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5, 771-780, 2004
Marcelo Ribani
Instituto de Tecnologia do Paran, Rua Prof. Algacir M. Mader, 3775, 81350-010 Curitiba - PR
Carla Beatriz Grespan Bottoli, Carol H. Collins e Isabel Cristina Sales Fontes Jardim*
Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13084-971 Campinas - SP
Lcio Flvio Costa Melo
Faculdade de Engenharia Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6066, 13081-971 Campinas - SP
Reviso
VALIDATION FOR CHROMATOGRAPHIC AND ELECTROPHORETIC METHODS. The validation of an analytical method
is fundamental to implementing a quality control system in any analytical laboratory. As the separation techniques, GC, HPLC
and CE, are often the principal tools used in such determinations, procedure validation is a necessity. The objective of this review
is to describe the main aspects of validation in chromatographic and electrophoretic analysis, showing, in a general way, the
similarities and differences between the guidelines established by the different Brazilian and international regulatory agencies.
Keywords: validation; legislation; separation methods.
INTRODUO
A necessidade de se mostrar a qualidade de medies qumicas,
atravs de sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade, est
sendo cada vez mais reconhecida e exigida. Dados analticos no
confiveis podem conduzir a decises desastrosas e a prejuzos financeiros irreparveis. Para garantir que um novo mtodo analtico
gere informaes confiveis e interpretveis sobre a amostra, ele deve
sofrer uma avaliao denominada validao. A validao de um mtodo um processo contnuo que comea no planejamento da estratgia analtica e continua ao longo de todo o seu desenvolvimento e
transferncia. Para registro de novos produtos, todos os rgos reguladores do Brasil e de outros pases exigem a validao de metodologia
analtica e, para isso, a maioria deles tem estabelecido documentos
oficiais que so diretrizes a serem adotadas no processo de validao1-15. Um processo de validao bem definido e documentado oferece s agncias reguladoras evidncias objetivas de que os mtodos
e os sistemas so adequados para o uso desejado.
As tcnicas de separao, tais como cromatografia gasosa (GC),
cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) e eletroforese capilar (CE), vm se destacando na qumica analtica pela capacidade de
realizarem anlises qualitativas e quantitativas em amostras
ambientais, farmacuticas, biolgicas e em alimentos. Neste contexto, esta reviso tem como objetivo comentar os principais aspectos
da validao em mtodos cromatogrficos e eletroforticos, mostrando as diferenas e similaridades entre as diretrizes estabelecidas
pelas diferentes agncias reguladoras internacionais e do Brasil.
CONCEITOS BSICOS DO PROCESSO DE VALIDAO
Vrios autores definem validao de mtodos e pode-se dizer
que os conceitos continuam evoluindo e esto constantemente sob
considerao pelas agncias reguladoras. Algumas definies podem
ser transcritas:
*e-mail: icsfj@iqm.unicamp.br
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Ribani et al.
metodologia oficial para uma determinada aplicao. Protocolos internacionalmente aceitos tm sido estabelecidos para a validao
completa, mais precisamente o Protocolo Harmonizado Internacional27 e o procedimento ISO (International Standard Organization)28.
Estes protocolos requerem um nmero mnimo de laboratrios e
materiais testes para serem includos no estudo interlaboratorial para
validao completa do mtodo analtico. No Brasil os estudos de
comparaes interlaboratoriais so coordenados pelo Instituto de
Pesquisas Tecnolgicas (IPT), atravs do Programa Brasileiro de
Metrologia em Qumica.
LEGISLAO
Existem razes legais, tcnicas e comerciais que justificam a
implantao da validao de mtodos analticos de separao, apesar de no haver uma norma estabelecida de mbito nacional ou internacional. Atualmente, para mostrar competncia tcnica, os laboratrios que executam as anlises devem submeter-se a um
credenciamento (accreditation) de um rgo vigente de mbito
nacional ou internacional.
