El Dr. Jose V. Sinisterra Gago.

Catedrtico de Qumica Orgnica y

Famacutica y el Dr. Andrs R. Alcntara Len, Profesor Titular de Qumica
Orgnica y Farmacutica del Departamento de Qumica Orgnica y Farmacutica de
la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense,

CERTIFICAN
que la presente Memoria titulada:

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD Y ENANTIOSELECTIVIDAD DE

DERIVADOS DE LA LIPASA DE Rhizomucor miehel.

que presenta Da. W Trinidad Lpez-Belmonte Coba para optar al grado de

Doctor en Farmacia, ha sido realizada bajo su direccin y rene las condiciones
necesarias para ser juzgada por el Tribunal correspondiente, autorizando as su
presentacin.
Para que as conste donde proceda, firman el presente certificado en Madrid,
8 de Febrero de 1996.

Fdo Dr J y Sinisterra Gago

Fdo Dr A R Alcntara Len

Ponenie: Sr. Dr.

,

-.

Fn;ftM: Cx fin

t{tLSUr

Vc.o.&/: Sn ~

Vcts!: Sr.

Voc/: Sr, Dr.

G~L

Secretario: Sr. Dr.

&C>q

ti
>30

La Dra. M

Carmen Avedao Lpez, Catedrtica y Directora del

Departamento de Qumica Orgnica y Farmacutica de la Facultad de Farmacia de

la Universidad Complutense,

CERTIFICA
que Dha. iNC Trinidad Lpez-Belmonte Coba ha realizado en los
laboratorios de este Departamento, bajo la direccin del Dr. Jos Vicente Sinisterra
Gago y del Dr. Andrs R Alcntara Len, el presente trabajo para optar al grado de
Doctor en Farmacia, con el titulo:

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD Y ENANTIOSELECTIVIDAD DE

DERWADOS DE LA LIPASA DE Rhizomucor miehel.

y para que as conste donde proceda, firma el presente certificado en Madrid, 8 de

Febrero de 1996.

Fdo: Dra. M8 Carmen Avendao Lpez

Memoria presentada para optar

al grado de Doctor en Farmacia por:
INC TRINIDAD LOPEZ-BELMONTE COBA

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD Y
ENANTIOSELECTIVIDAD DE DERIVADOS DE LA
LIPASA DE Ahizomucor miehel.

Directores:

Dr. Jos Vicente Sinisterra Gago

Dr. Andrs R. Alcntara Len

Departamento de Qumica Orgnica y Farmacutica

Facultad de Farmacia
Universidad Complutense

Madnd, Marzo de 1996

Quiero expresar mi ms profundo y sincero agradecimiento:

A mi padre Dr. Franciso Lpez-Belmonte Rubira, Profesor Titular del Departamento

de Biologa Vegetal II, porque esta Tesis Doctoral es el resultado de sus buenos y sabios
consejos,

Al Dr. Jos V. Sinisterra, Catedrtico del Departamento de Qumica Orgnica y

Farmacutica por la direccin de esta Tesis Doctoral y por haberme permitido trabajar en su
grupo de trabajo.

Al Dr. Andrs R. Alcntara Len, Profesor Titular del Departamento de Qumica

Orgnica y Farmacutica por la direccin de este trabajo, as como por su apoyo, dedicacin,
amistad y vaJiossimas enseanzas que me ha transmitido durante estos aos de trabajo.
A mi buena amiga Dra. M3 Jos Herniz con la que he compartido las prisas y
agobios; pero con la que sobre todo, he pasado muy buenos ratos y, a mis amigos y
compaeros de laboratorio, Dr. Miguel Arroyo, Dr. Jose M Moreno y prximamente tambin
doctor Carlos Torres con los que he compartido muchas horas de trabajo, pero tambin de
risas y sobre todo compaerismo, vagando por diversos cuartitos hasta llegar al flamante
laboratorio n0 6 del Departamento.

Al Dr. Burguillo del Departamento de Fisico-Quimica de la Facultad de Farmacia de

la Universidad de Salamanca por el anlisis por HPLC de la enantioselectividad de las
muestras de Ketoprofeno.

Al Dr. R. Garca-Caero, del Departamento de Bioqumica Analtica del Hospital

Puerta de Hierro, que tan amablemente realiz las electroforesis recogidas en esta Memona
y que me permitieron visualizar los resultados obtenidos.

A Victor Jimnez del Departamento de Microbiologa de la Facultad de Farmacia, que

siempre estuvo dispuesto a ayudarme y permitirme utilizar algunas tcnicas de su laboratono.

A Isidoro Fuentes y Sonia Chamorro por su valiosa colaboracin, durante las ltimas
fases de este trabajo
A todos mis compaeros del Departamento, especialmente a Chami, Isabel, Sonia,
Ana, M0Angeles, Raquel, Angel, Marisol, Csar, Femando, etc. y a M~ Eugenia Peas que
siempre estuvo dispuesta a ayudarme.
A mis padres, hermanos y a Rodrigo, por sus nimos y cario.
Finalmente, agradezco a la Universidad Complutense la concesin de la Beca PreDoctoral de Formacin de Profesorado y Personal Investigador por el apoyo econmico
prestado durante el perodo 1992-1995.

a mis padres

indice

INDICE
1.- OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

II.- INTRODUCCION

11.1.- ENZIMAS

11.1. 1

.-

Caractersticas como biocatalizadores

lo

11.1.2.- Evolucin histrica

lo

11.1.3.- Clasificacin y Nomenclatura

11
11

11.2.- LIPASAS
11.2.1.- Defmcin

II

11.2.2. Distribucin en la naturaleza

13

11.2.3.- Caractersticas de las lipasas microbananas

14

11.2.4. Mecanismo de accin

16

11.2.5.- Actividad cataltica de las lipasas

23

II.2.5.a.- Cintica enzimtica

I1.2.5.b.- Estereoselectividad de las lipasas
11.2.6.- Actividad de las lipasas en medio orgnico

33

11.2.7.- Aplicaciones de las lipasas

42
54

11.3.- LIPASA DE Rhizonwcor miehet

II 3 1

Rhizoinucor mehe

54

11.3.2.- Obtencin de la lipasa de Rh.mehe

56

11.3.3.- Estructura de la lipasa de Rh.miehe

61

11.4.- INMOVILIZACION DE ENZIMAS

11.4 1

91

Definicin

91

11.4.2.- Ventajas de la inmovilizacin

92

11.4.3.- lconvenientes de la inmovilizacin

94

11.4.5.- Mtodos de inmovilizacin

95

11.4.6.- Inmovilizacin por adsorcin inica

99

11.4.7.- Inmovilizacin por unin covalente

99

Indice

11.5.- ANTIINFLAMATORIOS NO ESTERO IDEOS

101

11.5.1.- Patologa de la inflamacin

101

11.5.2.- Antiinflamatorios no esteroideos

102

m.- PARTE EXPERIMENTAL

111

[111.- MATERIALES

113

111.1.1.- Reactivos

113

111.1.2.- Enzimas

116

III 1 2 a

Lipasa cruda de Rh.miehei

III.1.2.b.- Lipasa inmovilizada de R.miehei

111.1.3.- Sustratos

118

111.2.- PROGRAMAS DE CALCULO

119

111.2.1.- S1MIFIT

119

111.2.2.- HIIPERCHIEM

121
123

111.3.- CARACTERIZACION DE LA LIPASA DE Rh.miehet

111.3.1.- Determinacin de la concentracin de protenas

123

11I.3.1.a.- Mtodo del Biuret

I1I.3.l.b.- Mtodo de Bradford
111.3.2.- Determinacin de la actividad estersica

128

111.3.3.

131

Determinacin de la actividad lipsica

III 3 3 a.- Hidrlisis de aceite de oliva

I11.3.3.a.1.- Mtodo A
II1.3.3.a.2.- Mtodo B
II1.3.3.b.- Hidrlisis de tributirina
111.3.4.- Desarcin por abrasin de Lipozymet 1M20
III 3 5 Electroforesis
-

136
136

111.4.- SEMIPURIFICACION DE LA LIPASA CRUDA DE Rh. miehel.

111.4.1.- Semipurificacin de enzimas en funcin
de su peso molecular

137

J1I.4.l.a.- Ultrafiltracin.

137

111.4.l.b.- Dilisis

138
II

Indice

111.4.2.- Separacin de proteinas por diferencia

de solubilidad

140

m.5.- INMOVILIZACION DE LA LIPASA DE RH?miehei

146

111.5.1.- Activacin del soporte

146

111.5.2.- Inmovilizacin de la lipasa de Rh.rniehei

147

111.5.3.- Estudios de estabilidad trmica de

los derivados inmovilizados
m.6.- SINTESIS QUIMICA DE ESTERES BUTILICOS DE
ACIDOS (R,S) 2-ARWPROPIONICOS

150

III 6.1

150

Ester butlico de Ibuprofeno

111.6.2.- (R,S) 2-fenilpropionato de butilo

151

111.6.3.- Ester butilico de Ketoprofeno

152

III 6 4

152

Ester butilico de Naproxeno

m.7.- HIDROLISIS ENZIMATICA DE ESTERES

1117 1

153

mtodo A.

153

111.7.2.- mtodo B.

154

111 7 3

154

Asilanijento del producto de reaccin

[1.8.- SINTESIS ENZIMATICA DE ESTERES

III 8 1

155

Estudio de las variables continuas o estructurales .155

111.8.2.- Estudio de las variables discontinuas o de operacin.

Diseo estadistico de Experimentos.
111.8.3.- Mtodos de cuantificacin de las reacciones

156
157

III.8.3.a.- Determinacin rendimiento de reaccin 157

1I1.8.3.b.- Determinacin del exceso enantiomrico
111.9.- ISOTERMAS DE ADSORCION DE AGUA
III 9 1

calibracin del aparato de actividad de agua.

160
161
162

111.9.2.- Preparacin de las muestras

162

111.9.3.- Isotermas de absorcin

162

111.9.4.- Ajuste de la curva de la isoterma

163

III

indice

IV.- RESULTADOS Y DISCUSION

165

IV.1.- CARACTERIZACION DE LA LIPASA DE Rh.miehei 167

IV 11.- Determinacin de la concentracin de protenas

167

IV.1.2.- Determinacin de la actividad estersica

169

IV.1.3.- Determinacin de la actividad lipsica

173

IV 1 3 A -Hidrlisis de aceite de oliva

173

IV 1 3 b

178

Hidrlisis de tributirina

IV.2.- SEMIPURIFICACION DE LA LIPASA DE Rh.miehe 183

IV 2 1 -Ultrafiltracin

183

IV.2.2.- Dilisis y centrifugacin

185

IV.2.3.- Semipurificacin de protenas por

precipitacin tras la adicin de sulfato amnico
IV.2.4.- Conclusiones obtenidas tras la semipurificacin
111.3.~ INMOVIILIZACION DE LA LIPASA DE Rh.nehei
IV 3 1.- Seguimiento del proceso de inmovilizacin

190
206
209
211

IV.3.2.- Comparacin de los derivados inmovilizados

de la lipasa de Rh.rniehe

213

IV.3.3.- Estudio de la estabilidad trmica de la

lipasa de Rh.meheg mmovihzada

216

IV.3.4.- Inmovilizacin de la lipasa de Rhanehei

semipurificada

219

IV.4.- RESOLIJCION ENANTIOSELECTIVA DE AJNEs

IV 4 1

Enantioselectividad de la lipasa de Rh.mehe

228
228

IV.5.- HIDROLISIS ENANTIOSELECTiVA DE ESTERES. 229

IV.6.- SINTESIS ENANTIOSELECTIVA DE ESTERES

234

IV.6. 1.- Estudio de las variables de operacin

Diseo estadstico de Experimentos.

234

IV la.- Influencia de la cantidad de enzima

242

IV 6 1 b

246

Influencia del tiempo de reaccin

IV 6 1 c.- Influencia de la temperatura

IV

249

Indice

IV.6. id.- Influencia de la cantidad de agua en el medio 253

IV.6. le.- Influencia de la relacin molar de
sustratos (cido/alcohol)

263

IV.6.2.- Estudio de las variables estructurales

274

IV,6.2.a,- Disolvente orgnico

275

IV.6.2.b.- Alcoholes

281

IV.6.2.c.- Acidos (LS) 2-arilpropirncos

285

IV.6.3.- Estudio de la actividad de lipasa de Rh.inehei

semipurificada e inmovilizada sobre slice

308

V.- CONCLUSIONES

313

VI- BII3LIOGRAFIA

319

ABREVIATURAS
TCT

2,4,6-tricloro-1,3,5-triazma

AAS
DMIF
BSA

V0

>

ee

-4

pI

acetato de para-nitrofenilo

>

velocidad inicial
exceso ennatiomrico

coeficiente de enantioselectividad

>

FE

albmina de suero bovino

*.

pNPA

N,N-dimetilformamida

-*

factor de enantioselectividad

>

punto isoelctrico

-4

rend

rendimiento en ster (reaccin sintesis steres) y rendimiento en cido liberado

>

(reaccin hidrlisis de steres)

a~

actividad de agua

-4

AINEs

antiinflamatorios no esteroideos

-4

Abreviaturas de derivados de la basa de Rh.mlehei

SIL-SP

>

lipasa semipurificada por precipitacin con un 50% de saturacin de sulfato

amnico y postenormente inmovilizada por enlace covalente sobre slice.

sp

lipasa seinipurificada par precipitacin con un 50% de saturacin de sulfato amnico

-4

SIL-C
D

lipasa mnxavibzada por enlace covalente sobre slice

lipasa dializada

->

DC

lipasa dializada y centrifugada

DCC

-+

1M20

lipasa dializada y centrifugada dos veces

derivada comercial (Lipozyme 1M20) de lipasa inmovilizada por adsorcin sobre

una resma de intercambio aninico

RML-A

isoenzima A de la lipasa de Rhaniehe

RML-B

>

isoenzima B de la lipasa de Rh.miehe

rRMI.

-4

lipasa de RJi.mehei recombinante

OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

Objetivos y Pian de trabajo

La presente Tesis Doctoral se encuadra dentro de la tinca del Proyecto de

Investigacin:

Resolucin de racematos de 4gjdos2gflj-roinicosconact~v~dad

antiinflamatoria usando lipasas inmovilizadas como biocatalizadores. (Cdigo PB 9000 10C02-0 1).

Los objetivos planteados en la presente Tesis Doctoral fueron los siguientes:

1).- Caracterizacin de la lipasa de R.h.miehei cruda e inmovilizada por adsorcin sobre una
resma de intercambio aninico, comercializadas por el laboratorio Novo-Nordisk como
LipozymJ IOQUOL y Lipozyme~ 1M20, respectivamente. Para llevar a cabo dicha
caracterizacin se pusieron a punto diversas metodologas de:
* determinacin de concentracin de protenas
*

determinacin de actividad estersica

determinacin de actividad lipsica

2).- Semipurificacin de la lipasa cruda de Rhaniehei, para lo cual se analizaron diversas

metodologas de separacin de proteinas basadas en:
* la diferencia de tamao molecular
*

la diferencia de solubilidad

3).- Inmovilizacin de la lipasa de Ritmiehei por enlace covalente con slice, previamente
activada va 2,4,6,-tricloro-1,3,5-tnanna
* inmovilizacin de la lipasa de Rh.mniehei cruda y semipurificada.
*

estudio comparativo de este nuevo derivado inmovilizado y el derivado

comercial (1M20).

Objetivos y Pian de trabajo

4).- Desarrollo y puesta a punto de un mtodo de resolucin enantioselectiva de mezclas

racmicas de cidos (R,S) 2-arilpropinicos que pueda ser escalado a nivel industrial. Para
ello se han estudiado las variables estructurales y operacionales que intervienen en la
resolucin enantioselectiva de estos frmacos, catalizada por la lipasa de Rltmiehei cruda e
inmovilizada por adsorcin.

5).- Estudio de la actividad enzinitica de los derivados de la lipasa de Rh.mzehez obtenidos

en la presente Tesis Doctoral, tras la semipurificacin de esta enzima por diversas mtodos
e inmovilizacin por enlace covalente con slice, utilizndose posteriormente en la resolucin
enantioselectiva de AINEs derivados del cido (R,S) 2-arilpropinico.

INTRODUCCION

Introduccin

11.1.- ENZIMAS
11.1.1.- CARACTERSTICAS COMO BIOCATALIZADORES
Las enzimas son proteinas especializadas en la catlisis de las reacciones biolgicas.
Su inters reside en las siguientes caractersticas principales:
1).- Las enzimas son biocatalizadores y por tanto, disminuyen a energa de
activacin necesaria para que las reacciones se desarrollen, aumentando su velocidad.
Asimismo se ha comprobado que la enzimas presentan una actividad cataltica ms eficaz que
los catalizadores inorgnicos; por ejemplo, la enega necesaria para que se produzca la
reaccin de descomposicin del agua oxigenada en agua y oxgeno es de 75 KJ/mol en
ausencia de catalizador; 5OKJ/mol en presencia de platino y disminuye hasta SKJ/mol en
presencia de la peroxidasa (antiguamente denominada catalasa). Este efecto tan drstico sobre
la energa de activacin en presencia de enzimas se debe a la formacin de un complejo
intermedio enzima-sustrato, que posteriormente se transforma en producto y enzima.

Rncdta aittmuttc.
RatnscraMMka

1
E+SaE-S-E*P

Cuto d.en.cad.,

Figura 1: Efecto de la catlisis enzimtica sobre la energa de activacin. AE4 es la energa

de activacin para una reaccin 0catalizada
par una
mientras que AEA es la enega de
es la energa
libroenzima,
de reaccion.
una reaccin no enzimtica. NG

Enzimas

2). Las enzimas son selectivas, tanto de la reaccin que catalizan, como de los
sustratos que reconocen. Adems, presentan un elevado grado de estereo y regioselectividad
(en general, aceleran ms el proceso con un ismero que con el otro, lo cual constituye una
gran ventaja frente a los catalizadores qumicos clsicos). La selectividad de las enzimas se
debe a la formacin del complejo enzima-sustrato, el cual produce en una pequea regin de
la enzima denominada centro activo, el cual suele estar localizado en un hueco o cavidad
dentro de la estructura terciaria de la enzima. La especificidad enzimtica reside en las
caractersticas de ese centro activo (dimensiones, topologia, alineamiento de grupos
contrainicos y regiones hidrfobas), que condicionan las caractersticas que debe reunir un
determinado sustrato para acop larse en esa regin enzimtica. Solamente un nmero reducido
de aminocidos estn implicados en la catlisis enzimtica, los cuales no se localizan
consecutivamente en la cadena polipeptdica, sino que se encuentran juntos tras el proceso de
plegamiento enzimtico.
Se han propuesto numerosos modelos para explicar la selectividad de las enzimas para
un determinado sustrato. El modelo de la llave y la cerradura

% que da una versin

rgida

de las enzimas ha sido superado por el modelo de el acoplamiento o encaje inducido

Segn este modelo el sustrato induce la orientacin de los residuos en el centre activo para
que se unan al centro de fijacin y se desarrolle la reaccin. La selectividad de las enzimas
es la base de sus aplicaciones en Sntesis Orgnica, que permite llevar a cabo, por ejemplo,
transformaciones muy selectivas con estructuras quirales y polifimcionales.

3).- Las enzimas pueden ser objeto de regulacin; es decir, su actividad

cataltica puede estar determinada por la concentracin de sustratos, productos y otras
sustancias qumicas presentes en el medio; las cuales pueden producir, tanto su activacin
como su inhibicin.

4).- Las enzimas se degradan en condiciones relativamente suaves; por lo

que requieren una manipulacin ms delicada que los catalizadores metlicos. Las enzimas
se pueden desnaturalizar por diversos mecanismos como: la accin de proteasas, presentes

Introduccin

como agentes contaminantes en las preparaciones enzimticas; los cambios bruscos de las
condiciones del medio que pueden alterar la conformacin enzimtica; contaminaciones
microbianas, procesos de autooxidacin, etc
****

* *** * * ** * * ** * ** * *** ** * ****

*** * ****

* **

Algunos de los principales inconvenientes que presentan los procesas catalizados por
enzimas (la inestabilidad, el precio elevado y la especificidad respecto a sustrato) se han
podido superar mediante diferentes procedimientos como:
a).- La transformacin estereoselectiva de algunos sustratos, que conduce a la
obtencin de intermedios o productas de gran inters en Sntesis Orgnica.

b).- El desarrollo de tcnicas (como la inmovilizacin enzimtica> que permiten

m~orar la estabilidad de las enzimas y facilitan su posterior recuperacin y
reutiizacin3, siendo posible la utilizacin de estas enzimas como biocatalizadores
en procesos industriales.

4-

Los avances en Biologa Molecular y las nuevas tecnologas del ADN

recombnante han permitido la manipulacin del material gentico, el aislamiento de

genes y su expresin con el fin de obtener determinadas enzimas en grandes
cantidades4. Como consecuencia, el precio de las enzimas ha descendido
espectacularmente. Estas tcnicas tambin han permitido la modificacin selectiva de
algunas propiedades enzmticas.

d).- La limitacin debida a la insolubilidad de determinadas sustratos en agua, lo que

impeda el desarrollo de las reacciones enzimticas, ha sido superada mediante la
utilizacin de sistemas bifsicas o la adicin de pequeas concentraciones de
cosolventes orgnicos (etilenglicol, glicerol o dimetilsulfxido),
propiedades y caractersticas del biocatalizadot.

sin alterar las

Eftzunas

11.2.- EVOLUCION HISTORICA

El la denominacin de enzima (en la levadura) no se emple hasta 1877, pero mucho
antes ya se sopechaba que ciertos catalizadores biolgicos intervenan en la fermentacin del
azcar para formar etanol, de ah el nombre inicial de fermentos.
La primera teora general sobre la catlisis qumica fue publicada en 1835 por J.J.
Berzelius, el cual inclua en su artculo un ejemplo de lo que ahora se conoce como enzima,
la diastasa de malta, y sealaba que la hidrlisis del almidn catalizada por la diastasa era
ms eficaz que la catalizada por cido sulfrico.
Luis Pasteur en 1860 reconoci que la fermentacin era catalizada por enzimas y en
1897 E. Bcbner consigui extraer de las clulas de la levadura las enzimas que catalizan la
fermentacin alcohlica. Sin embargo, fue en 1926 cuando J.B. Sumnier aisl por primera vez
una enzima en forma cristalina; se trataba de una ureasa aislada de extractos de la alubia
Cannavalia enzyfannis. Suininer observ que estos cristales estaban constituidos por
estructuras proticas y lleg a la conclusin de que las enzimas eran protenas. No obstante,
sus puntos de vista no fueron aceptados hasta que Northrop entre 1930-36 aisl la pepsina,
tripsina y quimotripsma cristalizadas.

11.3.- CLASIFICACION Y NOMENCLATURA

Las enzimas se han clasificado sistemticamente en seis clases pnncipales7, cada una
de las cuales se divide a su vez en subclases, de acuerdo con el tipo de reaccin catalizada
por cada una de ellas (Tabla 1).
Cada enzima se designa por un nombre recomendado, generalmente corto y apropiado
para su uso habitual; por un nombre sistemtico que identifica la reaccin que cataliza y por
un nmero de clasificacin (ECC) que se emplea cuando se precisa la identificacin
mequivoca de la enzima (Tabla 1).
La enzima objeto de estudio de la presente Tesis Doctoral es la lipasa de Rhizomucor
miehel; la cual viene definida por el nmero E.C. 3.1.1.3, donde E.C. son las abreviaturas de
Comisin de Enzimas, la primera cifra 3 representa el nombre de la clase (hidrolasa), la
segunda cifra 1 representa a la subclase (enlace que hidroliza, esterasa), la tercera cifra 1 *
a la sub-subclase (esterasa que reconoce steres del glicerol) y la cuarta cifra 3 designa a
la glicerol-ester-hidrolasa de cidos de cadena larga.
10

Introduccin

Tabla 1: Clasificacin internacional de las enzimas (denominacin de clases, nmeros de

cdigo y tipos de reacciones)

-oxmo REDUCTASAS:
(Reacciones de xido-reduccin)

1.1-Actan sobre alcoholes >-OH

1.2-Actan sobre cetonas >C0
1.3- Actuan Sobre alquenos >CCH
1.4- Actan sobre grupos amino -~~2
1.5- Actan sobre grupos imino ~=NH

2-TRANSFERASAS:
<Transferencia de grupos funcionales)

2.1-Grupos
2.2-Grupos
2.4-Grupos
2.5-Chupos
2.6-Grupos

3-HIDROLASAS:
(Reacciones de hidrlisis)

3.1-Esteres
3.2-Enlaces glucosdicos
3.3-Enlaces peptidicos
3.4-Otros enlaces C-N
3. 5-Anhidridos de cido

4-LIASAS:
(Adicin a dobles enlaces)

4.1- >CC<
4.2- >CtO
4.3- >C=N

5-ISOMERASAS

5. 1-Racemasas

(Reacciones

de

de un tomo de C
carbonilo
glucosilo
fosfato
que contienen azufre

isomerizacin)

6-LIGASAS;
(Formacin de enlaces
con escisin de ..4TP)

6.1- Entre
6.2- Entre
6.3- Entre
6.4- Entre

tomos de
tomos de
tomos de
tomos de

C
C
C
C

y
y
y
y

O
5
N
C

11.2.- LIPASAS
11.2.1.- DEFINICION
Las lipasas (glicerol ster hidrolasas, FC 3.1.1.3) san un conjunto de enzimas cuya
funcin biolgica es catalizar la hidrlisis de triglicridos de grasas animales y aceites
vegetales para dar lugar a cidos grasos y glicerol. Esta hidrlisis tiene lugar a travs de los
pasos intermedios de formacin de diacilglicridos y monoacilglicridos83.

11

Lipasas

R2CO

OH

L~A5A

O-C--R1
+

3H~

.~.--.

R1COOH

OH

O-C-R3

R2000H

R30001-4

cidos grasos

GLicerol

Triglicdo

Esquema 1: Hidrlisis de triglicridos, funcin bilolgica de las lipasas

Actualmente, podemos decir que esta definicin se encuentra incompleta debido a que:
a).- No tiene en cuenta la especifidad de este grupo de enzimas, ya que a esta
definicin solo se ajustan las lipasas no especificas, que hidrolizan al triglicrido en sus tres
0. Pero hay otras lipasas especficas que
posiciones, como la lipasa de Staphylococcus aureus
hidrolizan determinadas posiciones del ster del glicerol, como las pertenecientes al gnero
Rhizopus, que slo hidrolizan las posiciones 1 y 3, o la isoenzima B de la lipasa de
Ceotnchum candidum2 que muestra preferencia por la posicin 2.

b).- Mediante el control de las condicones de reaccin, las lipasas son capaces
de llevar a cabo la reaccin inversa a la de su funcin biolgica, es decir, sintetizar steres
mediante procesos de esterificacin, transesterificacin e interesterificacin3.

e).- Por ltimo, son capaces de hidrolizar otro tipo de enlaces como amido y
tioester i4. 15

Debido a la baja solubilidad de sus sustratos naturales las lipasas se caracterizan por
su capacidad de catalizar la hidrlisis de los enlaces steres en la inteifase entre una fase
lipoide (que constituye el sustrato) y una fase acuosa donde est la enzima disuelta. Esta
propiedad las diferencia de las esterasas (carboxil ster hidrolasas, EC 3.1.1.1), que hidrolizan
preferentemente steres solubles en agua6. Por tanto, la diferencia entre ambos tipos de
enzimas radica en el estado fisico del sustrato; as, las lipasas son capaces de hidrolizar
micelas y emulsiones, mientras que las esterasas trabajan en un medio homogneo, donde se
12

Introduccin

encuentran disueltos tanto la enzima como el sustrato.

11.2.2.- DISTRIBUCION EN LA NATURALEZA

Las lipasas son enzimas muy abundantes en la naturaleza. En funcin de su origen
natural podemos dividirlas en tres grupos7
1.L2.2.a.- Lipasas animales
Las lipasas se encuentran en todos los niveles del reino animal; desde los invertebrados
hasta los mamferos, pasando por los reptiles8 y participan en varios niveles del metabolismo
de lipidos como la digestin de la grasa, y la absorcin, reconstitucin y metabolismo de
9

lipoprotemas
En los mamferos se pueden distinguir tres subgrupos de enzimas:
1).- las lipasas descargadas en el tracto digestivo por rganos especializados20
2>.- las lipasas tisuiares, tales como las presentes en el corazn, artenas,
cerebro, msculo, tejido srico, tejido adiposo, etc21
3).- las lipasas presentes en la leche22.

LI.2.2.b- Lipasas veretales

Las lipasas en los vegetales se acumulan principalmente en los tejidos de reserva de
energia como las semillas y frutos2. Cuando una semilla germtna presenta un alta actividad
lipolitica, para obtener la energa necesaria para llevar a cabo dicho proceso; por ella las
enzimas mejor caracterizadas de este grupo se encuentran en el mait, fruto de palma25,
26

27

trigo y avena

fl.2.2.c.- Huasas microbianas

Las lipasas de mayor inters industrial son las producidas por microorganismos
(bacterias, hongos y levaduras)28a9. La mayor parte de ellas son lipasas extracelulares, que tras
ser sintetizadas por el microorganismo son excretadas al medio de cultivo a travs de la
membrana celular. A ellas nos referimos a continuacin con ms detalle.

13

..

L~asus

11.2.3.- CARACTERISTICAS GENERALES DE LAS LIPASAS

MICROBIANAS
Las lipasas microbianas son glicoproteinas cidas que contienen entre un 3% y un
15% de hidratos de carbono, siendo la manosa la hexosa mas abundante. Su peso
molecular est comprendido entre 20.000 y 60.000 Daltons. Las caractersticas concretas
de cada enzima (especificidad de sustrato y condiciones de reaccin) son diferentes,
dependiendo del microorganismo del que han sido aisladas. Tambin es frecuente que un
mismo microorganismo produzca varias isoenzimas, que en algunos casos actan sobre
sustratos diferentes, pero que con frecuencia presentan distintos parmetros cinticos y
condiciones ptimas de reaccin. El origen de esta multiplicidad se relaciona con tres
causas:
a).- Biosntesis de varias protenas codificadas por genes diferentes30
b).- Biosntesis de una secuencia de aminocidos que sufre posteriormente
modificaciones post-traduccionales: asociacin con lpidos31, proteobsis parcial32 y
deglicosilacin parcial33
c).- Fenmenos de asociacin-disociacin de subunidades proticas iguales o
diferentes.

Se han encontrado un gran nmero de microorganismos que producen dos

isoenzimas. Las caractersticas de cada isoenzima son distintas, ya que actan sobre
sustratos diferentes y muestran, en muchos casos, parmetros cinticos y condiciones
ptimas de reaccin diferentes.
En la bibliografa consultada aparecen numerosos ejemplos de lipasas de origen
microbiano, tales como: Pencullum camembertP3, Asperghis ngeR4, Geotflchum
candidum30, Mucor IpolyUcus35, Rhzomucor mehei36 o Cromobacternim viscosum37.

11.2.3.a.- Condiciones de reaccin

Temperatura
Las lipasas son activas dentro de un amplio intervalo de temperaturas, que va de

20 a 45 0C; aunque el intervalo ptimo se sita entre 30 y 45 OCio Por encima de 40 0C

la mayora de las lipasas pierden su actividad; pero existen lipasas termoestables, como las
14

Introduccin

producidas por Aspergllus nger Rhzopus japonicus, Cromobactenum vscosum y

Geotrzchum candidum, que son estables con temperaturas superiores a 50 0C.
Excepcionalmente, la lipasa producida por Pseudomonas nutroducans es estable a 70

OCSZ

pH
En cuanto al pH, tas lipasas son activas en amplios intervalos de pH, centrndose
el pH ptimo entre 6,0 y 8,010. No obstante, la lipasa producida por Seaphilococcus hycus
presenta como p11 ptimo 9,032 y la lipasa de Bacillus tiene como pH ptimo ~

U.2.3.b.- Esuecificidacl
En funcin de su especificidad posicional las lipasas se clasifican en dos grupos:

Lipasas no especificas
No presentan una especificidad particular por las posiciones 1,2 3 de los
triglicridos. segn se refl~a en el esquema anteriormente citado. Producen cidos grasos
y glicerol, no apareciendo los diglicndos como intermedios de la reaccin.
A este grupo pertenecen las lipasas producidas por Candida ngosa, (i7eotrichum
canddum, Staphylococcus aureus, Penicllium cyclopium, etc.

Lipasas especificas
Actan especificamente sobre las posiciones 1 y 3 del glicerol. A este grupo
pertenecen las lipasas de Aspergllus lger, Rhizopus arrhizus, Rhizopus de1ema~ Rhizopus
javanicus, Pseudomonas species y Rhizoinucor rniehei38 (Esquema 2)
Tambin existen lipasas especficas de la posicin 2 del esqueleto de glicerol de la
trioleina, como la isoenzima de la lipasa de Geochum candidu,n42, pero son mucho ms
escasas.

15

Lipasas

ji

OC-R

3H20

LIPASA

1s
triglicrido

R1COOH

2-monoglicdo

R3COOH

2 cidos gyasos

Esquema 2: Mecanismo general de accin de las lipasas 1,3-especficas

Dentro de los factores que influyen en la especificidad de las lipasas microbianas, la

longitud de la cadena y el grado de insaturacin de los cidos grasos del triglicrido son los
dos factores mas importantes, pudindose encontrar numerosos ejemplos en la bibliografa.
La lipasa de PenicWum cyclopum es ms activa frente a triglicridos con cidos de cadenas
cortas que can los de larga cadena; la lipasa de Aspergillus nger y Rhizopus delemar
43. Afford~
muestran ms actividad hacia triglicrdos con cidos de longitud de cadena media
y Jensen45 han encontrado que la lipasa de Geotflchurn candidum es altamente especficapara
cidos grasos con un doble enlace cis en C

9.

11.2.4.- MECANISMO DE ACCION

Las lipasas son enzimas lipoliucas activas uncamente cuando estn adsorbidas sobre
46. Esta
una interfase oleo-acuosa; fenmeno que recibe el nombre de activacin interfacial
es la diferencia fundamental con las esterasas, que catalizan el mismo tipo de reacciones, pero
en medio acuoso. Por esta razn la utilidad principal de las lipasas reside en la posibilidad
de actuar sobre sustratos apolares, que solo son solubles en medios hidrfobos.

1L2.4.a.- Activacin interfacial

Durante dcadas se ha discutida mucho acerca de las bases moleculares del fenmeno
de la activacin interfacial de las lipasas. Algunas de estas teoras destacan el papel
fundamental del sustrata, mientras que otras se centran en la importancia de la enzima.
Segn las denominadas teoras del sustrato se enfatiza el papel de la concentracin
y organizacin del sustrato en la interfase oleo-acuosa. En este sentido, Brockman47 sefiala el
16

Introduccin

papel fundamental de la agregacin del sustrato en la interfase cuando se lleva a cabo la

hidrlisis de un sustrato insoluble en agua. Otros autores apuntan el hecho de la diferente
orientacin/conformacin de las molculas de sustrato en la interfase, lo cual favorecera un
ataque ms eficaz del enzima. Brockerhoff y Jensen4 proponen una teora basada en la
deshidratacin del sustrato al unirse en la interfase facilitndose as la formacin del complejo
enzima-sustrato.
Por el contrario, los defensores de la denominada teora de la enzima, postulada
principalmente por Desnuelle y cok, en l960~~, sugieren que durante la adsorcin de la lipasa
sobre la interfase oleo-acuosa se producen una serie de cambios coniformacionales en la lipasa.
Los recientes estudios por mecnica molecular y por rayos-x de la lipasa de Rh.miehei y por
rayos-X de su estructura cristalizada apoyan la segunda teora, ya que se ha comprobado la
existencia de una tapadera hidrofba constituida por un segmento helicoidal de la cadena
protica, que cubre el centro activo de la lipasa y que tras la adsorcin de la enzima a la
interfase oleo-acuosa, se abre dejando libre e] acceso del sustrato hasta el centro activo de la
enzima, donde se sita la triada cataltica y el agujero oxianinico, formado tambin tras la
adsorcin enzimtica. Estas zonas estructurales se describirn con detalle ms adelante (ver

11.3.3.).
En 1960, Desnuelle y co/si9 sugirieron un modelo bidimensional para explicar la
actividad lipolitica de las lipasas, que supuso un importante avance en el conocimiento del
mecanismo de accin de estas enzimas interfaciales. Dicho modelo sugiere que las lipasas.
que son enzimas hidrosolubles, para fijarse a la superficie interfacial deben sufrir un cambio
confonnacional previo. Este cambio conformacional ha sido observado en la fosfolipasa A

5052 (Figura 2)

y en lipasas de hongos

17

Lipasas

044. IDROFOuCO

NH

Superficie

Figura 2: Esquema del mecanismo de accin de la fosfalipasa A2 (a) y de una lipasa (h).

