Extraccin ADN bacteriano

Toda la informacin gentica esencial para la vida de la bacteria est contenida en una nica
molcula de cido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena y circular, cerrado por enlace
covalente. Dicha molcula se denomina cromosoma bacteriano.
Las bacterias Gram (-) no necesita el tratamiento con lisozima (Enzima bactericida que impide
infecciones y que est presente en numerosas sustancias segregadas por los seres vivos, como las
lgrimas, la saliva o la leche.) que si necesitan las bacterias Gram (+) que son ms difciles de
lisar y necesitan para ellos enzimas lticos.
Lisis celular
1. Aadir 1.5 ml de un cultivo overnight a un tubo de 1.5 ml.
2. Centrifugar a 14.000 x g durante 30 segundos. Eliminar el sobrenadante.
3. Aadir 600 l de Solucin de Lisis al pellet (denominacin genrica, utilizada para referirse a
pequeas porciones de material aglomerado o comprimido) celular y pipetear para resuspender y
lisar las clulas.
4. Incubar las muestras a 80C durante 5-10 minutos. Enfriar a temperatura ambiente.
Precipitacin del ADN
1. Pasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de 1.5 ml que contenga 600l de
isopropanol. Mezclar por inversin varias veces.
2. Centrifugar a 14.000 x g durante 3 minutos.
3. Eliminar el sobrenadante. Aadir 600 l de etanol 70% e invertir varias veces para lavar el
pellet de ADN.
4. Centrifugar a 14.000 x g durante 2 minutos. Cuidadosamente eliminar todo el etanol. Vigilar
no perder el pellet de ADN
5. Invertir el tubo y dejar secar en papel absorbente durante 15 minutos. Hidratacin del ADN 1.
Aadir 500-750 l de Solucin de Hidratacin del ADN. Resuspender mediante micropipeta el
pellet blanco. La incubacin a 55C con peridicas agitaciones con vortex ayudar a la
disolucin del ADN.

(BIOTED, S.f)

Extraccin ADN plasmdico

Los plsmidos son herramientas muy tiles en ingeniera gentica para la transformacin gnica
y la manipulacin gentica de procariotas y eucariotas. Los plsmidos empleados en ingeniera
gentica se llaman vectores. Son muy tiles para sintetizar en grandes cantidades protenas de
inters, como la insulina o los antibiticos, mediante un procedimiento conocido como
transformacin.
Extraccin del ADN plasmdico utilizando un mtodo denominado de lisis alcalina y
tratamiento con RNAsa que permiten la obtencin de un lisado celular claro con mnima
cantidad de ADN y ARN contaminante. En presencia de sales caotrpicas, el ADN plasmdico se
une a las membranas de slica de unas columnas presentes en el kit. Los contaminantes son
eliminados con un tampn de lavado y el ADN plasmdico es eluido con un tampn de elucin.
(BIOTED, S.f)
La lisis alcalina es el mtodo mayormente utilizado para el aislamiento de plsmidos circulares
proveniente de clulas bacterianas. Existen diversos protocolos para realizar lisis alcalina pero
todos se rigen por los siguientes pasos bsicos.
a. Remover las clulas del medio de cultivo en caldo mediante centrifugacin.
b. Descartar el sobrenadante para reducir contaminacin mediante fragmentos de la pared celular
del husped.
c. Resuspender las clulas en un amortiguador que contenga Tris, EDTA y glucosa.
d. Lisar las clulas con NaOH y SDS
e. Unin de las hebras de DNA y remocin de contaminacin mediante el acetato de potasio.
f. Precipitacin del DNA de plsmido mediante alcohol (etanol o isopropanol) y una sal (Acetato
de amonio, Cloruro de litio, Cloruro de sodio o Acetato de sodio).
g. Enjuague del material gentico con EtOH al 70% h. Resuspender el material gentico.
EtOH etanol.
(UNIVERSIDAD DE PUERTO RICO , S.f)