No Brasil, h duas agncias credenciadoras para verificar a competncia de laboratrios de ensaios, a ANVISA (Agncia Nacional
de Vigilncia Sanitria) e o INMETRO (Instituto Nacional de
Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial). Estes rgos
disponibilizam guias para o procedimento de validao de mtodos
analticos, respectivamente, a Resoluo ANVISA RE no 899, de 29/
05/20034 e o documento INMETRO DOQ-CGCRE-008, de maro/
200311. Suas similaridades e diferenas podem ser melhor visualizadas
na Tabela 1.
importante esclarecer que resolues so documentos com
poder de lei, que devem ser obedecidas e guias so documentos que
sugerem uma linha a ser seguida e so, portanto, abertos para interpretao. Os guias so recomendaes e so intencionalmente vagos
para deixar aos analistas a flexibilidade de adapt-los de acordo com
o mtodo a ser usado29.
Os parmetros para validao de mtodos tm sido definidos em
diferentes grupos de trabalho de organizaes nacionais ou internacionais. Infelizmente algumas definies so diferentes entre as diversas organizaes. Uma tentativa para harmonizar estas diferenas
foi feita para aplicaes farmacuticas, atravs da ICH (International
Conference on Harmonization)2,3, na qual representantes das indstrias e agncias reguladoras dos EUA, Europa e Japo definiram
parmetros, requerimentos e, em alguns casos, tambm metodologias
para validao dos mtodos analticos.
Quim. Nova
ANVISA
Especificidade/Seletividade
Faixa de trabalho e Faixa linear de trabalho
Linearidade
Especificidade/Seletividade
Intervalos da curva de calibrao
Linearidade
Curva de Calibrao
Limite de Deteco (LD)
Limite de Quantificao (LQ)
Exatido
Preciso
Repetibilidade (preciso intra-corrida)
Preciso intermediria (preciso inter-corrida)
Reprodutibilidade (preciso inter-laboratorial)
Robustez
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Os parmetros analticos normalmente encontrados para validao de mtodos de separao so: seletividade; linearidade e faixa de
aplicao; preciso; exatido; limite de deteco; limite de
quantificao e robustez.
Estes termos so conhecidos como parmetros de desempenho
analtico22, caractersticas de desempenho10,11 e, algumas vezes, como
figuras analticas de mrito22.
Seletividade
A seletividade de um mtodo instrumental de separao a capacidade de avaliar, de forma inequvoca, as substncias em exame na
presena de componentes que podem interferir com a sua determinao em uma amostra complexa. A seletividade avalia o grau de interferncia de espcies como outro ingrediente ativo, excipientes, impurezas e produtos de degradao, bem como outros compostos de propriedades similares que possam estar, porventura, presentes. A seletividade
garante que o pico de resposta seja exclusivamente do composto de
interesse14,32. Se a seletividade no for assegurada, a linearidade, a exatido e a preciso estaro seriamente comprometidas.
O mesmo significado tem sido freqentemente utilizado para o
termo especificidade3,12,14,20,21. Esta situao gera confuso desnecessria e isto pode ser evitado utilizando somente o termo seletividade,
como sugerido pela IUPAC32. Um mtodo instrumental de separao que produz resposta para uma nica substncia de interesse, normalmente um dado elemento, pode ser chamado de especfico e um
mtodo que produz resposta para vrios compostos qumicos, com
uma caracterstica em comum, pode ser chamado de seletivo16,20.
Desde que h poucos mtodos cromatogrficos que respondem a
apenas uma substncia, o termo seletividade mais apropriado, como
sugerido pela IUPAC.
A seletividade o primeiro passo no desenvolvimento e validao de um mtodo instrumental de separao e deve ser reavaliada
continuamente durante a validao e subseqente uso do mtodo.
Algumas amostras podem sofrer degradao, gerando compostos que
no foram observados inicialmente, que podem coeluir com a substncia de interesse.