Otra hiptesis, basada tambin en la modificacin enzuntica, consiste en la

dimerizacin de la enzima inducida por la agregacin del sustrato. Verger y co/sl postularon
un modelo segn el cual la enzima se une a la interfase por un lugar adicional topogrfica y
funcionalmente diferente al lugar de actuacin, estabilizando las interaciones con la interfase
(Figura 3).

Fase acuosa
E

Fase Iipdica
4.

Figura 3: Modelo esquemtico de lipolisis

18

Introduccin

Un factor caracterstico de la lipolisis es que la concentracin y orientacin de la

enzima y del sustrato en una fase superficial viene determinada por fuerzas distintas de las
que intervendran en el caso de interacin directa entre la enzima y el sustrato en la catlisis
homognea.
Como se deduce de la Figura 3. el microentomo de la enzima es muy diferente del
macroentomo. La monocapa donde se encuentra la lipasa viene determinada por la naturaleza
del sustrato, por la presencia o no de agentes emulsificantes, etc., y en general, por el
coeficiente de reparto del sustrato en la bicapa. Por otro lado, hay enzimas que necesitan la
presencia de cofactores, como la colipasa, que sirven de unin entre la protena y la interfase.
Todos estos factores aaden nuevas dificultades al estudio de la actividad enzimtica, por lo
que en la

bibliografa se recogen numerosos trabajos acerca de las caracteristicas fsica-

quimicas de la interfase y de los factores que determinan el rea interfacial de las

emulsiones 4754.56
La principal utilidad de la emulsin es la creacin de grandes reas interfaciales que
contienen el sustrato apolar en un volumen relativamente pequeo. Ello permite la adsorcin
de todas las molculas de enzima en la interfase y la mxima velocidad de reaccin47. La
diferente distribucin del tamao de la emulsin puede modificar el comportamiento cintico
de la enzima Por otro lada, tambin es importante utilizar emulsificantes apropiados que
disminuyan la tensin interfacal e impidan fenmenos de agregacin, que provocan la
disminucin del rea, superficial47
Actualmente se recomienda el uso de monocapas lipdicas frente a los sistemas
clsicos, ya que presentan una sede de ventajas57:
a).- Son muy sensibles por lo que se necesitan cantidades mnimas de lpidos para
realizar medidas cinticas.

b).- Permiten el control de parmetros fsico-qumicos caractersticos de la pelcula

monomolecular, apanando informacin sobre el curso de la reaccin.

c)- Se mejora la calidad de la interfase, que depende de la naturaleza de los lpidos

que forman la monocapa, orientacin y conformacin de las molculas, carga,
viscosidad, etc.
19

Lipasas

ll.2.4.b.- Mecanismo de reaccin de a linolisis y sntesis de steres

Las lipasas presentan un elemento estructural diferenciador que no se conoce en otro
grupo de enzimas. Dicho elemento estructural es una tapadera formada por una porcin
helicoidal de la cadena polipeptidica, que se coloca sobre el centro activo de la enzima
cuando est inactiva. Tras la activacin interfacial, expuesta en la seccin anterior, esta
tapadera se abre, dejando libre el acceso hasta el centro activo. Adems, se forma un
aguj ero oxianinico donde se unir el sustrato y ser, tambin, el encargado de estabilizar el
mtermedio tetradrico de la reaccion.
El centro activo de las lipasas est constituido por una triada cataltica
(Ser His Asp), que constituye otro elemento comn (junto con el agujero oxianinico) entre
las lipasas y las serinproteasas58. Por lo que, el mecanismo de accin de las lipasas es muy
semejante al de las serinproteasas.
Para el estudio del mecanismo de accin de las lipasas se analiz la estructura de los
complejos covalentes cristalizados de la lipasa de Rh.mehe con sus inhibidores (fosfonato
de p-nitrofenilo y n-hexilfosfonato de etilo)5960 y se observ que la apertura de la tapadera,
al unirse con el inhibidor, provoca una alteracin total en la superficie de acceso al centro
activo de la enzima, de forma que sta zona adquiere un caracter ms hidrfobo, favoreciendo
la interaccin de los sustratos (Figura 4).

20

Introduccin

Hydrcpbobic surface
r

Hydwpbobc surface
lbpu

Figura 4: Activacin interfacial de la lipasa de Rh.mehe. (C) enzima nativa; (D) complejo
enzima-inhibidor.
21

Lipasas

El mecanismo de accin de las lipasas en la reaccin de sintesis o hidrlisis de steres,

en funcin del tipo de sustratos, es muy similar al de las serin-proteasas61, como se muestra
a continuacin en la Figura 5.

o
Asp<2os~

o
IV.- Complejo acil-enzima

1.- Complejo enzima-sustrato

iL

11
o

<0

Asp<203

Aspc2os)
H

II.- Intermedio tetradrco

V.- Intermedio tetradrico

11

11

00
Sp203

00
Aspi~o~~~< --

1-1N

N-~ 1-1-0

o
o

1-l

20

III.- Complejo acl-enzima

VI.- Complejo enzima-producto

Figura 5: Mecanismo general de sntesis de steres catalizada por lipasas. La numeracin de

6
los residuos corresponde a la lipasa de Rh.miehei

22

Introduccin

Durante

la reaccin de sintesis de steres, el carbono carbonilico del cido sufre el

ataque nucleoflico del grupo hidroxilo del residuo de Serma de la triada cataltica, que ha
sido previamente activado a travs de una red de puentes de hidrgeno con los otros dos
elementos de la triada (Histidina y Asprtico) (Figura 5). A continuacin, se forma un
intermedio tetradrico que se estabiliza porpuentes de hidrgeno con el residuo Serina-82 que
forma parte del agujero oxianinico. Este frgil intermedio se rompe liberando una molcula
de agua y dando lugar al complejo acil-enzima, el cual es atacado por el alcohol que hay en
el medio de reaccin. De esta manera, se forma otro intermedio tetradrico, tambin
estabilizado por el agujero oxianinico, que se rompe liberando el ster corespondiente. Al
mismo tiempo, la trada cataltica de la enzima recupera su estructura original. La velocidad
de reaccin de todo este proceso est determinada por la primera fase, formacin del complejo
acil-enzima, ya que es la ms lenta.
En las reacciones de hidrlisis de steres el mecanismo de accin es el mismo; la
nica variacin reside en la naturaleza de los sustratos. El primer donador de ada es un ster,
en lugar de cido; tras la rotura del primer intermedio tetradrico se libera un resto alcohlico
y el ataque nucleofilico final lo realiza una molcula de agua, en lugar de una molcula de
alcohol.
11.2.5.- ACTIVIDAD CATALITICA DE LAS LIPASAS
Un catalizador se defme como toda aquella sustancia que acelera la velocidad de una
reaccin y puede ser recuperada, sin sufrir cambios qumicos, al final de la reaccin.
En los organismos vivos las enzimas actan como catalizadores de la mayora de las
reacciones biolgicas; pero actualmente las enzimas tambin se utilizan como catalizadores
de reacciones de sntesis quimica orgnica, pennitiendo la realizacin de reacciones que antes
presentaban muchos inconvenientes o eran inviables (ver ILZ 6,).

23

Lipasas

lI.2.5.a.- Cintica enzim tica

U.2.5.a.1.- Determinacin de la actividad catalitica de una enzima.
La actividad catalitica de una enzima se expresa como milimoles de sustrato
transformados por unidad de tiempo.
Cuando se quiere comparar la actividad de distintas enzimas, como catalizadores de
una determinada reaccin, se utiliza el trmino de actividad especfica que equivale a la
actividad cataltica por miligramo de protena.
El valor de actividad cataltica se calcula a travs de la pendiente de la recta obtenida
al representar la velocidad de reaccin, expresada en milimoles de sustrato transformados por
minuto, frente a la cantidad de protena, expresada en miligramos. Para poder comparar la
actividad enzimtica especifica de distintas enzimas es necesario que la determinacin de su
concentracin protica se haya realizado siguiendo la misma metodologa, ya que los
resultados obtenidos, por ejemplo segn el mtodo del biuret y el mtodo de Bradford son
diferentes.

ll.2.5.a.2.- Estudio del mecanismo de accin de una enzima

El mecanismo de accin de una determinada enzima depende del tipo de reaccin que
catalice. En la presente Tesis Doctoral se analizaron dos mecanismo de accin para la lipasa
de Rh.mehe:
a) reacciones de hidrlisis con un salo sustrata (determinacin de la actividad
lipsica y estersica), segn cintica Michaelis-Menten.

b) reacciones de sntesis de steres con dos sustratos, segn cinticas de tipo

ping-pang bi-bi.

Cinticas de Michaelis-Menten.
Los principios generales de la cintica de las reacciones qumicas son aplicables a las
reacciones catalizadas por enzimas, pero stas muestran un rasgo caracterstico y que solo se
d en las reacciones biocatalizadas: la saturacin con el sustrata.
Las reacciones ms sencillas de la cintica enzimtica, son aquellas en las que un
sustrato 5 es convertido en un producto P por medio de una reaccin catalizada por una
24

Introduccin

enzima E, sin que se produzcan inhibiciones por producto u otras sustancias. Estas reacciones
siguen el siguiente esquema:

SE

S-E

-~

P+E

La cintica de estas reacciones enzimticas sigue el modelo descrito por Leonor

Michaelis y Maud Menten en 191363. Segn este modelo cintico, para una determinada
concentracin de enzima, la velocidad de reaccin aumenta proporcionalmente con la
concentracin de sustrato [S], hasta ocupar todos los centros activos de la enzima, alcanzando
entonces un estado de saturacin enzimtica y mxima actividad con una velocidad constante
(V~j (Figura 6)

Figura 6: Representacin de Michaelis-Menten. Efecto de la concentracin del sustrato sobre

la velocidad de una reaccin catalzada enziniaticamente.
Este proceso se expresa cuantitativamente a travs de la ecuacin de MichaelisMenten, ecuacin de velocidad para las reacciones catalizadas por enzimas que slo actan
sobre un sustrato y que es considerada como la ecuacin bsica de la cintica enzimtica.

25

Lipasas

[5]
KM + [S]

Constante de M.ichaelis

(CM):

[1]

es la concentracin de sustrato a la cual se alcanza una

velocidad de reaccin que equivale a la mitad de la velocidad mxima, es decir, es la

concentracin de sustrato a la cual la mitad de los centros activos de la enzima estn
ocupados. KM indica el grado de estabilidad del complejo enzima-sustrato; ya que

ni

valor

elevado de KM indica que la unin del complejo es muy dbil.

Velocidad mxima (V~J: Indica la velocidad mxima de reaccin, que se obtiene

cuando todos los centros activos de la enzima estn saturados de sustrato.

Para analizar la actividad cataltica de una enzima se utiliza el nmero de recambio

(kJ, parmetro que relaciona la velocidad mxima de reaccin con la concentracin inicial
de enzima y que, representa el nmero mximo de molculas de sustrato convertidas en
producto por unidad de tiempo por una molcula de enzima cuando est totalmente saturada
de sustrato.
y
ma

[2]
[E0]
Con el fin de transformar la ecuacin de Miehaelis-Menten en una representacin
6566.
lineal se siguen los mtodos de: Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee
*

Mtodo de Lneweaver-Burk: Se representan el inversa de la velocidad de reaccin

(11v) frente al inverso de la concentracin de sustrato (lis). El punto de corte
de la recta con el eje y representa la inversa del valor de V~ y el valor de
la pendiente equivale al cociente KMN~

26

Introduccin
*

Mtodo de Eadie-Hofstee: Se representa la velocidad frente al cociente V/(S]. El

valor de la pendiente equivale a -KM y el punto de corte con el eje de
ordenadas equivale a

La representacin de Eadie-Hofstee se considera ms precisa67~8, por lo que va a ser

la representacin lineal utilizada en la presente Tesis Doctoral.

Cinticas muitisustrato
La mayoria de las enzimas suelen utilizar ms de un sustrato para llevar a cabo su
accin cataltica. Muchos de los principias aplicados para enzimas que actan sobre un solo
sustrato pueden aplicarse tambin a sistemas multisustrato. No obstante, en la mayoria de
estos casos se suele observar un comportamiento michaeliano cuando la concentracin de un
sustrato se mantiene constante y solamente vara el segunda sustrato. Segn la terminologa
comunmente aceptada, se consideran reacciones secuenciales aquellas en las que todos los
sustratos se unen a la enzima antes de que se forme el primer producto de la reaccin. Estos
mecanismos secuenciales se llaman ordenados si los sustratos se unen a la enzima y los
productos se liberan en un orden obligatorio. Par su parte, un mecanismo al azar implica la

no obligatoriedad en el orden de combinacin o liberacin. Par otra parte, las reacciones en

las cuales unos o ms productos se liberan antes de que todos las sustratos se aadan se
denomnina 1,inz-vona o de doble desplazamiento y el trmno uni-uni o bi-bi hace referncia
al nmero de sustratos presentes.

La cintica de las reacciones de transferencia de acilo catalizadas por lipasas en medio

orgnico, que pueden concluir en la sntesis o hidrlisis de steres en funcin de la naturaleza
de las sustratos, corresponde a un mecanismo de reaccin tipo pmg-pong bi-bi69, que es una
variacin del modelo de Michaelis-Menten, definido para reacciones con das sustratos y que
se desarrollan en das etapas.
El mecanismo general de reaccin de las lipasas se basa en la formacin de un
complejo acil-enzima con el primer sustrato racnuco (A~ y A

5), que posteriormente sufre un

ataque nucleofilica por el segundo sustrato (B) formndose los producto de la reaccin

(~R

y P3). Este mecanismo de accin se represent en el apartado anterior (ver 1L2.4.b.; Figura
S), pero se puede esquematizar para un sustrato racmica segn el siguiente modelo:
27

Lipasas

reaccin enantimero R
R2OH

R,OF-I

Enzima RC02R1

I----1

ROQEnz

Enzima+ R002---R2

A6

AR

reaccin enantimero 5
R10H

Enzima

RCO--Enz

iZi.~-p..
k2,

Enzima+
________

A,

PS

Esquema 3: Mecanismo do reaccin tipo ping-pang bi bi para sustratos quirales

En las reacciones de sntesis de steres los sustratos AR y A8 son los enantimeros

de un cido y K-OH es un alcohol, mientras que los productos

~R

y P~ son los enantimeros

del ster formado y R1-OH es el agua liberada en la reaccin

En el esquema 3, para la reaccin de sntesis de steres, k8, kb, W8 y kb son constantes
70. Cineticamente, lc, y k, equivalen a K
netas de velocidad
0/K,J, de ambos enentimeros (AR
y

A8) y kb, kb representan la constante de unin y el rendimiento cataltico de cada complejo

diastereoisomrico acil-enzima respecto al nuclefilo aquiral.

Los valores de las constantes de velocidad k8 y kb corresponden a las siguientes
ecuaciones

3 y 4 respectivamente.

ka
=

exp (-A071/RT)

[3]

exp (-AG~/RT)

[4]

donde T1 y T2 indican los estados de transicin.

Si la velocidad de reaccin del enantimero AR

y la velocidad del enantimero

7
rival A8 es VAS entonces ~plicando el mtodo de constantes netas de velocidad de Cleland
,

se obtienen las siguientes reacciones:

28

es VAR

Introduccin

tnz]OvR=

l/kdA~]

[EnziO/vAS l/kjA5]
=

Estas ecuaciones
competitidores

k~[Asjj/k~kb[AR] )

(l/kb +

(1/kb

ks[AR]/kakb[Aj)

l/(ROH]

[5]

l/[ROH]

[6]

indican claramente que la discriminacin entre dos sustratos

depende de la secuencia completa de la reaccin.

En las reacciones de hidrlisis de steres los sustratos

(AR

y A8) son los

enantimeros de un ster quiral y R2-OH es un alcohol, mientras que los productos

(~R

y P5)

son los enantimeros del cido liberado. En estas reacciones se produce una prdida parcial
de especificidad debido a la elevada concentracin de agua (55,SM), que es el disolvente de
la reaccin. Como consecuencia, el segundo trmino de las ecuaciones 5 y 6, que representa
los pasos que siguen a la fase irreversible de la reaccin, son anulados, quedando esas
ecuaciones reducidas a

las siguientes ecuaciones para las reacciones de hidrlisis

,

[Enz]Jv
[Enz]dyB

11kJA]

[7]

lIka[B)

[8]

Combinando las dos ecuaciones 7 y 8 se obtiene la ecuacin 9~.

VA/VB

= (ka/ka)

([A]/[B])

[9]

Esta ecuacin 9 indica que en las reacciones hidrolticas, la enantioselectividad

depende imicamente de la secuencia cataltica que conduce hasta el pmer paso reversible.
Esta diferencia en cuanto a la enantioselectividad de los dos procesos explica por qu, en
algunos casos, la enantioselectividad del proceso es mayor en las reaccianes de esterificacin
73-75

en disolventes orgnicos que en reacciones de hidrlisis en medio acuoso

Las reacciones que siguen un mecanismo de tipo ping-pong dan lugar a grficas de
Lineweaver-Burk paralelas para diferentes concentraciones del segundo sustrato, mientras la
V~ y la KM del primer sustrato tambin aumentan (Figura 7).

29

Lipasas

[sus*ratO-U]
2K

It

-4.

1/~

Figura 7: Grficas de Lineweaver-Burk paralelas, caractersticas de la cintica ping-pang.

IIZ.5.b.- Estereoseleetividad de las liasas

Las lipasas son enzimas enantioselectivas; propiedad que ha permitido llevar a cabo
transformaciones regio- y enantioselectivas que no eran posibles por tcnicas de Sintesis
Orgnica tradicional y que sern analizadas en el prximo apartado (ver 11.2.6.)

ll.L5.b.1..- Parmetros de enantioselectividad

Con el Fm de cuantificar la enantioselectividad de una enzima en una determinada
reaccin, Sih y cos76~ definieron un parmetro denominado Coeficiente de
enannoselectividad iR). Este coeficiente se defini como la relacin entre los parmetros V,,~
y KM de los dos enantimeros AR y A

8.

Durante una reaccin enantioselectiva, silos dos enantimeros compiten por el centro
activo de la enzima y se cumplen las exigencias de la teora del estado estacionario postuladas
por Michaelis-Menten, las velocidades de reaccin de ambos enantimeros se pueden definir
en funcin de los parmetros cinticos K0~ y KM. segn las siguientes ecuaciones:

30

introduccin

[E] lAR]

[10]

/ KM)AS [E] [A8]

[11]

~AR

(kcat

~AS

KM)AR

Por tanto, el coeficiente de enantioselectividad (E), seguiendo la definicin antenor

se puede expresar segn la ecuacin 12

(V~ KM)A
[12]

(VWS.X/KMt

Dado que estas constantes cinticas estn relacionadas con la energa libre de ambas
estados de transicin, la enantioselectividad de una reaccin est relacionada con la diferencia
de energa de los estados de transicin correspondientes a cada ismero (ecuacin 13).
(k0~ KM)A
AAG=(AGt-AGB)=-RT1n

[13]
(k~~ KM)B

Actualmente, para reacciones irreversibles en lugar de utilizar todos estos parmetros,

las reacciones correspondientes a cada uno de los enantimeros, se
7<1 que
simplifica el proceso empleando la expresin matemtica propuesta por St y coW
relaciona el valor de E con la conversin (c) y el exceso enantiomrico del sustrato (e;) o
caractersticos

de

del producto (eec). El inconveniente de este parmtro es que solo se puede aplicar en
ecuaciones de primer orden o de pseudoprimer orden, es decir en aquellas reacciones
donde solo haya un sustrato o en las que uno de ellos est en una concentracin muy supenor,
como la reaccin de hidrlisis de steres, en la cual uno de los reactivos (el agua) es el
disolvente de la reaccin y la velocidad de reaccin depende unicamente de la concentracin
del ster.

[14]
lix [(l-c)

(l+ee
8)]

31

Lipasas

lix [l-c (l-ee,)]

[15]
lix [l-c (l+ee~)]
En estas ecuaciones la conversin y los excesoso enantiomricos se expresan en tanto
por uno.

1L2.&b.2.- Determinacin experimental del rada de enantiaselectividad de una

reaccin.
Para determinar el grado de enantioselectividad alcanzado en una reaccin la
metodologa ms utilizada es la cromatografa por HPLC con columna quiral.
La cromatografa se basa en la distribucin de un compuesto entre das fases: una
mvil y otra estacionaria.

Hasta hace pocos aos, la mayora de las fases estacionarias

utilizadas en cromatografa gaseosa y en cromatografa lquida eran aquirales, lo que

significaba que la separacin

de enantimeros no poda realizarse directamente, sino que

previamente haba que formar diastereoismeros por reaccin con un agente opticamente puro.
Brooks y Gilbert76 desarrollaron por primera vez tui mtodo de separacin de los dos
ismeros de Ibuprofen por cromatografa gaseosa, mediante la formacin de amidas
diasterosisomricasde

este cido con R(+) -metil bencil amina. A partir de ese momento, han

ido ~areciendo en la bibliografa diversos mtodos de separacin de enantimeros de cidos

2-anpropincos mediante cromatografa, previa derivatizacin777.
No obstante, es ms til utilizar un mtodo cromatagrfico directo de separacin de
enantimeros utilizando una fase estacionaria quiral y una fase mvil aquiral. En la presente
Tesis Doctoral se ha seguido esta metodologa utilizando columnas quirales tipo Chiralcel
(Daicel Chemical Imnd.), cuya fase estacionaria supramolecular es un derivado de celulosa y
una fase mvil aquiral, con una composicin determinada segn el cido 2-arilpropinico
analizado (Tabla 13). Dado que experimentalmente se detennina el exceso enantiomrico del
cido quiral (producto de la reaccin de hidrlisis de los esteres de dichos cidas 2arilpropinicos), para calcular el coeficiente enantiomrico (E) dela reaccin de hidrlisis se
utilizar la ecuacin [15].

32

introduccin

1L2.6.-. ACTIVIDAD DE LAS LIPASAS EN MEDIO ORGNICO

El medio natural de actuacin de las enzimas durante los procesos biolgicos es el

agua. En este medio las enzimas adoptan una conformacin plegada de forma que los
aminocidos apolares se colocan hacia el interior de la molcula, mientras que los residuos
polares se disponen en la superficie en contacto con el agua del medio79. En medio orgnico
las enzimas tenderan a plegarse en sentido contrario, de forma que quedaran en la superficie
los residuos apolares. Este hecho conduce al planteamiento de cmo es posible que las
enzimas puedan retener su actividad cataltica en medio orgnico.

Las diversas investigaciones llevadas a cabo coinciden en sealar que la estructura

enzimtica en medio orgnico no se modifica, y par tanto, la actividad enzimtica se

mantiene. Algunos autores afirman que una enzima nativa en medio orgnico sufre mi
atrapamiento cintico, debido a las interacciones hidrfobas producidas por la baja constante

dielctrica del medio, lo que permite el mantenimiento de la estructura proteica. Esta rigidez
enzimtica se ha camprobado en la proteinasa a-ltica mediante tcnicas de RMiN de deuterio
so

en estado slido

y en la a-quimotripsina mediante tcnicas de resonancia de spin

electrnco8t. Otros autores han comprobado que tras liofilizar una disolucin enzimtica,
dicha enzima mantiene la conformacin que tena al pH de la disolucin de partida y adems
dicha conformacin se mantiene cuando la enzima liofilizada se utiliza en un medio con
disolventes orgnicos anhdros~. Finalmente, se ha comprobado por medio de diagramas de

difraccin de rayos-X, que la estructura de la subtilisina Carlsberg cristalizada en acetonitrilo

anhidro es idntica a la de la enzima en aguan

11L2.6.a.- Ventajas de la catlisis enzimtica en medio or~nco

El empleo de enzimas como catalizadores en medio orgnico presenta una serie de
ventajasl3M:
1).- aumento de la solubilidad de la mayada de las compuestos orgnicos
2).- posibilidad de llevar a cabo reacciones que son imposibles en medio acuoso
debido a restricciones cinticas o termodinamicas.
3) - aumento de la estabilidad enzimtica
4) sencilla recuperacin de los productos de reaccin
-

33

Lipasas

5).- debido a la insolubilidad de las enzimas en medio orgnico es posible su

recuperacin al final de la reaccin por simple filtracin, lo que permite su
posterior reutilizacin.
6).- eliminacin de contaminaciones microbianas.
7).- se evitan reacciones secundarias provocadas por el agua, como la hidrlisis de los
anhdridos de cido utilizados como agentes acilantes o la polimerizacin de
las quinonas, utilizadas como regenerador de cofactores.
8).- aumenta su estabilidad trmica, permitiendo su utilizacin a temperaturas elevadas,
hasta 1 00 0C47.

9).- las enzimas inmovilizadas por adsorcin sobre superficies no porosas no se

desprenden del soporte cuando se utilizan en medio orgnico.

IL2.6.b.- Eleccin del disolvente orgnico

La naturaleza del disolvente orgnico afecta a la estabilidad y actividad enzimtica por
70
tres vias

a>.- Inhibiendo o inactivando la enzima por interaccin directa con ella, ya que
el disolvente orgnico puede distorsionar las puentes de hidrgeno y las interacciones
hidrbofas que mantienen la estructura protica, provocando una disminucin de su actividad
y estabilidad88.

b).- Los disolventes orgnicos pueden interaccionar con sustratos o con

productos de la reaccin. Por ejemplo, el cloroformo provoca una significativa disminucin
de la actividad cataltica de la peroxidasa durante la reaccin de oxidacin de fenoles89.

4- el disolvente orgnico puede interaccionar con la capa de agua esencial que

rodea a las enzimas, provocando la alteracin de su conformacin activa. La interaccin entre

el disolvente orgnico y el agua esencial de una enzima es directamente proporcional al

caracter polar de dicho disolvente; ya que los disolventes polares tienen mayor capacidad para

captar esas molculas de agua, provocando la desnaturalizacin, y por tanto desactivacin

enzimtica90. Esta va de alteracin enzimtica es la ms importante en el caso de las lipasas.

34

Iniroduccwn

En general, la eficacia catalitica de las enzimas disminuye al aumentar la polaridad del

disolvente75. Se ha comprobado que los disolventes polares pueden desactivar las enzimas; al
captar el agua esencial para el mantenimiento de la conformacin enzimtica activar o al
penetrar hasta su ncleo hidrofbo, alterando su delicada conformacin.

Con el fin de optimizar la actividad cataltica de las enzimas en medio orgnico se

suele utilizar el parmetro logP (coeficiente de particin del disolvente en un medio bifsico
n-octanol/aguaf93, como medida de la polaridad de los disolventes orgnicos74.~. Laane ~

cols.96 analizaron la relacin existente entre la actividad enzinitica de varias lipasas y otros
parmetros fisico-quimicos de los disolventes orgnicos, como la constante dielctrica (e), la
capacidad de formar enlaces de hidrgeno (y), el momento dipolar (u) y la polarizabilidad
(a), pero solo obtuvieron una correlacin clara con el valor de logP.

En funcin del logP se han clasificado los disolventes orgnicos en tres grupos96:
1).- JogP <2 (solubilidad en agua superior al 0,4 %) Distorsionan la delicada
y vital capa de agua que rodea a las protenas, ya que penetran en dicha capa o reemplazan
las molculas de agua de dicha capa
III).- Iog P entre 2 y 4 (solubilidad en agua entre 0,04 y 0,4 %). Distorsionan
las interacciones enzima-agua, pero en menor medida que los disolventes anteriores. Alteran
la actividad enzimtica de forma impredecible.
In).- IogP > 4 (insolubles en agua). No distorsionan el escudo de molculas
de agua que rodean a la protena y mantienen a la enzima en su estado activo.

As pues,los disolventes apolares como: hexano, isooctano, tolueno, ciclohexano, tercbutil- y diisopropilter y derivados halogenados como tricloro- o trifluoroetano han sido
utilizados con xito coma disolventes ai reacciones catalizadas par lipasas. Sin embargo, al

utilizar disolventes polares como N,N-dimetilformamida(DMF), piridina y n-butanol, se altera

la estabilidad enzimtica y se desactiva el biocatalizador70.
Centrndonos en el comportamiento de la lipasa de Rh.mehe diremos que Zaks y

35

Lipasas

Klibanov3, tras analizar la influencia de la naturaleza del disolvente orgnico en la actividad

de tres lipasas de origen diverso (lipasa pancretica porcina, lipasa de Rhsnwhei y lipasa de
C.cylindracea) durante la reaccin de transesterificacin de tributirina y n-heptanol,
observaron que la lipasa de Rhwnehe ocupa una posicin intermedia respecto a su
sensibilidad a la naturaleza del disolvente, ya que la actividad de la lipasa de C.cylindracea
es directamente proporcional a la naturaleza del disolvente y la actividad de la lipasa
pancretica porcina no tiene ninguna relacin con el mayor o menor grado de polaridad del
medio, debido probablemente a que sus molculas esenciales de agua estn ms fuertemente
unidas y es ms dificil que el disolvente las elimine96. Adems, comprob que ningua de estas
lipasas era activa en dimetlsulfxido y DMF, debido a la disolucin de las proteinas en estos
disolventes, mientras que en los otros disolventes las lipasas se mantienan en suspensin y
activas.
Miller y cols.9 analizaron la actividad de la lipasa inmovilizada de Rh.miehe
(Lipozyme 1M20) en la reaccin de sntesis del miristato de propilo utilizando diferentes
disolventes. Comprobaron que esta lipasa es practicamente inactiva en disolventes polares o
miscibles en agua, mientras que presenta una elevada actividad en disolventes apalares.
Adems, comprobaron que en algunos casos en los que se utilizaron disolventes polares era
posible recuperar la actividad enzimtica resuspendiendo la lipasa en un disolvente apolar
como el hexano y aadiendo una cierta cantidad de agua. Esta recuperacin solo fue posible
en el caso del tetrahidrofurano (THF) debido a que este disolvente elimina solamente las
molculas de agua unidas muy debilimente a la enzima, provocando pocas alteraciones
conformacionales, las cuales son fciles de solventar al adicionar cierta cantidad de agua. Por
el contrario, al seguir el mismo procedimiento con DMIF, la enzima no recuperaba su
actividad, ya que este disolvente elimina todo el agua de la molcula provocando alteraciones
irreversibles de la protena.
En conclusin, el disolvente orgnico ideal para una determinada reaccin es aquel que
solubiliza los sustrato~9 y no desorbe ni distorsiona el manto acuoso esencial para el
mantenimiento de la conformacin activa de la enzima~.

36

Introduccin

11L2.6.c.- Importancia del agua en la actividad enzimtica en inedia orgnico

Como se indic anteriormente, el medio biolgico de actuacin de las enzimas es el
agua, ya que participa directa o indirectamente en todas las interacciones no covalentes
(interacciones electrostticas, enlaces de hidrgeno y fuerzas de Van der Waals0 que
permiten el mantenimiento de la conformacin nativa, y por tanto, catalticamente activa de
las enzimas~ ~

Adems, se ha comprobado que aunque las enzimas mantienen

perfectamente su actividad y conformacin en medio orgnico, se pueden inactivar si se

elimina todo el agua del medio, ya que el disolvente orgnico captar molculas de agua de
la enzima. Por tanto, la cuestin que hay que plantearse no es si las enzimas necesitan agua,
smo cuanta agua necesitan para mantener su conformacin activa en un medio determinado3.

El mtodo ms conecto para establecer la cantidad de agua esencial para la actividad

de una determinada enzima se basa en la correlacin entre la actividad cataltica y la cantidad
de agua disponible por la enzima en un disolvente orgnico. Esta correlacin se obtiene a
travs del concepto de actividad de agua (a,j, que es el mejor parmetro para describir la
distribucin de agua en sistemas multifsicost

II.2.6.c.1.- Actividad de agua (a,,)

S suponemos un sistema cerrada en el que una fase gaseosa hmeda se encuentra en
equilibrio con una fase lquida, tambin hmeda, se puede defmir la actividad de agua (a,,)
de la fase lquida a una temperatura dada como [161105

fw

[16]

donde:

f,, es la fugacidad del agua en la mezcla a la temperatura de equilibrio

es la fugacidad del agua pura a la misma temperatura

Si la concentracin de agua en el sistema es pequea (como sucede en los procesos

biocatalizados en medios orgnicos ligeramente hidratados) y se trabaja abajas presiones (pe.
a presin ambiental de 1 atm), se puede suponer que el vapor de agua se comporta como un
37

Lipasas

gas ideal, por lo que se puede sustituir la fugacidad por la presin parcial del vapor de
agua [17].
1,,
[17]

La presin de vapor del agua pura (P0,,) en estas condiciones se considera igual a la
unidad. La ecuacin transformada y expresada en tanto por ciento se define como Humedad
relativa en el equilibrio (PiRE) [18].

HRE=P,,lO0=a.~<lO0

[181

II.2.6.c.2.- Isotermas de adsorcin

En la prctica, la actividad de agua (a,,) se determina introduciendo la muestra en una
cmara de medida cenada, a temperatura constante y con volumen lo ms pequeo posible.
Pasado un tiempo, se alcanza el equilibrio entre la humedad del aire de la cmara y la de la
muestra. Esta humedad relativa del aire en la cmara de medida, corresponde a P~, y si
consideramos P~

1, obtenemos el valor de a,, a partir de [17).

La forma ms comn de representar estos datos, es una curva que mide la variacin
de la cantidad de agua aadida (g. agua g. muestra) frente a a,,. Segn las medidas sean
efectuadas durante la deshidratacin de la muestra (desorcin) o en el curso de la
rehidratacin de la misma (adsorcin o resorcin) se obtendrn dos curvas, que no tienen por
qu coincidir (fenmeno de histresis).
Como se indica en la Figura 8 una isoterma de adsorcin se divide tres zonas.

38

Introduccin

0.23

(kW

Activklad de agua <A..)

0.75

la

Figura 8: Isoterma terica de adsorcin-desorcin.

Al analizar el contenido en agua de una enzima hay que considerar dos fracciones de
molculas unidas a las enzimast06:
a).- la primera fraccin est constituida por molculas de agua facilmente
separables, que pueden ser facil y exactamente cuantificadas por desorcin. Estas molculas
de agua residual (no superior a 0,07 mg agua/mg de enzima), se cree que interaccionan
107

solamente con grupos funcionales cargados y algn agrupamiento de aminocidos polares

El agua que se desorbe inicialmente procede tanto de residuos polares, como no polares de
la secuencia polipeptdica de la enzima; aunque, evidentemente, los residuos ms expuestos
al medio sern los ms polares. La energa libre de desoran, de estas molculas de agua
hacia el disolvente orgnico es favorable (AG <0).

b).- la segunda fraccin de molculas de agua se mantienen fuertemente unidas

a la enzima y constituyen parte de su estructura. Su desarcin desde zonas cargadas de la
enzima hacia el disolvente orgnico suele ser termodinamicamente desfavorable (NG > O).

39

Lipasas

En la isoterma terica (Figura 8) se pueden diferenciartres zonas, que se corresponden

con los diversos tipos de molculas de agua unidas a la enzima:
Zona 1: El agua presente en esta zona de la isoterma es el agua ms
fuertemente unida, que en el caso de las protenas corresponderia al agua de cristalizacin.
Este agua est unida a zonas polares de la protena por interacciones agua-in o agua-dipolo.
La entalpa de vaporizacin de este agua es mucho mayor que la del agua pura, y no puede
congelarse a -40 0C. El limite de las zonas 1 y II coresponde al contenido de humedad
monocapa. Al contrario de lo que pueda inferirse del nombre, la monocapa no significa la
cobertura de toda la materia seca por una capa simple de molculas de agua densamente
empaquetadas, sino que se trata de la cantidad de agua necesaria para formar una monocapa
sobre los grupos altamente polares y accesibles de la materia seca.

