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Tipos de HPLC
Cromatografa de fase normal
La cromatografa de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el primer
tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se caracteriza por separar
los compuestos en base a su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase estacionaria polar y
una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de inters es bastante polar. El
compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de adsorcin
aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin entre el
QUIMICA ANALITICA II
compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil) aumenta
el tiempo de retencin.
La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del compuesto de
inters, sino tambin en factores estericos de forma que los ismeros estructurales a
menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilizacin de disolventes ms polares
en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los compuestos mientras que los
disolventes ms hidrofbicos tienden a aumentar el tiempo de retencin.
La NP-HPLC cay en desuso a los aos setenta con el desarrollo del HPLC de fase
reversa o Reversed-phase HPLC debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos de
retencin puesto que los disolventes prticos cambiaban el estado de hidratacin de la
silica o almina de la cromatografa.
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Parmetros
Dimetro interno
El dimetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crtico que determina la
cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y tambin influye en su
sensibilidad. Las columnas de dimetro interno ms grande (>10 mm) se utilizan
normalmente en la purificacin de compuestos para su utilizacin posterior. En cambio,
las columnas de dimetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el anlisis cuantitativo
de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimizacin del
consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas se suelen denominar columnas
de rango analtico y normalmente estn asociadas a un detector UV-VIS. Aparte, existen
otros tipos de columnas, como las de tipo capilar, con un dimetro inferior a 0.3 mm,
utilizadas principalmente en espectrometra de masas.
Tamao de poro
Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie. Los
poros pequeos proporcionan una mayor superficie mientras que los poros de mayor
medida proporcionan una cintica mejor, especialmente para los compuestos de tamao
ms grande; por ejemplo, una protena que sea ligeramente ms pequea que el tamao
de los poros puede entrar, pero difcilmente saldr con facilidad.
Presin de la bomba
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Dionex Corporation
Eksigent Technologies
Gilson, Inc.
Micro-Tech Scientific
PerkinElmer, Inc.
Proxeon Biosystems A S/
Varian, Inc.
Waters Corporation
Knauer
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JASCO
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