Cuantificacin de DNA utilizando un espectrofotmetro La concentracin de cidos nucleicos

puede ser determinada utilizando la espectrofotometra ya que estos absorben luz ultravioleta a
un intervalo de 260nm. La concentracin de cidos nucleicos es determinada con la siguiente
Formula: 9 ug/ml del cido nucleico = (Abs 260nm)( factor de dilucin recproco)(factor de
conversin de concentracin)
(QIAGEN, S.f)

Bibliografa
BIOTED. (S.f). EXTRACCIN ADN BACTERIANO. Obtenido de
http://bioted.es/protocolos/EXTRACCION-ADN-BACTERIANO.pdf
BIOTED. (S.f). Extraccin ADN plamdico . Obtenido de
http://bioted.es/protocolos/EXTRACCION-ADN-PLASMIDICO.pdf
Isabel Cristina Cadavid Snchez*, D. A. (Diciembre de 2013). Comparacin de dos
mtodos de extraccin de ADN a partir de plantas del gnero Solanum,
subgnero Leptostemonum. Obtenido de
http://www.scielo.org.co/pdf/biote/v15n2/v15n2a21.pdf
QIAGEN. (S.f). DNeasy Plant Mini Kit. Obtenido de
https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dneasy-plant-minikit/#orderinginformation
UNIVERSIDAD DE PUERTO RICO . (S.f). Laboratorio de genetica de bacterias.
Obtenido de http://www.uprm.edu/biology/profs/rios/labman.pdf
Yaxsier de Armas, e. a. (2011). Comparacin de tres mtodos de extraccin de ADN
de tejidos embebidos en parafina. Obtenido de
http://web.a.ebscohost.com.recursosbiblioteca.eia.edu.co/ehost/pdfviewer/pdf
viewer?vid=2&sid=6996f7ba-729b-4dd0-89cecd07c7bdee03%40sessionmgr4007&hid=4114

Extraccin de protenas
Mtodos en estado slido.
Moler en un mortero: Las clulas son rotas por medio de una molienda con abrasivos
como la arena o almina.
Molino con perlas: Las clulas son trituradas con esferas de vidrio o acero.
Shock osmtico: Ruptura osmtica de la membrana. La clulas se hacen estallar al
someterlas a un medio hipotnico, lo cual hace que la membrana no resista la presin
osmtica. Puede ocasionar el dao a las membranas de algunas organelas. No se
recomienda porque en algunas organelas se lesiona la membrana. Es utilizado para el
aislamiento: Mitocondria y Cromosomas Mitticos.
METODOS FISICOS
Descompresin de gas: Ruptura esplnica de las clulas por la generacin de burbujas al
disminuir la presin (ley de Henry).
Cavitacin hidrodinmica: Consiste en la formacin de micro burbujas de vapor
producidas de forma mecnica en un medio lquido por variaciones en la presin, lo cual
induce al rompimiento de la pared celular.
Desecacin: Puede ser secado por aire forzado, secado al vaco y secado por solventes y
consiste en la deshidratacin celular, provocando un rompimiento de las mismas.
pH extremos: Transiciones en la escala de pH, bsico y cido. Algunas clulas no son
resistentes a estas variaciones.
Detergentes: Permeabilizacin de clulas por solubilizacin de protenas de membrana,
debido a apertura de poros. Ejemplo: Triton X-100, SDS, Tween, Spam.
Mtodos qumicos.
Solventes orgnicos: Disuelven la pared celular fundamentalmente por la disolucin de
lpidos asociados a membranas. Ejemplo: Tolueno, acetona.
Antibiticos: Algunos se utilizan por sus propiedades en la sntesis de la pared celular,
como algunas penicilinas.

 Agentes quelantes: Algunos como el EDTA atrapan cationes divalentes (Ca+2) que
debilita la membrana celular.
Agentes caotrpicos: Urea o sales de guanidina favorecen la disolucin de protenas y
minerales de la pared celular de algunas bacterias ocasionando su ruptura. Otro agente
caotrpico utilizado es el isotiocianato de guanidinio.
Adicin de enzimas: Lisozima + EDTA; esta combinacin digiere las paredes celulares
por ruptura de los enlaces (14) glicosdicos entre el cido N-acetilmurmico (NAM) y
la N-acetilglucosamina (NAG) del mucopptido. Otro ejemplo es: la proteinasa K junto
con SDS.