Zona II: El agua aadida en la zona II ocupa los restantes sitios de la primera
capa y vanas capas adicionales (agua en multicapa). La entalpa de vaporizacin del agua en
multicapa es ligera o moderadamente superior a la del agua pura.

Zona LII: El agua de la zona III es el agua menos ligada a la protena y por
ello se denomina agua de la fase masiva. Tiene una entalpia de vaporizacin igual que la
del agua pura, por lo que se trata de agua congelable.

ll.2.6.c.3.- Competencia por el agua en un sistema biocatalidco

La disponibilidad del agua alrededor de las molculas activas de enzima depende de
la presencia de elementos en el sistema que pueden competir por el agua, segn sea su
afinidad por la misma,- como: los disolventes orgnicos, los reactivos, los aditivos y los
soportes.

Disolventes orgnicos
Como se indic anteriormente (ver II.2.6.b.) los disolventes compiten, en funcin de
su polaridad, con la enzima por el agua.
La capacidad de captacin de agua por parte del disolvente se refleja en su isoterma
de adsorcin. Halling y cols.0 comprobaron la similitud existente entre las isotermas de
40

Introduccin

adsrocin de agua de las protefnas en aire y en disolventes de diferente polaridad hasta un

valor de a,. prximo a 0,5. De esta forma dedujo que el disolvente no influye en la cantidad
de agua fuertemente ligada a la enzima (que corresponde al agua que todava queda retenida
tras la liofilizacin).
Al realizar estudios de actividad con lipasas en disolventes tan dispares como hexano
(logP

3,5) y 3-pentanona (logP

0,8), se observ que, en todos los casos e

independientemente de la polaridad del medio, la actividad enzimtica ptima de las lipasas

analizadas se situaba en tomo a una a.~= 0,55 t Por tanto, la medida de la actividad de agua
permite establecer las condiciones idneas de reaccin.

Reactivos
La naturaleza y concentracin de los sustratos sobre los que actan las enzimas pueden
alterar la distribucin del agua en el sistema. As por ejemplo, una concentracin elevada de
alcohol0 o de cido en una reaccin de esterificacin catalizada por lipasas, puede
provocar una disminucin drstica de la actividad enzimtica debido a un aumento de la
capacidad de la fase orgnica para solubilizar agua, y por tanto de sustraera del
biocatalizador.

Aditivos
Las sales pueden competir con las molculas de enzima por captar el agua del
medio112. De la misma forma, los azcares presentes en muchos preparados enzimticos
comerciales, son capaces de captar agua3.
Compuestos similares al agua coma el glicerol y otros glicoles4, la N,Ndimetilformamida5 y el dimetilsulfxido6 son capaces de alterar la actividad enzimtica, ya
que estos compuestos actan como mimticas del agua y en algunos casos la adicin de estos
compuestos produce un mcremento en la actividad de muchos biocatalizadores.

Soportes
Reslow y cols.7 demostraron que la naturaleza del soporte sobre el que se inmovdiza
una enzima influye en la actividad cataltica de la enzima inmovilizada. Este comportamiento
es debido a la acuofilia del soporte, que es la capacidad de ste para adsorber agua,
41

Lipasas

utilizando como disolvente de referencia el diisopropilter saturado en agua. Estudios

anlogos8 demostraron que los soportes hidrfobos favorecen la actividad cataltica frente
a los soportes hidrofilicos. De todas formas, ni la capacidad del soporte para absorber agua,
ni su contenido en agua pueden pronosticar una determinada actividad en una reaccin
biocatalizada.
En el equilibrio, la a.~ ser la misma en todas las fases del sistema, incluyendo el
soporte donde la enzima se encuentra mmovilizada. Controlando el valor de a,, del sistema,
se ha podido comprobar que el perfil de la curva actividad enzimtica/a,, es similar en la
mayora de los soportes utilizados922

11.2.7.- APLICACIONES DE LAS LIPASAS

11.2.7.a.- Evolucin histrica de la aplicacin industrial de las enzimas
El uso de enzimas en procesos industriales se remonta a las antiguas civilizaciones
orientales de Clima y Japn, que utilizaban las enzimas para la produccin de alimentos y
bebidas alcohlicas. Homero describe, en ima de sus obras, el proceso seguido por los griegos
para la elaboracin de queso; removiendo la leche con ima rama de higuera. Esta rama
liberaba una proteasa que provocaba la coagulacin de la leche.
En 1875 Christian Hansen desarroll la primera industria de produccin de enzimas.
En su fbrica produca una preparacin enzimtica estandarizada, compuesta por una mezcla
de quimosina, tambin denominada raiina, y pepsina. Esta preparcin se denorni cuajo y
se utiliz en la preparacin de quesos.
Pero, hasta 1955, con la produccin de la glucoamilasa, no se desarroll a gran escala
la industria de las animas. Sin embargo, fue la utilizacin de las proteasas en la composicin
de los detergentes el factor que impuls definitivamente esta industria. A partir, de ese
momento se iniciaron diversos frentes de investigacin acerca de las enzimas y su utilizacin.
Las aplicaciones del uso de enzimas se dividen en cuatro categoras23
1).- enzimas como productos finales:
mdustria de detergentes
industria de agentes de limpieza
industria farmacutica
mdustria de alimentacin animal
42

Introduccin

2).- enzimas como elementos del proceso

mdustria textil
industria del cuero
industria papelera
mdustria azucarera
industria cafetera
3).- produccin de alimentos y bebidas
mdustria quesera
industria cervecera
mdustria del vino y de las zumos
industria de productora de protenas
mdustria crnica
industria panadera
industria de grasas y aceites
4).- enzimas como catalizadores industriales
procesamiento del almidn
produccin de antibiticos
industria dedicada a la qumica fina

IILZ.7.b.- Aulicaciones industriales de las basas

Aunque la industria de las lipasas se ha desarrollado ms lentamente que la de otro
tipo de enzimas industriales como las proteasas y carbohidrasas, recientemente se han
propuesto nuevas aplicaciones potenciales para este tipo de enzimas, lo que las har
enonnemaite competitivas can las anteriormente mencionadas.
El inters actual acerca del uso de las lipasas en procesos biotecnolgicos se debe,
fundamentalmente, a que estas enzimas24:
a).- son capaces de catalizar reacciones de sintesis o de hidrlisis de steres
controlando las condiciones de reaccin; ya que, las lipasas pueden trabajar en medios
muy variados, desde soluciones acuosas a medios orgnicos, sm que sufran una
desactivacin apreciable

43

L4pasas

b).- son enzimas asequibles dada su alta produccin mediante tcnicas de

ingeniera gentica

no son excesivamente sensibles a la estructura del sustrato, lo que las

convierte en biocatalizadores de amplio espectro.

La oferta comercial de lipasas microbianas por parte de laboratorios japoneses,

europeos y americanos, se ha incrementado espectacularmente, debido a su gran variedad de
aplicaciones y a su bajo precio. En la Tabla 2 se muestran algunos ejemplos de lipasas
comerciales.

Tabla 2: Lipasas microbianas comerciales ms utilizadas.

Lipasa de

nombre comercial

laboratorio suministrador

Aspergllus nger

Amano A

Amano

Candida rugosa

LipaseOF, Amano Lipase AY

Sigma y Amano

Rhzomucor mehez

Amano R-l0, Lipozyme

Aniano y Novo-Nordisk

Candida antretica

SP525, SP435A,Novozym435

Novo-Nordisk y Flulca

Georichum candidum

Amano upase GC

Sigma y Amano

gumicola lanuginosa

Lipolase

Novo-Nordisk

Pseudomonas cepacia

AmanoP; PS, PS30, LPSO

Amano y Fluka

Las lipasas se utilizan fundamentalmente en la industria alimentaria (produccin de

quesos y elaboracin de leche para lactantes) y en la industria de grasas y aceites Asimismo,
se emplean en la industria de los detergentes, de los agentes de limpieza, en la industria
farmacutica, en la industria papelera y como catalizadores en numerosas reacciones de
sntesis orgnica.

44

Introduccin

fl.2.7.c.- Utilizacin de las basas en reacciones de sntesis orgnica

En la presente Tesis Doctoral el estudio de las aplicaciones de las lipasas se ha
centrado en su utilizacin como catalizadores de reacciones de Sintesis Orgnica, ya que las
lipasas pueden catalizar reacciones difciles de llevar a cabo por mtodos qumicos
convencionales. A continuacin se indican algunos ejemplos.

Oxidacin indirecta de cidos

El descubrimiento reciente de que las lipasas pueden catalizar la formacin de

peroxicidos carboxlicos a partir del correspondiente cido carboxilica y perxido de
hidrgeno, sea otro ejemplo de aplicacin de lipasas en procesos qumicos orgnicos24 El
proceso objeto de estudio se represaita a continuacin:

Upase

de C.a,wrrttca

o
R~KOH

OOH

Epoxidacic quimiea

01Ri

Esquema 4: Oxidacin indirecta de un cido, catalizada par lipasas.

La lipasa cataliza la oxidacin del cido en percido, presumibleniente por el

intercambio del grupo -OH por -OOH. Esta reaccin se ha utilizado en la epoxidacin de
aclohexeno por tratamiento del alqueno con lipasa, H~O2, y un cido carboxilico de cadena
larga o media.

45

Lipasas
*

Ester4ficacin regioselectiva de O-glucsidos.

La lipasa B de Candida antarctca se ha empleado en la esterificacin regioselectiva

en C6 de glucsidos2t El coste de este proceso es bastante bajo, ya que la glucosa se obtiene
facilmente de los vegetales. Adems, la no utilizacin de reactivos qumicos txicos hace que
este proceso tenga un gran inters industrial (Esquema 5).
RCOO
RCOOH

OH

O%H

Lipasa

OH

OH

OH

OH

Esquema 5: Esterificacin regioselectiva del C~ de O-glucsidos.

Estos compuestos, debido a sus buenas propiedades surfactantes, representan una

importante alternativa a los productos ya existentes, empleados con muy diversos fines; desde
cosmticos a detergentes de lavado en fro, desengrasantes industriales de metales para usos
electrnicos, etc.

ll.2.7.c.1.- RESOL1IJCION DE RACEMATOS

La actividad biolgica, la biodisponibilidad y el metabolismo de un compuesto quiral
25~27. Existen numerosos
puede variar de forma muy significativa de un enantimero a otro
ejemplos acerca del distinto comportamiento de los enantimeros de un determinado
compuesto; ya que uno puede ser activa y el otro inactivo; uno txico y el otro inerte, uno
agonista y el otro antagonista2. A pesar de sto la mayora de los frmacos con centros
quirales se han comercializado, hasta ahora, como mezclas racmicas debido a que la
separacin de los enantimeros par mtodos de sntesis orgnica convencional en algunos
casos es difcil de realizar; lo que conlieva el encarecimiento y prolongacin del proceso29
En 1982, los frmacos racmicos y aquellos compuestos con un solo enantimero puro
se comercializaban en ima proporcin de 7 a 1. Actualmente la situacin es muy diferente,
tras las indicaciones propuestas por la FDA (Administracin Americana de Alimentos y
Medicamentos) en 1992, segn las cuales las frmacos quirales dejan de ser considerados
46

Introduccin

como entidades individuales y comienzan a ser considerados como combinaciones de

frmacos30. Como consecuencia de estas directrices, el desarrollo de un frmaco quiral, si se
quiere comercializar como mezcla racmica conleva la realizacin de estudios farmacolgicos
y toxicolgicos de dicha mezcla y de cada uno de los enantimeros, lo que provoca el
encarecimiento y prolongacin del desarrollo de dicho frmaco.
Las circustancias anteriormente descritashan forzado a muchas empresas farmacuticas
a sintetizar ismeros puros, o por el contrario, a dedicarse a la fabricacin de molculas
aqmrales De ah el pronstico de que, para el ao 2000, el 80% de este tipo de frmacos
sintticos sean comercializados como enantimeros puros3 (Figura 9).

loo

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4~
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C
U)

20

Enaofionwa pta

m
Antes de
1983

U MZCICs roo<flt
AriTos OC
1987

2000

Figura 9: Evolucin de la produccin de sustancias opticamente puras durante los ltimos

anas
De entre todas las posibilidades de introducir asimetra, o de resolucin de racematos,
los procesos biocatalizados estn adquiriendo mayor importancia cada dia y sin duda las
lipasas presentan una enorme aplicabilidad, debido a su enantioselectividad y amplia
especificidad de sustrato, lo que las convierte en instrumentos de gran valor para la obtencin
de compuestos enantiomricamente puros.

47

Lipasas

Realizar un estudio exhaustivo del gran nmero de biotransformaciones recogidas en

la bibliografa sera muy extenso, por ello remitimos a una serie de referencias bibliogrfica,

t No obstante, a continuacin se indican algunos ejemplos

que recogen este amplio campo

de inters.

Reacciones de acilacin

Diversos agentes acilantes se han empleado en acilaciones irreversibles y altamente

enantioselectivas (e.e. > 93 %) de 2-halo-1-aril-etanoles empleando la lipasa de Pseudomonas
fiuorescens39. Se ha demostrado que mediante el uso de esta enzima, en disolventes anhidros
y de acetatos de vinilo

como donadores de acilo es posible sintetizar alcoholes

enanuomricamente puros140-142 de gran inters sinttico (Esquema 6).

(cN

OH

3co)20

Lipasa de Pfiuorescens

OH

OAc
CH

2X

OH
+

AcOH
Lipasa de P.Jluorescens

Esquema 6: Sntesis de alcoholes enantiomricamente putos.

Reacciones de hidrlisis

Scilimati y cok.

llevaron cabo la resolucin de steres racmicos catalizada par

lipasas; para lo cual seleccion un ster no hidrolizable en carboxilo terminal para mejorar
la enantioespecifI~4ad a la hidrlisis del otro grupo ster (Esquema 7)
O

OH

Lipasa

0
+

OH

/1Y41OtBu

OtBu

(n=0,1,5,10)

(R)e.e.>99%

Esquema 7: Hidrlisis enantioselectiva de steres.

48

(8> c.c.

30-96%

Introduccion

El anlisis de las influencias estructurales en la hidrlisis de steres es uno de los

puntos de mayor actualidad en el campo de la biocatlisis. Tras el estudio de la influencia del
tamao del anillo en la hidrlisis de acetatos cclicos, catalizada por la lipasa de Pseudomonas
fluorescens, se ha observado que los acetatos con configuracin R se hidrolizan
preferentemente, con alta enantioselectividad, independientemente del tamao del anillo

1146~

Las lipasas de pncreas porcino y la de Candida rugosa realizan la hidrlisis

enantioselectiva de steres bicclicos47 con un exceso enantiomnco supenor al 94 % para
el caso concreto de los acetatos y de los butiratos de endo-7-oxabiciclo [2,2,1] hept-2-ilo, para
asi obtener los correspondientes alcoholes bicclicos y steres pticamente puros con un e.e.=
9397
148

Varias lipasas, de Pseudotnonas fiuorescens, Aspergullus nger y Candida rugosa, se

han probado en la hidrlisis de los steres etlicos de 2-cloro-N-benciloxicarbonil derivados
de algunos aminocidos no naturales. Los mejores resultados se han obtenido mediante la
reaccin llevada a cabo con la lipasa de Aspergilhs nger, donde se ha observado una
preferencia en la hidrlisis de los enantimeros L (e.e.= 85-96 %)49i Este fu el primer
intento de resolver aminocidos no naturales, algunos de los cuales no se pueden hidrolizar
mediante acilasas.

Con la lipasa de Candida rugosa se han obtenido los enantimeros del trans-2aminocclohexanol

mediante

hidrlisis

de

(+)-2-azdociclohexanoatos

posterior

hidrogenacin50. Con esta rmsma enzima mmovilizada sobre celite5 se han resuelto acetatos
de tetrahidroisoquinolinio utilizando como medio de reaccin isooctano saturado con agua.
OAc
OH
CH:

Lipasa

CH~

doCngosa

CH3

CH

CH3O~y.t~X>

CH3cY>N.Pk..t

Esquema 8: Resolucin de acetatos de tetrahidroisoquinolimo.

49

Lipasas

La hidrlisis enantioselectiva de chsteres, particularmente en compuestos proquirales

est ahora utilizndose como mtodo para preparar sintones quirales para la sintesis de
compuestos bilgicamente activos. Una fcil sintesis de R(-) muscona se ha realizado
utilizando una aproximacin quimoenzimatica va hidrlisis del diacetato proquiral al sintn
quiral, empleando como catalizador la lipasa de Pseudomonasftuorescens52 (Esquema 9).

AcO

OAc

CH

Lipasa de Pjluorescens

AcO
CH3

OH
H
H

(R)-muscona

Esquema 9: Sntesis de R(-)-muscona.

Esta enzima, tambin se ha utilizado en la sntesis de la prostaglandina A2 (PGA2) ya
53 (Esquema 10).
hidrlisis regioselectiva del diacetato inicial

t,
AcOCH
2

Lipasa de P.fiuorescens

CH2OAc

rs

HOCH2

PGA2
CH2OAc

Esquema 10: Sntesis de prostaglandina k

La preparacin de butirato de (R)-glicidilo y (R)-glicsdol, elementos sillares de la
sntesis de frmacos fr-bloqueantes, es un importante ejempo de la aplicacin industrial de
lipasas para la obtencin de productos enantiomricamente puros. La lipasa pancretica
55 (Esquema 11).
porcina se emple en la hidrlisis del ster correspondiente

50

CH

Introduccin

o
II

lipasa pancretica porcino

RCr
Rbutd
butirato

FI

butirato de (R)-glicidilo

de (R,S) glicidilo

(S)-glicidol

ArO/>QNHR
H
OH

estructura general
de IB-bloqueantes
Esquema 11: Resolucin enanticespecfica del butirato de (R,S)-glicidilo.

La lipasa de Geotflchum candidum ha sido utilizada para catalizar la hidrlisis

enantioselectiva y regioespecifica de steres de cidos grasos con un resto aciloxi en posicin

fr Los

correspondientes Whidraxicidos liberados son componentes estructurales de muchas

toxinas naturales de plantas, microorganismos y animales superiores56 (Esquema 12).

1%
Lipasa da O. candida,,

R4jbMe

ster (LS) de cida gruo ~-aciImiJada

OMe

(5> 13-hzdroxiacudo

Me

ster (A) de cidogruo ~-rilaxlado

Esquema 12: Hidrlisis de steres de cidos gasos (3-aciloxilados.

Reacciones de fransester4ficacin

La transesterificacin de un ster en medio acuoso catalizada por lipasas no tiene un

inters prctico, porque se va a producir preferentemente la hidrlisis enzimtica del sustrato
y del producto. Sin embargo, cuando el agua se reemplaza por un disolvente orgnico, como
medio de reaccin, la situacin cambia completamente, obtenindose buenos resultados57.

51

Lipasas

La piridina seca es el mejor disolvente para llevar a cabo la transesterificacin de

steres de cidos carboxilicos y glcidos empleando la lipasa de Pseudomonas fluorescens.
Esta reaccin tiene inters para la produccin de biosupeificies559.
Sin embargo, la lipasa de pncreas porcino es ms activa en tetrahidrofurano,
habindose utilizado en acetilaciones regioselectivas de los hidroxilos primarios en
furansidos. El grupo donador de ado ms activo es el acetato de 2,2,2-trifluoroetilo60. El
grupo de Wong ha utilizado steres de enol, como acetatos de isopropenilo o de vinilo, como
agentes de transferencia irreversible de acilo61. Este proceso es interesante pues el grupo
saliente se tautomenza al compuesto carbonilico correspondiente, lo que hace que la reaccin
sea irreversible (Esquema 13).

O
+

ROH

Lipasa

O
+

RtCH,

Esquema 13: Reaccin de transferencia irreversible de arMo

Bovara62 llev a cabo la la resolucin enantioselectiva del frmaco mucoltico ()
trans-sobrerol, por medio de una reaccin de transesterificacin enantioselectiva.
HO
~0Ac

Lipasa de Pseudomonas

OH

OH

Esqueusa 14: Transetunficaejn del ()-tran.s-sobrerolcon acetato de vinilo.

La lipasa de Rh.miehei se emple para la resolucin del trans-fr.fmilglicidato de metilo

vta transesterificacin63. El exceso enantiomrico (ee) de la reaccin fue del 95

%.

Ambos

productos, el sustrato no modificado (2K, 3S) y el producto obtenido (25. 3R), se convirtieron
en N-benzail-(2R,3S)-3-fensl-isoserina que es la cadena lateral en C-13 del agente antituxnoral
Taxol (Esquema 15).
52

Introduccin

Lipasa da Rh.miehei
+

COOMe

Ph~ ~1~COOMe

R-OH

hl/lS

.1

O
II
NH CPh
Ph

KC

OOH

OH

Esquema 15: Transestenficacin del trans-~-fenilgIicdato de metilo.

Los 2-ciclohexen-l-oles sustituidos en 2 y 3 son intermedios en la sntesis de

alcaloides tales como la (+)-vmcamma. La resolucin cintica de dichos compuestos ha sido
llevada a cabo mediante transesterificacin con acetato de vinilo catalizada por la lipasa de
Rh.mehe. El exceso enantiomrico del correspondiente ster fue del 97%

~.

Reacciones de ester4flcacin

Las reacciones de esterificacin en medio orgnico catalizadas por lipasas son ms

enantioselectivas que las correspondientes reacciones de hidrlisis en agua. Por esta razn las
reacciones biocatalticas desarrolladas en medio orgnico van adquiriendo una gran
importancia como mtodo de obtencin de compuestos homoquirales.
Theil y cola. 165.166 describen la esterificacin regioselectiva y enantioselectiva de un
meso-diol para obtener el acetato de (1 R, 4S)-4-hidroxi-2-iclopenteni]o (esquema 16) que
es un paso clave del proceso de sntesis de la prostaglandina E

2. El rendimiento de esta

reaccin fue de 50-65 % y el exceso enantionirico (ee) superior al 99

%.

La enzima

empleada fue la pancreatina y el agente acilante fue el acetato de tricloroetilo.

53

Lipasa de Rhizomuco, nuiehel

Por su parte Johnson y Bist~ obtuvieron rendimientos y excesos enantiomticos

similares empleando la lipasa B de C.antrctca y el acetato de iso-propenilo como agente
acilante.
OH

OAc
Ijoasa

HO
Esquema 16: Esterificacin regio- y enantioselectiva de un meso-diol:

11.3.- LIPASA DE Rhfzomucor miehel

HSI.- Rbizomucor ,niehei
Rijzomucor mehel es un hongo ficomiceto que en un principio se incluy en el gnero
Mucor68. Tras un estudio ms exhaustivo de su estructura y propiedades se observaron
algunas diferencias importantes en cuanto a su morfologa y requerimientos trmicas, por lo
que se reclasific dentro del gnero Rhzomnucor, que fue defmido como taxn por Lucet y
Constantin en 1899169.
Los hongos pertenecientes al gnero Rhizomucor son termfilos. Lindt (1886), Miehe
(1907) y Lucet y Constantin (1900) a principios de siglo, determinaron que la temperatura
ptima para el desarrollo de las cepas de estos hongos es 37-40 oc y su temperatura de
crecimiento se situa desde 22-24 oc hasta 50 oc, muy diferentes de las temperaturas ptimas
para el desarrollo de los hongos del gnero Mucor9.
Morfologicamate, el gnero Rhzomucor difiere del gnero Mucor por la presencia
de estolones y rizaides ~

54

IMtroduccin

2Snm
a

fi

Ji
a

1 OMm

o o
oo o
oo o Cd
o
00 o
o

2Sun

Figura 10: Esquema de la morfologa del bongo Rhzomucor mehe. (a) esporangiforos; (b)
rizoides; (o) columelas; (d) esporas; (e) zgosporas entre suspensores.
En la Figura 11 se recoge una imagen de microscopio del esporangio globoso de Rh.
inehel, que prescita ima columela piriforme y sin q,fisis.

>~

A
LS..

a
-

4,
a

1
2open
-

Figura 11: Imagen de microscopio del esporangio globoso de RA.miehei

55

Lipasa de Rhi.zomucor ,niehei

113.2.- OBTENCION DE LA LIPASA DE Rhhonu~cor niehel

El hongo ficoiniceto Rhzomucor inehel produce una lipasa extracelular (triacilglicerol

acilliidrolasa EC 3. [.1.3.) activa en la hidrlisis de un amplio espectro de lpidos de aceites
y grasas de origen vegetal y/o animal7
U.3.2.a.- Isoenzimas dc la masa de Rhzomucor miehel
En un principio, la lipasa de Rh.mehe se obtuvo por fermentacin de cepas selectas
72

de dicho hongo
Tras diversos estudios de purificacin7374 se observ la existencia de dos isoenzimas
A y B. Aunque en el sobrenadante de la fermentacin se identificaron ambas isoenzimas, tras
el proceso posterior de purificacin a pH bajo se produce la deglicosilacin de la forma A.
que se transforma en la forma B. Las diferencias detectadas entre ambas formas enzimticas
son las siguientes73
* sus cargas netas son ligeramente diferentes a pH

presentan distinto punto isoelctrico: pI (A~ 3,9 y pI (B~ 4,3

la forma B es ms activa, aunque es menos estable.

Las dos isoenziinas presentan tambix ima serie de similitudes, ya que a pH 7 alcanzan
ambas su mxima actividad lipsica y son especificas de la posicin 1 de los triglicridos.
siendo su velocidad de reaccin mayor con monoglicridos de cidos de cadena larga (12:0,
14:0, 16:0, 18:0) que con monoglicridos con cidos cortos (4:0, 6:0, 8:0).

C.2.2.- Obtencin de la lipasa de R.nehe

Como se indic anteriormente, esta lipasa se obtuvo imcialmente par fermentacion del
hong Rhzomucor miehel. Tras el desarrollo de las tcnicas de ingeniera gentica la lipasa
de Rh.mehez se obtiene actualmente por tcnicas de recombinacin gentica, siguiendo la
estrategia que se representa en el esquema ~7.

56

nroduccion

fennentacin hongo Rhfrcvnucor ,niehei

~1.

obtencin lipasa
purificacin lipasa

purificacin total mARN

4.
4,

determinacin secuencia AA

transcripcin

obtencin cADN

4.

donacin cADN en cot

sntesis oligonucletidos
equivalentes (oligoprobes)

(genoteca cADN)
plsmido pRML-787

Identificacin de clones con cADN

por hibridacin con oligoprobes

obtencin molcula
recoinbinante

transformacin en clula
hospedadora de A.oryzae

4,

obtencin del clon

y multiplicacin

4,

expresin de la lipasa
de Rh.mehe

Esquema 17: Estrategia de clonaje para obtener la lipasa de RI.rniehei

El cADN correspondiente al precursor de la lipasa de Rh.mehei se insert en un

plsmido de expresin de A.otyzae 76, denominado pRML-787 que presenta un promotor de

A.otyzae a-amilasa, un terminador de A.nzger glucoamilasa y un marcador gentico de

acetamidasa, que permite el crecimiento de las clulas en medios donde la nica fuente de
nitrgeno es la acetamida. En la Figura 12 se representa la estructura de la molcula
recombinante obtenida

57

Lipasa de Rhizonuucor nuehei

u.
t

a.

a-
S.S

Figura 12: Molcula recombinante constituida por .3 plsmido pRiML-787 y el cADN

conespondiente a la lipasa de Rh.mehe.
Esta molcula recombinante se introdujo en la clula hospedadora de A.oryzae por un
proceso de transformacin, obtenindose un clon de clulas, productoras de la lipasa de
Rh.mehei. Tras el estudio de las protenas secretadas por el clon de clulas se observ que
una gran proporcin corresponda a lipasa de Rh.rnehei (rRML). La composicin en
aminocidos, el peso molecular y la actividad enzimtca especfica de esta lipasa
recombinante (rRML) result ser semejante a la de la lipasa de Rh.mehet obtenida por
fermentacin del hongo (RNft).
El mecanismo de maduracin de la lipasa de Rh.mehet en las clulas transformantes
no se conoce, pero se comprob que el 70% de la lipasa secretada por A.oryzae era
correctamente madura, es decir, haba perdido la secuencia de aminocidos caracterstica del
precursor; mientras que el restante 30% haba perdido el residuo de serna N-terminal.
A partir de la estructura de los dos cADN aislados de esta lipasa3 se lleg a la
conclusin de que la lipasa de Rh.mehe es sintetizada como un precursor de 363
aminocidos (peso molecular de 39.529 D) que presenta una s~al peptdica de 24
aminocidos y un propptido de 70 aminocidos. Tras un proceso de maduracin, todava
desconocido, la lipasa de Rh.mehet queda constituida por 269 aminocidos (peso molecular

de 29.472 1)) coincidiendo con el estudio de la secuencia de anunoacidos realizado con la

58

Introduccin

lipasa purificada77. Esta secuencia de aminocidos (utilizando la nomenclatura estndar de

tres letras) se representa en la Figura 13, comparndola con la secuencia de nucletidos del
cADN, oxTqondiaxte a la pre-lipasa de Rh.mehei3.
. 1
MtUMW AU ITT CItAS es ST Ci LIC YA? CE It
ST a a, U

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MA a

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Figura 13 Secuencia de aminocidos de a lipasa de Rh.miehe

de su cADN.

secuencia de nucistdos

Los nucletidos se numeran a partir de la primera base del codon iniciado? (ATO) y
los aminocidos se numeran a partir del primer residuo de la lipasa madura, dando nmeros
negativos a los 94 aminocidos del precursor que se pierden tras la maduracin. Una flecha
indica la posicin del primer aminocido de la lipasa madura. El aminocido Met-103 es el
residuo carboxi terminal de

mis

cofta lipasa variante del precursor. El pentapptido donde se

encuentra la triada catalitica est marcado por un rectngulo

59

Lipasa de Rhizomucor miehe

En la Tabla 3 se muestra la composicin en aminocidos de la lipasa de Rh.mehe (en

sus formas A (RML-A) y B (RLMIL-B)), deducida a partir de la secuencia de nucletidos del
correpondiente cADN y de la lipasa secretada por A.oryzae tras el proceso de transformacin
gentica (rRML), que es muy similar para todas ellas7736.
Tabla 3: Composicin en aminocidos de la lipasa de Rh.miehez en sus formas A y B, del
correpondiente cAUN y de la lipasa obtenida por tcnicas de clonaje (rRML).
AMINOCIDO

BML-A

RML-E

cADN

r1IML

Asp/Asn

28

29

26

29

Thr

26

26

27

25

Ser

29

26

25

24

Glu/Gln

21

23

21

25

Pro

19

14

13

14

Gy

17

21

20

19

Ala

19

19

18

18

Cys-SH

-7

.7

Val

20

21

21

21

viet

Ile

14

16

17

16

Leu

22

22

22

22

Tyr

14

15

15

14

Phe

10

10

10

Lys

jis

Iq,

Mg

lo

10

10

lo

TOTAL

271

277

269

273

Por todo ello, se puede concluir que el mecanismo responsable de la maduracin del
precursor de esta lipasa presenta la misma especificidad en Rh.mehe y en A.oryzae36.
Asimismo, el punto isoelctrico de la lipasa recombinante (rRML) purificada es 4$, semejante
al de la forma B36.
60

Introduccin

11.3.3.- ESTRUCTURA DE LA LIPASA DE Rkizomucor mielsel

En 1990 Brady y cols.58 cristalizaron la lipasa de Rhzomucor iniehez y

estudiaron su

estructura mediante la tcnica de rayos-X. De esta forma, describieron el modelo atmico

obtenido con una resolucin de 3,1

A (posteriormente refmado hasta 1,9 A). La descripcin

de la estructura de esta lipasa fue completada por Derewenda y

cois.

los cuales analizaron

la estructura de un complejo enzima-inhibidor, para as poder estudiar las diferencias

estructurales entre las distintas conformaciones de la lipasa.
Una vez conocida la estructura complexa de la lipasa de Rh.miehe se llevaron a cabo
estudios ms profundos acerca del proceso de activacin, simulando el movimiento de la
tapadera elemento caracteristico de las lipasas9. Para estos estudios se utilizaron tcnicas
de mecnica molecular, con las que se pudo simular el movimiento de la tapadera mediante
ngulos pseudotorsionales restringidos, en vacio, para simular el medio hidrofbico de la
interfase lipdica o del disolvente orgnico, con distintos valores de constante dielctrica.
Estos estudios revelaron algunas similitudes importantes con las serin proteasas.
son la existencia de una triada cataltica (Ser.. lbs.. .Asp) y de

una

como

cavidad onaninica en el

que participan los nitrgenos de algunos residuos, Adems, se descubri la existencia de una
estructura a-helicoidal que acta como irna tapadera, cubriendo la triada cataltica y que
desempea un papel fundamental en el proceso de activacin de la lipasa, ya que, cuando la
enzima

se

encuentra

en

la interfase oleo-acuosa, fundamental para su activacin, esta

tapadera se abre y deja al descubierto una gran

zona

hidrofba, donde se encuentra el centro

activo de la enzima.
La estructura de la lipasa de Rh.miehe sirvi como base para el estudio estructural de
otras lipasas homlogas, toda ellas producidas por hongos. Dichas lipasas son las producidas
por Ceotncum candidum, Humnicola lanuginosa, Penddium camernbertnyRhizopus delemar46.

61

Lipasa de Rhzomucor niehei

r
4

-Q

4
Figura 14: Estructura de la lipasa de Rhtzamucar miehel obtenida del

Banco

de

Datos Proticos.

11.3.3.a.- Caractersticas generales

La lipasa de Riuntehel est constituida por una

cadena

protica sencilla compuesta por

269 aminocidos, con un peso molecular aproximado de 30 kW

Brady y

cois.

cristalizaron esta lipasa obteniendo cristales con la simetra del grupo

espacial P21212~ La celdilla unidad tiene las siguientes dimensiones: a= 71,6

c=

55,0

A. Si

A, ~

75,0

A,

se considera una molcula por celdilla, el volumen especifico es de 2,5 ,43 por

dalton.
En el mapa de densidad electrnica de la estructura cristalina de la lipasa de
62

Introduccin

Rh.mehe, realizado por Brady y cok.58, se definieron vagamente dos fragmentos: el

fTagmento N-terminal, que comprende los 13 primeros aminocidos y un largo bucle externo
entre

lo~residuos 36 y 48. Posteriormente, Derewenda y

cok.t7

descubri que la hlice a N-

terminal acta como soporte para la parte distal de la lmina.

Las coordenadas atmicas de la posicin de cada uno de los aminocidos de la lipasa

de Rh.mehe, as como su estructura terciaria fueron depositadas por Brady y cok.

el

en

Banco de Datos Proticos, del cual se ha obtenido la siguiente representacin (Figura 14).

fl.3.3.b.- Estructura primaria

En la Tabla 4, publicada por Derewenda y

cok.7 en 1992, se recogen los 269

residuos aminoacidicos de la lipasa de Rh.mieher y su posicin en la cadena polipeptidica.

Adems, se indican los ngulos dihedros del esqueleto protica, las asignaciones de la
estructura secundaria, obtenidas a travs del algoritmo DSSP0; las asignaciones finales
basadas en los ngulos dihedros y en el sistema de enlace por puentes de hidrgeno y, por
ltimo, el grado de exposicin al medio de cada residuo, expresado en 2.
Tabla 4: Estructura de la lipasa de Rhzomucor mehe. Secuencia de aminocidos, ngulos
dihedros, puentes de hidrgeno, estructura secundaria y grado de accesibilidad de los
aminocidos al medio.
Dihedral angIe.

e>

Mun-ch.in hydrogen bond

Seeondwv

Residue

<3
6

167
145

79
83

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<19=4.20=4>

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125

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WAT

2340
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(21N,21O~WAT>

(21N,220,22N>
(23=4)
(23=4)
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<25=4.26=41
{WAT, 27=41<3-2A>}
<270,WAT)
(28 =4,WAT)
29=4
WAT
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<32=4.33=4)

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Lipasa de thfroniucor aniehei

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WALT
WALT
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WALT
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Introduccin

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34
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-40
-40
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WALT
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WALT
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WALT

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WALT
WALT
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(60=4,WALT>
(161 =4,WALT)

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WALT

WALT
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WALT
WALT
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1.

