ayuda de una lmpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado.
Si no observa aglutinacin en los tubos, lavarlos de 3 4 veces con solucin salina, decantar bien todo el
sobrenadante en el ltimo lavado y contine con la fase de coombs.
Agregar una gota de suero antihumano de coombs.
Centrifugar por 15 segundos
Resuspenda suavemente el botn de clulas y observe la presencia o ausencia de aglutinacin o hemlisis
con la ayuda de una lmpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado.
Comprobar los resultados aadiendo a cada tubo una gota de clulas sensibilizadas. Deben dar como
mnimo 2+ de aglutinacin.

INTERPRETACIN.
La aglutinacin o hemlisis indica incompatibilidad debida a anticuerpos irregulares.
No aglutinacin o no hemlisis Indica compatibilidad.
BIBLIOGRAFIA
MINISTERIO DE SALUD. Manual de Normas Tcnicas y Procedimientos de Bancos de Sangre. 1 Edicin.
Editorial Carrera Sptima Ltda. Santa Fe de Bogot, 1994.
DUEAS RIVERA, Vctor Hugo. El Banco de Sangre. Editorial Universidad del Valle. Santiago de Cali,1998.
CORTES, Armando, Administracin, Tcnicas y Procedimientos en los Servicios de Transfusin. Editorial
Universidad del Valle. Santiago de Cali, 1998.

TALLER
Realice un esquema de cada una de las tcnicas descritas anteriormente.
Explique porqu el suero de coombs detecta GR sensibilizados tanto in vivo como in vitro.
Que diferencia encuentra entre el fundamento del Coombs Directo e Indirecto.
En que situaciones est indicado realizar la prueba de Coombs Directo e Indirecto.
Cual es la finalidad de realizar el contrl de coombs al final de la prueba.
Porqu considera que en estas tcnicas el lavado de las clulas es crtico.
Con que finalidad se realiza la determinacin de coombs directo fraccionado.
A un paciente con anemia hemoltica autoinmune, se le realiza la prueba de coombs directa, resultando
positiva 4+, al realizar el coombs directo fraccionado dio aglutinacin en los tubos marcados IgG y C3d,
interprete la prueba y sugiera que otra determinacin se le debe realizar al paciente.
Que casos clnicos estn asociados a resultados positivos y negativos de coombs directo.
En la prueba de Coombs Indirecto, explique que se pretende con la fase de sensibilizacin y explique si
habr alguna relacin entre la fase de la tcnica en que se detecta el anticuerpo y el tipo de anticuerpo.
Teniendo en cuenta el objetivo de la prueba de coombs indirecto, que eventos pueden estar involucrados
con esta prueba y de un ejemplo relacionado con el evento nmero 2.
Con que finalidad se debe realizar la cuantificacin del coombs indirecto y como se interpreta el escore.
A un paciente con anemia hemoltica autoinmune se le cuantifica el anticuerpo presente encontrndose los
siguientes resultados: Dil 1/1: 4+, : 4+, : 3+, 1/8:2+, 1/16:1+, 1/32: w. Informe el resultado del coombs
indirecto.
En que casos est indicada la determinacin del coombs indirecto.
Con que finalidad se realiza la tcnica de rastreo de anticuerpos y si esta da positiva que pruebas sugiere
deben realizrsele al paciente o donante.
Que caractersticas deben tener las clulas pantalla I y II y las del panel de clulas.
En que casos est justificado investigar la presencia de anticuerpos irregulares o rastreo de anticuerpos.

Con que finalidad se realizan las pruebas cruzadas.


Una prueba cruzada negativa que le garantiza al receptor o paciente.
Que determina la prueba cruzada mayor y menor.
Que tipo de anticuerpos se evidencian en cada fase de la tcnica de pruebas cruzadas.
Al realizar las pruebas cruzadas se obtuvo los siguientes resultados. Interprete las dos situaciones expuestas
a continuacin y diga si hay o no compatibilidad.
1. PCM: 4+, CI. 0+, CII: 0+, PCm: 0+, Ac: 0+
2. PCM: 0+, CI:4+, CII:4+, PCm: 0+, Ac. 4+.
PCM: prueba cruzada mayor.
PCm: prueba cruzada menor.