A seletividade pode ser obtida de vrias maneiras. A primeira
forma de se avaliar a seletividade comparando a matriz isenta da
substncia de interesse e a matriz adicionada com esta substncia
(padro), sendo que, nesse caso, nenhum interferente deve eluir no
tempo de reteno da substncia de interesse, que deve estar bem
separada dos demais compostos presentes na amostra1,3,12,22. Uma
segunda maneira atravs da avaliao com detectores modernos
(arranjo de diodos, espectrmetro de massas), que comparam o espectro do pico obtido na separao com o de um padro e utiliza-se
isto como uma indicao da presena do composto puro16,18,32. Estas
duas maneiras so as mais utilizadas. O mtodo de adio padro
tambm pode ser aplicado para os estudos de seletividade14,18, porm
este mtodo utilizado quando no possvel obter a matriz isenta
da substncia de interesse. Neste caso feita uma curva analtica
com adio da substncia de interesse na amostra e comparada com
uma curva analtica sem a presena da matriz. Comparam-se ento
as duas curvas analticas e caso elas sejam paralelas, pode-se dizer
que no h interferncia da matriz na determinao da substncia de
interesse, portanto o mtodo seletivo. Outro procedimento para
avaliar a seletividade atravs da coleta do composto de interesse e
realizao de nova anlise por outra tcnica cromatogrfica, ou com
mtodos e tcnicas que so especficos para a estrutura da substncia
de interesse como, por exemplo, espectrometria de massas, resso-
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Ribani et al.
Quim. Nova
de preciso e exatido22. A faixa de aplicao normalmente expressa nas mesmas unidades dos resultados obtidos pelo mtodo, e depende do uso em questo. Vrias recomendaes so encontradas na
literatura. Por exemplo, a ANVISA especifica um intervalo compreendido entre 80-120% da concentrao terica para frmacos e medicamentos e de at 120% do limite mximo especificado para determinao de impurezas4. Para resduos, o GARP (Associao Grupo
de Analistas de Resduos de Pesticidas)39 recomenda uma faixa de
concentrao com valores variando entre a metade e o quntuplo da
concentrao do limite de quantificao. A IUPAC especifica que os
pontos da curva analtica devem ser igualmente espaados sobre a
faixa de concentrao de interesse e que esta faixa compreenda 0
150% ou 50150% do valor esperado, dependendo de qual destas
duas opes for mais adequada10. Para produtos formulados, a ICH,
entre outros, recomenda uma variao de 20% do valor declarado
ou esperado3,7,12.
As diretrizes da ICH3 e da ANVISA4 especificam um mnimo de
cinco nveis de concentrao, juntamente com certos mnimos de
variao especificados. O GARP tambm sugere cinco concentraes que devem ser injetadas em ordem crescente de concentrao,
no mnimo trs vezes cada, com estimativa do desvio padro relativo
(RSD) entre as injees inferior a 5%. A IUPAC recomenda seis ou
mais nveis de concentrao10.
A quantificao do composto de interesse em validao pode ser
obtida atravs dos seguintes mtodos: padronizao externa; padronizao interna; superposio de matriz; adio padro.
Padronizao externa
O mtodo de padronizao externa compara a rea da substncia
a ser quantificada na amostra com as reas obtidas com solues de
concentraes conhecidas preparadas a partir de um padro. Preparam-se solues da substncia a ser quantificada em diversas con-
Padronizao interna
O mtodo de padronizao interna consiste na preparao das
solues padro de concentraes conhecidas da substncia de interesse, s quais se adiciona a mesma quantidade conhecida de um
composto chamado padro interno. Aps anlise dessas solues,
constri-se um grfico, relacionando a razo de reas (rea da substncia/rea do padro interno que tem concentrao constante) com
a concentrao (variada) da substncia. A amostra tambm analisada aps a adio da mesma quantidade conhecida do padro interno.
Atravs da razo de reas obtidas no cromatograma tem-se a concentrao da substncia na amostra. Idealmente, a substncia usada
como padro interno deve ser similar substncia a ser quantificada,
ter tempo de reteno prximo a esta substncia, no reagir com a
substncia ou outro componente da matriz, no fazer parte da amostra e, quando cromatografada, ficar separada de todas as demais substncias presentes na amostra40,41. Este ltimo requisito no necessrio quando a deteco feita por espectrometria de massas, na
qual cada composto produz um espectro caracterstico. O mtodo de
padronizao interna extremamente til, especialmente pelo fato
de que independe de pequenas mudanas em variveis experimentais, como temperatura da coluna e tamanho da amostra. Este mtodo bastante til em cromatografia gasosa, na qual se usa seringa
para injeo de amostra42 e por isso deve ser feito a cada anlise.