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49
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115
54

Lipasa de Rhaonmucor nueh el

Dihedral anglos (C>

Maw-eh.in hydrogen bond

Rnidue
64
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66
67
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(87 =4,WALT>
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<190=4,900)
(131 =4,191 0, WAT)
(192=4,WAT)
WAT
(158 OH>
WALT
<WALT, WALT>
71=4
220=4
(173=4,WAT>
222=4
<75 =4,WALT)
224=4
203=4
(223 N,WALT>
253=4
WAT
207=4
208=4
(217=412,WALT)
WALT
178=4
(178 NI!!, WALT)
(213 =4,WALT>
WALT
WALT

56
66

0
8
E
Y
W
1
T

2080
WALT

A
3

218
219
220
221
222
223
224
225

fi
mt

08=4

212
213

217

WAT
680
WAT
>650
1650
650
1380
1940

Acen.iblity
(A>
5
44
50
90
26
o
37

A>

WAT?<33 A)
2~0
950
1970
2330
1990
231 0
231 01(34 A>

YL

fi
fi

49
3

fl<7>

fi

.
.

/R

-.

fi

6
4
8
24
0
50
73
57
112

03
5

Introduccin

Dihedrad anglos (>

M.an.chs.in hvdrogen bancA

Secnd..r

Res,due

4
T

23)

125
127
03

232

233
234

u>

Y
C
1
8
U
L
E
1
8
D

235

236
237
238
239
240
241

242
243

04
70
58
7S
14
55
125
98
03
loa
50
68
66
98
67
88
Ql
93
134
84
62
63
-72
83

e
s

244

245
246

=4
8
1
Y
1

247
248
249
250

251
252
253

254
255
256
251
258
259

260
261
262
263
264
265
266
267
268
269

T
8
Y
U
U
II
L
8
Y
E
<3
1
=4
7
<3
L

47
130
58
84
101
69
121
28
128

Smbolos:

98

llama 3;

C.0

133

225 =4
(9 N, WALT)
223=4
7=4
WALT
WALT
WALT
219=4
(237 0, WALT)

128
130

>24
109
15
139
S
1541
136
173
6
8
>28
26
17
15
5

246 =4
WALT
233 =4
<247 =4.247 0>
248 =4
WALT
251 =4
WALT
(252 =4.WALT)
202 NI!>
<WALT. WAT>
204=4
257 =4
258 =4
200 =4
(265 0, 143 =4
(265=4.264=4h
200 =4
263 =4
WALT

142
9
73
174
137
-44
-29
18
33
2
126
125
33
7
133
126
105
23
6
47
4

hlice ~;

WALT
260 =4
WALT
WALT
(269=4,264 0 1)

226 0
WALT
223 0
70
221 0
50
WALT
237 0
217 0
WALT
WALT<(33
610
WALT
221 O~
WALT
244 0
245 0

fi
fi

A>

fi

29

y.

It

86
84
0
2
35
71

It

28

y.

o
mt

65
95
44

y.
a
fi
fi

50

255 0
fi

263 0
WALT
WAT
260 0
WALT
258 0
WALT
(264 0. WALT)

Si
4
5>

57
50
85
48
36

254 0

267 0

WALT

fi <8>

248 0
250 0
202 0
#39 0>
# 39 0
253 0

WAT
>

Acoeeailiiity

=4

O
Vi.

fi
fi

(6>

26
50
17
30
O
22
48

7
82
21
33

12
90
48

VR

84

it.

pupo amida o carbonilo libn; 44 pupo amida o cartonilo lifre ocuh; ~

() puente 3; cedo de la hlice; 9 tomos de molculas con relacin

conformacin Ramachandran no permitida;

de

simeia
il.3.3.c.- Estructura secundaria

La lipasa deRh.mehei est formada por 269 aminocidos, de los cuales 130 (48,3 %)
forman parte
horquillas

de lminas o de hlices y el resto de los residuos (51,7 %) estn situados en las

3 y en los largos bucles superficiales.

En la Figura 15 aparece una representacin esquemtica de la estructura secundaria

de la lipasa de Rh.mehei.

67

Lipasa de Rhizomucor miehel

mi

ma

mg

i~

1W

53

K~I

fi

a~

37

~
~

6
NY

~->

Figura 15: Esquema de la estructura secundaria de la lipasa de Rh.miehu

ll.3.3.c.1.- Zona central de lminas 3

En la Figura 16 aparecen representados los puentes de hidrgeno entre los grupos
peptidicos que forman parte de

Figura

la zona central de lminas 3.

16: Zona central de lminas (3 de la lipasa de Rh.mrehe

La notacin usada para las hebras 3(1-8), de la hoja central, sigue la secuencia de
stas; excepto para

la novena hebra, que se denomina 8

De las nueve hebras, siete de ellas se disponen en una direccin y solo das se colocan
en la direccin opuesta.

Adems, las cinco hebras centrales constituyen una hoja paralela

contmua

68

Introduccin

Asimismo, aparecen dos clsicos abombamientos I~, como los descritos por
Richardson1, entre un estrecho par de enlaces de hidrgeno sobre un par de hebras
antiparalelas. El primero de estos abombanajentos aparece en la hebra 1 y en l participa el
residuo lle-52, el cual presenta una conformacin helicoidal. El segundo abombamiento se
encuentra en un medio estructuralmente semejante, al final de la hebra 7, donde el residuo
Thr-225, adopta una conformacin

YR-

[L3.3.c.2.- Hlices a
Hay cinco hlices a que contienen, al menos, cuatro aminocidos consecutivos con
conformacin

aR.

Estos fragmentos son los siguientes: del 11 al 27; del 85 al 91; del 109 al

132; del 146 al 159; del 182 al 191 y del 254 al 257.
La hlice a ms larga (109-132) presenta un pronunciado doblez originado por el
residuo Val-ls, el cual adopta una conformacin

IR

Como resultado, se ven afectados tanto

el sistema de puentes de hidrgeno, como los oxgenos de los grupos carbonilo de Gly-l 16,
Glu-l 17 y Asn-120 y los grupos amido de la cadenaprncipal (Asn-120 y Glu-121), los cuales
participan solamente en los puentes de hidrgeno con molculas de agua. No se ha encontrado
nada en la secuencia alrededor del doblez que sugiera que este hecho es resultado de la
esteroquimica local. Es posible que el doblez se haya formado al final del proceso de doblaje,
cuando la larga hlice a se une al centro de la molcula.
Adems, hay regiones muy helicoidales, las cuales no son clasificadas como hlices
continuas debido a sus grandes irregularidades. Los dos fragmentos ms largos de este tipo
se encuentran entre los residuos 41-48 y 242-248.

1L3.3,c.3,- Horquillas

$y

bucles

El caracter predominantemente paralelo de las lminas

3 implica

que la mayoria de

las conexiones entre las hebras sean del tipo 3-a-3 dextrgiras.
Solamente hay tres pares de hebras antiparalelas contiguas que estn unidas por medio

de horquillas 3; estas hebras son las siguientes: 1-2, 2-3 y 7-8.

En la lipasa de Rh.mehe aparecen cuatro largos bucles superficiales, los cuales no
tienen una estructura secundaria definida. Estos bucles se encuentran entre los siguientes

residuos: del 28 al 49 (es el bucle que conecta la hlice N-terminal con la primera hebra de
69

Lipasa de Rhizomucor ,niehei

la hoja 3); del residuo 92 al 108 (conecta la tapadera con la hlice 3); del 160 al 168
(conecta la hlice 4 con la hebra 5) y del residuo 201 al 219 (es el bucle que une dos hebras
contiguas (6 y 7)). Todos estos bucles presentan las caractersticas de los bucles (2,definidos
por Leszczynski y Rose~. Estos bucles estn formados por menos de la cuarta parte de los
residuos de la lipasa (24,1 %), pero ocupan el 32 % del rea superficial.
Lo ms novedoso de estos bucles se encuentra en el segundo de ellas, entre los
residuos 92 y 108, que conecta el extremo C-terminal de la tapadera con la hlice 3. Este
bucle tiene una cabeza retorcida debido a dos prolnas que participan
en un puente antparalelo entre las posiciones 87 y 107. Este extremo N-terminal interviene
en el reordenamiento conformacional que tiene lugar durante la activacin enzimtica.
Tambin hay dos extensos fragmentos polipeptdicos, cuya ausencia define la prdida
de la estructura secundaria; dichos fragmentos aparecen entre los residuos 175 a 181 y 236
a 253. El primero de ellos se sita en el interior de la molcula y conecta la hebra 5 de la
lmina central con la tapadera; el segundo fragmento, forma parte de la zona C-terminal y
se sita en una zona superficial de la molcula.

IT.3.3.d.- Estructura terciara

La lipasa de R.h.mehe, segn la clasificacin de protenas en funcin de su estructura
secundaria83, es una proteina de estructura tipo ~J3R;en la que se alternan las dos
estructuras: fragmentos con estructura de hlice a y con estructura de lmina

3.

Dichos

fragmentos se disponen de forma que las lminas 3 se colocan en la zona central hidrfoba
y las hlices a se disponen alrededor protegiendo y estabilizando la estructura protica.
Las hlices a forman una serie de horquillas, bucles y segmentos helicoidales que
unen o empaquetan la zona central de lminas

3178,

Todos estos bucles son dextrgiros; con

lo que se crea una situacin poco comn, en la cual la lmina central es asimtrica, quedando
todos los fragmentos enlazantes (hlices a) localizados en un lado de la hoja.
La zona cenfraJ de lminas

3 paralelas,

est formada por 8 hebras y una pequea

hebra adicional, denominada (8). Esta zona de lminas !3 plegadas es muy similar a la de la
carboxipeptidasa AIU, aunque la hebra Y de la lipasa est en direccin opuesta a la de la
carboxipeptidasa A.
En la lipasa de Rh.mniehe, sobre la hoja de laminas 3 se dobla una hlice a N70

Introduccin

terminal, que se une a la zona ms distal de la hoja a travs de un corto pentapptido Nterminal (residuos del 5 al 9), que constituye la pequea hebra adicional (8) antes
mencion7ada7. Esta pequea hebra 8, a su vez, est unida por puentes de hidrgeno al
extremo (2-terminal de la octava hebra grande, en el extremo de la hoja central. Este patrn
de plegamiento de la lipasa de Rh.miehei constituye un interesante vinculo evolutivo entre las
protenas del sistema tipo W[3 paralelo y las del tipo barril 3.
Un largo bucle superficial (residuos del 80 al 109) conecta el extremo (2-terminal de
la hebra 3 con el extremo N-terminal de un largo doblez helicoidal que se dirige hacia la
hebra 4

Este bucle, en principio, se podra clasificar como un gran bucle O segn la

definicin clsica, dada por Leszczynslci82.

U.3.3.d.1.- Puentes disulfuro

El plegamiento de la cadena polipeptidica de la lipasa de Rh.miehei se estabiliza a
travs de tres puentes disuifuro: Cys4O-Cys43; Cys29-Cys268 y Cys235-Cys244

~.

Todos estos enlaces son dextrgiros, aunque no pertenecen a nmgim patrn estndar
de enganches y espirales dextrgiros8>.
Estos enlaces disulfuro se colocan en una zona bastante superficial de la molcula,
excepto el enlace Cys235-Cys244 que est oculto hacia el interior.
El enlace Cys29-Cys268 estabiliza el plegamiento global de la estructura; mientras
que, el enlace Cys235-Cys244 es necesario para estabilizar las dos hebras terminales.

11.3.34.2.- Enlaces de las prolinas

En la cadena protica de esta lipasa aparecen 13 residuos de Prolina, cuatro de los
cuales (los residuos 34, 209, 229 y 250) partcpan en enlaces cis peptidicost

La distribucin de estos cuatro residuos de cs-Prolina en la lipasa de Rh.miehei

est

de acuerdo con esos intermedios de plegamiento deducidos de la localizacin de las molculas

de agua internas.(ver seccin molculas de agua internas). Es bien conocdo que la
somenzacin de los enlaces imida de la prolina generan fases lentas de plegamiento. El
pentapptido 206-210 (que se sita al principio del segmento (2-terminal, cubriendo el
agrupamiento

de 7 molculas internas de agua) presenta una considerable barrera de energia,

ya que tres de sus residuos son prolinas (206, 209 y 210). De la misma forma, la presencia
71

Lipasa de Rhizomucor miehei

del residuo Pro-34 supone un paso limitante de la velocidad de formacin de un bucle,

relativamente rigido, que contiene el puente disulfuro (Cys4O-Cys43) y la hlice N-terminl.

fl.3.3.e.-

Puentes de hidrgeno

Il.3,3.e.1.- Puentes de hidrgeno de la cadena principal

En la estructura de la lipasa de Rh.mehe aparecen 190 puentes de hidrgeno del tipo
0(z) H-NG), que representan el 70 % del total posible; esta proporcin es ligeramente
supenor que la proporcin del 61 % indicada por Baker y Hubbard5 para la mayora de las
protenas de estructura globular. Por otra parte, 68 de estos enlaces aparecen en las hlices
a y 66 en puentes paralelos y anti-paralelos. Adems, 63 (63.4 %) de los grupos carbonilos
estn hidratados y los restantes 20 enlaces, que representan el 7,4 %, no pertenecen a ningun
sistema de puentes de hidrgeno. En comparacin, de todos los grupos NH, solamente 46 (17

%) estn hidratados y 20 no participan en puentes de hidrgeno. La proporcin de grupos CO

y Nl-? no enlazados en la lipasa de Rh.miehe es menor que lo indicado por Baker y
Hubbard5 para protenas globulares, que era del 11,2 % y 12 % respectivamente.
De los grupos ocultos en el interior de la molcula, solamente 4 grupos carbonilo ((20)
(residuos 81, 175, 178 y 219) y 2 grupos amino (NHXresiduos 145 y 221) parecen carecer
de cualquier sistema de puente de hidrgeno.
Un total de 39 grupos CO (14,5 %) estn involucrados en puentes de hidrgeno con
tomos de cadenas laterales; 61 (22,7 %) participan en puentes de hidrgeno doblemente
bifurcados y 5 (1,8 %) interaccionan con otros tres grupos donadores; en este ltimo tipo de
enlaces siempre participan molculas de agua.
Entre los grupo amino peptdicos. 22 (8,2 %) interaccionan con cadenas laterales y
solamente 10 (3,7 %) forman parte de puentes de hidrgeno bifurcados.
Todos estos datos son bastante semejantes al modelo de protenas gobulares descrito
por Baker y Hubbard5.

fl.3,3.e.2.- Puentes de hidrgeno de las cadenas laterales y puentes salinos

La estructura secundaria de la lipasa de Rltmehei se estabiliza a travs de una serie
de puentes de hidrgeno y puentes salinos entre los distintos residuos aminoacidicos de la
enzima.
72

Introduccin

Los puentes salinos se establecen entre cadenas laterales cargadas, predominantemente

Arg con Glu o Asp. Una gran mayora de estas interacciones aparecen en la superficie de la
proteina;y solamente 3 grupos y dos pares sencillos (Glu22l-Ser24i y Tyr28-Hisl43) estn
enterrados. Uno de los tres agrupamientos internos pertenece a la triada cataltica y otro es
un agrupamiento

de tres residuos que se sita en la interfase de la hlice N-terminal con la

lmina 3,
Tabla 5: Puentes de hidrgeno y puentes salinos entre os residuos polares y cargados de la
7,
lipasa de Rh.,niehei

WuI6

27 .4
25 A
30 A

Tvr28

0~

221

:;Hisi4a

SerS6
.Aspdl
Arg6S
Asp7O
SerT
Asp4S
Ser74
Sr84
OmISO

0
0
=4
=4
0
0
O>
0
0
0

~y109
Aspl56

=4C
0
O

27 A
27 A
2O A
28 A
27 A
30 A
25 A
24A
33 A
3~3 A
3OA
27 A
25 A
3~3 A
3l A
3OA

O
=4~1
O
0
<Y
&
0
=4
0
0
0
0
0
=4
=4
=4

Asn63
AsnO3
Asp7O
01n129
TyrISO
01u72
0h02
LysISl
AsnS7
TyrOO
TyrIS7
AsplS
TyrIlS
ArgIOO
ArgI6O
0In119

SerI8S

32 A

SerI67

(fln>76

2QA
25 A

O
0

ThrI7S
TyrlQ5

0
O
0

G1u24O
01u240
OIu240

Ser

rg7

N
~

s~
s

r~I1S

=4
=4

Asn246

=4

28 A
27 A
31 A

2GA

[gju221

~
~

0
O
0

OluIS
OluIS
Tyr172

pue. sise; O pupo atmo d. n.&to, A rs&o. ctitccL

?t ajiaco ,ndn ai. do. cadata lanka

73

Lipasa de Rhizon,ucor niehel

ll.3.3.e.3.- Modificaciones en enlaces de hidrgeno tras la activacin enzirn tica

En la enzima nativa3, los residuos del fragmento comprendido entre los restos Ser-82
y Phe-94 participaifen puentes de hidrgeno de caracter interno. El grupo hidroxilo de la Ser82 est enlazado por puente de hidrgeno a la amida de la Ser-84. El fragmento (2-terminal
de esta regin (93-96) es estabilizado por interacciones de los tomos de Val-95 de la cadena
prmcpal el N con NM de His y el O con N de Lys-109.
Tras la activacin enzimtica, la tapadera gana tres interacciones adicionales con la
zona principal de la molcula de protena. As la Ser-82 es estabilizada, en esta nueva
conformacin por una interaccin de un grupo hidroxilo con 081 del Asp-9 1. La cadena lateral
polar de la Asn-87, ahora entenada bajo la tapadera, forma una serie de nuevas
mteracciones: el 061 se enlaza con el N de la amida de Thr-93 y Phe-94, mientras el N~
forma un enlace con el carbonilo de la Tyr-60. El grupo hidroxilo de la Ser-84 forma un
puente de hidrgeno con el o~ del Asp-6 1. La zona helicoidal central de la tapadera retiene
su integridad estructural, mediante el oxgeno carbonilico de 11-89 formando un puente de
hidrgeno adicional con el hidroxilo de Thr-93. El residuo de Leu-92 se incorpora a la hlice,
mientras que la Thr-93 asume la conformacin

pasando a ser el ltimo aminocido de la

hlice. El imidazol de la Ris-LOS canbia el puente de hidrgeno con el nitrogeno peptdico

de la Val-95 por el enlace al oxgeno carbonilico de la Ala-90, con Nc involucrado en lugar
de N81.

11.3.3.f.- Centro activo

El Centro catalitico de la lipasa de Rh.mehe est constituido por tres elementos78 que
en la Figura 17 se sealan en la estructura general de esta enzima:
A).- la triada catalitica (Ser.. His. . .Asp), que es la responsable del ataque nucleofilico
al grupo carbonilo del enlace ster.

B).- la cavidad oxianinica, que tambin aparece en las sernproteasas; y que estabiliza
el mtermedio tetradrico (sustrato-enzima)

C).- la tapadera helicoidal, elemento exclusivo de las lipasas que es la responsable

de la activacin interfacial de la enzima cuando se encuentra sobre la interfase oleo-ac
74

Introduccin

Figura 17: Localizacin de los residuos de la triada cataltica (Ser-144, lis-257 y Asp-203)
y la Ser.82 del hueco oxianinico, elementos caractersticos del centro activo de la lipasa de
Rh.miehei.

75

Lipasa de Rhizomucor miehei

U.3.3.f.l.- Triada cataltica

La triada cataltica de la lipasa de Rh.mwhei (Ser-144. His-257 y Asp-203) es muy
similar a la de las serinproteasas, no solo por los aminocidos que la constituyen, sino
tambin por el tipo de enlaces, ya que todos los puentes de hidrgeno identificados en este
sistema son tambin caractersticos deesta constelacin en serinproteasas. El Nd de 1-Lis est
unido por un puente de hidrgeno al 0 de Ser; mientras que, el N8 del grupo iniidazol est
unido por otro puente de hidrgeno a uno de los oxgenos carboxlicos del Asp y por fuerzas
de van der Waals al otro oxgeno carboxilico.
El apareamiento Asp-HIis aparece en varias familias de enzimas (serinproteasas,
esterasas, hidrolasas y oxidorreductasas). La estereoqumica de la pareja Asp-His en la lipasa
de Rh.mzehei es muy tpica. El 08! del residuo Asp-203 forma un enlace de hidrgeno con
el N0 de la His-257 (tipo sin) y otro con un Q~ del residuo Tyr-260 (tipo ant?). La
esteroquimica de estos das enlaces es muy favorable e indica fuertes interacciones. Por otro
lado, el Qfl del Asp-203 est unido por medio de fuerzas de Van der Waals al N8 de la His257 y al N peptidico de la Val-205.

11.3.31.2.- Cavidad oxianinica

Este es otro elemento comn entre lipasas y sern proteasas. La funcin de dicha
cavidad es estabilizar el intermedio tetraedrico enzima-sustrato (Figura 18) formado durante
la reaccin, en el paso de

acilacin

y deacilacin.

Brady y cois. sugirieron que los nitrgenos de los residuos Leu-145 y Gly-146
forman parte de esta cavidad. Pero posteriormente. Brzozowski y cols.9 y Derewenda y co1a~
revelaron que la cavidad oxianinico se forma durante el cambio confonnacional, producido
durante la activacin enzimtica, y est constituido por el enlace peptdico y los grupos
hidroxilo de la cadena lateral de Ser-82. Sin embargo, la estructura exacta de esta cavidad
oxianinica es bastante desconocida. Recientemente Norin y cois. lo analizaron por mtodos

de modelizacin molecular por ordenador. Estos estudios sugirieron la existencia de 2

regiones dentro de la cavidad oxianinica. Una de estas regiones presenta gran afinidad por
grupos alifticos, y constituye la zona de unin del sustrato, mientras que la otra zona, situada
ex el lado opuesto, es de naturaleza hidrofilica. En esta ltima regin se almacenan molculas
de agua, que son fundamentales para las reacciones de hidrlisis, ya que, el acceso del agua
76

Introduccin

a la interfase hidrfoba, donde se sita la enzima activa, es muy difcil. El estudio del
intermedio acil-enzima indica que esta regin hidrofilica se sita en una posicin muy
favorable para el ataque nucleofilico del carbono carbonilico reactivo del grupo acilo.
R<diacilglicerol)

NEHisI
O-

Ser,~ NH-.

--J--~

(~) reIms de enlace

Ser,2 OH
R(cido graso)
Figura 18: Representacin
9 esquemtica del intermedio tetradrico enzima-sustrato de la lipasa
de Rhzomucor ,niehei
La lipasa de Rh.mrehe es un excelente catalizador para la resolucin racmica de
alcoholes secundanos Por esta razn Norin8 tambin estudi la influencia de la estructura
de la cavidad oxiamnica en la enantiose]ectividad de la lipasa, ya que dicha estructura
condicionar la disposicin de los enantimeros en el agujero oxianinico y la mayor o menor
facilidad de ataque nucleofilico. Para estos estudios se hicieron simulaciones de dinmica
molecular y minimizacin energtica de los modelo de transicin enzima-sustrato, que dieron
una idea de la orientacin de la unin de los dos enantimeros de diferentes sustratos
(hexanoato de (R,S) 1-feniletilo y hexanoato de (R,S) 2-octilo).
En las estructuras de partida, para la modeizacin molecular, los radicales ms
voluminosos de ambos steres se colocaron en la misma orientacin. La conformacin final
de mnima energa del enantimero (R) ms reactivo, no era muy diferente de la estructura
micial, los grupos fenilo y hexilo del alcohol liberado estaban perpendiculares al fondo del
centro activo; mientras que, los grupos metilo ocupaban una pequea cavidad en el centro
activo. En la lipasa de Rh.miehei, esa pequea cavidad est formada por Gly-266 y la cadena
lateral de Tyr-28, His-143, His-257 (componente de la triada cataltica) y Leu-258. El
enantimero (5), menos reactivo se uni de forma distinta al centro activo. En este caso, los
grupos metilo se colocaron perpendiculares al fondo del centro activo (como se colocan los
grupos voluminosos de los enantimeros (R)) y los grupos fenilo y hexilo se orientaron a lo
largo de la cavidad del centro activo. La energa de interaccin de los nantimeros (5) era

77

Lipasa de Rhizomucor miehei

mayor, lo que indica que esos complejos enzima-sustrato eran ms tensos que las de los
enantimeros (R) ms reactivos. Esta tensin era debida a que en el estado de transicin los
grandes grupos del ~enantimero(5) menos reactivo interaccionaban muy desfavorablemente
con la enzima.
Adems, se analizaron los enlaces de hidrgeno formados entre el oxianin del
intermedio tetradrico y los grupos amida del esqueleto protico, que se unen por dos puentes
de hidrgeno. Estos grupos amida se asignan a los residuos Leu-145 y Ser-82. Asimismo, la
cadena lateral de la Serna est umda por otro puente de hidrgeno a la cadena lateral del
Asp-91 de la tapadera.

11.3.3.f.3.- La tapadera
Este es un elemento caracterstico de las lipasas. En estas enzimas el centro activo est
enterrado bajo una cortahlice superficial (residuos del 85 al 91) que se denomina tapadera.
El desplazamiento de esta tapadera se consider la base estructural de la activacin
inteifacial de las lipasas58. Esta teora se prob experimentalmente por medio de la
caractenzacin por rayos-X, a una resolucin de 3,0

A, de un complejo de lipasa de Rh.mehei

con el inhibidor n-hexilfosfonato de etilo y por medio del estudio de los cambios
conformacionales observados durante la activacin en el complejo enzima-inhibidor (fosfonato
de p-nitrofenilo), que fueron descritos con una resolucin de 2,6

A59.

En la Figura 19 se indica la disposicin del residuo Arg-86 en la conformacin cerrada

de la lipasa de Rh.mehe, componente de la tapadera de esta lipasa y que desempea un papel
fundamental en la apertura de la tapadera, ya que como se representa en la Figura 19 su
disposicin en relacin con el esqueleto protico se modifica por completo al abrirse la
tapadera La estructura abierta de la lipasa de Rh.iniehe (Figura 20) corresponde al complejo
enzima-inhidor (fosfonato de p-nitrofenilo).

78

Introduccin

Figura 19: Estmctura CEBRADA de la lipasa de Rh.miehei. El residuo sealado del centro
activo es Ser-144 y el residuo de la tapadera es Arg-S6.

79

Lipasa de Rhizomucor ,niehei

Figura 20: Estructura ABIERTA de la lipasa de Rh.mehei que corresponde a] complejo

enzima-inhibidor. Los residuos sealados son Ser-144 del centro activo y Arg-86 de la
tapadera..

80

-4

introduccin
59 analizaron

Brozozowski y cols.

el cambio conformacional de la tapadera durante

la activacin enzimtica a travs del complejo de la lipasa con un inhibidor (n-hexilfosfonato

de etilo). Este cambio conformacional descrito es un simple y rgido movimiento de la parte
helicoidal (LeuS5-Asp9l). Este movimiento consiste en la traslacin de 8 del centro de
gravedad de la hlice y una rotacin de 1670 alrededor de una eje casi paralelo al eje de la
hlice. Existen dos regiones bisagra bien definidas que permiten el movimiento de la
tapadera y que se sitan a cada lado: el tripptido de Ser 82-84 y el tetrapptido 92-95.
Cuando la tapadera helicoidal se enrolla, para abrir el centro activo, su zona hidrofilica, que
en

la estructura nativa estaba expuesta al medio externo, queda parcialmente enterrada en una

cavidad poar, previamente rellenada con molculas de agua bien ordenadas. Al mismo
tiempo,

el lado hidrofbo de la tapadera queda completamente expuesto al medio externo,

constituyendo una gran superficie

apolar alrededor del centro activo

(ver

11.2.4.; Figura 4).

De esta forma, la exposicin de los residuos catalticos al medio va acompaada por un

marcado incremento

en

la hidrofobicidad de la superficie que le rodea. As se explica la

activacin interfacial, por

la estabilizacin de esta superficie apolar con la zona lipdica de

la interfase, la cual podra crear una enzima catalticamente activa, capaz de atacar la
molcula de triglicrido, que se encuentra en la fase lipdica.

En la lipasa de Rh.miehei la activacin enzimtica se produce por el desplazamiento

de la tapadera, que deja al descubierto el centro cataltico5 y provoca un profundo cambio
en

la naturaleza de la superficie de la molcula de la lipasa activa con respecto a la superficie

de la lipasainactiva, ya que se crea una amplia superficie apolar, la cual estabiliza el contacto
entre

la enzima y la interfase lipidica, Al representar la diferencia de rea superficial

venus

e] nmero de los residuos (Figura 21) se observa que 12 aminocidos de naturaleza hidrofba
quedan especialmente expuestos en la superficie de la molcula; dichos aminocidos son: Ile85, Trp-88, Ile-89, Leu-92, Phe-94, Val-205, Leu-208, Phe-213, Val-254, Leu-255, Leu-258
y Leu-267

60

81

Lipasa de Rhizomucor miehe

1
1u

50

.4

1E

~ 50
E

21

41

Cl

81

IDI

III

141

rwMda

181

81

291

221

241

281

nubu

Fgura 21: Representacin de la diferenciade ares superficial respecto al nmero de residuo60.

El fragmento peptdico entre Arg-8O y Val-95 no est involucrado en ningn enlace
de hidrgeno con otras zonas de la molcula; de esta forma, la tapadera interacciona con
el cuerpo principal de la protena solamente a travs de

interacciones

hidrofbicas78.

Los estudios llevados a cabo por Derewenda y cols.60 indicaron que, tras la activacin,
la lipasa de RJi.miehei se estabiliza por nuevos enlaces de hidrgeno formados entre la cadena
lateral de Asn-87 (residuo de la tapadera) y Tyr-60 con Asp-61, en la parte de la zona
principal.
La enzima en un medio acuoso se estabiliza adoptando la forma inactiva cenada,
principalmente por efectos hidrofbicos29. Por el contrario, en un medio no polar, como una
capa lipdica, la parte hidrofilica de la tapadera no podra formar interacciones polares
favorables con el medio. Norin

y cok.76 sugieren,

a travs de un estudio terico mediante

dinmica y mecnica molecular, que la enzima se estabiliza en este medio abriendo su

tapadera por

medio de interacciones electrostticas entre la tapadera y la cavidad polar

de la enzima.

82

Introduccin

ll.3.3.f.4.- Funcin dolos residuos de Arginina en la estabilizacin de la tapadera abierta

Tras diversos estudios de la lipasa de Rh.miehei modificada quimicamente en sus
residuos de Arginina, se comprob una variacin en la actividad y enantioselectividad de esta
lipasa. Esta modificacin era especialmente significativa cuando el residuo alterado era la
Arg-86. Modificaciones especificas de este residuo por mutaciones confirmaron la importante
funcin de este aminocido en la actividad enzimtica. El residuo Arg-86 se localiza en la
tapadera y participa en varios enlaces de estabilizacin de la conformacin activa de la
enzima. De todos estos datos se dedujo que la exacta posicin de la tapadera tiene gran
importancia en la actividad y especificidad de la enzima.
Norin y cok.79 utilizaron tcnicas de Mecnica Molecular para estudiar la apertura de
la tapadera helicoidal de la lipasa de Ritmiehei, considerando los clculos en vacio como
un modelo simple del medio bidrofbo. La tapadera se forz a moverse reversiblemente,
para poder analizar la forma nativa y la forma activa de la lipasa. La razn de por qu
diferentes simulaciones de mecnica molecular conducen a estructuras abiertas o cerradas
puede explicarse por las fuertes interacciones de la cadena lateral cargada de Arg-86 con Asp203 (en la forma nativa o cenada) o con Asp-91 (en la forma abierta o activa); en este ltimo
estado el residuo de Arg-86 se sita prximo a la superficie, mientras que el residuo Asp-91
queda entenado en una cavidad polar.
Estudios ms profundos del papel que desempean los residuos de Arginina en el
proceso de activacin de la lipasa de RJi.miehei, fueron llevados a cabo por Holmquist y
cois.

~.

Estos investigadores modificaron especificamente los residuos de arginina por

reaccin qumica con los mhhidores

1 ,2-ciclohexanodiona

y fenilglioxal.

modificada presentaba una significante prdida de actividad (66 %),

con

La enzima

tributirina como

sustrato A continuacin, se analiz el grado de modificacin de las argrnflias; Arg-86 fue el

residuo que se modific en mayor grado (85%); Arg-30, Arg-68 y Arg-l60 se modificaron
en menor grado

(<

70 %)

Arg-7, Arg-8O, Arg-l78, Arg-196, Arg-197 y Arg-202 no se

modificaron.
En la Figura 22 se muestra la disposicin de los residuos de Arginina en la estructura
general

de la lipasa de

RJi.miehei.

83

Lipasa de Rhiz,>mucor miehel

1~~

Figura 22: Localizacin de los residuos de ARCININA en la estructura de la lipasa de

Rh.nuiehei.

84

Introduccin

A la vista de todos estos resultados, se mut especificamente la Arg-86 por guanidina

y se observ una significativa disminucin de la estabilidad del confrmero abierto. La

guanidina es estructuralmente
competir con

semejante a

la cadena lateral de Arginina, por tanto podr

Arg-86 en el lugar de enlace. De esta forma, la tapadera no podr llegar a

estar en su posicin abierta adecuada, con lo que disminuir la actividad enzimtica y se

alterar su enantioselectividad.
desempea

Todos estos datos confirmaron la importante funcin que

la Arg-86 en la inhibicin de la lipasa de Rh.miehei.

Los residuos Arg-30 y Arg-80 estn localizadas en una regin de la lipasa, donde
interacciona

la zona poar de la tapadera con la superficie protica en la conformacin

abierta. Por tanto. la modificacin de estos dos residuos afectar a la conformacin activa de
la enzima.
Por su parte, los residuos Arg-68 y Arg-l6O estn ms alejadas de la tapadera y del
centro activo de la enzima; por tanto, su modificacin apens afectar a la actividad
ennmtica.

Adems, las modificaciones de la Arg-86 pueden tambin alterar la enantioseleetividad

de esta lipasa. Este hecho fue analizado por Holmquist y cok.59 en reacciones de hidrlisis
steres alifticos (2-metildecanoato de 1-heptilo) y de steres de alcoholes aromticos o
alifticos (2-metildecanoato

de fenilo) en ciclobexano. La lipasa de Rh.mniehei

nativa

hidroliza

preferentemente el enantimero S (E~= 8,5) del ster del alcohol aliftico; por el contrario, con
el ster del alcohol aromtico es R-enantioselectiva

(ER=

2,9). La modificacin qumica del

residuo de Arg-86 altera la enantioselectividad de una reaccin u otra en funcin del agente
qumico utilizado. As, al modificar la enzima con 1.2-ciclohexanodiona se modifica la
enantioselectividad de la reaccin con el ster aromtico (ER=~ 2,0); por el contarrio si la
modificacin quimica se realiza con fenilglioxal se altera la enantioselectividad para el ster
aliftico (E~= 2,5).
Si la modificacin enzimtica se realiza por mutacin de la Arginina por guanidina,
disminuye la enantioselectividad de la reaccin con el ster aliftico (Eg 1,9) y aumenta la
enantioselectividad

en

la otra hidrlisis (Ej 4,4) con el ster aromtico. Todos estos

resultados indican que la presencia de guanidina y el tratamiento con 1 ,2-ciclohexanodiona

o con fenilgloxal originan diferentes conformaciones del centro activo de la lipasa de
Rh.miehei.
85

Lipasa de Rhizomacar miehei

La significativa alteracin de la enantioselectividad de ambas reacciones, como

resultado de la mutacin con guanidina, sugiere que la cadena lateral polar de Arg-86
participa en Ja colocacin adecuada de la tapadera en la conformacin activa de la lipasa.
Por el contrario, en la reaccin de sntesis del ster aliftico en ciclohexano las
modificaciones qumicas o por mutacin de la Arg-86 no alteran la enantioselectividad de la
reaccion.
A la vista de estos resultados se lleg a la conclusin de que en un medio orgnico
la contribucin de las interacciones electrostticas para mantener la tapadera abierta son ms
importantes que la contribucin de Arg-86; por esta razn, la modificacin de dicho residuo
no altera la correcta colocacin de la tapadera ni la enantioselectividad de la enzima. Por
el contrario, en agua, estas interacciones electrostticas son mucho ms dbiles y la
estabilidad de la conformacin activa depende en mayor grado de las interacciones del residuo
de Arg-86; por tanto, cualquier modificacin en dicho residuo, altera la estabilidad de la
tapadera abierta, y por tanto, la enantioselectividad de la lipasa de Rh.miehei.

