Miguel Ojeda Milln 01099203

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Aldo Betancourt Snchez 01324454
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Extraccin, purificacin y caracterizacin de una -amilasa
termoestable y alcalina tolerante de Bacillus cereus
La -amilasa termoestable y alcalina resistente producida por la bacteria
Bacillus cereus fue aislada de agua del puerto de Cuddalore. La bacteria crece
y produce -amilasa a 35C, pH 7.5 y 1% de concentracin del sustrato. LA
actividad mxima de la -amilasa fue registrada a 65C, pH 8 y 89% de su
actividad se mantuvo aun a pH 11. Agregando cloruro de manganeso la
actividad de la -amilasa incrementa 4%, sin embargo es inhibida por EDTA. El
peso molecular de la -amilasa purificada es de 42 kDa.

Proceso de extraccin de -amilasa a partir de Bacillus cereus

El cultivo celular es centrifugado a 6,000 rpm por 30 minutos y se
utiliza el sobrenadante

Centrifugacio
n

Precipitacion con sulfato de amonio al 80%

Precipitacion

Se realiza una dialisis con un bufer de fosfato de potasio 20 mM

pH 7 por 24 horas a 4C
Se realiza una cromatografa de intercambio ionico con la resina
DEAE-Sephandex, bufer fosfatos pH 7
Se realiza la elucion incrementando la molaridad del fosfato y
disminuyendo el pH
Se recolecta la enzima eluida y se realizan ensayos de actividad
enzimatica

Dialisis
Cromatograf
a
Elucion
Recoleccion

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Obtencin de alfa-amilasa a partir de Chenopodium quinona

La Chenopodium quinoa o como comn mente se conoce quinua es
considerado un pseudocereal proveniente de Sudamrica. Cuando el grano de
la quinua comienza a germinar los carbohidratos son degradados por la
presencia de alfa-amilasa, lo que hace que en este punto de su desarrollo
represente una fuente importante de la enzima previamente mencionada. El
siguiente proceso de extraccin fue presentado por Bedn et al en su trabajo
Purifcacin Parcial y Caracterizacin de Alfa Amilasa de granos germinados de
Chenopodium quinoa (Quinua), publicado en octubre del 2013.

Proceso de extraccin de alfa-amilasa con grado de purifcacin de 5.6 (Gmez et

al, 2013).
Desinfeccin de semillas

NaOCl 1% y agua

Germinacin de las semillas

placas petri con estreptomicina y gentamicina, 36 horas, camara osura, T 22 C y hmedad relativa de 83%

Homogeneizado

Con bufer fosfato 20mM+6.7 mM NaCl(extract crudo)

Centrifugado

2000g por 20 min (se descarta el sobrenadante)

Centrifugado

4500 g por 5 min (recuperando el sobre nadante)

Filtrado

se descarta el sobrenadante

Precipitacin

saturacin al 45% de sulfato de amonio por 15 horas @ 4C

Dessalinizacin y concentracin

tubos con fltros Amicon Ultra 10K-NMWL de 10 000.

Precipitado del sobrenadante

Con sulfato de amonio al 60% por 15 horas

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Estudios en la extraccin y caracterizacin de -amilasa a partir del

pericarpio de Borassus indica.
El pericarpio fresco es recolectado de las frutas (B. indica) y
lavado abundantemente con agua destilada.

Se toman 5 gramos del pericarpio y suelo para hacer una

fna pasta utilizando 20 ml de bufer acetato de sodio fro a
0.025M con un pH de 5.5 y CaCl2 0.02 M como agente
estabilizante.

Los contenidos son centrifugados a 6,000 rpm durante 15

minutos a 40C.

El sobrenadante se diluye en razn 1:10 con bufer acetato

de sodio y usado como fuente de enzimas.

Se digiere almidn con la enzima extrada a 37C por 10, 20,

30 y 60 minutos en distintos tubos respetivamente.

Los productos de azcar obtenidos se identifcan en cada

marca tiempo especfco por cromatografa ascendiente en
papel con el fltro Whatman #1, en un sistema solvente de
n-butanol, piridina y agua en radios de 6:4:3 (v/v) a
temperatura ambiente.

Se desarrolla un cromatograma mediante la inmersin del

papel en reactivo de hidrxido nitrato/sodio de plata.

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Por ltimo los valores RF de los azcares se calculan y

comparan con los stndard.
Referencias
Srnivasa, R., Venkateswara, R., N, R. S., & Sambasiva, R. (2005, March). Studies
on the extraction and characterization of thermostable -amylase from pericarp
of Borassus indica [Electronic version]. African Journal of Biotechnology, 4(3),
289-291.
Gmez, M. B., Crdenas, O. N., Carpio, C. S., & Romn, A. G. (2013).
Purifcacin Parcial y Caracterizacin de Alfa Amilasa de granos germinados de
Chenopodium quinoa (Quinua). ECI Peru, 10 (1), 51-57.
N. Annamalai, e. a. (13 de Febrero de 2011). National Center for Biotechnology
Information. Obtenido de
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3209940/