Superposio de matriz
O mtodo de superposio de matriz (matrix-matched) consiste na adio do padro da substncia em diversas concentraes
em uma matriz similar da amostra, isenta da substncia, e construo do grfico de calibrao relacionando as reas obtidas com as
concentraes dos padres. O mtodo de superposio de matriz pode
ser utilizado para calibrao, tanto com a padronizao interna como
com a padronizao externa. Este mtodo usado para compensar o
efeito da matriz ou de possveis interferentes e de suma importncia em determinaes quando a matriz pode interferir na pr-concentrao, extrao, separao ou deteco da substncia de interesse. Sua principal vantagem sobre o mtodo de padronizao externa
que fornece uma melhor correspondncia com a composio da
amostra. Por exemplo, se algumas substncias so determinadas em
soro humano e uma soluo padro aquosa for usada na calibrao,
resultados errneos podem ser obtidos por causa do efeito da matriz;
para tais medies, uma matriz de soro humano seria melhor para
realizar a calibrao do que a soluo aquosa41. O mtodo de
superposio de matriz tem o inconveniente de no proporcionar a
magnitude do efeito de co-extratos, alm de aumentar o custo e o
tempo das anlises43. Alguns autores acreditam que o efeito dos coextratos sobre a resposta da substncia de interesse deveria ser avaliado pela comparao do mtodo de superposio de matriz com a
padronizao externa (padres preparados nos solventes)25. Apesar
de se obter uma calibrao confivel com o mtodo de superposio
da matriz, ele somente uma forma para compensar efeitos da matriz, mas no elimina situaes analticas tpicas: a intensidade de
um efeito e a concentrao de interferentes na matriz podem diferir
de uma matriz ou amostra para outra44. Assim, em amostras nas quais
pode ocorrer o efeito da matriz e no se tem disponvel uma matriz
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dem partir de uma nica soluo estoque, atravs de diluies sucessivas das solues de trabalho anteriormente preparadas ou atravs
do preparo de todas as solues diludas, partindo sempre da soluo estoque. Este ltimo modo o mais recomendado, porm, dependendo da faixa de concentrao em questo, diluies diretamente
da soluo estoque podem envolver medies de volumes to pequenas que o erro se torna grande. A Figura 3a mostra um esquema
da seqncia utilizando este modo de preparo. Uma outra abordagem para o preparo das solues de trabalho mostrada na Figura
3b. Neste caso, so preparadas duas solues estoque de concentraes diferentes e as solues de trabalho so preparadas a partir destas duas solues, seja por diluies sucessivas ou partindo das solues estoque. Este modo de preparo das solues de trabalho mais
adequado, pois permite avaliar atravs da curva analtica o erro embutido na soluo estoque, decorrente da pesagem dos padres.
Uma outra maneira de se preparar as solues seria atravs da
pesagem separada de cada concentrao do padro da substncia da
curva analtica, ao invs da utilizao de diluies sucessivas de uma
soluo mais concentrada40. Esta a maneira ideal de se preparar as
solues, pois a preparao individual mostra o erro verdadeiro na
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preparao de todas as solues padro e no, erros de diluio. Entretanto, este mtodo torna-se invivel quando se trabalha com anlise de traos, j que a quantidade de padro a ser pesada to pequena que a sensibilidade da balana semi-microanaltica no permite tais pesagens, devido aos erros associados.
Preciso
Representa a disperso de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padres, sob condies definidas3,11. A preciso avaliada pelo desvio
padro absoluto (), que utiliza um nmero significativo de medies, normalmente maior que 20. Na prtica, em validao de mtodos, o nmero de determinaes geralmente pequeno e o que se
calcula a estimativa do desvio padro absoluto (s).
Quim. Nova
amostra (tipicamente 10 ou mais vezes), seguida pela mdia dos valores da rea do pico ou altura do pico e determinao da estimativa
do desvio padro relativo de todas as injees.
Para a repetitividade, o INMETRO11 recomenda sete ou mais
repeties para o clculo da estimativa do desvio padro. A ICH3 e
ANVISA4 sugerem que a repetitividade seja verificada a partir de
um mnimo de nove determinaes cobrindo o limite especificado
do procedimento (ex.: trs nveis, trs repeties cada um), ou a partir de um mnimo de seis determinaes a uma concentrao similar
ao valor esperado.