[1.3.3.2.- Molculas de agua

En total se han identificado, dentro de la estructura cristalizada de la lipasa de
175

Rh.miehei, 230 molculas de agua; de las cuales 12 tiene un inequvoco caracter interno
197 molculas (86 %) estn unidas directamente con la protena por enlaces de
hidrgeno: 14 de ellas forman 4 enlaces de hidrgeno con tomos de la protena (su factor
de temperatura isotrpica media (B) es 24,5

A,

lo cual refleja, como era de esperar, su

reducida movilidad). Un total de 27 molculas de agua forman 3 enlaces de hidrgeno (B

medio= 29,8

A),

52 molculas forman 2 enlaces de hidrgeno (B mediw 37,3

molculas forman un solo enlace de hidrgeno con la protena (B medio 45,6

A)

y 104

A).

De las restantes 33 molculas de agua; 30 estn unidas a otras molculas de agua y

las otras 3 no estn unidas a ningn tomo. Todas estas molculas se han caracterizado por
tcnicas de densidad electrnica difusa y factores de alta temperatura.
La gran mayora de los agrupamientos de molculas de agua se colocan alrededor de
los residuos polares y/o cargados de la superfice formando una intrincada red de enlaces de
hidrgeno que interconecta los aminocidos y sus agrupamientos.
Una gran proporcin de molculas de agua estn asociadas a agrupamientos polares.
86

Introduccin

En la Tabla

aparece un listado de las molculas de agua y sus enlaces e interacciones con

los distintos aminocidos. Esta distribucin es caracterstica de protenas globulares.

Tabla 7: Molculas internas de agua: enlaces de hidrgeno, enlaces por fuerzas de Van der
Waals y asignacin de los tomos de hidrgeno.
2
ArgiE
a-o A
W&t55
0:

N
O.

0U

:0

VdW

(Y

o
Wat5O

0:
01-11
0-1-12

O
Wat57

HO
0
:0
N1
N

:0

01n176

VdW

N
O

VdW
VdW

e
Y

ArglO6
Pro2Ofi
Argl97

0k175

-,

:0

(1112

O:
0
WatlSO

0111
0112
O:
0:

o
O
WatlOO

0Hl
0-112
O:

o
o
O
Wat4S

lVat47

Wat5

~Vat6

Watal

Wat264

:0
N~

VdW

VdW

(
7
:0
Y
11O
O
O
O
Y
O

3-2

a-o A

:0

Tvrl9S

3-3

2-8

A
A

Y
11-O
Y
:0
:0
Y

His217
01n176
Wat4l
A1a218
Wat4S
Leu2lO
Val179

:0

Leul?

3o A

.-.

:0

Y
O
:0
:0

2-7

Wat6
01n174
Thr2l
Thrl7B
Argl96
Wat5
ThrlQs
Phe7fl
Hisl43
HisI43
5er24
Leu23
Met65
5er27
An26

-.

O:
OHl
0-H2
O:

VdW

0:
O

011
O:
O
O
OII
011
O

0H
O:
O:
O
O
O

ArgliS
Asp2O3
(4tu2Ol
His2O7
Arg2O2
Ser24S
Thrl73
ThrIOS
(;1n176
WatI9O
Thrl7S
ThrllS
ArgIPi
ClvJ7S
WatlSg

Tvrl95

OH2
O:
0:
O
0Hl
0112

OHl
0-112

Asn2O7

:0

OHl

O
Wat27

VdW
VdW
VdW
VdW

al A
2-6 A

-.

VdW

(Y-Hl

Wat5b
01u121
~Vat55
Pro2O6
Asn246

26 A
28 A
27 A
3-i A
32 A
2-8 A
2-9 A
2-7 A
33 A
33 A
31 A
2~S A
3-1 A
so A
3-4k
3-4 A
3-4 A
3-2 A
3-0 A
2-9 A
2-7 A
3-4 A
3-4 A

VdW

rgIO7

VdW
.
-

VdW

VdW
VrIW

112--O
:0
:0
Y
C
O
:0
8

VdW
VdW

:O>~

8er44

.-

Y
Y
O

8er82
8or145
SerS2
LeuI4S
Ser244
TrpSS
TrpSS

VW

VdW
VW
VdW
VdW

87

O
O

O
(M

so A

3-O A
33 A
3-O A
2? A

so A
A
2-aA
3~ A
30 A
2-6 A
2-7 A
2-6 A
2-7 A
2-9 A
3~ A

a-a A
2-7 A
3-6 A
34 A

34

2-7

33

A
A

3-2

3-4 A

~ A
3-~ A
3-3 A

Lipasa de Rhizomucor miehei

En la lipasa de Rh.mniehei, adems de estas caracteristicas tipicas, aparecen molculas

de agua encerradas en el interior de la protena, formando una profunda depresin llena de
molculas de agua, adyacente al centro activo. Esta depresin constituye un espacio
alternativo para la tapadera, durante la activacin enzimtica pues puede interaccionar con
ellos o con el microentomo hidrfilo que rodea a la protena.

U.3.3.g.l.- Localizado de las molculas internas de agua y su implicacin en el

proceso de plegamiento molecular
Muchas protenas contienen molculas de agua internas, unidas fuertemente a cadenas
laterales polares o a la cadena principal. Estas molculas suelen quedar atrapadas en el interior
durante el proceso de plegamiento de la cadena protica y se convierten en parte de la
arquitectura molecular de la protena. Estudios de resonancia magntica nuclear de alta
resolucin indican-que estas molculas estn en idntica situacin en la estructura cristalizada
y en disolucin, lo que indica que no se intercambian con el medio.
La lipasa de Rhiniehei no es una excepcin y contiene una serie de molculas de agua
estrictamente internas, ocultas bajo los bucles de la cadena principal. El agrupamiento ms
grande (formado por 7 molculas de agua) se sita en el lado proximal de la zona central de
lminas 13, justo debajo del segmento C-tenninal de la hebra 8, del siguiente giro y del
oligopptido C-terminal (del residuo 231 en adelante). Las molculas de agua estn agrupadas
en tres grupos de dos molculas cada uno y un grupo de una sola molcula.
Las molculas de agua, denominadas W5 y W6 constituyen un agrupamiento que se
sita en el centro de la interfase formada por el lado distal de la lmina 13

la hlice N-

terminal.

El agua W91, situada al final del fragmento C-terminal de la misma hlice, tambin
forma parte

de la interfase.

El agua W264 est entenada bajo el largo bucle que hay entre la hlice N-terminal
y

la primera hebra de la lmina 13 (residuos del 27 al 49). Esta molcula est estabilizada por

un poco comn puente de hidrgeno con el tomo de azufre del residuo Met-65.
Cualquier cambio en alguna de estas molculas de agua requerira un desplegamiento
parcial de la protena. En algn caso, seria necesario un ablandamiento del segmento Cterminal, en otros casos, se tendra que producir un disociacin temporal del extremo N88

Introduccin

de la hlice a con la lmina

terminal

Algunas
intermedios
secundaria,

evidencias

13.

experimentales

apuntan

hacia

la teora

de la existencia de

de plegamiento, en los cuales se forman algunos elementos de estructura

previos

al plegamiento final de la estructura terciaria de la protena. La

distribucin de las molculas internas de agua, junto con la localizacin de los residuos de
prolina y los puentes bisulfuro, parece sugerir que las hebras 1-6, junto con los bucles de
interconexin podrian plegarse primero con el extremo C-terminal; seguido de una fase lenta
la cual la hlice N-terminal queda anclada sobre la hoja completa, permitiendo a los

durante
residuos

del 5 al 8 unirse de forma antiparalela a la hebra 8.

Por otro lado hay que destacar la localizacin de la molcula de agua W27, que ocupa
el lugar de unin del sustrato, o ms precisamente, el agujero oxianinico. Esta molcula dona
un protn al oxigeno del grupo hidroxilo de la Serna activa y acepta dos enlaces de
hidrgeno de los grupos amida de Ser-82 y Leu-145 de la cadena principal.

ll.3.3.g.2.- Depresin hidrofilica adyacente a la tapadera.

Con frecuencia, en la superficie de las protenas globulares aparecen pequeas
depresiones ocupadas por molculas ordenadas de disolvente. En el caso de la lipasa de
Rh.miehei, esta caracterstica tiene una gran importancia, ya que esta depresin superficial
parece ser la posicin alternativa de la tapadera durante la activacin de la lipasa o apertura
del centro activo por desplazamiento de dicha tapadera78.
3 fragmentos de la cadena polipeptdica rodean esta depresin de 13

A de profundidad:

el fragmento entre los residuos 59 y 61 (parte de la conexin entre las hebras 1 y 2); el final
de la zona N-terminal de la hlice 3 (residuos del 108 al 113) y la zona polar de la tapadera.
Uno de los puentes salinos superficiales (Asp6l-Arg8O) se sita en la periferia de esta
cavidad. El fondo de la hendidura est ocupada por residuos polares: Thr-149 (en el punto
ms profundo), Thr-62, Ser-l 14, Ser-82 y His-lOS. Adems hay 12 molculas de agua unidas
directamente a los tomos de la protena y 13 molculas unidas a la capa secundaria.

89

Lipasa de Rhizomuco, ngiehei

TI.3.3.b.- Localizacin de los residuos de Lisina

Uno de los objetivos de la presente Tesis Doctoral fue la inmovilizacin de la lipasa
de Rh.miehei por nlace covalente con un soporte de slice, punto que ser tratado en
profundidad en las secciones siguientes de esta Memoria. Sin embargo, dentro del estudio de
la estructura de la lipasa de Rh.miehei es importante analizar la localizacin de los resiudos
de usina, ya que el enlace covalente entre la enzima y el soporte se realiza a travs del grupo
amino de estos residuos.
La lipasa de Rh.miehei presenta 7 residuos de lisina (Lys-50, 53, 73, 106, 109, 131 y

137) y como se observa en la Figura 23, todas ellas se sitan muy expuestas al medio.
Adems, se encuentran suficientemente separadas del centro activo y de la tapadera, como
para no interferir en los cambios estructurales de la proteina durante el proceso de activacin
enzimtica y no obstaculizar el acceso de los sustratos hasta el centro activo. Por tanto, se
puede considerar viable la inmovilizacin de la lipasa de Rhaniehei a trvs de los residuos
de lisina.

[1.3.3.1.-Relacin entre el mecanismo de accin

la estructura de la lipasa de Rh.miehei

Tras el anlisis estructural de la lipasa de Rh.

miehel

se lleg a la conclusin de que

el mecanismo de accin de la lipasa se desarrolla en dos fases. Primero, se desplaza la

tapadera, posiblemente a travs de una activacin interfacial; y a continuacin, el enlace
ster se hidroliza por medio de un mecanismo muy similar al de las sern proteasas.
El desplazamiento de la tapadera, en respuesta a la adsorcin de la lipasa a la
interfase aceite-agua, es considerado como la base estructural para el proceso de activacin
interfacial.
Las consecuencias funcionales de los cambios estructurales de las lipasas son los
siguientes 46:
a).- la accesibilidad del sustrato hasta el Centro activo de la enzima es mayor, ya que
ste, antes del cambio estructural estaba enterrado.
b)

.-

se crea una extensa superficie hidrfoba alrededor del acceso al centro activo.

90

Introduccin

Figura 23: Localizacin de los residuos de LISINA en la lipasa de Rh.miehei.

91

Inmovilizacin de enzimas

11.4.- INMOVILIZACION DE ENZIMAS

11.4.1.- DEFINICIN
La inmovilizacin de enzimas fue definida en la U Conferencia sobre Ingeniera
Enzimtica90 como el proceso por el cual se confina o localiza a la enzima en una regin
definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad cataltica
y permiten ser reutilizadas repetidamente.
Esta definicin fue posteriormente ampliada indicando que la inmovilizacin es el
proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de
movimiento de enzimas, orgnulos, clulas, etc. por su unin a un soporte91~

11.4.2.- VENTAJAS DE LA INMOVILIZACIN

La inmovilizacin de enzimas presenta una serie de ventajas entre las que destaca el
aumento de la estabilidad del biocatalzador. Adems se pueden citar una serie de ventajas
desde el punto de vista bioquimico e mdustrial.

ll.4.2.a.- Aumento de la estabilidad enzimtica

El incremento de la estabilidad de las enzimas observado tras el proceso de
mmovilizacin se debe fundamentalmente a:
a).- La restriccin de los cambios conformacionales de la enzima, por la existencia de
uniones multipuntuales enzima-soporte92. Estas uniones confieren mayor rigidez a la enzima.
De esta forma, la enzima se hace ms resistente a las desactivaciones trmica y quimica, las
cuales implican un cambio conformacional del sistema.

b).- Alteracin del microentomo de la enzima

Esta alteracin es consecuencia de las interacciones enzima-soporte~~. La presencia
de un minimo porcentaje de agua favorece93: la estabilidad del derivado enzimtico, la
transferencia de masa de los sustratos hidrfobos hacia el centroa activo y los procesos de
sntesis, respecto de los de hidrlisis. Esta mnima cantidad de agua, localizada en el
microentonio del centro activo, viene regulada, en las enzimas inmovilizadas, por un
parmetro denominado acuofilia del soporte, tal y como se coment en la seccin 1L26.c.3.
Cuanto mayor es la

acuofihia

de un soporte, ms agua absorber este, retirndola por

92

-4

Introduccin

tanto del centro activo de la enzima en aquellos medios con baja concentracin de agua, lo
cual hace que no se pueda adquirir la conformacin activa, disminuyendo as la eficacia del
biocatalizador. As pues hay que considerar que el soporte no es del todo inerte, sino que
juega un papel muy importante en la actividad de la enzima inmovilizada.

II.4.2.b.- Ventajas desde el punto de vista industrial

La utilizacin de enzimas inmovilizadas a nivel industrial presenta una serie de
ventajas aadidas:
a).- Disminucin de los costes del proceso industrial, ya que es posible la reutilizacin
del catalizador enzimtico.

b).- Aumento del control del proceso, por lo que se puede optimizar el rendimiento
de producto final y su calidad, debido a que la enzima se separa facilmente del
producto.

c).- Posibilidad de realizar procesos continuos y/o multienzimticos, que son

facilmente automatizables y requieren menos mano de obra que los procesos
discontinuos.

1L4.2.c. Ventajas desde el punto de vista bioqumico

Con la aparicin de los derivados mmovilizados se han podido solventar una serie de
inconvenientes y aclarar algunas propiedades que presentan los sitemas proticos mn
que difcilmente podran ser simulados en soluciones homogneas94.

vivo,

a).- Se pueden prevenir las interacciones protena-protena que conducen a

agregaciones o a autolisis, lo cual a menudo produce efectos indeseables19597 ya que
,

al fijar una protena a un soporte, se impiden los movimientos tranglocacionales y

rotacionales, incluso si est atrapada en un gel98. Esto es factible siempre y cuando
el soporte no est completamente recubierto de molculas de enzima99.
b).- Se evitan posibles cambios conformacionales, que podran provocar la alteracin,
o incluso desaparicin, de algunas funciones biolgicas de la enzima. Este hecho
93

Inmovilizacin de enzimas

resulta de gran utilidad para el estudio de las relaciones estructura-actividad de las

200

protemas

c).- En el caso de tener molculas de diferente naturaleza (hidrofbicas, con carga, etc)
co-mmovilizadas con la enzima, el microentomo puede ser manipulado para simular
situaciones que se producen
naturaleza del soporte20~

iii vivo.

Esto tambin puede conseguirse variando la

d).- Se pueden crear sistemas estructuralmente asimtricos202, en los cuales la

concentracin de las molculas de enzima no sea uniforme en todo el volumen, lo cual
puede simular los modelos cinticos de sistemas de membranas.

11.4.3.- INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACION

A pesar de todas estas ventajas la inmovilizacin de enzimas presenta una serie de
203
inconvenientes
a).- Se produce la alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado
nativo.

ti).- El sistema enzima-soporte es heterogneo, ya que pueden existir diferentes

fracciones de protena inmovilizadas con un diferente nmero de uniones al soporte.

e).- Es posible que la enzima pierda total o parcialmente su actividad durante el

proceso de inmovilizacin.

d).- Inicialmente aumenta el coste del proceso porque hay que aadir el procedimiento
de inmovilizacin.

94

IntrQduccin

11.4.4.- METODOS DE INMOVILIZACION

Aunque existen numerosos mtodos de inmovilizacin, cada uno de los cuales presenta
un diferente grado de complejidad y eficacia, ninguno de ellos rene todas las ventajas de la
mmovilizacin. Por esta razn es interesante analizar los mtodos disponibles y compararlos,
ya que la actividad, estabilidad y facilidad de manejo del biocatalizador puede variar
enormemente segn el mtodo empleado.
Las lipasas han sido inmovilizadas siguiendo numerosos mtodos, pero presentan la
dificultad adicional de su bajo nivel de pureza y la presencia de molculas de hidratos de
carbono en su estructura, cuyos grupos hidroxilo pueden competir con los grupos amino de
los residuos de lisina de la protena para unirse al soporte, cuando se pretende llevar a cabo
la inmovilizacin por dichos residuos.

[1.4.4.a.- Clasificacin de los mtodos de inmovilizacin

Los mtodos de inmovilizacin se pueden clasificar en dos grandes categorias192:
A) Mtodos fsicos
La enzima no sufre modificaciones estructurales ya que queda retenida fisicamente por
la estructura del soporte.
* Atrapamiento en una matriz.
*

Inclusin en membranas:
>

microencapsulacin

>

reactores de membrana

B) Mtodos qumicos:
La enzima se une al soporte por una unin quimica.
* Entrecruzamiento.
*

Unin a soportes:
*

adsorcin inica

unin covalente

En el Esquema 18 se representan los diferentes mtodos de inmovilizacin enzimtica

95

Inmovilizacin de enzimas

RETEN~ION FISICA

Esquema 18: Principales mtodos de inmovilizacin de enzimas.

II.4.4.b.- Tino de soportes

Una gran variedad de materiales naturales o sintticos, orgnicos e inorgnicos se han
empleado como soportes para inmovilizar enzimas. Estos materiales difieren entre si por su
tamao, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente suelen ser cilindros, hojas, fibras
y ms frecuentemente esferas.

96

Introduccin

La eleccin del tipo de soporte depende fundamentalmente de la aplicacin industrial

posterior de la enzima inmovilizada. Algunas de las caractersticas que se tienen en
consideracin acerca de la naturaleza del soporte son204:
-

Resistencia mecanca.

Resistencia a la contaminacin microbiana.

Funcionalizacin qumica.

Facilidad de regeneracron.

Estabilidad trmica.

Estabilidad frente agentes qumicos.

Caracter hidroflico/hidrofbico.

Capacidad de carga de enzima.

Coste del soporte.

Sin embargo, ninguna sustancia presenta todas estas propiedades juntas y en un grado
adecuado; por esta razn, se han empleado una gran variedad de soportes, los cuales pueden
clasificarse en dos grandes grupos, en funcin de su naturaleza: soportes orgnicos (protenas
fibrosas como colgeno y queratina; polimeros sintticos como acrilamida, alcohol
polivinilico, hidrogeles, resinas fenlicas, etc.) y soportes inorgnicos (silice. bolas de vidrio
almina, xidos de titanio, etc.)

U.4.4.c.- Factores a considerar en el proceso de inmovilizacin

Debido a que no existe un mtodo perfecto de inmovilizacin se deben analizar una
serie de factores del biocatalizador para determinar si la estrategia seguida es adecuada205.
Dichos factores son los siguientes
-

Actividad enzimtica.

Efectividad de la utilizacin de la enzima

Desactivacin y caractersticas de regeneracion.

Coste del proceso de inmovilizacin.

Toxicidad de los agentes empleados en el proceso de inmovilizacin.
Propiedades finales deseadas en el derivado inmovilizado.
Reaccin a la que se aplicar el derivado inmovilizado.
97

Inmovilizacin de enzimas

II.4.4.d.- Comparacin de los diferentes mtodos de inmovilizacin

En la Tabla 8 se resumen y comparan las caratersticas generales de los diversos
mtodos de inmovilizacion.
Tabla 8:Comparacin de los diferentes mtodos de inmovilizacin
METODO

Inclusin en

Atrapa-

Entrecru-

Adsorcin

Unin

membranas

miento

zamicoto

qumica

covalente

Preparacion

Media

Difcil

Media

Sencilla

Difcil

Fuerza de unin

Dbil

Media

Media-dbil

Media

Fuerte

Actividad
enzimtica

Mediaalta

Baja

Baja

Media

Alta

Regeneracin
soporte

Posible

Imposible

Imposible

Posible

Difcil

Medio-

Medio

Medio

Bajo

Alto

Alta

Alta

Baja

Mediaalta
Limitada

Coste proceso

alto

Estabilidad

Media

Validez

General

General

Limitada

General

Proteccin
frente ataques
microbianos

Si

Si

Si

No

No

A continuacin, se analizarn en profundidad los mtodos qumicos de inmovilizacin

(adsorcin inica y unin covalente) ya que en la presente Tesis Doctoral se inmoviliz la
lipasa de Rh.miehei por unin covalente sobre silice y se estudi el derivado comercial de esta
lipasa (Lipozyme 1M20), inmovilizada por adsorcin sobre una resina de intercambio
anionco.

98

Introduccin

11.4.5.- INMOVILLZACION POR ADSORCIN IONICA

Este ha sido el mtodo ms utilizado para mmovilzar lipasas. Este mtodo se basa en
la unin de la enzima a un soporte sin funcionalizar por medio de puentes de hidrgeno,
fuerzas de Van der Waals e interacciones inicas.
El proceso de adsorcin se realiza en dos fases: en la primera se produce la difusin
de la enzima hacia el soporte y en la segunda se une la enzima a los centros capacitados de
la superficie del soporte. Estas dos fases estn controladas por la carga externa de la protena
y del soporte, siendo el paso de unin mucho ms rpido que el paso de difusin207209.
Mediante esta metodologa se han inmovilizado sobre Celite la lipasa de Aspergillus
nige?0, Rhizomnucor mehei21 la lipasa de Geotrichum candidum212 sobre alumina y la lipasa
,

de pncreas porcino213 sobre vidrio poroso.

Una variante de la inmovilizacin por adsorcin consiste en emplear resinas de

intercambio jnico, que contienen grupos funcionales y contraiones mviles. Estos
contraiones pueden ser intercambiados reversiblemente por otros iones que presenten la misma
carga sin que se produzcan cambios en la matriz insoluble. Siguiendo este procedimiento se
han inmovilizado la lipasa de C.rugosa sobre Duolite y Amherlite214 y la lipasa de Rh.zniehei
en Duolite21 y otras resinas macroporosas216~7.
En la presente Tesis Doctoral se ha empleado la lipasa de Rh.miehei inmovilizada
sobre Duolite y comecializada por el laboratorio Novo-Nordisk con la denominacin de
Lipozym& 1M20. Las caractersticas tcnicas de este derivado inmovilizado se recogen en la
seccin Experimental.

11.4.6.- INMOVILIZACION POR UNION CO VALENTE

Esta metodologa se basa en la activacin previa de determinados grupos qumicos del
soporte para que reaccionen con grupos nuclefilos de la protena. Los grupos funcionales de
las protenas implicados con mayor frecuencia en la unin con el soporte son los grupos sammo de los residuos de usina y los grupos carboxilato de los residuos aspartato y glutamato,
todos ellos situados hacia el exterior de la superficie protica. Dado que en la presente Tesis
Doctoral se sigui esta metodologa para inmovilizar la lipasa de Rh.miehei se analiz la
localizacin de los residuos de lisina en el esqueleto protico (ver 1L3.3.h.)
99

Inmovilizacin de enzimas

El proceso de activacin del soporte se lleva a cabo en condiciones drsticas,

mcompatibles con la estabilidad de la enzima, por lo que este mtodo requiere dos pasos:
activacin previa del soporte y posterior inmovilizacin de la enzima, que debe realizarse
mmediatamente, ya que las formas activadas de los soportes suelen ser muy inestables.

11L4.6.a.- Funcionalizacin del soporte

La funcionalizacin del soporte se puede llevar a cabo siguiendo diversos mtodos.
La eleccin de la metodologa a seguir est en funcin del tipo de soporte y la naturaleza de
la enzima que se vaya a inmovilizar a continuacin. Los mtodos de funcionalizacin ms
empleados en la inmovilizacin de lipasas son los siguientes:
* vta arninosilano.
*

va broinocangeno

va carbodijmnida

vra glicidol

via 2,4, 6-tricloro-I,S,5-triazina (TCT)

Este es el mtodo seguido para activar el soporte (slice) sobre el que se inmoviliz
la lipasa de Rh.miehei en la presente Tesis Doctoral.
Este mtodo permite la activacin de polisacridos en general utilizando 2,4,6-tricloro1,3,5-triazina y fue descrito origmanamente por Kay y Crook21. En este proceso de activacin
el soporte puede reaccionar mediante uno o dos grupos con el agente activante (generalmente
cuanto mayor es el tiempo de reaccin ms molculas de TCT reaccionan con los grupos del
soporte), obtenindose de este modo una activacin completamente irreversible. Siguiendo este
mtodo se ha inmovilizado tambin la lipasa de C.cylindracea219.

loo

Introduccin

[1.5.- ANTIINFLAMATORIOS NO ESTEROIDEOS (AtiNEs

15.1.- PATOLOGL4 DE LA IINFLAMACION
La patologa producida por la inflamacin tiene una gran incidencia a nivel mundial
debido a su implicacin en numerosas enfermedades como. la artritis reumatoide, la
dismenorrea, la osteoartritis y otros proceos reumticos agudos y/o crnicos, lo cual ha
potenciado el estudio de frmacos eficaces para mitigar el proceso de la inflamacin.
La inflamacin es un mecanismo de defensa del organismo frente a lesiones tisulares
causadas por traumatismos, productos quimicos, etc. durante la cual se liberan gran cantidad
de sustancias que provocan una serie de procesos de defensa en el organismo220:
a>.- vasodilatacin local con aumento del flujo sanguneo en la zona.
b).- aumento de la permeabilidad de los capilares, con lo que se produce la fuga de
grandes cantidades de liquido hacia los espacios intersticiales
c).- coagulacin de liquido en estos espacios debido al exceso de fibringeno y otras
protenas que salen de los capilares.
d).- tumefaccin celular.
e>. infiltracin celular y fagocitosis
-

O.- proliferacin de fibroblastos y sntesis de tejido conjuntivo que actan reparando

la lesin que se ha producido.

Las sustancias liberadas durante el proceso inflamatorio se clasifican en dos grupos:

histamina y eicosanoides (prostaglandinas, prostaciclinas. tromboxanos y leucotrienos).
Los eicosanoides constituyen un conjunto de sustancias procedentes de cidos grasos
poliinsaturados de 20 carbonos, en especial del cido araquidnico que es el precursor ms
importante de los mediadores celulares que intervienen en el proceso inflamatorio. En el
Esquema 19 aparece el proceso de transformacin del cido araquidnico en prostaglandinas.
prostaciclinas y tromboxanos por accin de la ciclooxigenasa y en leucotrienos por accin de
la lipooxigenasa.

lo

Antiinflamatorios no esteroideos (ALVEs)

FououpIDoe

Postal/pa se A

OCXX/

COOH

Acdo Araqudruco

CcJooaduenas//
~=X.~~COOH

\4(~ooxi~enasa

~7j7jjQ<j74

A. OHPGG

5-HPETE

PROSTAGLANOHAS

fwmsm

LEUCOTRENO A4

____A
CO
kt~SamI
Lmrnhiem

vE

Esquema 19: Cascada del cido araquidnico.

11.5.2.- FARMACOS ANTIINFLAMATORIOS NO ESTEROIIDEOS (AINEs

Los antiinflamatoriosno esteroideos (AINEs) son un conjunto de frmacos analgsicos
que poseen actividad antitrmica y antiinflamatoria. Se denominan no esteroideos para
diferenciarlos de los corticoides con actividad antiinflamatoria.
La eficacia relativa de cada uno puede ser diferente para cada accin; de ah que su
utilizacin en una determinada indicacin teraputica depender de su grado de eficacia y de
su grado de toxicidad.
Todos los AINEs actan sobre el proceso inflamatono inhibiendo la sntesis de
prostaglandinas mediante la inhibicin de la enzima ciclooxigenasa (esquema 19), aunque el
grado de actividad antiinflamatoria varia de unos AINEs a otros. Sin embargo, no hay
estudios que relacionen el grado de inhibicin de la ciclooxigenasa con la eficacia
22122
antiinflamatoria en pacientes individuales
LI.5.2.a.- Evolucin histrica
La primera terapia utilizada para el tratamiento de la artritis reumatoide se basaba en
el empleo de corticoesteroides. No obstante, debido al caracter crnico de esta enfermedad,
102

Introduccin

el tratamiento prolongado con estos frmacos produjo la aparicin de numerosos e importantes

efectos secundarios. Por esta razn, durante los aos cincuenta el departamento de
investigacin de la compaa Boots Pharmaceutical comenz a trabajar en la bsqueda de
nuevos agentes antiinflamatorios no esteroidicos (AINEs). Se comenz buscando nuevas
hiptesis que explicasen la actividad antiinflamatoria de la aspirina y otros compuestos como
los pirazoles223 con el objeto de encontrar agentes ms potentes y con menos efectos
secundarios que stos.
Tras una serie de estudios sobre la aspirina y sus anlogos estructurales se lleg a la
conclusin de que el grupo funcional fundamental era el cido carboxilico, En 1957 se
descubri que algunos cidos alcanicos y alquenicos, derivados del bifenilo, estilbeno y
difeniletano, presentaban propiedades antirreumticas, pero los resultados de las pruebas
biolgicas (ensayos in vivo) no fueron satisfactorias224
Sin embargo, los cidos fenil-alcanicos, y en particular, los para-sustituidos con
radicales alquilicos, se mostraron teraputicamente vlidos. Entre todos ellos destac el cido
4-isobutilfenilactico (Ibufenac) que presentaba una actividad antiinflamatoria de dos a cuatro
veces superior a la aspirina y era mucho mejor tolerado que sta.
El aumento de longitud de la cadena alquilica condujo la obtencin de una serie de
cidos ms activos, los cidos propinicos sustituidos en posicin 2 con un grupo arilo. De
todos ellos el que presentaba mayor actividad era el cido 2-(4 -isobutil)fenilpropinico
(comercializado con el nombre de Ibuprofeno) que presenta actividad farmacolgica entre 16
y 32 veces ms potente que la aspirina y con menores efectos secundarios.

103

Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs)

IILS.2.b.- Clasificacin
Los AINEs se clasifican en seis familias en funcin de su estructura quimica. En la
Tabla 9 aparecen estos grupos y el frmaco prototipo de cada uno de ellos.
Tabla 9: Clasificacin de frmacos antiinflamatorios no esteroidicos (AuNEs).
Grupo farmacolgico

Fnnaco prototipo

cido saliclico

acido acetilsaliclico (APtS)

para-aminofenol

Paracetaniol

pirazolona

Metamizol

cido propinico

Naproxeno

cido indolactico

Indometacina

cido pirrotactico

Ketorolaco

cido fenilactico

Diclofenaco

cido piranoactico

Etodolaco

cido antranitico

cido mefenmico

cido nicotinico

Isonxina

oxicanis

Piroxicam

U.5.2.c.- Mecanismo de accin

El mecanismo de accin de los AINEs se basa en la inhibicin de la cicloox.igenasa,
enzima que convierte el cido araquidnico en un endoperxido cclico, el cual se transforma
en prostaglandinas y tromboxanos (Esquema 19). La inhibicin de la accin de la
ciclooxigenasa consiste en que los AINEs impiden la sustraccin del hidrgeno de C-13 del
cido araquidnico y, por tanto, bloquean la peroxidacin en C-l 1 y C-15. El mecanismo
difiere de unos AINEs a otros, pero en todos los casos la inhibicin es estereoespecifica.

11.5.3.- AflNEs DERIVADOS DEL ACIDO (RES) 2-ARIILPROPIONICO

Uno de los objetivos de la presente Tesis Doctoral es la obtencin de AINEs
pertenecientes al grupo de frmacos con estructura de cido 2-arilpropinico con elevada
pureza ptica, utilizando como catalizador del proceso la lipasa de Rhizomucor miehei.
Estos frmacos constituyen un grupo homogneo, dentro de los AINEs, por sus
104

Introduccin

caractersticas quimicas y farmacolgicas; aunque varan sus caractersticas farmacocinticas,

En el esquema 20 se muestran algunos de los AINEs pertenecientes a este grupo.

COOH

-.

Aeido 2-fenil

0H30

proponieo

Ibuprofeno

cOOl-l

Naproxeno

o
N

COOH

Ketoprofeno

tIi:i0(

COON

Flurbiprofeno

COOI4
Suprofarto

Fenoprofeno

Esquema 20.- MINEs dedvados del cido 2-arilpropinico

IiL5.3.a.- Acciones farmacolgicas

Todos los AINIEs de este grupo presentan accin anttrmica, analgsica y
antiinflamatoria. Todos son capaces de inhibir la ciclooxigenasa. aunque su potencia varia de
unos a otros. No obstante, no hay una buena relacin entre esta potencia inhibidora y su
eficacia analgsica y antiinflamatoria. As, en su conjunto son considerados como
antiinflamatorios de eficacia moderada, incluso inferior a la del AAS, aunque la potencia
antcclooxgenasa de alguno de ellos, como el naproxeno, sea superior.

11.5.3.1,.- Caractersticas estructurales

Los AINEs de esta familia presentan un centro estereognico en la cadena carbonada,
residiendo la actividad farmacolgica unicamente en el enantimero

S()225.

Se ha

comprobado que el ismero S(+) del cido 2-(6-metoxi-2-naftil)propinico (Naproxeno) es

28 veces ms activo como antiinflamatorio que el ismero R(-926 y el ismero S(+) del
Ibuprofeno es 160 veces ms potente que el R(-). A pesar de esto, la mayora de las formas
farmacuticas son mezclas racmicas de ambos enantimeros R(-) y S(+), ya que una vez
105

Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs.)

administrada la forma racmica el enantimero R(-> es invertido en S(927,en una proporcin

que varia de un producto a otro (mucho en el Ibuprofeno y Fenoprofeno. poco en el
Flurbiprofeno) y de un individuo a otro. No obstante, se ha comprobado que la conversin
de un enantimero en otro en el organismo no es del 100%: por ejemplo, slo dos terceras
partes del enantimero R(-) de Ibuprofeno se transforma in vivo en el ismero

S(928.

Por ltimo, el enantimero R(-) de la mayora de los cidos 2-arilpropinicos es

almacenado en e] tejido adiposo229, donde puede alcanzar elevados niveles.
La obtencin de este grupo de AINEs enantiomricamente puros es interesante por las
siguientes razones:
a> se reducida la dosis administrada
-

b)

dismmuian los efectos secundarios debidos al almacenamiento del

enantimero R(-) en el tejido adiposo230

se evitada la variabilidad de la respuesta teraputica, al no producirse la
inversin total de los enantimeros R(-) in vivo23.