Mtodos biolgicos
Autolisis: Es un proceso biolgico por el cual una clula se autodestruye, en vegetales la
absorcin de agua en exceso puede causar el rompimiento de vacuolas; en animales la
produccin de la enzima autolisasa puede ocasionar la hidrlisis celular; en bacterias las
enzimas autolticas de la pared bacteriana (autolisinas) lleva a la lisis celular.
Lisis inducible: Exponer las clulas a soluciones concentradas con sales y/o tratamiento
radioactivo puede inducir la lisis celular.
Inhibidores de pared celular: Algunas sustancias alteran la permeabilidad de la
membrana celular, como: polienos, polimixinas e imidazoles.
Lisis celular
Vlido para clulas sin pared celular como las clulas de tejidos animales, pero no es suficiente
para clulas vegetales o bacterias. Consiste en suspender las clulas en una solucin hipotnica
(ms diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmtica el agua difunde al interior
de la clula, causando su hinchamiento y rotura.

Mtodos fsicos para la dirupcin de muestras:

Homogenizacin mecnica o Licuadora: La muestra se tritura mediante cuchillas
rotatorias. Se utiliza para gran cantidad de tejido.
Homogenizador Dounce: Tubo de vidrio con pistn ajustado maja las clulas por accin
de corte. Se utiliza en clulas tisulares; til para protocolos de enriquecimiento de
protenas mitocondriales o nucleares.
Homogenizador snica o de ultrasonidos: Ondas de sonido emitidas por una sonda para
romper las membranas celulares. Se utiliza en clulas, tejidos, bacterias.
Pulverizacin en Nitrgeno lquido: La muestra se pulveriza utilizando un mortero y un
almirez refrigerados. Se utiliza en tejido animal o vegetal.
Molino con perlas de vidrio: La ruptura celular se produce por agitacin de las perlas de
vidrio. Se utiliza en levaduras.
Soluciones Tampn y detergentes, segn el tipo de protena de inters y la localizacin
subcelular.
Protena nativa (no desnaturalizada): Detergente suave no inico. Se recomienda
evitar detergentes desnaturalizantes (SDS, Deoxicolatos).
Protena localizada en citoplasma (soluble): Tris-HCl, puede combinarse con mtodos
mecnicos, tales como el homogenizador Dounce.
Protena localizada en citoplasma (unida a citoesqueleto): Tris-Triton. Los
detergentes Triton son suaves y no inicos.
Protena localizada en membrana mitocondrial o nuclear: NP-40, RIPA (mltiples
detergentes), Triton X-100; para antgenos con niveles bajos de expresin pueden ser
necesarios procesos de enriquecimiento.
Para lisado total de clulas: NP-40, RIPA, Triton X-100.

BIBLIOGRAFIA.

Advansta Corporation. (2011). Anlisis de Protenas. Obtenido de

http://www.ecogen.com/upfiles/A56009.pdf

Bioquimica. (s.f.). uhu. Obtenido de http://www.uhu.es/08007/documentos%20de

%20texto/apuntes/2005/pdf/Tema_06_purificacion_proteinas.pdf

UNAD. (S.f). Leccin 20. Extraccin, purificacin y caracterizacin de proteinas.

Obtenido de Universidad Nacional Abierta y a Distancia.:
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/211619/Contenido_en_linea_eXe/leccin_20_extracci
n_purificacin_y_caracterizacin_de_proteinas.html

Universidad Nacional de Quilmes. (Marzo de 2010). TP2: Extraccin y cuantificacin de

protenas . Obtenido de https://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp2.pdf

Pontificia Universidad javeriana. (S.f). Tcnicas de fragmentacin y separacin de los

componentes de las clulas. Obtenido de
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/fraccionamie
nto.htm