Preciso intermediria
Indica o efeito das variaes dentro do laboratrio devido a eventos como diferentes dias ou diferentes analistas ou diferentes equipamentos ou uma combinao destes fatores3.
A preciso intermediria reconhecida como a mais representativa da variabilidade dos resultados em um nico laboratrio e, como
tal, mais aconselhvel de ser adotada. O objetivo da validao da
preciso intermediria verificar que no mesmo laboratrio o mtodo fornecer os mesmos resultados.
O nmero de ensaios necessrios para se avaliar a preciso intermediria segue a mesma recomendao da ICH3 e ANVISA4 para o
clculo de repetitividade descrita acima. A preciso intermediria pode
ser expressa atravs da estimativa do desvio padro relativo (RSD).
Reprodutibilidade
o grau de concordncia entre os resultados das medies de
uma mesma amostra, efetuadas sob condies variadas (mudana de
operador, local, equipamentos, etc.)46. A reprodutibilidade refere-se
aos resultados dos estudos de colaborao entre laboratrios e deve
ser considerada em situaes como a padronizao de procedimentos analticos a serem includos, por exemplo, em farmacopias, procedimentos do CODEX, etc. muito comum encontrar desacordo
entre mtodos analticos. Isto aparece quando vrios laboratrios
analisam uma amostra em comum, em estudos colaborativos.
Freqentemente, altas variaes so observadas entre os resultados.
Assim, os dados provenientes de apenas um laboratrio no so suficientes para avaliar a reprodutibilidade do mtodo. Estudos
colaborativos no so somente indispensveis para avaliao da
reprodutibilidade, eles tambm podem ser de grande ajuda para testar a exatido do mtodo47.
A IUPAC no aconselha tirar concluses com menos de cinco
laboratrios e recomenda oito laboratrios em seu guia atual10. Alm
disso, mais crtico que o nmero de laboratrios envolvidos que
estes possuam competncia e habilidades similares queles que usaro o mtodo em rotina.
A documentao que apia os estudos de preciso em nvel de
reprodutibilidade deve incluir estimativa do desvio padro absoluto,
estimativa do desvio padro relativo e intervalo de confiana. Horwitz
et al.48 estabeleceram uma relao matemtica para expressar a dependncia entre valores do RSD e concentrao da substncia, pelo exame de resultados cumulativos de estudos colaborativos envolvendo
grande faixa de compostos de interesse, matrizes e tcnicas analticas.
Os valores obtidos por esta relao matemtica so introduzidos em
um grfico e originam a denominada Trombeta de Horwitz48.
Exatido
Representa o grau de concordncia entre os resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de referncia
aceito como verdadeiro3,11. importante observar que um valor exato ou verdadeiro o valor obtido por uma medio perfeita e este
valor indeterminado por natureza49.
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o posterior. Os padres de referncia no compendiais so substncias com elevado teor de pureza, que podem ser obtidas atravs de um esforo razovel e devem ser cuidadosamente caracterizados para garantir sua identidade, potncia e pureza. recomendvel que fatores de correo de pureza sejam includos em
qualquer clculo existente no mtodo.
uma verso da substncia modificada isotopicamente e
composto quimicamente diferente da substncia de interesse, mas
representativo de seu comportamento. Algumas vezes este composto denominado padro interno23,41.
A limitao do procedimento de recuperao a de que a substncia adicionada no est, necessariamente, na mesma forma que a
presente na amostra. Isso pode implicar, por exemplo, na presena
de substncias adicionadas em uma forma que proporcione melhor
deteco, ocasionando avaliaes excessivamente otimistas da recuperao. Pelo fato de outros componentes da matriz poderem interferir na separao, deteco ou na quantificao da substncia, efeitos dos componentes da matriz devem ser investigados.
importante considerar como a eficincia do mtodo varia em
funo da concentrao da substncia. Na maioria dos casos, a disperso dos resultados aumenta com a diminuio da concentrao e a
recuperao pode diferir substancialmente a altas e baixas concentraes. Por esse motivo, a recuperao deve ser avaliada na faixa de
concentrao esperada para o composto de interesse. Isto pode ser
feito adicionando a substncia em pelo menos trs diferentes concentraes, por exemplo, prximo ao limite de quantificao, prximo
concentrao mxima permitida pelo mtodo em teste e em uma concentrao prxima mdia da faixa de uso do mtodo. Para anlises
em nvel de resduos, o GARP recomenda que se trabalhe nos nveis
de adio de 1, 2 e 10 vezes o valor de limite de quantificao39. Para
componentes em maiores concentraes, os nveis de adio podem
ser 50, 75, 100, 125 e 150% do nvel esperado para a substncia24.