ILS.3.c.- Caractersticas frmacocinticas

En general, los AINEs se absorben completamente, tienen un volumen de distribucin
pequeo, se unen bastante a protenas y se acumulan en medias cidos, como los puntos de
inflamacin232. La variabilidad de la respuesta de los pacientes a los diferentes AINIEs se
explica mediante la dosis y la concentracin en plasma233.
En la Tabla 10 se resumen las caracteristicas farmacocinticas de estos frmacos234.
Grado de absorcin (%)(abs); metabolismo presistmico (met); semivida de eliminacin
(h)(t);volumen de distribucin (l)(Vd); grado de unin a protenas (%)<prot); aclaramiento
(ml/lg/min) (Cl) y excrecin urinaria (%)(excr)

106

Introduccin

Tabla 10: Caracteristicas farmacocinticas de tos AIINIEs derivados del cido 2-arlipropionico.
FRMACO

Abs

met

tVz

Vd

prot

CI

cia

[buprofeno

>~5

--

99

0,75

<1

Naproxeno

100

5 %

12-lS

6,3

99

0,13

(1

Ketoprofeno

>90

escaso

1-3

7,7

95

1,2

<1

Fenbufeno

80

--

10-17

98

--

--

Fenoprofeno

80-90

escaso

1,4-3

99

0,5-1

2-5

--

3-6

99

0,3

(15

Flurbiprofeno

El Naproxeno e Ibuprofeno presentan farmacocmnticas lineales, al aumenta la dosis

tambin aumenta la concentracin plasmtica, hasta el punto de la saturacin protica235.
Todos estos frmacos se absorben completamente por va oral, con ~

comprendido

entre 1 y 2 h. excepto el Naproxeno, cuyo t~ es de 2-4 h. si bien el de su sal sdica es

tambin de 1-2 h. En general la comida disminuye la velocidad de absorcin, pero no la
cantidad absorbida. La absorcin por va rectal es ms lenta e irregular.
Se unen intensamente a la albmina, en un 99% a las concentarciones que alcanza en
plasma. Cuando la concentracin plasmtica de albmina disminuye (artritis reumatoide y
ancianos), la fraccin libre aumenta
Difunden bien y pasan al liquido sinovial, done alcanzan concentraciones que suelen
ser la mitad de la plasmtica, ya que la concentracin de albmina es menor. Sin embargo,
cuando las administraciones son repetidas (tratamientos crnicos) se alcanzan concentraciones
que fluctan menos que las plasmticas y permiten distanciar ms la administracin, pasan
la barrera placentaria y alcanzan muy bajas concentraciones en la leche.
El nietabolismo es intenso y variado, de forma que la excrecin renal de forma libre
es mnima. El Ibuprofeno R(-) se transforma amplianmete en su enantimero activo (S+).
Entre los procesos metabolizadores

destacan los de hidroxilacin,

desmetilacin

conjugacin, mayoritariamente con cido glucuronico.

Las semivdas de eliminacin son de 2-4 h, excepto en el caso del naproxeno (12-15
h).

107

Antiinflamatorios no esteroideos <dINEs.>

11.5.34.- Aplicaciones teraputicas

Los AINEs se utilizan comunmente como tratamiento de primera linea de los

transtomos reumatolgicos. Contrariamente a los analgsicos opiceos, no crean adiccin y
pueden utilizarse durante perodos prolongados de tiempo, pueden administrarse a todos los
grupos de edad por distintas vas de administracin232.
Por su actividad antiinflamatoria y analgsica se utilizan en el tratamiento sintomtico
de la artritis reumatoide, la osteoartritis y la artritis gotosa. Su eficacia es comparable a la del
AAS a la dosis de 2-3 g/dia; tienen pues una eficacia media. Las dosis varia segn el
compuesto (Tabla lo). En los tratamientos crnicos se acons~a empezar con dosis bajas para
mejorar la tolerabilidad y aumentar paulatinamente la dosis. Los ataques agudos de gota solo
responden a las dosis mximas posibles.
Cada vez se utilizan ms con fines estrictamente analgsicos, como es el caso del
Ibuprofeno y el Naproxeno sdico. Se emplean en el tratamiento de diversas algias como la
dismenorrea, los clicos renales y los dolores postoperatonos de mtensdad moderada.

11.5.3*.- Reacciones adversas

En general son semejantes a las de los otros AINEs, pero la incidencia de alteraciones
gatrointestinales es menor que el cido acetilsalicilico, fenilbutazona o indometacina; no
presenta los problemas sanguneos de las pirazolonas y producen menos molestias
neurolgicas que la Iindometacina. Por esto, se utilizan con frecuencia en situaciones clnicas
de intensidad leve o moderada.
Las reacciones adversas que pueden producir son las siguientes: dispepsia, ulceraciones
y erosiones gastrointestinales; alteraciones neurolgicas como somnolencia, mareo o sedacin;
erupciones drmicas y diveras reacciones de hipersensibilidad; incluso puede aumentar el
tiempo de hemorragia debido a su accin antiagregante, aunque son muy poco frecuentes las
alteraciones hemopoyticas y hpticas.

1L5.3.f.- Estrategias para la obtencin del enntiinero S(+> puro.

Aunque la sntesis asimtrica por va qumica de los cido S(+) es teenicamente viable,
esta metodologa no resulta rentable porque son necesarios reactivos de elevado coste y no
se obtiene un rendimiento aceptable del enantimero S(+) puro para su posterior
108

Introduccin

comercializacin236238.
Actualmente se ha planteado la resolucin de estas mezclas racmicas mediante
reacciones enzmticas catalizadas por lipasas, debido a su amplia especificidad de sustrato,
elevada enantioselectividad, gran estabilidad y tolerancia a elevadas concentraciones de
sustrato

(>

1M)239, y por

el hecho de no requerir cofactor, as como por su disponibilidad

comercial y bajo coste econmico240.

Siguiendo esta estrategia de catlisis enzimtica se han obtendio cidos R(-) y S(-4-)
2 aril-propinicos con diferente grado de pureza enantiomrica (Tabla 11).

Tabla 11: Mtodos bioteenolgicos de resolucin de cidos 2-aril-propinicos catalizados por lipasas.

ACmO

reacc

Nue

Lipasa

Conv

ee~dd,

Re.

(%)
Ibuprofeno

EST

propanol

Rh.miehei

15-20

70 (R)

241

EST

pentanol

C.rugosa

49

99 (R)

242

R20

C.rugosa

47

99 (S)

243

RID

CR
2CH3

Naproxeno

Ketoprofeno

RIO

CH,CH2CI

F120

C.antrctica

63

58 (R)

244

EST

butanol

M.javanicus

39

8 (5)

245

EST

butanol

A.niger

23

5 (5)

245

1-lID

CH3

R,O

Rh.miehei

18

95(R)

246

RIlO

CH3

1-1,0

R.oryzae

45

98(5)

246

RilO

CH,CF3

R20

Rh.miehei

95

81(R)

247

RID

CH2CR3

R20

C.rugosa

21

98 (5)

243

Flurbiprofen
RIO
CH3
H20
Crugosa
39
65 (5)
248
EST: reaccin de esterificacin; HIll: reaccin de hidrlisis; TR.N: reaccin de transesterificacion

109

PARTE EXPERIMENTAL

111

Parte Experimental

111.1.- MATERIALES
111.1.- REACTIVOS

m.i.i.-

Disoluciones tampn

Todas las sales empleadas en la preparacin de disoluciones tampn fueron de grado

analtico y se utilizaron sin ninguna purificacin previa. Todas las disoluciones se prepararon
con agua purificada destilada/desionizada (18,2 MO de resistividad) en un equipo Barnstead
Ropure.

1111.1.2.- Disolventes orgnicos

Los disolventes orgnicos empleados durante la realizacin de esta Memoriahan sido
los siguientes:
-

ciclohexano (99 % de pureza) de Labsean (Dublin, Irlanda).

hexano (95 %) de Labscan.

acetonitrilo (99 %) de Labscan.

iso-butilmetilcetona (4-metil-2-penta.nona) (99,5

1,4-dioxano (99,8 %) de Sigma.

ter diisoproplico (99 %) de Sigma.
iso-octano (2,2,4-trimetilpentano) (99,7 %) de Sigma.
N,N-dimetilformamida (99 %) de Merck (Darmstadt, Alemania)
1,1,1-tricloroetano (99,5 %) de Merck.

tolueno (99,5 %) de SDS (Peypin. Francia).

ter etlico (99,5 %) de SDS.

%) de Sigma.

acetona (99,5 %) de SOS

heptano de May&Baker Ltd. (Dagenheim, Reino Unido).

Todos estos disolventes se utilizaron sin ninguna manipulacin previa, excepto e]

ciclohexano y el tolueno que se secaron previamente y la acetona, que fue purificada con
KMnO4, secada y destilada.

113

Materiales

m.1.2.a.- Secado de ciclohexano

El ciclohexano rigurosamente anhidro se utiliz como disolvente en las reacciones de
suitesis de steres -de cidos (R,S) 2-arilproptonicos, en las cuales se quiso analizar la
influencia del agua en la actividad de la lipasa mmovhzada de Rh.rnehei (Lipozyme 1M20).
Se coloc a reflujo 1 litro de ciclohexano durante 30 mm, con sodio metal y plato
poroso. A continuacin, se destil y se recogi sobre tamiz molecular de 4 A249. Temperatura
de ebullicin del ciclohexano

80,7 0C

flI.1.2.b.- Secado de 1-butano!

El 1-butanol anhidro se utiliz como sustrato, en las mismas reacciones que el
cclohexano desecado. 60 ml de 1-butanol se colocaron a reflujo con 5 g de magnesio
metlico y unas gotas de cloroformo como catalizador, hasta que todo el magnesio se
convirti en butxido de magnesio. En, ese momento se aadieron los 940 ml de butanol
restantes y se dej a reflujo durante 1 h. A continuacin, se destil y se recogi sobre tamiz
molecular de 4

Temperatura de ebullicin del 1-butanol

116 <C.

IlII.1.2.c.- Secado de tolueno

El tolueno anhidro se utiliz en el proceso de activacin de la siice por el mtodo de
la 2,4,6-tricloro-l,3,5,-triazina.
Se dej el tolueno agitando con cloruro clcico anhidro en polvo durante una noche.
Posteriormente, se filtr con un filtro de pliegues, para eliminar el CaCl

2 y se recogi en un

249

recipiente que contenia sodio en lminas

III.1.2.d.- Purificacin y secado de acetona

La acetona purificada se utiliz para lavar el derivado inmovilizado sobre slice.
Primero se trat la acetona con permanganato potsico (KMnO

4) para oxidar los posibles

restos de 2-propanol, para lo cual se coloc a reflujo un volumen determinado de acetona con
una punta de esptula de KMnO4 durante 8 h. A continuacin, se filtr para eliminar los
restos de MnO2 y se desec con carbonato sdico anhidro (Na2CO3) poniendolo a reflujo
durante 8 h. Se volvi a filtrar con filtro de pliegues para eliminar el agente desecante y se
destil, recogiendo la acetona tratada sobre tamiz molecular de 4
114

,4249~

Temperatura de

J-a,te Experimental

ebullicin de la acetona

111.1.3.- Reactivos

53 0C.

para la determinacin de protenas

Para realizar la recta de calibrado se us como patrn la albmina de suero bovino del
laboratorio Sigma Chemical.

LII.1.3.a.- Mtodo del biurel

-

sulfato cprico pentahidratado (CuSO

45H20) de Merck

tartrato sdico-potsico tetrahidratado (NaKC4H4O6 .4H20) de Merck.

hidrxido sdico (NaOH) de SDS.

[U.l.3.b.- Mtodo de Bradford

-

azul brillante de Coomassie G-250 de Aldrich

cido orto-fosfrico (H3P04) diluido al 85 % (plv) en agua de Aldrich.

etanol al 95 % de SDS.

[11.1.4.-Reactivos usados en la inmovilizacin sobre slice

La slice utilizada fue Kieselgel 40 de Merck que presenta las siguientes caractersticas
2/g; dimetro
texturales: dimetro de partcula: 0,063-0,2 mm, superficie especifica: 239 m
medio de poro: 9,5 A y volumen de poro acumulado: 0,57 cm3/g
-

2,4,6-tricloro-l,3,5-triazina de Merck

N,N,N-trietilamina de Aldrich

cromato de potasio (K
2CrO4)

de Aldrich

disolucin acuosa (0,1014 N) de nitrato de plata (AgNO3) de Aldrich.

m.i.s.-

Soluciones salinas patrn del aparato medidor de actividad de agua

Para la calibracin del aparato medidor de actividad de agua se utlizaron soluciones

salinas patrn comercializadas por Novasina (Zunch, Suiza).
0C
* sal-II (Lid 70%); a.~=0,l; humedad relativa= 11,3 % a 25
* sal-98 (K
2Cr2O7 82%); a~= 0,9; humedad relativa= 98 % a 25 C

115

Nfateriales

111.1.6.- Otros reactivos inorgnicos

-

sulfato amnico ((NIH4)2(504)) de Aldrich

pentxido de fsforo (P205) de Aldrich.

cloruro clcico anhidro (CaCI2) de Panreac (Barcelona, Espaa).

fosfato sdico monocido anhidro (NaJIPO4) de Merck.

fosfato sdico dicido anhidro (NaH2PO4) de Merck.

Tris(hidroximetil)aminometano de Merck.

acido clohidrico concentrado (HCl) de SDS.

acido sulfrico concentrado (~I2SO4) de SOS.

ftalato cido de potsio de Sigma.

fosfato potsico dicido (KIH2PO4) de Panreac

111.2.-ENZIMAS

La enzima objeto de estudio ha sido la lipasa (triacilglicerol acilhidrolasa (EC 3.1.1.3.)

t IOOOOL) e inmovilizada (Lipozym& 1M20>, ambas
de Ehzomucor miehel cruda (Lipozyme
suministradas por el laboratorio Novo-Nordisk (Bagsvaerd, Omamarca)

[11.2.1.-Lipasa cruda de Rh.jmniehe (1

4ipozvme~ IOOOOL

Lipozyme~ 10000L fue obtenida por tcnicas de recombuiacin gentica (ver 11.3.2.)
250: peso molecular = 30 kD; punto
Las caractersticas de esta lipasa son las siguientes
isolctrico = 4; pH ptimo = 6-8 (en la reaccin test de actividad lipsica con tributirina,
mtodo AF95 de Novo-Nordisk); T~ ptima
densidad= 1,15 g/nil

40-50 0C (en la misma reaccin test);

Esta lipasa tiene una actividad de 10000 UL/g, donde una Unidad Lipsica (UL)
corresponde a la cantidad de enzima que libera un micromol de cido butrico por minuto
en la reaccin de hidrlisis de una emulsin de tributirina medida en pH-stato a 30 0C y
pH7,0

250

111.2.2.- Lipasa inmovilizada de Rh.miehei (Lipozvme 1M20

La lipasa de Rh.miehe se presenta en forma inmovilizada sobre una resma

macroporosa de intercambio aninico por adsorcin jnica. El derivado obtenido es
116

Parte Experimental

comercializado por el laboratorio Novo-Nordisk con el nombre de (Lipozyme~ 1M20 951

La resma macroporosa de intercambio aninico utilizada es Duolite A-56S de Duolite
International (Paris, Francia). Este soporte es una resina granular, porosa y de caracter
debilmeffte bsico. El polmero es un policondensado reticulado de fenol-formaldehido, de
caracter hidrfilo y con una distribucin de tamao de poro controlada252
Las caractersticas fisicas de la resina Duolite A-568 son las siguientes: tamao de
pancula: 0,3-0,6 mm; radio de poro: 50-300

A. y

superficie especfica: 200 m2/g

252

En la Figura 23 se muestra una microfotografa del soporte (Figura A) sin enzima y

(Figura B) con enzima (derivado Lipozymet 1M20)25

(a>

(b>
t 1M20 <a> sin enzima y (b)

Figura

Microfotogratia del soporte del derivado Lipazyme

con lipasa de Rh.mehe adsorbida..
23b

El tamao de pancula de Lipozyme 1M20<> oscila entre 0,3 y 0,6 mm. El contenido
en agua de este derivado inmovilizado es del 10 % (p/p 953
Lipozyme~ 1M20 tiene una actividad de 43

UII/g, donde una unidad de

interesterificacin (U) se define como la cantidad de lipasa que cataliza la incorporacin de

1 gmol de cido palmitico a trioleina por minuto a 40 0C. alcanzando la mxima actividad
a 70 oc

251

117

Materiales

m.3.- SUSTRATOS

111.3.1.- Actividad estersica

Para la determinacin de la actividad estersica se emple como sustrato el acetato de
p-nitrafenilo de Sigma (StLouis, EEUU).

1111.3.2.- Actividad lipsica

Para determinar la actividad lipsica se emplearon dos sustratos, segn el mtodo

utilizado:
Sustrato Sigma:Emulsin de aceite de oliva al 50 % (y/y) de Sigma (St.Louis, EEUU)
Tributirina de Aldrich (Steinheim, Alemania) al 98 % de pureza. Diariamente se
prepar una emulsin de tributirina, utilizando coma emulsificante una disolucin acuosa de
goma arbiga, glicerina, NaC y KIH2PO4.
-

goma arbiga de Sigma

glicerina de Aldrich

cloruro sdico de Panreac

fosfato potsico dicido (KH2PO4) de Panreac

111.3.3.- Sntesis de steres

m.3.3.a.- cidos (R,S) 2-arilpropinicos

*

Ibuprofeno (cido (R,S) (2-(4-isobutilfenil)propinico) de Boots (Nottingham, Reino Unida)

cido (R,S) 2-fenilpropinica de Fluka (Buchs, Suiza)

Naproxeno (cida (R,S) 2-(6-metaxi-2-naftil)propinico) de Syntex (Palo Alto, EEUU)

Ketoprofeno (cido (R,S) 2-(3-benzoilfenil)propinico) de Menarini (Badalona, Espaa)

11L3.3.b.- alcoholes
1-butanol, 3-metil-l-pentanol, 1-octanol, ciclohexanol y 2-propanol de Sigma.

118

Parte experimental

IiLLZ.- PROGRAMAS DE CALCULO

11L2.L- SIIMEIT

A lo largo de esta Tesis Docotral se ha utilizado como herramienta de clculo el

paquete integrado SIMIFIT versin 4.0. para llevar a cabo el ajuste de los datos experimentales
a determinadas ecuaciones matemticas.
Este paquete informtico, diseado por WG. Bardsley254, escrito en lenguaje Fortran
compilado y desarrollado en base a rutinas de regresin no lineal de la librera NAG
Workstation, emplea algoritmos de optimizacin matemtica por iteracin con el objetivo de
minimizar la funcin Sumatorio de Residuales (SSQ), definida mediante el mtodo de
mnimos cuadrados.
La funcin SSQ se define como:
SSQ

[19]

Z~(yry9

donde, y~= dato experimental obtenido para la variable independiente y, cuando la

variable dependiente x adopta el valor x~.
y~ valor calculado para la variable dependiente y, cuando x

x~, utilizando para

ello la funcin con los parmetros calculados.

Las suposiciones estadsticas en las que se basa el criterio de los mnimos cuadrados
son: que la ecuacin par ajustar es la correcta, el error en la respuesta es estnctamente aditivo
y los errores son independientes entre si y siguen una distribucin homocedstica (varianza
constante), esto es, las medidas se han hecho con la misma precisin. Este tipo de regresin
se denomina regresin sin pesos estadsticos.
No obstante, la mayora de las veces las medidas expenmentales siguen una
distribucin beterocedstica (diferente varianza), y se hace necesario dar ms importancia
(ms peso) a los datos de menor error frente a los de ms error. Para ello, lo que se hace es
corregir los residuales con un factor llamado yeso estadstico, (wJ, que es inversamente
propocional a la varianza de los datos (el cuadrado de la desviacin estndar).

119

Programas de clculo

1
S2

[20]

De esta forma, la funcin que se optimiza se denom.ma sumatorio ponderado de

residuales (WSSQ), que se define como:

WSSQ

X (1157)

(Yr yJ2

[21]

La desviacin estndar en las mediciones de la variable dependiente se determina

mediante rplicas. De esta forma, se le asigna a cada conjunto de medidas (y

1) su desviacin

estndar correspondiente, que se utiliza para ponderar el error. No obstante, esta metodologa
es recomendable siempre que el nmero de rplicas obtenidas por cada valor de la variable
y sea mayor o igual a 3. Como sto no es factible en muchas ocasiones, otra metodologa
que puede sugerirse consiste en determinar el error experimental promedio que tiene el
mtodo, y asignar a cada punto dicho errar experimental coma error relativo constante.
Generalmente se toma coma valor de dicho error el 5

%.

Como parmetros que cuantifican la bondad del ajuste, el paquete SIMFIT calcula el
2). Por otra parte, cuando se utilizan como pesos
valor del coeficiente de determinacin (R
estadsticos las desviaciones tpicas de los errares (o estimaciones de las mismas), la funcin

WSSQ sigue una distribucin ji-cuadrado (X2) con g grados de libertad, siendo g

n de

puntos experimentales de parmetros de ajuste. De esta forma, por comparacin del valor
-

de ji-cuadrado con WSSQ se puede establecer la bondad del ajuste. El programa Simfit
calada automaticamente la probabilidad de que ji-cuadrado exceda el valor de WSSQ. As,
cuando la probabilidad de que ji-cuadrado sea mayor de WSSQ es menor de 0,01 (nivel de
significancia del 1 %) o menor de 0,05 (nivel de significacia del 5 %), se debera rechazar
el ajuste utilizando dichos niveles de significacin.
Simfit tambin permite establecer entenas de bondad de ajustes a travs del estudio
de los residuales, los cuales, en un ajuste ptimo deberan quedar distribuidos al azar y no
deberan presentar una correlacin seal significativa, por lo que el nmero de residuales
positivos y negativos debe ser similar, y no debe haber series largas de residuales con el
mismo signo, ni tampoco muy pocas series. El nmero de residuales positivos se designa con

120

Parte experimental

la letra n, el de residuales negativos con la letra m y el nmero de series con

Simfit

establece dos tests acerca de las series, que deben dar una probabilidad (p) comprendida ente
a/2 y 1-tr/2 (cx= 0,05 0,01, segn el nivel de significancia con el que se trabaje). La prueba

de los signos, tambin desarrollada por este programa, debe dar una probabilidad p=a,para
poder considerar el ajuste como bueno. Un nuevo estadstico que el programa calcula es el
test de Durbin-Watson, que indica la posibilidad de que exista una correlacin seriada, esto
es, que el signo que presente un residual venga impuesto por el signo del anterior.
Normalmente, cuando el valor de dicho estadstico est comprendido entre 1,5 y

2,5,

se puede

descartar dicho efecto.

Es frecuente que los parmetros del ajuste deban ser distintos de cero, pues el hecho
de anularse suele conllevar el que la variable respuesta y no dependa de alguna variable
explicativa x, o que lleve consigo una simplificacin del modelo debido a la desaparicin
de una parte funcional del mismo. As, para determinar si un parmetro puede considerarse
nulo o no, ste se mide en unidades estndar, es decir, se calcula el cociente:
valor estimado del parmetro
1=

[22]
error estndar de su estimacin

si el valor de este cociente T est dentro de cierto limites (que se consultan en las tablas
estadsticas de la t de Student, considerando como grados de libertad (g = n0 puntos
-

parmetros>, puede ser que el parmetro se anule; si por el contrario, el valor de T rebasa esos
lmites, entonces el valor del parmetro es distinto de cero. El programa Sint suininistra
toda esta informacin mediante un parmetro de redundancia.

111.2.2. HIPERCHEM
Los clculos de Mecnica y Dinmica Molecular de la estructura de los cidos (R,S)
2-arilpropionicos, objeto de estudio en la presente Tesis Docotal, se realizaron con el
programa I-IIIPERCHEM255.
El estudio por Dinmica Molecular de estos compuestos se realiz a alta temperatura
debido a la mayor eficacia para atravesar barreras de energa en el espacio conformacional
multidimensonal256. Se eligi una temperatura de 100 0K como punto de partida, ya que
121

Programas de clculo

permite a la molcula explorar un nmero de conformaciones separadas por barreras

energticas significativas. Para evitar el riesgo inherente a toda simulacin de Dinmica
Molecular a alta temperatura, de que la estructura encontrada corresponda a un minimo local
de alta energa se realizaron con cada una de los confrmeros obtenidos procesos de dinmica
molecular sucesivas de ps (T= 450 0K); lOps (T= 350 0K) y 12 Ps (T= 300 0K).
Finalmente, la geometria de los confrmeros de mnima energa obtenidos de los
cidos (R,S) 2-arilpropinicos se analiz por Mecnica Molecular mediante el uso del mtodo
MM+ como campo de fuerzas. Primeramente se utiliz el algoritmo steepest descent de
forma interactiva hasta un gradiente de 0,1 kcal/mal

A.

Una vez optimizada esta estructura

se procedi a una nueva optimizacin utilizando el algoritmo Fletcher-Reevescon gradiente

conjugado hasta un valor de gradiente 0,02 kcal/mol

A, que permiti

considerar los efectos

de la conjugacin de dobles enlaces, tan importante a priori, en las molculas objeto de

estucho.

122

..

Parte experimental

111.3.- CALRACTERIZACION DE LA LIPASA DE Rhizomnucor miehei

La caracterizacin de la lipasa de Rinzomucor miehel se centr en los siguientes
puntos:
1).- Determinacin de la concentracin de proteinas
2).- Determinacin de la actividad estersica

3).- Determinacin de la actividad lipsica

4).- Estudios de abrasin del derivado inmovilizado comercial de la lipasa de
Rh.miehei (Lipozymet 1M20)
5).- Electroforesis

m.3.1.- DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE PROTEINAS

La determinacin de la cantidad de proteinas de la lipasa de Rh.miehei se hizo
emplendo mtodos espectrfotomtricos. El mtodo de rutina fue el metodo del Biuret,
aunque para la determinacin de la lipasa semipurificada por precipitacin con sulfato
amnico se emple el mtodo de Bradford, para evitar posibles interferencias entre los grupos
amino de la proteina y del sulfato amnico al reaccionar con las sales de cobre del reactivo
de biuret.
En los dos mtodos el patrn de protena utilizado para la elaboracin de las
correspondientes rectas de calibrado fue albmina de suero bovino (BSA).

[I1.3.1.a.- Mtodo del biuret

Para la determinacin rutinaria de la concentracin de protenas de la lipasa empleada
utilizamos el mtodo espectrofotomtrco del Biuret, basado en la formacin de un compuesto
coloreado como resultado de la reaccin, en medio alcalino, de los enlaces peptidicos de las
protenas y las sales de cobre que forman parte del reactivo del biuret257259 La intensidad de
-

color del compuesto formado ser proporcional a la concentracin protica de la muestra.

Reactivo del biuree

Se disolvieron 1,5 g de sulfato cprico pentahidratada (CuSO

4
-

51120) y 6,0 g de

tartrato sdico-potsico tetrahidratado (NaKC4H4O6 4H20) en 500 ml de agua destilada. A

-

123

Caracterizacin de la lipasa de Rh.miehei

continuacin se aadieron, con agitacin constante, 300 ml de NaOH al 10% (p/v) y se

complet hasta 11 con agua destilada. Este reactivo se debe guardar en botellas de plstico;
el almacenaje pued ser indefinido, pero debe desecharse si aparecen depsitos. La adicin
de yoduro potsico (1K) al 1% (p/v) aumenta la estabilidad del reactivo y no tiene efecto
apreciable sobre la calidad del mismo.

Patrn de protena

Se prepararon diluciones de distinta concentracin (2 diluciones para cada

concentracin) de albmina de suero bovino (BSA) diluida en agua.

Procedimiento experimental

Las medidas de la intensidad de colar del compuesto formado se realizaron empleando

un espectrofotmetro 13V-visible Shimacjzu UV-2 100 a una X545 nm, correspondiente a la
longitud de onda de mxima absorcin del compuesto coloreado.
Primero se realiz una recta de calibrado colocando en cada tubo de ensayo 1 ml de
cada dilucin de albmina de suero bovino y 4 ml del reactivo de biuret (volumen total

inI). Se agit cada tubo y se dej incubando, para que se desarrollara la reaccin, a
temperatura ambiente durante 30 mm

o a 37 oc durante 20 min. El color observado al

trmino de este periodo de incubacin, es estable durante al menos 1 h. Debe realzarse un

ensayo en blanco colocando en un tubo 1 ml de agua y 4 ml del reactivo de biuret a fin de
evitar errores sistemticos.
Los parmetros del ajuste de la recta de calibrada, realizado con el programa SIMFIT,
considerando un 5 % de errar relativo constante para cada punto, aparecen a continuacin
(ecuacin 23):
Absorbencia

N=20

R=0,997

tfl

FSNDCKC

dado que

(0,2380,004)[proteinas (mg/m)]

~5NDcxp

2923

es mayor que

(a~O.O5)

(0049-1-0001)

[23]

1,73

F11~<.~005~ 3,0

FsND~b~a,

con, al menos, un 95 % de certeza.

124

la ecuacin es efectivamente significativa

Parte experimental

Ah.o,hsoI* (0.04

.60

____

4W.30K

20

lo

0.00
000

.50

1.00

1.50

200

250

USA) <mg/mo

Figura 24: Recta de calibrado del mtodo del biuret con seroalbmina bovina, considerando
95 % de certeza.

un

En la Figura 24 aparecen, adems de la recta de calibrado

confianza (

(),

el intervalo de

) y el intervalo de prediccin (4

El intervalo de confianza describe los limites entre los que estarn comprendidos los
valores de la recta de regresin con un 95 % de probabilidad.
El intervalo de prediccin indica los limites entre los que estarn comprendidos los
valores de los ensayos puntuales que se realicen, en las mismas condiciones experimentales,
con un 95 % de probabilidad y sern los valores extremos que se utilicen como lmites de
confianza al utilizar dicha recta como curva de calibracin.

Muestra problema

La determinacin del contenido protico de la lipasa cruda de Rhaniehe se realiz,

para cada uno de los lotes suministrados por Novo-Nordisk, por triplicado, tomando 1 ml de
una dilucin en agua 1/5

(y/y)

de dichapreparacin enzimtica y aadindole 4 ml de reactivo

de biuret y posterior medida de la absorbancia a 545 nm. Para cuantificar la cantidad de

125

Caracterizacin de la lipasa de Rh.miehei

protena se emple la recta de calibrado antes indicada (ecuacin 23). La concentracin de

protenas de los lotes de lipasa cruda de Rh.meher suministrados oscil entre 66,5 mg/ml y
62,6 mg/ml. A efedts prcticos se considerar el siguiente valor estndar: (642)mg/mi,
medido con un 95 % de certeza.

IIJiI.3.1.b.- Mtodo de Bradford

Este mtodo, como se ha indicado anteriormente, se utiliz para determinar la

concentracin de protenas de la lipasa de Rhaniehei semipurificada por precipitacin con
sulfato amnico ((NH4)2504).
El mtodo de Bradford se basa en la adsorcin de la protena al azul brillante de
Coomassie G-250, lo que provoca un cambio en el espectro de absorcin visible del colorante,
260
desplazando el pico de absorbancia mxima desde 465 nm hasta 595 nm
Reactivo de Coomasne

Se disolvieron 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 50 ml de etanol al

95%, se aadieron 100 ml de cido orto-fosfrico al 85 % &/v) y se complet hasta 11 con
agua. El reactivo se mantuvo 24 h en oscuridad, guardado en un frasco topacio. Transcurrido
ese tiempo se filtr.

Patrn de protena

Se prepar una dilucin de 1 mg/ml de albmina de suero bovino (BSA) en agua.

Procedimiento experimental

Se coloc en cadatubo de ensayo una cantidad conocida de la disolucin de albmina

de suero bovina; se camplet con agua hasta un volumen de 0,1 ml y se aadieron 5 md de
reactivo de Coomassie. Se agit bin e inmediatamente se midi la absorbancia en el
espctrofotmetro 13V-vis a X=595 nm. La medida debe hacerse inmediatamente porque la
adsorcin de la protena al reactivo de Commassie se produce casi instantaneamente y es
mxima y estable entre los primeros 5 y 20 primeros minutos. Cada punto experimental se
midi por triplicado.
Los parmetros del ajuste de la recta de calibrado, realizado con el programa SIMFIT,
126

Parte experimental

considerando la desviacin estndar para cada grupo de tres medidas, aparecen a continuacin:
Los parmetros y la ecuacin de la recta de calibrado obtenida, considerando una
regresi lineal con pesos estadsticos porporcionales a la desviacin estndar de cada grupo
de tres medidas, es la siguiente:

Absorbancia

(O0092O.0003)[proteinas (gg)]

N= 21

dado que

~SNOexpes

menos, un 95 %

mayor que

(043+001)

[24]

R=
0,991=1
t

t,~= 31,87
FSNDexp

1.19 (a~O,O5)

1016

F119 (a=005)= 2,99

FsND~bUMB,

la ecuacin es efectivamente significativa con, al

de certeza.

En la Figura 25 se representan, adems de la recta de regresin, el intervalo de

confianza y el intervalo de prediccin (ver IJLJ.i.a.).
Ab-a.,.,.

1.10

<no.>

1.00
.90
.80 y.70

Lot
.50

3oh
-.20 F-lot
0.00
0

10

20

30
40
50
(SS4 v,k,cgr...o.>

60

70

Figura 25: Recta de calibrado del mtodo de Bradford con seroalbmina bovina.

127

Caracterizacin de a lipasa de Rh.miehec

Muestra problema

Este mtodo solo se utiliz para la determinacin del contenido protico del lote de
la lipasa cruda d Elimiehel que posteriormente fue sometido a un tratamiento de
semipurificacin por precipitacin con sulfato amnico, para comprobar la variacin del
contenido proteico tras el proceso. En cada caso se tomaron 5 ml del reactivo de Coomassie
y 0,1 ml de la dilucin enzimatica por analizar; dicha disolucin enzimtica fue 1/10
en agua para la lipasa cruda y 1/6

(y/y)

(y/y)

para la lipasa semipurificada. Todos los ensayos se

hicieron por triplicado y se midi la absorbancia a 595 nm. Para cuantificar la cantidad de
proteinas se emple la recta de calibrado indicada anteriormente (ecuacin 24).
De esta forma, la concentracin de protenas obtenida, por este mtodo, para la lipasa
cruda de Rh.tniehei suministrada por Novo-Nordisk oscil entre 8,4 mg/ml y 7,7 mg/ml. El
valor promedio que se considert fue: (8,10,3)mg/ini, considerado con un 95 % de certeza.

111.3.2.- DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ESTERASICA

La actividad estersca de la lipasa cruda de Rh.miehei se determin en funcin de
la cantidad de p-nitrofenol liberada durante la reaccin de hidrlisis, en medio alcalino
(pH=7,8), del acetato de p-nitrofenilo. El aumento de absorbancia producido a 400 nm se
correlaciona con la cantidad de pnitrofenal liberado. &Ka del p-nitrofenol

7,04)

o
lipasa de Rh,niehei
~
~
73

acetato de p~oifrofmilo

CH3COOH

cido aclico

p-oifrofaol

Esquema 21: Reaccin de hidrlisis del acetato de p-nitrofemlo.

Reactivos
*

sustrato: disolucin de acetato de p-nitrofenilo (pNPA) en acetanitrilo (0,75 mM)

tampn de trabajo: Tris-MCI (0,IM) pH=7,8

Esuectros de absorcin
Para establecer la longitud de onda de estudio de la reaccin de hidrlisis del acetato
de p-nitrofenilo se obtuvieron los espectros de absorcin 13V-vis del sustrato (acetato de pntrofenilo) y del producto (p-nitrofenol), para comprobar la longitud de onda de trabajo en
128

Parte experimental

la cual la absorbancia del p-nitrofenol debe ser mxima, mientras que la absorbancia del
acetato de p-nitrofenol debe ser nula.
Se prepar una disolucin (0,IM) de acetato de p-nitrofenilo en acetonitrilo. A
continuacin, en la cubeta del espectrofotmetro se colocaron 0,1 ml de dicha disolucin y
2,4 ml del tampn de trabajo (Tris-UCI (0,1M) pH=7,8), para que las condiciones en las que

se realiz el espectro fueran similares a las condiciones de reaccin. El mismo procedimiento

se sigui con el p-nitrofenol.
Comparando los espectros de la Figura 26 se tom la longitud de onda de 400 nm para
dicho estudio.
Absortando (0.0)
2.50

200

1 50

00

0.50

0.00
200

300
400
longitud de onda

500

Figura 26: Espectros de absorcin UV-vis del acetato de p-nitrofenilo y del p-nitrofenol
Reaccin de hidrlisis del acetato de p-nitrofenilo
En la cubeta de muestra se colocaron 2,4 ml de tampn Tris-HCl (0,1 M) pH= 7,8 y
un volumen determinado de lipasa cruda de Rhaniehei, colocando agua como referencia en
la otra cubeta. La reaccin se dispar al aadir un volumen determinado de una disolucin
de acetato de p-nitrofenilo en acetonitrilo (2,5 mM). La reaccin se llev a cabo a 37 C,
129

Caracterizacin de la lipasa de Rh.miehei

cuantificando el incremento de absorcin, debido a la liberacin de p-nitrofenol, a

?y

400 nm

durante 100 s. La velocidad micial se calcul ajustando el primer tramo de la curva

absorbancia-tiempo a una recta y midiendo su pendiente, la cual se expres como
AAbsmjmin. Para correlacionar esta medida con los moles de sustrato hidrolizado se realiz
una recta de calibrado (ecuacin 25) en la que se represent la absorbancia final de cada
ensayo frente a la concentracin de sustrato en la cubeta de reaccin (Figura 27). Para obtener
el valor de absorbancia final se dej transcurrir la reaccin hasta alcanzar la saturacin.
Absad*eIs<DO>

2.00
1.80

1.40k

1.20 f-

80
.60
.41)
.20
0.00
0.00

04
.06
.08
fp-nIbvftt 1 <aSO)

02

.10

.12

Figura 27.: Recta de calibrado del p-riitrofenol

Los parmetros y la ecuacin de la recta de calibrado obtenida, considerando una

regresin lineal con pesos estadsticos proporcionales a la desviacin estndar de cada grupo
de tres medidas, es la siguiente:

Absorbancia = (18,60,2)[NPA (mM)]

N=24

(0 115+0 009) [251

R=0,996

texp=518
FSND.XP=

2686

(~0.05)

130

2,96

Parte experimental

dado que

FSNDCXP

es mayor que

FSND,abolada,

la

ecuacin

es efectivamente significativa con, al

menos, un 95 % de certeza.

El valor de la pendiente de esta recta, segn la ley de Lambert-Beer, equivale al

coeficiente de extincin molar (c) del p-nitrofenol en estas condiciones.

s= (18,6 0,2) mM cm

De esta forma, al cuantificar el coeficiente de extincin molar (e) del producto de la hidrlisis
enzimtica del pNPA, se pueden convertir los datos de AAbs min, calculados por el
espectrofotmetro Uy-visible, en medidas de Ajc] 1 Nt. Este incremento, cuantificado durante
los primeros 100 s, permite calcular la velocidad inicial de hidrlisis, parmetro que se
emplear como medida de la actividad estersica de las preparaciones enzimticas analizadas.

[11.3.3.- DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD LIPASICA

La actividad lipsca se determin empleando tres mtodos, dos de ellos basados en
la hidrlisis de aceite de oliva y uno basado en la hidrlisis de tributirina.
Para el mtodo de la tributirina y para uno de los mtodos con aceite de oliva los
ensayos se llevaron a cabo en un sistema potenciomtrico de valoracin a pH constante ([pHstato) de la casa Crison formado por:
-

unidad central: Mcrott 2022

unidad de valoracin: Microbur 3031

unidad de agitacin; Microstirrrer 2038

electrodo combinado de pH

mdulo registrador: impresora Epson LX-800

bao de termostatizacin del reactor.

131

:.

Caracterizacin de

a lipasa de Rh.miehei

Ill.3.3.a.- Hidrlisis del aceite de olivia

Para la hidrlisis del aceite de diva (emulsin al 50% (y/y) de la casa Sigma) se
emplearon dos mtodos, ambos basados en la valoracin volumtrica del cido liberado
durante la reaccin de hidrlisis catalizada por la lipasa de Rh.miehei, usando como agente
valorante una disolucin de NaOH lm.M. En el mtodo A el cido liberado se neutraliz
durante el transcurso de la reaccin empleando un pH-stato. En el mtodo B la valoracin se
hizo a punto final.

m.3.3.a.1.- Mtodo A
Reactivos
*

sustrato Sigma: emulsin de aceite de oliva al 50 % (y/y) con 0,1 % de azida sdica

como

conservante,

de

la

casa

Sigma.

Este

sustrato

se

diluy

previamente al 20 % en tampn de trabajo.

tampn de trabajo: tampn fosfato (2inM) pH7,2
disolucin valorante: NaOH (lmM) de factor = (0,9880,002),valorada previamente

con ftalato cido de potasio.

Procedimiento experimental

En la cubeta de reaccin del pH-stato se aadieron 4 ml de tampn fosfato (2 mM)

pH=7,2 y un volumen determinado de lipasa cruda de Rh.miehe. La mezcla se dej agitando
durante 5 mm para que la homogeneizacin alcanzase la temperatura deseada. Posteriormente,
se ajust el pH del medio a 7,0, adicionando unas gotas de una disolucin de NaOH, y se
aadi un volumen determinado de una disolucin 36 mM de sustrato Sigma en tampn. Las
velocidades iniciales se midieron utilizando un mtodo de valoracin a pH fijo, con agitacin
constante y a 37 0C, valorando el cido liberado con una disolucin de NaOH (1 mM) f
(0 988+0 002).
El dato de velocidad enzimtica inicial se obtuvo ajustando el tramo inicial de la
curva, obtenida al representar los mililitros de la disolucin de NaOH adicionados por minuto,
a una recta y calculando su pendiente, la cual se expres en mimoles de acido hidrolizado por
minuto.

132

Parte experimental

m.3.3.a.2.- Mtodo B.
Este mtodo ha sido descrito por la casa Sigma para la detemnnacin de lipasas en
suero (Sigma, protocolo n0 800), basado en el mtodo de Tietz y Fiereck61 y consiste en la
valoracin volumtrica, al final de la reaccin, del cido total liberado durante la reaccin de
hidrlisis.

Reactivos
*

suserato Sigma: emulsin de aceite de ojiva al 50 % (y/y), con 0,1 % de azida

sdica como conservante.

tampn de trabajo: Tris-UC (0,2 M) pH=8,0

etanol al 95 %

indicador: timo[ftaleina al 0,9 % (p/v) en etanol

disolucin valorante: NaOH (0,05 M) de factor

(1,0840,003)valorada con ftalato

cido de potasio.

Procedimiento experimental

Se elabor una recta de calibrado de la cantidad de cido hidrolizado frente a los

miligramos de proteina, haciendo ensayos por triplicado para distintas cantidades de lipasa
nativa de Rh.miehei.
Para cada cantidad de lipasa se prepararon tres tubos de ensayo con 1,2 ml de agua,
0,5 ml de sustrato Sigma, 1,5 ml de tampn de trabajo y una cantidad variable de lipasa de
Rh.miehei. Los tubos se agitaron y se dejaron incubando durante 3 h a 37 0C para que la

reaccin de hidrlisis se desarrollara. Paralelamente, se realizaron ensayos en blanco, por

triplicado para cada cantidad de lipasa, con agua en lugar de Lipozyme IQOCOL y se dejaron
incubando en las mismas condiciones.
Al cabo de las tres horas se verti el contenido de cada tubo en su correspondiente
erlenmeyer, en el que previamente se haba adicionado 1,5 ml de etanol y 4 gotas de
timolftaleina. El cido liberado se valor aadindo NaOH (0,OSM) hasta que la dilucin vir
de incoloro a rosa. Se calcul la cantidad media de NaOH gastada en los tres ensayos
realizados para cada cantidad de lipasa y se le rest la cantidad media gastada en los
correspondientes ensayos en blanco; los ml de NaOR que resultan de esa diferencia se
133

Caracterizacin de la l4asa de Rh.miehei

multiplicaron por un factor de conversin (280) de unidades lipsicas convencionales en

unidades lipsicas internacionales25
El ensayo se realiz para un intervalo de concentracin de protenas entre 0,7 y 53,3
mg, pero el tramo recto de la curva 131/1 mgproteina solo lleg hasta 40 mg protena; por lo
tanto, ese es el intervalo que se consider para la recta de calibrado.
Los parmetros y la ecuacin de la recta de calibrado obtenida, considerando una
regresin lineal con pesos estadsticos proporcionales a la desviacin estndar de cada grupo
de tres medidas, es la siguiente:

actividad hidroltica (131/1)

(162)(mg proteina)

N~24

R~ 0,833

tI.fl(a...Oos>

7,06

F,ND

FSNDe;p=49,9

dado que

FSNDCXP

es mayor que

FsND~bu~a,

(163537) [26]

1,18
1,39

122 (=0.05)

la ecuacin es efectivamente significativa con, al

menos, un 95 % de certeza.
En la Figura 28 se representaron, adems de la recta de regresin, el intervalo de
confianza y el intervalo de prediccin.
aEvtd.dltpalo. (IJI~

40W

1
ji

2002
1502

1002

10

20
~1

30

40

50

<MW

Figura 28: Recta de calibrado de actividad lipsica frente a cantidad de protena, con 95 % de certeza.
134

Parte experimental

En las reacciones con lipasa inmovilizada de Rh.miehei (Lipozym 1M20) el

procedimiento experimental seguido fue muy similar al de la lipasa nativa, con la nica
diferencia de que se aadieron 3m1 de agua, en los tubos donde se desarroll la reaccin, para
aumentar el volumen y poder observar mejor el viraje de color durante la valoracin
volumtrica.

ffi.3.3.b.- Hidrlisis de fributrina

Este mtodo, que es experimentalmente semejante al mtodo A de hidrlisis de aceite
de oliva. se basa en la determinacin de la actividad lipsica en funcin de la hidrlisis de
tributirina catalizada por ambas enzimas Este es el mtodo recomendado por Novo-Nordisk
para la determinacin de la actividad hpsica250
Reactivos
*

suswao: tributirina emulsificada. La emulsin se prepar diariamente y se mantuvo

con agitacin constante. En un matraz de 100 ml se aadieron 5 ml de tributirina, 16,6

ml de emulsificante y se complet con agua. A continuacin, se sonic en un bao de

agua durante 15 min.

emulsificante: se prepara cada mes. En un vaso de precipitados se aadieron 8,95 g de
cloruro sdico (NaC), 0,20 g de fosfato potsico dicido (KWPO

4), 200 ml de agua

y 270 ml de glicerina. Se agit la mezcla y se adicionaron poco a poco 3 g de goma

arbiga; cuando todo estuvo bien disuelto se pas a un matraz de 500 ml y se enras
con agua.
*

solucin valorante: NaOH (0,05M) f

(0,975+0001), valorada previamente con ftalato

cido de potasio.

Procedimiento experimental

Para un ensayo estndar, en la cubeta del pH-stato se aadieron 5 ml de tributirina

emulsificada y 5 ml de agua y una cantidad determinada de lipasa. Se ajust el pH del medio
a 7,0 y comenz la valoracin volumtrica con NaOH (0,05 M) fr(0,9750,001).
Para determinar la actividad lipsica se tom el tramo inicial de la curva de valoracin

y se calcul su pendiente. La velocidad enzimtica inicial se cuantific siguiendo el mismo

135

Caracterizacin de la lipasa de Rh.,niehei

procedimiento que en el mtodo A de hidrlisis de aceite de oliva.

Til.3 4.- DESORCION POR ABRASION DE LA LIPASA INMOVILIZADA DE

Rhizomucor miehet

Se intent separar la enzima inmovilizada comercial (Lipozyme> 1M20) de su soporte,

sometindola a la accin de un medio fuertemente cido (HCI 0,IM), otro medio fuertemente
alcalino (NaOH 0,lM) y un medio neutro (tampn Tris-HC (O,lM) pH=7,0), para lo cual, se
prepararon 3 lotes de 300 mg de Lipozyme9M20 y cada uno de ellos se suspendi en 10 ml
del correspondiente medio. Las disoluciones se mantuvieron en agitacin durante 96 h en un
bao termostatizado a 37 0C. Pasado ese tiempo, se filtraron con una placa filtrante del n0 4
y se determin la concentracin de protenas (por el mtodo del Biuret; ver 11L3.1.a.,)) en los
liquidos de filtrado, para comprobar si la enzima se separ del soporte, tras alguno de estos
tratamientos.
Posteriormente, se llev a cabo un tratamiento similar con ciclohexano, disolvente
orgnico que se utilizar posteriormente en reacciones de sntesis de steres. Se mantuvieron
300 mg de Lipozym> 1M20 en contacto con 10 ml de ciclohexano durante 72 h a 37 oc.
Pasado este tiempo, se procedi a la extraccin con 3x5 ml de agua destilada/desionizada, de
la posible protena que se hubiera desorbido y se llev a cabo una cuantificacin por el
mtodo del biuret de la cantidad de protena en dicha fase acuosa.

111.3.5.- ELECTROFORESIS

Las electroforesis SDS-PAGE (dodecil sulfato sdico en gel de poliacrilamida) se

realizaron siguiendo el sistema Laemmli262. El gel separador era de un gradiente 10% y el gel
concentrador de un 5

%.

Las muestras se sometieron a condiciones reductoras tratandolas con

~3-mercaptoetanol.

136

Parte experimental

Iil.4.- SEMIPURIIFICACION DE LA LIPASA DE Ch. miehet

En la presente Tesis Doctoral se llev a cabo la semipurificacin de la lipasa cruda
de Rhizomucor miehel, para lo cual se emplearon dos tipos de mtodologas:
a).- basados en la separacin de proteinas en funcin de su tamao molecular
(ultrafiltracin y dilisis)

b).- basados en la separacin protica por diferencias de solubilidad

(precipitacin con sulfato amnico)

111.4.1.- SEMIPURIFICACION DE ENZIMAS EN FIJNCION DE SU PESO

MOLECULAR
Debido al elevado peso molecular de las protenas, es posible la separacin de
molculas de pequeo tamao que puedan contaminaras empleando mtodos sencillos, los
cuales tambin pueden ser utilizados para la resolucin de mezclas de proteinas. Los mtodos
utilizados en la presente Tesis Doctoral, basados en este principio han sido la ultrafiltracin,
y la dilisis.

III.4.1.a.- Ultrafiltracin
La ultrafiltracin es un proceso de separacin de protenas de pequeo tamao por
filtracin a travs de una membrana semipermeable con un determinado tamao de poro, con
ayuda de la fuerza centrfuga y una corriente de nitrgeno, que puede ser aplicada en sentido
paralelo al flujo o de forma tangencial264.
El aparato de ultrafiltracin empleado fue un modelo UHP-43 de Micron Analitical,
conectado a una corriente de nitrgeno y con agitacin constante. Las membranas de
ultrafltracin fueron membranas Diaflo modelo YM1O de Amicon, que dejan pasar a su
travs paniculas de peso molecular inferior a 10 kD. La ultrafiltracin se llev a cabo en
cmara fria a 40C,

137

Semipur~/icacin de a lipasa de Rh.nwiehei

Procedimiento experimental

Se ultrafiltraron 25 ml de lipasa cruda de Rh.miehei (Lipozyme iQOQOL). En el

momento en que el Volumen del residuo qued por debajo de la hlice del aparato de
ultrafiltracin se di por finalizado el proceso. Los lquidos ultrafiltrados se recogieron en una
probeta, se midi su volumen y se determin la concentracin de protenas por el mtodo del
biuret (ver 11I.3.1.a.).
Posteriormente, se restituy el volumen de los lquidos de filtrado aadiendo al residuo
la misma cantidad de agua y se volvi a ultrafiltrar. Este proceso se repiti catorce veces; la
membrana se cambi tras la octava ultrafiltracin.
m.4.1.b.- Dilisis
La dilisis es otro mtodo de separacin de protenas en funcin de su tamao
molecular. En este caso se utiliza una membrana semipermeable de celofn con un tamano
de poro determinado, que retiene las sustancias de mayor peso molecular dejando pasar hacia
el medio acuoso, en el que est sumergido la membrana, las partculas menores264.
Las membranas de dilisis empleados son de tamao 2 (30 mx 14,3 mm) de Medicel
International Ltd. (Londres, Reino Unido). Estas

membranas dejan pasar a su traves

molculas de peso molecular inferior a 12000-14000 daltons. El peso molecular de la lipasa

cruda de R/tmiehei es de aproximadamente 30 U)

250

Procedimiento experimental

Debido al caracter fuertemente cido de la lipasa de Rh.miehei las membranas de

dilisis se rompan con facilidad. Por esta razn, para dializar 15 ml de lipasa cruda se
utilizaron 3 membranas diferentes, con 5 ml de lipasa cada una. A continuacin, se colocaron
en un bao con 20 1 de agua destilada/desionizada durante 48 h, renovndo el agua del bao
cada 24 iv
La lipasa dializada se dividi en dos lotes. Con uno de ellos, se hicieron ensayos de
actividad estersica (ver 111.3.2.) y lipsica (siguiendo el mtodo A de hidrlisis de aceite de
oliva;verIIL3.3.a.) y se determin la concentracin de protenas por el mtodo del biuret (ver

138

Porte experimental

El otro lote se centrifug a 5000 r.p.m. durante 30 mm a 4 0C. El sobrenadante

(denominado DC), se recogi y se determinaron sus actividades lipsica y estersica; asi
corno, su concentracin de protenas por el mtodo del biuret. El residuo se diluy en agua,
para restituir el volumen inicial, y se volvi a centrifugar segn las condiciones antenores.
Se recogi el nuevo sobrenadante (denominado D2C) y se llevaron acabo los ensayos
anteriores; el residu se diluy en agua y se centrifug de nuevo. A continuacin, se hicieron
los correspondientes ensayos tanto con e] sobrenadante, denominado D3C; como con el
residuo diluido en agua.
En el Esquema 22 se representa el proceso experimental seguido.
LIPASA le Rl.. miehel DL4L1Z41X4

.1.

centrifugacin

sobrenadante

resduo

Biuret
ensayos de actividad

DC

centrifugacin 2

[ipsica
estersica
re~duo

sobr~adante

4,

Biuret
ensayos de actividad
lipsica
DZC
estersica

centrifugacin 3

sc,breuadante

it

Suret

ensayos de actividad

D3C

_____

lipsica
estersca

re~duo

4,
Biuret
ensayos de actividad
lipsica
R
estersica

Esquema 22.: Esquema del mtodo de semipurificacin por dilisis y centrifugacin..

139

Semipurificacin de la lipasa de Rh.,niehei

m.4.2.-

SEPARACION

DE

PROTEINAS

POR

DIFERENCIA

DE

SOLUBILIDAD
Las protenas en disolucin pueden sufrir profundas variaciones de su solubilidad en
funcin del pH, la fuerza inica, las propiedades dielctricas del disolvente y la temperatura.
Esta caracterstica ha sido aprovechada para separar mezclas de protenas, ya que cada una
posee una composicin en aminocidos caracteristica, la cual determina su comportamiento
como electrolito.
En la presente Tesis Doctoral se utiliz un mtodo precipitacin de protenas por
alteracin de la fuerza jnica del medio, basado en la adicin de sales neutras.
Este es probablemente el mtodo ms empleado para llevar a cabo el fraccionamiento
de protenas por precipitacin ya que presenta una serie de ventajas265:
a).- es un mtodo sencillo
b).-.el precipitado protico obtenido no suele desnaturalizarse y su actividad
se recupera tras redisolverlo.
c).- la adicin de sales neutras estabiliza la protena frente a procesos de
desnaturalizacin, proteolisis o contaminacin microbiana.

La mayora de los grupos hidrfobos de las cadenas laterales de los aminocidos de

las protenas se colocan hacia el interior de la molcula. No obstante, algunos de ellos se
disponen en la sup erficie formando una serie de agrupaciones hidrfobas, que no interaccionan
con las molculas de agua, ni con los grupos inicos del medio. El grado de solubilidad de
una determinada protena est en funcin de la distribucin de dichas agrupaciones hidrfobas
superficiales y de su relacin con las zonas hidrfilas de la protena (Figura 29).

140

Parte experimental

agua

IP

Q
Q

o
o

catin

anin

@ zona hidrfoba
zona con carga negativa

-p

zona con carga positiva

Figura 29: Representacin esquemtica de las reas cargadas de la superficie de una

protena interaccionando con los iones del medio. Las reas hidrfobas superficiales
de la protena interaccionan con molculas de agua, las cuales forman una matriz
ordenada alrededor de esas reas.
Al aadir sales al sistema, los iones salinos son solvatados por molculas de agua. Si
la concentracin de sales es muy elevada, las molculas de agua que rodean a la proteina se
desplazan para solvatar el exceso de iones del medio, dejando expuestos los agrupamientos
hidrfobos de la superficie protica. De esta forma, se produce la interaccin entre los
agrupamientos hidrfobos de distintas molculas de protena formando el correspondiente
precipitado Por tanto, las protenas que presentan mayor cantidad de agrupamientos
hidrfobos superficiales se agregaran ms facilmente. Los agregados formados son una mezcla
de diferentes protenas, por lo que la concentracin de sal necesana para lograr la
precipitacin depender de cada caso concreto. Adems, dado que cada protena tiene una
composicin de aminocidos caracterstica, su comportamiento frente a la adicin de sales
tambin ser diferente. Por esta razn se deben preparar una sene de disoluciones saturadas
141

Semipurificacin de la lipasa de Rh.,niehei

con distinta cantidad de la correspondiente sal, y as poder establecer la cantidad de sal

necesaria para la protena objeto de estudio.

I11.4.2.a.- Factores a considerar

111L4.2.a.1.- Naturaleza de la sal utilizada.
Para determinar el tipo de sal adecuada para la semipurificacin de protenas por
precipitacin hay que analizar una serie de factores:
*

naturaleza del anin

La efectividad de la sal empleada viene determinada principalmente por la naturaleza

del anin. Los aniones multivalentes son los ms efectivos por este orden:
fosfato

>

sulfato

acetato

>

>

cloruro

No obstante, dado que a pH neutro el in fosfato se encuentra como mezcla de HPO4

~

WPO desde el punto de vista prctico el ms adecuado es el anin sulfato.

*

naturaleza del catin

Aunque tienen menos mfluenca en este mtodo, tambin es un factor a considerar.

Los cationes ms adecuados son los monovalentes por este orden:
amonio

>

potasio

>

sodio

gzrado de solubilidad de la sal

Este factor es importante, ya que se suelen emplear elevadas concentraciones salinas

hasta lograr la precipitacin de la protena. Por esta razn las sales de potasio no son
adecuadas debido a su escasa solubilidad en agua

densidad de la solucin salina

Es necesario considerar la densidad de la solucin salina en relacin con la densidad

del agregado protico, ya que la diferencia entre ambas densidades determinar la facilidad
de la separacin por centrifugacin del agregado protico de la masa lquida.

pureza qumica de la sal

La sal utilizada debe presentar pocas impurezas y debe ser economica.

142

Parte experimental

Teniendo en cuenta todos estos factores se eligi el sulfato amnico como sal
precipitante, puesto que:
* presenta un buen grado de solubilidad (una solucin saturada en agua es
aproximadamente 4M)
* la pureza y el precio del sulfato amnico comercial son bastante aceptables.

El nico inconveniente inherente a este mtodo es que la protena semipurificada

contendr cierta cantidad de sulfato amnico, por lo que no se deben utilizar mtodos de
cuantificacin de protenas, en los que pueda interferir el sulfato amnico. El mtodo
recomendado es el mtodo de Bradford265.
III.4.2.a.2.- Cantidad de sal aadida al medio
Como se ha indicado, anteriormente, cada protena requiere una determinada cantidad
de sal para precipitar. Por esta razn, es necesario preparar un gradiente de disoluciones
enzimticas con distinto grado de saturacin de la sal. A continuacin, es necesario analizar
con que grado de saturacin salina precipitan las protenas de la disolucin enzimtica; as
como determinar la concentracin protica y la actividad enzimtica de cada uno de los
precipitados obtenidos. De esta forma, se determina la cantidad de la correpondiente sal
necesaria para obtener la protena activa y en mayor concentracin. La cantidad de sal aadida
se expresa en porcentaje de saturacin, asumiendo que el extracto protico disuelve la misma
cantidad de sulfato amnico que el agua pura. As, para calcular los gramos de sulfato
amnico que deben aadirse a un litro de agua a 20 0C para obtener una concentracin
determinada, se emplea la siguiente ecuacin

533 (S2

S~)
[27]

100-0,3

~2

donde S~== concentracin inicial y S

2 = concentracin final.

143

Semipurificacin de a lipasa de Rh.miehei

1111.4.2.a.3.- Temperatura del medio.

La temperatura a la cual se lleva a cabo la precipitacin es muy importante, ya que

al aumentar la temperatura, disminuye la solubilidad de las proteinas, por lo que la
temperatura utilizada habitualmente es de 40C.
ffi.4.2.c.- Procedimiento experimental
Como se indic anetriorniente, dado que cada protena tiene una composicin de
aminocidos caracteristica, su comportamiento frente a la adicin de sales tambin ser
diferente. Por esta razn se prepararon una serie de disoluciones con distinto grado de
saturacin de sulfato amnico, para as poder establecer la cantidad de sal adecuada para
precipitar la lipasa de Rltrniehei.
Previamente se pulveriz el (NH

4)2504 con ayuda de un mortero y se prepar una

disolucin 1/10 de lipasa de Rh.miehei en. tampn Tris-HCI (50 mM) pH7,5. A continuacin,
se tomaron 7 muestras de 25 ini cada una y se les adicion poco a poco una cantidad variable
de (NH4)2S04, para obtener un gradiente de disoluciones saturadas. En la Tabla 12 aparece
265.
la cantidad de (NH4>2S04 aadido en cada caso y el grado de saturacin alcanzado
Tabla 12: Cantidad de sulfato amnico aadido a la disolucin enzirntica para obtener
distintos grados de saturacin salina.
% saturacuon

(NRJ

2S04 (g)

20

2,67

30

4,15

40

5,72

50

7,37

60

9,15

70

11,05

80

13,07

lh a 4 0C. Posteriormente, se centrifugaron a 5000

Cada disolucin se agit durante
0C durante 40 min.
r.p.m. a 4
En las disoluciones al 20, 30 y 40 % de saturacin no apareci ningn precipitado; por

144

Parte experimental

tanto, con ellas no se continu el proceso.

El sobrenadante de las disoluciones al 50, 60, 70 y 80 % de saturacin, en las que si
hubo prcipitacin, se retir y el residuo se diluy en 10 ml de tampn Tris-ECl (50 mM)
pH~=8,0. A continuacin, cada residuo diluido se dividi en dos lotes (A y B).
Con los lotes (A) se hicieron ensayos de actividad estersica (ver fIL 3.2.) y lipsica
(siguiendo el mtodo A de hidrlisis de aceite de oliva; ver 1II.3.3.a.). Asimismo, se

determin su concentracin deproteinas por el mtodo deBradford (ver 11L3.1.b.) ya que con
el mtodo del biuret podian existir interferencias entre los grupos amonio de la protena y
tos del (NH4)2S04 al reaccionar stos con las sales de cobre del reactivo de biuret265.
Los lotes B se dializaron con una membrana de dilisis de 30 m x 14,3 mm y se
liofilizaron. Posteriormente, se realizaron tambin ensayos de actividad lipsica y estersica
y se determin su concentracin de protenas por el mtodo de Bradford.

145

Inmovilizacin de a lipasa de Rh.miehei

m.5.- JINMOVILIZACION DE LA LIPASA DE Rhizomucor miehel

En la presente Tesis Doctoral se llev a cabo la inmovilizacin de la lipasa de
Rhizomucor miehei por unin covalente con slice, previamente activada va 2,4,6-tricloro-

1,3,5-triazina (TCT) (ver 1L4.6.).

Como ya se mdic en la Introduccin, los procesos de inmovilizacin por enlace
covalente se desarrollan en dos etapas, ya que el proceso de activacin del soporte se lleva
a cabo en condiciones drsticas, que pueden alterar la estabilidad de la enzima. Las dos fases
del proceso son:
a) activacin de la slice va 2,4,6-tricloro-1,3,5-triazina (TCT)
b) inmovilizacin de la enzima sobre slice activada

La slice utilizada fue Kieselgel 40 de Merck, que presenta las siguientes

caracteristicas texturales:

dimetro de partcula: 0,063-0,2 mm

superficie especifica 239 m2/g

dimetro medio de poro: 9,5 A
volumen de poro acumulado: 0,57 cm3/g

m.s.i.- ACTIVACION DEL SOPORTE

La activacin del soporte, slice en este caso, se realiz por reaccin con 2,4,6-tricloro1,3,5-triazina (TCT) (Esquema 23). La optimizacin de esta metodologa fue llevada a cabo
por miembros de nuestro grupo de trabajo266

$....

cl
OH

Activacin
de a slice

cl
Silice

2,4,b-tricloro.. l,3.5-triazina

b- % N
5

INMovIUzAcIoN
Enz-NH
2

Esquema 23: Activacin de la slice con 2,4,6-tricloro-1,3,5-tiiazina (TCT)

En un matraz se aadieron 25 g de Slice, 250 ml de tolueno seco, 7,5 g de 2,4,60C

tricloro-l,3,5-triazina y 15 ml de N,N,N-trietilamma La mezcla se mantuvo a reflujo a 60
146

SJH

Parte experimental

durante 4h. A continuacin, se procedi al lavado del soporte, para lo cual la slice activada
se filtr a vacio con un embudo Euchner y se lav con 250 inI de tolueno seco y con acetona

previamente pura hasta que la slice se decolor.

IiLLS.l.a.- Medida del 2rado de activacin

El grado de activacin de la slice se midi en funcin del tanto por ciento de TCT
unida, para lo cual se hizo una determinacin de cloruros tanto del soporte activado como en
los lquidos de lavado siguiendo el mtodo de Mobi967
Para la valoracin de los cloruros de los liquidas de filtrado se tomaron 5 ml de dichos
lquidos, se aadieron 10 ml de NaOH (0,1 M> y la mezcla se agit durante 5 min. A
continuacin, se separaron ambas fases en una ampolla de decantacin y se repiti el proceso

dos veces ms. Posteriormente, se unieron las tres fases acuosas, de las cuales se tom 1 nl,
que se mezcl con tampn fosfatolNaOH (0.1 M) pH= 7,0 y con 0.05 g de K

2CrO4,

valorandose la mezcla con una disolucin de AgNO3 (0,IM), hasta la formacin de un

precipitado rojo de Ag2Cr2O4.
Para la valoracin de los tomos de cloro remanentes en el soporte activado

se

tomaron 0,1 g de ste y se tuvieron en agitacin, durante 2 h a temperatura ambiente, con 10

ml de NaOH (0,1 M). A continuacin, se tom 1 ml de la disolucin y se valoraron los inoes
cloruro de forma anloga al caso anterior. En los dos casos se hicieron ensayos en blanco para
determinar la posible existencia de cloruros en el disolvente organico, solucion de NaOH,
tampon, etc.

111.5.2.- LNMOVTILIZACION DE LA LIFASA DE Rhizomucor iniehel

En la presente Tesis Doctoral se inmovilizaron la lipasa de Rh.miehei cruda

t IOOOOL) y semipurificada por precipitacin con un 50% de saturcin de sulfato

(Lipozyme
amnico, ya que ste fue el proceso de semipurificacin con el que se obtuvieron mejores
resultados. El procedimiento seguido con ambas enzimas fue el mismo.

Procedimiento experimental

Se prepar una disolucin (5,16 mg protena/mi) de lipasa cruda de Rltmiehei en

tampn Tris-HCl (0,lM) pH= 8,0. En el caso de la lipasa seniipurificada el precipitado
147

Inmovilizacin de la lipasa de Rh,miehe

obtenido se disolvi en el mismo tampon.

11 g de slice activada y 100 ml de la disolucin de lipasa se agitaron, durante 49 h

a 4 oc,. A continuacin, se filtr a vaco con un embudo buchner y el residuo se lav con
tampn Tris-HCI (0,IM) pH 8,0 hasta que los lquidos de lavado dieron negativo el ensayo
del Biuret, es decir, hasta que no hubo protenas en los lquidos de lavado.

11I.5.l.a.- Determinacin de la carra protica del derivado

La carga protica del derivado inmovilizado se determin por diferencia entre el
contenido protico de la disolucin enzimtica inicial y los liquidos de lavado. El mtodo de
determinacin protica utilizado fue el mtodo del biuret <ver 11L3.La.)

ll1.&2.b.- Determinacin de la actividad retenida del derivado

Para calcular el porcentaje de actividad retenida se hizo un ensayo estndar de
actividad lipsica con tributirina (ver III? 3.3.b.) a la disolucin enzimtica inicial y al derivado
inmovilizado, La actividad lipsica, obtenida en cada ensayo, se expres por miligramo de
protena con fines comparativos. La concentracin protica de la disolucin enzimtica inicial
se detennin por el mtodo del Biuret y la concentracin protica del denvado inmovilizado
se determin en funcin de la carga enzimtica calculada anteriormente.

11115.3.- ESTUDIOS DE ESTABILIDAD TERMICA DE LOS DERIVADOS

INMOVILIZADOS
Para estudiar la estabilidad trmica de los derivados inmovilizados obtenidos, frente
a la enzima cruda y semipurificada de Rh.rniehe, se almacenaron tanto los derivados como
las enzimas a 37 y 50 0C. A continuacin, se analiz la actividad lipsica de cada uno de ello,
tras un determinado tiempo de almacenaje, haciendo ensayos de hidrlisis de tributirina (ver
fIL 3.3.b.)

Procedimiento experimental

El medio utilizado para almacenar las enzimas presentaba la misma composicin de

sales inorgnicas que el emulsificante en el que se prepar el sustrato de la reaccin de
hidrlisis de tributirina, es decir 1,8 g de NaC y 0,041g de KH

2PO4 completando con agua

148

Parte experimental

hasta iOOmi.
Las lipasas cruda y semipurificada de Rh.miehei se diluyeron en el medio de
almacenaje y se mantuvieron a 50 y 37 0C, analizando su actividad lipsica cada cierto
tiempo.
Para analizar la estabilidad de los derivados inmovilizados se prepararon pequeas
muestras (2 por cada tiempo estudiado) con 50 mg de derivado y 0,2 ml del medio de
almacenaje. Estas muestras se almacenaron a 50 y 37 0C de temperatura durante un
determinado tiempo, tras el cual se analiz su actividad lipsica remanente.

m.5.3.a.- Ajuste estadstico de las curva de termoestabilidad obtenidas

La actividad lipsica obtenida tras un determinado tiempo de almacenaje a 37 y 5

0c

de cada enzima se expres en porcentaje de actividad retenida. Los resultados obtenidos se

representaron frente al tiempo de almacenaje (horas) y las curvas de desactivacin obtenidas
se ajustaron a un modelo exponencial decreciente con ayuda del programa EXFIT del paquete
integrado SIMFIT, versin 4.0

254

149

Acidos (R,S) 2-arilpropinicos

111.6.- SINTESIS OUIMICA DE

ESTERES BUTILICOS DE

CIDOS <LS) 2-ARILPROPIONICOS

Para la resolucin enantioselectiva de los antiinflamatorios no esteroidicos derivados
del cido (R,S) 2-arilpropinico, se plante una metodologa basada en la hidrlisis
enantioselectiva de los steres butlicos de dichos cidos. Para poder llevar a cabo esta
hidrlisis se sintetizaron, por va quimica, los correspondientes steres siguiendo la
metodologa descrita a continuacin.
Los sustratos de partida fueron las mezclas racmicas de los cidos:
(R,S) 2-(4-isobutilfenil)propinico (Ibuprofeno)
(R,S) 2-fenjipropinico
(R,S) 2-(3-benzoilfenil)propinico (Ketoprofeno).
(5) 2-(6-metoxi-2-naftil>propinico (Naproxeno) y (E.) 2-(6-metoxi-2-naftil)propinico

Los espectros de resonancia magntica nuclear de protn (H-RMN) se reistraron

en un aparato Bruker, modelo

250.

Como referencia interna se utiliz tetrametilsilano (TMS).

Los datos de los desplazamientos qumicos se expresaron en 8 (ppm). Para la interpretacin

de primer orden se emplearon las siguientes abreviaturas: snglete (s), doblete (d), triplete (t),
cuadruplete (c) y multiplete (m).
Los anlisis elementales cuantitativos fueron realizados en el Servicio de Microanlis
de la Universidad Complutense. El analizador utilizado es un modelo 2400-ClIN de PerkinElmer.
Los espectros infrarrojo (IR) se registraron en un espectrofotmetro Perkin-Elmer
modelo 283, utilizando pelcula de poliestireno para la calibracin del aparato.