As medies de recuperao so as mais comuns devido dificuldade em se obterem CRM (que, para certas aplicaes, nem existem) e so expressas em termos de porcentagem da quantidade medida da substncia em relao quantidade adicionada na matriz
(branco ou placebo), em um determinado nmero de ensaios51.
Os intervalos aceitveis de recuperao para anlise de resduos
geralmente esto entre 70 e 120%, com preciso de at 20%39.
Porm, dependendo da complexidade analtica e da amostra, este
valor pode ser de 50 a 120%, com preciso de at 15%39.
Adio padro
Este mtodo usado quando for difcil ou impossvel preparar
um branco da matriz sem a substncia de interesse. Um exemplo
seria a anlise de -caroteno em amostras de mamo, nas quais o caroteno sempre estar presente.
No mtodo de adio padro, quantidades conhecidas da substncia so adicionadas em diferentes nveis numa matriz da amostra,
antes do procedimento de preparo da amostra, que j contenha quantidades (desconhecidas) da substncia52. A concentrao da substncia de interesse na amostra original pode ser determinada grfica e
matematicamente, como j mostrado anteriormente. Em geral, para
adio padro, uma boa abordagem adicionar 25, 50 e 100% da
concentrao esperada da substncia na matriz24. A amostra sem adio do padro e cada uma das amostras com o padro adicionado
devem ser analisadas e as quantidades medidas relacionadas com a
quantidade adicionada.
Limite de Deteco (LD)
O limite de deteco (LD) representa a menor concentrao da
substncia em exame que pode ser detectada, mas no necessaria-
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Quim. Nova
vel (por ex. um dia, uma semana, um ms, dependendo da necessidade)12. Freqentemente, em equipamentos automatizados, as corridas cromatogrficas so realizadas durante a noite para melhor aproveitamento do funcionamento do laboratrio. Esta prtica requer maior estabilidade das solues. A estabilidade das amostras e padres
importante em termos de temperatura e tempo. Se uma soluo no
for estvel em temperaturas ambientes, a diminuio da temperatura
pode aumentar a estabilidade das amostras e padres. Com relao
ao tempo, estabilidade de dias ou meses mais desejvel, entretanto
em alguns casos, as solues precisam ser preparadas cada vez que
forem realizadas as anlises24.
Em certos tipos de amostras, faz-se necessrio avaliar a estabilidade da substncia para determinar o tempo de estocagem das amostras38. Tempos longos de estocagem de amostras biolgicas, por exemplo, aumentam a probabilidade de degradao dos compostos de interesse, com subseqente formao de metablitos. Conhecendo a
estabilidade, as anlises podem ser completadas antes de ocorrer a
degradao.
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Recomendao
Repetitividade (RSD)
Resoluo (Rs)
TF 2
CONFORMIDADE DO SISTEMA
Antes de realizar experimentos de validao ou mesmo anlises
de amostras, deve-se avaliar se o sistema utilizado para a anlise
capaz de fornecer dados de qualidade aceitvel. Esta avaliao
alcanada com experimentos de conformidade do sistema (system
suitability), que pode ser definida como um conjunto de testes para
garantir que o equipamento utilizado est apto a gerar resultados de
exatido e preciso aceitveis. A conformidade do sistema pode causar dvidas quanto ao seu alcance e, por isso, encontrada em duas
abordagens.
A primeira considera que a resoluo e a repetitividade do sistema cromatogrfico sejam adequadas para a anlise a ser realizada.
Assim, a conformidade do sistema verificada antes que o desenvolvimento do mtodo e a validao tenham sido completados. Os critrios selecionados so baseados no desempenho do mtodo determinado durante a validao. Por exemplo, se o tempo de reteno da
amostra fizer parte do critrio de conformidade do sistema, a sua
variao (estimativa do desvio padro) pode ser determinada durante a validao, que pode ter uma variao de 3%, por exemplo (baseado nos resultados de validao) durante o uso rotineiro.
A segunda abordagem considera o sistema como um todo e inclui,
alm do sistema cromatogrfico, a calibrao e manuteno dos equipamentos e instrumentos utilizados em todo o procedimento analtico,
dentro das especificaes. Neste caso, a conformidade do sistema baseia-se no conceito de que o equipamento, componentes eletrnicos,
operaes analticas e amostras constituem um sistema integral que
pode ser avaliado como um todo. Pode-se dizer, ento, que a conformidade do sistema a verificao de um sistema para garantir a sua
qualidade antes ou durante a anlise de amostras desconhecidas.
Alguns autores consideram que, se o sistema estiver qualificado, a
validao do mtodo pode ser desenvolvida. Algumas vezes os critrios para avaliao da conformidade do sistema so definidos antes da
validao e, quando realizados durante as anlises, estes testes garantem que o desempenho do sistema est apropriado para o uso.
Os parmetros a serem medidos e seus limites recomendados, de
acordo com a US-FDA, esto na Tabela 26. Tipicamente, no mnimo
dois destes critrios so requeridos para garantir a conformidade do
sistema.
REVALIDAO
Dentro de um laboratrio provvel que, aps um perodo de
tempo, certos reagentes e equipamentos possam ter sofrido altera-
es, seja por mudana de fornecedor, troca de componentes ou desgaste do equipamento provocado pelo uso constante. possvel que
o desempenho do mtodo e, ento, a validade dos resultados gerados
pelo mtodo sejam afetados por estas mudanas. A revalidao, que
pode ser necessria em tal situao, a reavaliao de um mtodo
analtico validado em resposta a uma mudana em algum aspecto do
mtodo18,25. impraticvel e provavelmente desnecessrio revalidar
um mtodo que tenha sofrido pequenas mudanas. Prope-se que
estas pequenas variaes sejam avaliadas durante a validao, no
parmetro de robustez, e que a revalidao de mtodo seja limitada
s situaes como mudanas de maiores extenses. Para mtodos de
separao, alteraes significativas poderiam ser devido a mudanas
no produto para o qual o mtodo foi validado, no instrumento, no
reagente (tipo ou fabricante) ou no procedimento.
A revalidao tambm deve ser considerada quando a proposta
e/ou o nvel de qualidade desejado do mtodo so alterados, o procedimento modificado, ou mesmo quando um mtodo usado novamente aps um certo perodo de tempo.
Com respeito a quais parmetros devem ser inclusos na
revalidao, pode-se dizer que quanto maiores as alteraes no mtodo, maior deve ser a abrangncia da revalidao.
CONCLUSO
Os conceitos de validao de mtodos continuam a evoluir e esto sempre sob considerao. A proposta deste trabalho foi fornecer
ao leitor uma viso dos conceitos e procedimentos de validao utilizados no desenvolvimento de mtodos instrumentais de separao
pelos laboratrios industriais, acadmicos e governamentais. Vrias
discusses foram inseridas no decorrer do texto, mas alguns pontos
devem ser enfatizados para finalizar este tema.
As tcnicas cromatogrficas e eletroforticas so alvos primordiais dos procedimentos de validao, pois envolvem monitoramentos
que dizem respeito a aspectos como sade pblica, monitoramento
ambiental, comrcio exterior e controle de qualidade de produo.
A legislao, no que diz respeito validao de metodologias,
tem vrias nuances e diferentes interpretaes. Parte desta caracterstica intencional, pois permite a adaptao para cada tipo de problema. A legislao brasileira tem sido melhor definida nos ltimos
dois anos, atravs de resolues e recomendaes do INMETRO e
ANVISA, inspiradas em diretrizes da ICH e do grupo EURACHEM.
Para que um estudo de validao seja conduzido com sucesso, necessrio que se tenha amplo conhecimento da legislao referente s
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Ribani et al.
Quim. Nova
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