111.6.1.- (RS) 2-(4-isobutilfenil)pronionato de butilo

(R,S) ster butilico del Ibuprofeno.
Se disolvieron 10 g de cido (R,S) 2-(4-isobutilfenil)propinico (Ibuprofeno) en 40 ml
de 1-butanol y se aadieron unas gotas de ~SSO4 para acidificar el medio. La mezcla se
mantuvo a reflujo durante 18 h. A continuacin, se sigui un procedimiento analtico de
extraccin para separar el cido y el ster. Para ello, se aadieron 20 ml de agua y 20 ml de

150

Parte escperinental

acetato de etilo. La mezcla se agit bien y se separaron dos fases (acuosa y orgnica) en una
ampolla de decantacin; la fase acuosa se volvi extraer dos veces ms con acetato de etilo,
Posteriormente, se reunieron las tres fases acuosas y se les aadi 20 ml de NaOH (0,5 M),
para formar la sal sdica del cido y de esta forma separarla del ster que qued en la fase
orgnica; tras separar estas dos fases, la orgnica se trat dos veces ms con la disolucin de
NaOH (0,5M). Se juntaron las tres fases orgnicas que contienen el ster butilico y se desec
con CaCI2 anhidro, el cual se retir posteriormente por filtracin. Finalmente, se elimin el
acetato de etilo por evaporacion.
Rendimiento: 88 % en producto aislado.
H-KMN(CDCI3, 250 MHz): 8= 7,3-7,0 (m,4H); 4,1 (t, 2H); 3,7 (c, IH); 2,45 (d, 2H);
1,4 (m, 1H); 1,5 (d, 3H); 1,3 (m, 4H); 0,9 (t, 37-1); 0,85 (t, 6H)
IR (film\u cm): 3040, 2957, 1732, 1626, 1165,
Anlisis elemental:
calculado para C,ItO,:

C 77,82 %

, h 9,99 %

encontrado:

C 77,00 %

,H

9,70 %

111.6.2.- <R.SI ster 2-feniluronionato de butilo

Se parti de 5 g del correspondiente cido disuelto en 50 ml de butanol. A la mezcla
se le aadi, gota a gota, 5,09 ml de SO2CI (relacin molar 1:2) y se dej a reflujo durante
una noche. Posteriormente se concentr en rotavapor la solucin hasta la mitad de su volumen
aproximadamente y se le adicion Cl3CH saturado de amoniaco (110 mi). Finalmente se filtr
el NTH4CI formado y se concentr la solucin de cloroformo. Para purificar el producto se
coluinn en silica gel utilizando n-hexano/acetato de etilo (13/3) como eluyente.
Rendimiento: 86 % en producto aislado
H-RMIN (CDCl3, 250 MHz): 8= 7,4-7,2 (m, 5H); 4,15 (t,2H); 3,7 (c, IH); 1,5 (d, 3H);
1,3 (m, 4H); 0,9 (t, 3H)
IR (film)(u cml: 3070, 3040, 2970, 1740.
Anlisis elemental:
calculado para C,,H1802:

C 75,69 %

, H 8,80 %

encontrado:

C= 75,52 %

, 11=

151

8,67 %

4 cidos (R,S) 2-ar/propinicos

111.6.3.- <RS) 2-<6-metoxi-2-naftil)nronionato de butilo

La metodologia de esterificacin seguida fue igual que en el caso del 2-fenilpropionato
de butilo. Sin embarg, la purificacin se llev a cabo mediante un proceso de recristalizacin
en hexano seco caliente (a reflujo) dejando que se enfre lentamente a temperatura ambiente
durante una noche.
Rendimiento: 83 % en producto aislado
H-RMTN (CDCl3, 250 MHz):

&~

7,1-7,7 (m, 611); 4,1 (t, 211); 3,9 (s, 311); 3,8$ (m,

4): 3055, 2953, 1724. 1607

IR (film)(u cm
Anlisis elemental:
calculado para C,H~O,:

79,96 %

, H 8,20 %

encontrado:

80,00 %

H= 7,90 %

111.6.4.- <RS) 2-<3-benzoilfenil)nronionato de butilo

(R,S) ster butlico de Ketoprofeno.
La metodologa empleada fue la misma que en el caso del 2-fenilpropionato de butilo.
La purificacin tambin se realiz por columna rellena de slica gel utilizando diclrometano
como eluyente.
Rendimiento: 87 % en producto aislado
H-RMN(CDCI

3, 250 MHz): 5= 7,4-7,9 (m, 911); 4,1 (t, 2H); 3,85 (c, 111); 1,6 (d,

311); 1,3 (m, 411); 0,9 (d, 311).

IR (film)(u cm): 3061, 2960, 1760, 1732, 1597.
Anlisis elemental:
calculado para C.H~O2:

C= 81,60 %

encontrada:

C= 81,40 Ve

152

, 11= 7,53 %
, 11 7,39 %

Parte experimental

111.7.- HIDROLISIS ENZIMATIC DE ESTERES

En estas reacciones de hidrlisis de steres se emplearon dos metodologas debido a

la difcil reproducibilidad en la obtencin de la emulsin de los steres butilicos de los cidos
(R,S) 2-arilpropinicos y a la necesidad de extraer el producto de la reaccin, ya que en las
tcnicas analticas empleadas no se pueden utilizar muestras acuosas.
La diferencia entre los dos mtodos solo se basa en el procedimiento experimental, ya
que los sustratos, tampn de trabajo, lipasas y proceso de extraccin final son semejantes.
En el Mtodo A se dividi el volumen total de reactivos en diferentes alcuotas de 3
ml cada una, que se pararon a distintos tiempos de reaccin. Por el contrario, en el Mtodo
B se trabaj a mayor volumen (10 m) a un tiempo fijo para todas (143 h).
En el Mtodo A. aunque se obtienen varios valores de rendimiento para cada reaccin,
los resultados son poco reproducibles, debido al difcil manejo del crudo de reaccin durante
la extraccin y a la dificultad de reproducir las condiciones de la emulsin. En el Mtodo B
solo se obtiene un valor de conversin para cada reaccin. Sin embargo, la manipulacin de
la reaccin durante el proceso de extraccin fue mucho ms sencillo y la reproducibilidad
alcanzada mucho mejor; por todo ello, ste fue el mtodo elegido para estudiar las reacciones
de hidrlisis de steres de cidos (R,S) 2-arilpropinicos.
111.7.1.- METODO A
Procedimiento expenmental

Cada tipo de reaccin se realiz por triplicado, poniendo en cada tubo de ensayo el
ster correspondiente (0,125M) y 3 mide tampn Tris-HC de diferente pH, segn la reaccion.
El contenido de cada tubo se sonic a 20 watios en un can de ultrasonidos Branson modelo
Sonifier 450 durante 2 min hasta obtener una emulsin homogenea; se aadi la lipasa cruda
(Lipozyme 10000L)(0,4 ml) o inmovilizada (Lipozyme~ 1M20) (300 mg) y se colocaron los
tubos en un bao de agua termostatizado a 37 0C. Cada reaccin se par a un determinado
tiempo de reaccin; se extrajeron el ster remanente y el cido hidrolizado siguiendo un
procedimiento analtico de separacin (ver III. 7.3); se analizaron en un cromatgrafo de gases
(ver fIL 8.3.a.) para determinar el rendimiento de la reaccin y posteriormente se analizaron

en un HPLC con columna quiral (ver fIL8.3.b.) para determinar el exceso enantiomrico del

153

Acidos <R,S) 2-arilpropinicos

cido hidrolizado.

m.7.2.- METODO B
Procedimiento experimental

Cada reaccin se llev a cabo solo una vez pero el volumen de reaccin fue mayor
y todas las reacciones se detuvieron a un tiempo fijo de 143 h. Se eligi ese tiempo fijo de
reaccin porque el rendimiento de la reaccin estndar (hidrlisis del ster butilico de (R,S)
Ibuprofeno (0,125 M) en tampn Tris-HCl (0,1 M) pH= 7,0) era aproximadamente del 50

%.

En un reactor de 25 ml se aadi el ster correspondiente en una concentracin 0,125

M y 10 ml de tampn Tris-MCi (0,1 M) de diferente pH, segn la reaccin. A continuacin,
se sonic a 20 watios en un can de ultrasonidos Branson modelo Sonifier 450 durante 2
mn; cuando la emulsin estuvo bien formada (aspecto homogneo, blanquecino y sin
cogulos), se adicion la lipasa cruda (0,4 m) o inmovilizada (300 mg), segn el caso. La
reaccin se dej transcurrir durante 143 h en un bao termostatizado a 37 <C. El proceso
seguido a continuacin (extraccin,

anlisis del rendimiento de la reaccin y exceso

enantiomrico del cido hidrolizado) es el mismo que en el Mtodo A.

111.7.3.- AISLAMIENTO DEL PRODUCTO DE REACCION

El medio de reaccin se filtr con un filtro de pliegues, para eliminar la lipasa (en el
caso de la lipasa cruda este procedimiento fue bastante dificultoso, debido a la consistencia
viscosa de la enzima). A continuacin, se aadieron unas gotas de H2S04, para acidificar el
medio, y se aadieron 20 ml de ter etlico y 10 ml de agua, para tener volumenes semejantes
en las dos fases; se agit durante algunos minutos y en una ampolla de decantacin se
separaron la fase orgnica y la fase acuosa. La fase acuosa se volvi a extraer, dos veces mas,
con 20 ml de ter etlico. Finalmente, se unieron las tres fases orgnicas, en las que estan
diluidos el ester y el cido; se desecaron aadiendo una punta de esptula de CaC12 anhidro,
que posteriormente se elimin por filtracin con un filtro de pliegues. El ter etlico se
elimin por evaporacin y el residuo seco se diluy en hexano (para el Ibuprofeno y cido
2-fenilpropinico) o en ter diisoproplico (para el Naproxeno y Ketoprofeno). De esta forma
el cido hidrolizado y el ster remanente se encuentran en medio orgnico, preparados para
ser analizados en el cromatgrafo de gases y en el HPLC con columna quiral.
154

Parte experimental

m.&- SINTESIS

ENZIMATICA DE ESTERES

Uno de los objetivos de la presente Tesis Doctoral es el estudio del comportamiento

de la lipasa de Rh.miehei en medio orgnico como catalizador de la reaccin de sntesis
enantioselectiva de steres de antiinflamatorios no esteroideos derivados del cido 2-ah!propinico (AINEs).
Este estudio lo hemos dividido en dos secciones, segn sean los factores objeto de
estudio:
1) estudio de las variables continuas o estructurales (disolvente y sustratos
(cidos y alcoholes)

2) estudio de las variables discontinuas o de operacin (temperatura, volumen

de reaccin, velocidad de agitacin, tiempo de reaccin, cantidad de
catalizador, etc.), empleando la metodologa del Diseo estadstico de
Experimentos

[11.8.1.-ESTUDIO DE LAS VARIABLES CONTINUAS O ESTRUCTURALES

JIIILS.1.a.- Reaccin estndar
* cido: Ibuprofeno (0,125 M)
*

alcohol: 1-butanol (0,125 M)

disolvente: ciclohexano (10 mi)

temperatura = 37 0C
tiempo de reaccin 72 h

enzima: lipasa cruda (Lipozym& IOOOOL) (0,4 mil)

lipasa inmovilizada (Lipozyme* 1M20) (300 mg)

Procedimiento experimental

Para estudiar la influencia de la naturaleza de los sustratos (cidos (R,S) 2arilpropinicos y alcoholes) y disolventes se defini una reaccin estndar, en la cual se
fueron modificando esas variables estructurales, para determinar cuales son las condiciones
ptimas para la actuacin de la lipasa de Rh.miehei en estas reacciones. Este tipo de

155

Acidos <R,S.> 2-arilpropinicos

cada vez).
En un reactor de 25 inI se aadieron los sustratos (cido y alcohol) y el disolvente. A
continuacin, dich reactor, se coloc en un bao termostatizado a 37 0C con agitacin
constante. Se dej transcurrir la reaccin y cada cieno tiempo se tomaron alcuotas de 0,1 mi,
las cuales se diluyeron en 1.4 ml del disolvente empleado. Estas muestras se filtraron con
microfiltros de nylon de 0,2 im de la casa Lida.

m.8.2.- ESTUDIO DE LAS VARIABLES DE OPERACION

(Diseo estadstico de Experimentos)

Para el estudio de las variables continuas o de operacin, que pueden influir en las
reacciones de sntesis de steres, no se utilizaron los ensayos OV.A.T., empleados en el
anlisis estructural de la reaccin, sino que se utiliz un mtodo de variacin mltiple
mediante la aplicacin de un anlisis factorial denominado Diseo estadstico de
Experimentos, ya que este mtodo permite determinar con mayor certeza que variables son
las que ms influyen en el proceso y si hay algn tipo de influencia conjunta de las variables
estudiadas.
En el Diseo estadstico de Experimentos todos los parmetros objeto de estudio varan
simultanemente de forma programada, desarrollandose un estudio eficaz y racional de las
variables elegidas en todo su intervalo y obtenindose informacin adicional acerca de los
efectos debidos al conjunto de dos o ms variables268.
En la presente Tesis se ha aplicado esta metodologa al estudio de la reaccin de
sntesis del ster butlico de Ibuprofeno en isooctano a 37 0C. Este estudi se aplic a la
lipasa cruda (Lipozyme IOOOOL) e inmovilizada (Lipozym> 1M20)

de Rh.miehei. La

reaccin con los valores medios de cada variable se realiz por triplicado con cada enzima,
hasta alcanzar un rendimiento aproximado del 50 %; el cual se logr a las Eh con la lipasa
cruda y a las 24 h con la lipasa mmovilzada. El procedimiento seguido para cuantificar el
rendimiento de la reaccin se indica en la seccin siguiente (ver fIL8.3.a.). El exceso
enantiomrico de estas reacciones no se determin, ya que la finalidad de este estudio era solo
conocer la influencia de estas variables en la actividad cataltica de estas lipasa.
El nmero total de experimentos fue de 19, de los cuales 16 constituyeron el anlisis
factorial en s (combinacin de las variables en sus niveles mximo y mnimo), y tres
156

Parte experimental

(correspondientes al punto central de cada variable) permitieron un analisis estadistico del

diseo y el clculo de los limites de confianza del estudio. Los valores mximos y minimos
de est& variables se combinaron de forma aleatoria usando el programa STATGRAPH269
La variacin del rendimiento de la reaccin, determinada por cromatografia gaseosa
(verIILS.3.a), se expres como unafuncin polinmica de las seis variables objeto de estudio

(ecuacin 28):
Y (%) = b,

+ ~

1x~

~ b~x1x~

[28]

m.8.3.- METODOS DE CUANTIFICACION DE LAS REACCIONES

IIiLS.3.a.- Determinacin del rendimiento de la reaccin

El rendimiento total de la reaccin se midi con un cromatgrafo de gases Shimadzu

GC-14A equipado con un detector de ionizacin de llama, un inyector de split (1:2) y una
columna SPB-l sulfur

m x 0,32 mm). El gas transportador empleado fue nitrgeno, la

0C, la temperatura del detector fue 350 0C. La
temperatura del inyector fue de 300
temperatura de la columna y el flujo del gas transportador variaron en funcin del cido
(15

analizado, como se recoge en la Tabla 13.

Tabla 13: Condiciones de anlisis del rendimiento de reaccin por cromatografia gaseosa.
ACIDO

Tacolumna

flujo de N
2

Ibuprofeno
Naproxeno
Ketoprofeno
tr

2fenilpropioni
= tiempo retmOi~i

tr (cido)

Ir (ster)

180 oc
0C
190
190 oc

12 ml/mm
30m1/mm

6 min
lomin

10 mm
l7min

30 ml/mm

16 mm

25 mm

180 0C

3 ml/rrnn

3 mm

5 mm

157

cidos (R,S) 2-arlipropinicos

sT ~ R T
1U. t.Yb

5. 57?

10.412

TOP

CRGA

CHROMTOPAC
3~FWLE

MO

~EPORT HO

PILE
~ETHOIi

(4

41

15

M~<

PKHO

TUI!

0.373

2
3

5.577
10.412

10239952 0 E
2528156
129914

TOTAL

13400021

AREA

CONC
80.1009
18.9201
0.9689
100

Figura 3<>: Cromatograma obtenido tras el anlisis por cromatografia gaseosa de una reaccin
de sntesis del ster butlico de Ibuprofeno, catalizada por la lipasa de Rh.miehei.
A partir de los datos suministrados por los cromatogramas se calcul la conversin en
ster a travs de dos mtodos cuantitativos, ambos coincidentes:

Ifl.8.3.a.l.- Mtodo de la calibracin absoluta o del estndar externo.

Este mtodo indirecto consiste en utilizar un estndar externo, para lo cual se debe
disponer de mezclas sintticas cuyas concentraciones de analito (Ibuprofeno) sean conocidas
con precisin. Se prepar una curva de calibrado directa (rea frente a concentracin de
analito) a partir de los cromatogramas correspondientes obtenidos inyectando el mismo
volumen (0,2 j4) de mezclasinttica en cada caso. Cuando se inyecta igual volumen de la mezcla
problema procedente del medio de reaccin, el rea obtenida se correlaciona directamentecon la
cantidad de cido remanente a travs de la curva de calibrado.

158

Parte experimental

Ana

8E.~

area

(4,10,1)IOE+5 [cido (M)j

>4= 11
t~

(2,3O,1)IOE4

R= 0,99

9<~.005~

1,83

texp=

46,3
=

2144

.
4E4-

4-

y
OE.V
0.00

040

080

1.20

1.60

Cenoetadln de IbuprW.no (mgmt>

2.00

Figura 31: Recta de calibrado por cromatografa gaseosa para el Ibuprofeno.

lifl.8.3.a.2.- Mtodo directo o de normalizacin de reas.

En este mtodo se considera que la suma de las reas de todos los picos corresponde
al 100 % de los solutos separados y, por tanto, el rea del soluto A ser el porcentaje en peso
del mismo en la muestra. Para poder aplicar este mtodo es necesario que todos los
componentes de la muestra se eluyan de la columna y que el detector presente igual
sensibilidad para todos ellos, dando respuestas lineales y reproducibles. Esta condicin slo
se cumple cuando se trata de series homlogas de solutos de alto poder de ebullicin. En el
caso de la separacin del Ibuprofeno y su ster butilico se cumplen estos requisitos. Adems,
se comprob la validez del mtodo por comparacin con el mtodo cuantitativo del patrn
externo, Este fue, por tanto, el mtodo elegido para calcular el rendimiento de las reacciones
enzimticas tanto de sintesis como de hidrlisis realizadas a lo largo de la presente Tesis
Doctoral debido a su mayor simplicidad.

159

Acidos <R,S) 2-arilpropinicos

Ill.8.3.b.-

Determinacin del exceso enantiomrico del cido remanente

El exceso enantiomrico del cido remanente, en las reacciones de sintesis enzimtica

de steres se detennin mediante 1{PLC (Waters-Miillipore, modelo 590) dotado con una
columna quiral (Chiracef-OD; de Daicel Chemical Industries Ltd.; Tokio, Japn) de
carbamato de celulosa (25cm x 0,46cm), capaz de separar los enantimeros R y S de los
cidos 2-arilpropinicos.
Los componentes de la fase mvil se modificaron en funcin del cido analizado
(Tabla 14), pero en todos los casos el flujo de dicha fase mvil fue de 0,8 ml/mm, la presin
fue de 200 psi y la longitud de onda empleada para la determinacin espectrofotomtrica de
estos compuestos fue de 254 nm.
Las muestras de Ketoprofenofueron analizadas con una columna quiral (Chiralcel~-OJ;
de Daicel Chemical md.) de ster de celulosa (25cm x 0.46cm). El flujo de la fase mvil fue
de 1 ml/mm, la presin fue de 780 psi y la longitud de onda fue tambin de 254 nm.

Tabla 14: Caractersticas de la fase mvil utilizada para detenninar el exceso enantiomrico
de las reacciones emzimticas de sntesis de steres.
CIDO

fase mvil

Ibuprofeno

hexano 2-propanol 1 actrifluoroacetico

(100/1/0,1) (y/y/y)

Naproxeno

hexano 2-propanol acactico

(97/3/1) (y/y/y)

Ketoprofeno

hexano 1 2-propanol! acactico

(90/10/1) (y/y/y)

2-fenslpropiomco

hexano 1 2-propano! ac. fnnico

(98/2/1) (y/y/y)

Los tiempos de retencin de los enantimeros R y S de cada cido fueron los

siguientes:

Ibuprofeno

>

Naproxeno
Ketoprofeno

(R) 19 min; (8) 22 mm

(R) 22 mm; (8) 24 mm

(R) 20 min; (8) 25 mm

cido 2-fenilpropinico

-~

(R) 22 mm; (8) 24 min

160

Parte experimental

c:\lctaIIc\dat,\
Vial Nuiaber
Injec ion Number

Vial naln
Initial Pressute
2 samples per seo
Original
o:\lotalk\method\
O: \LCTALK\SEQLJENCE\

Wavelength
254 nm
Cnt re n t
o: \ 1 cta 1 lcVue t hod\
C : \ICTALK\ SEQLJENCE\

0.1212

-0. 0064

Re tant
4. 54

4.72
6.95
10.51

11 .08
17.52
20 . 91

0.00

Peak Mame

Time

ares
136660
1303452
18299
111041

58998
4164903
2982798

25.00

Are.

he ight

1.557

210849

14.852
0. 209
1 . 265
o .672
47 .457
33. 988

943315

26758
102987
36218
1275698
712075

Height
6.374
28.517
0. 809
3.113
1.095
38,565
21,527

Figura 32: Cromatograma obtenido tras el anlisis por HTPLC con columna quiral de una
reaccin de sintesis del ster butlico de Ibuprofeno, catalizada por la lipasa de Rh.miehei.

111.9.- ISOTERMAS DE ADSORCION

Las isotermas de adsorcin son una representacin grfica de la variacin de la
actividad de agua (a) respecto a la cantidad de agua aadida al medio en el que se encuentra
la enzima (en este caso la clula del aparato) (ver 1L2.6.c.)

La medida de actividad de agua se realiz en un medidor modelo Rotronic Hygroscop

D.T. de la casa Aname, especial para disolventes orgnicos, que permiti la lectura simultnea
de humedad y temperatura, la cual se fij a (250,5)0C aproximadamente, mediante un bao
termostatizado acoplado a una clula de medidas.

161

Isotermas de adsorcin

111.9.1.- CALJiBRACION DEL APARATO DE ACTIVIDAD DE AGUA (as,

La calibracinse llev a cabo, en primer lugar, con el patrn de menor a~ (sal-II; a,,
0,1) y, posteriormente, con el patrn de mayor a.~ (sal-98; aj 0,9) (ver JILI.5.)

[1.9.2.-

PREPARACION DE LAS MUESTRAS

Las muestras objeto de estudio deben ser desecadas totalmente antes de comenzar una
isoterma. En este caso para desecar las enzimas se han empleado dos metodologas diferentes
en funcin del estado fsico de stas, ya que la lipasa cruda de Rh.rniehei (Lipozyme 1 OOOOL)
es un lquido, mientras que el derivado inmovilizado (Lipozyme 1M20) es un slido.

Lipasa cruda de Rh. miehel (Lipozyme lOOOOL)

Para desecar esta lipasa se congel

previamente a -180 oc utilizando nitrgeno

lquido, ya que debido al alto contenido en azcares de la preparacin enzimtica, no se pudo

congelar con los mtodos convencionales. A continuacin, se liofiliz y posteriormente se
desec colocandola en atmsfera de 1>20, anhidro, conectado a una bomba de vacio. Para
verificar el total secado de la enzima se midi el valor de a,,, en el detector de actividad de
agua; dicho valor debe oscilar entre 0,005 y 0,01.
Lipasa inmovilizada de Rh.iniehei (Lipozymet 1M20)
Para desecar la lipasa inmovilizada por Novo-Nordisk (Lipozyme 1M20) se coloc
una determinada cantidad de enzima en un desecador con 1>20, anhidro y se conect a una
bomba de vacio hasta que se alcanz un valor de a~ de entre 0,005 y 0,01 aproximadamente.

11L9.3.. ISOTERMAS DE ADSORCIN

La metodologa empleada fue la misma tanto para la lipasa cruda como para la lipasa
inmovilizada; la nica diferencia surgi al llevar a cabo las isotermas en aire o con
disolventes orgnicos.
Para realizar las isotermas en aire se coloc una cantidad determinada (100-200 mg)
de lipasa, previamente desecada, en la cmara del aparato medidor, mientras que, para las
isotermas con disolvente orgnico, adems de la lipasa, se coloc 1 ml de disolvente orgnico
162

Parte experimental

anhidro.
Una vez colocados en la cmara del aparato medidor de agua, previamente
termostatizado a (250,5)C, las muestras correspondientes, se fueron aadiendo cantidades
crecientes (lil) de agua. Tras cada adicin se esper aproximadamente 2h, hasta alcanzar el
valor de equilibrio de a,, y se procedi a la lectura del valor de a,, para cada nuevo volumen
de agua aadido. La isoterma se di por finalizada cuando el valor de a,, fue
aproximadamente de 0,9; ya que los valores prximos a 1 indican que la lipasa est saturada
de agua. Por ltimo, se represent la curva de cantidad de agua aadida por mg de enzima
frente a la variacin de actividad de agua, ajustandola a un mtodo de splines cbicos, como
se describe a continuacin a (ver 111.9.4.).

fliL9.4.- ASUSTE DE LA CURVA DE LA ISOTERMA

El ajuste de las curvas de cantidad de agua aadida por gramo de enzima seca frente
a a.,, se llev a cabo empleando el programa COMPARE, incluido dentro del paquete
estadistico SIMFIT, versin ~ 254 Dicho programa est basado en una estrategia emprica de
ajuste de curvas por el mtodo denominado de splines cbicos. Este mtodo consiste en
dividir el intervalo (a,b), que contiene los datos por ajustar, en diferentes subintervalos (a1,
a), ,(a01, aa), de forma que en cada subintervalo (al, a~1) se construye una cbica
c~(polinomio de grado tres), que sea continua hasta su segunda derivada, de modo que en las
uniones de los intervalos (llamados nudos), las cbicas y sus derivadas P y 21 coincidan. De
esta forma, todas las cbicas se unen suavemente en los nudos, para formar una nica cbica.
El programa COMPARE permite utilizar la curva suavizada mediante splines cbicos como
una curva de calibracin, de manera que se puedan llevar a cabo clculos de la cantidad de
muestra seca que presenta una preparacin enzimtica, de la cual se conozca su valor de a,,,
con un porcentaje de confianza del 95

%.

163

RESULTADOS Y DISCUSION

165

Resultados y Discusin

IV.1.- CARACTERIZACION DE LA LIPASA DE Rh.miehe

En la presente Tesis Doctoral se ha estudiado la lipasa producida por el hongo
RI-zizomucor miehel, comercializada por Novo-Nordisk en su forma cruda (Lipozyme 1 OOOOL)
e mmovilizada (LipozymeMM2o) sobre una resma de intercambio aninico (Duolite A-568).
El estudio realizado abarc los siguientes puntos:
a).- determinacin del contenido protico
h).- estudio de la actividad estersica
e).- estudio de la actividad lipsica

IV.1.1.- DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE PROTEIINAS

[V.1.1.a.- Lipasa cruda de Rhizomucor miehel (Lipozvmet 1OOOOL~
El primer paso del estudio de la lipasa de Rh.miehei fue la determmacin de la
concentracin de protenas de los diferentes lotes de lipasa cruda utilizados, para lo cual se
sigui el mtodo del biuret (ver 11L3.I.a.). La concentracin media de todos los lotes fue

(642)mg proteina/m de Lipozym& lOOOOL.

Asimismo, se emple el mtodo de Bradford (ver fIL3.I.b.), para la determinacin
de la concentracin protica de los lotes de Lpozymet 1 OOOOL que fueron semipurificados
por precipitacin con sulfato amnico. Este mtodo se emple con el objeto de evitar las
posible interacciones entre el sulfato amnico y las sales de cobre del reactivo del biuret, que
podrian distorsionar el resultado de la determinacin protica. Como se observa en la Tabla
15 los resultados obtenidos con los lotes 4 y 5 son muy similares, por lo que se consider un
valor medio de (8,10,3)mg protena/ml Lipozyme IOOOOL.
Cabe resaltar los diferentes valores de concentracin de protenas obtenidos con cada
mtodo. El mtodo del biuret es menos especifico ya que el reactivo utilizado interacciona
con todos los aminocidos, por lo que se cuantifican incluso los pequeos pptidos que
contaminan la preparacin enzimtica (Lipozyme~> 1 OOOOL) y menos sensible, pues trabaja en
intervalos de concentracin de protena mayor. Sin embargo, e] mtodo de Bradford, basado
en la adsorcin del reactivo a la superficie protica es menos sensible para esos pequeos
pptidos, por lo que el resultado obtenido es menor.
Dado que el mtodo del biuret result ser til para cuantificar elevadas concentraciones

167

Caracterizadn de la Lipasa de

arn~~

de protena, ste fue el mtodo de rutina seguido para la cuantificacin de carga protica de
la liapasa cruda de Rh.miehei, excepto como se ha indicado anteriormente, en los
experimentos llevados a cabo en presencia de sulfato amnico.
Las rectas de calibrado de ambos mtodos aparecen en las secciones IL3.1.a. y
111.3. 1.b., respectivamente.
Tabla 15: Contenido protico de los distintos lotes de Lipozymet lOOOOL.
LOTE
BIURET
BRADFORD
(mg/m)

(mg/m)

621

641

671

6412

842+0 01

661

776+001

IV.1.1.b.- Lipasa inmovilizada de P.hfromucor

miehel (LinozvinJM2O

La carga enzimtica del derivado comercial Lipozyme~> fue determinado por Vzquez
y coLt270, los cuales emplearon el mtodo de Gotham y coLy.271, que es una modificacin del

mtodo de Bradford para protenas insolubles. El resultado obtenido indica que la carga
protica del derivado inmovilizado Lipozymet 1M20 es de 0,12 mg protena/mg de
Lipozyme~ 1M20, siendo ste el valor considerado a lo largo de esta Memoria.
Las enzimas inmovilizadas por adsorcin son facilmente desorbidas en medio acuoso.
Por ello, el denvado inmovilizado Lipozyme 1M20 fue sometido a un proceso de desorcin
por abrasin (ver 111.3.4.) en medio acuoso, a distintos pH, y en ciclohexano, condiciones en
las que se utilizara posteriormente el biocatalizador. Tras el proceso de abrasin se determin
la concentracin de protenas desorbidas del soporte y se calcul el grado de desorcin del
derivado en los diferentes medios. Los resultados aparecen en la Tabla 16.

168

Resultados y Discusin

Tabla 16: Grado de desorcin del derivado Lipozymet [M20tras un proceso de abrasin en
diferentes medios (t48h y T8=37C).
naturaleza del
medio

cantidad de
derivado (mg)

protena inicial
(mg)

protena
desorbida
(mg)

% abrasin

acuoso pHl

300

36

7 0~0,3

19,4 :0,8

acuosos pH7

300

36

3 5~0,3

9,7

acuoso pH43

300

36

6 2~0,2

17,2 xO,6

ciclohexano

300

36

0,3

Para determinar la cantidad de protenas iniciales se consider el dato de carga

enzimtica del derivado inmovilizado Lipozym? 1M20 (0,12 mg protena/mg de Lipozymet
IM2Oj>, determinado por Vazquez y col?0.
En medio orgnico ladesorcin del derivado inmovilizado es nula, lo cual indica que
en las reacciones de sntesis de steres la carga del derivado inmovilizado no se modifica.

Este hecho justifica la elevada actividad observada en las reacciones de esterificacin en

medio orgnico, catalizadas por Lipozym? 1M20.
Por el contrario, en medio acuoso si se produce la desorcin de protena del derivado
inmovilizado, factor que es necesario considerar al plantearse experimentos en medio acuoso
con este derivado. En medios fuertemente cidos o bsicos, el grado de desorcin es ms
importante que en medio neutro, debido a que en esos medios drsticos la enzima y el soporte
sufre mayores alteraciones, con lo que la desorcin protica es mayor. En medio neutro el
grado de desorcin es menor, siendo ste el pH ptimo de actuacin del derivado
251

inmovilizado en soluciones acuosas

1V.1.2.- DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ESTERASICA

Siguiendo el proceso de caracterizacin de la lipasa de Rh.miehei, se determin la
actividad estersica especfica de los distintos lotes de lipasa cruda (Lipozyme~ lOOOOL).
La actividad estersica de la lipasa cruda de Rkmiehei se determin en Puncin de
la cantidad de p-nitrofenol liberado durante la reaccin de hidrlisis del acetato de pnitrofenilo, en medio alcalino (pH=7,8). El aumento de absorbancia producido a 400 nm se

169

Caracterizacin de

la lipasa de ALmiehel

correlaciona con la cantidad de p-nitrofenol liberado. (pKa del p-nitrofenol =

7,04>

<ver

IILS.2.)

O
II
CH3C O

lipasa de Rh.tniehei
NO2

CH3 COOH

HO

NO2

H2O

tampn pH= 7,8

acetalo dep-nitrofenIo

cido actico

p-nitrofenol

Esquema 24: Reaccin de hidrlisis del acetato de p-nitrofenilo.

IV.L2.a.- Actividad estersica esnecifica
La actividad especfica viene dada por el valor de la pendiente de la recta obtenida al
representar la velocidad de reaccin frente a la cantidad de protena.
Con el objeto de determinar la actividad estersica especfica de los lotes 2,3,4 y 5 de
t IOOOOL) se realizaron ensayos estndar con cantidades
lipasa cruda de Rb,miehei (Lipozyme
variables de lipasa. Posteriormente, se represent la velocidad de reaccin (mmoles
hidrolizados/min) frente a la cantidad de protena utilizada en cada ensayo (mg proteina,
determinado por mtodo del biuret). Como se observa en la Tabla 17 los resultados obtenidos,
dentro del intervalo de concentracin de protenas considerado (0,5 a 2,5 mg/ml) y dentro del
error experimental, son semejantes en todos los lotes analizados, excepto en el lote 3.

Tabla 17: Actividad estersica especfica de la lipasa cruda de Rh.mieh,ei

LOTE

actividad especfica
(mmol/min mg prat)

8 6~0,8

5 540,3

8 2~0,9

7 l~O,6

IV.1.2.b.- Determinacin de las constantes cinticas de la actividad e*rska

Para detenninar las constantes cinticas

(KM

l<cat)

se eligieron dos lotes (2 y 5) y se

realizaron diversos ensayos con una cantidad constante de lipasa (0,032 mg protema,
cuantificado por biuret), variando la concentracin de la disolucin de sustrato (acetato de p170

Resultados y Discusin

nitrofenilo en acetonitrilo).
Para llevar a cabo el ajuste de los datos de actividad frente a concentracin de sustrato
se utiliz el programa MiIvffIT, del paquete estadistico SIMFIT, versin 4.0

254

Este programa

permite el ajuste de los datos directamente a una hiprbola michaeliana, Los ajustes, a menos

que se indique lo contrario se llevaron a cabo con pesos estadisticos proporcionales al 5 %

de error.
En las Figuras 33 y 34 se recogen las representaciones de Michaelis-Mente y Eadie-

Hofstee, respectivamente de los lotes analizados.

velocidad de reaccin <mmo/mln)
0.25

0.20-

0.15

jit

0.05

0.00I~
0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

Ide2

deS

0.010

coneantracin de aoao de p-nltraftnhlo (U)

0.012

FIgura 33: Representacin de Michaelis-Menten de la actividad estesica de los lotes 2 y

5 de lipasa cruda de Rkmiehei.

171

Caracterizacin de la lipasa

deA~uU~j

99.2

74.4

~>

49.6

24.8

0.0

5.7

16.5

27.2

38.0

48.8

// [s]

Flpra 34: Representacin de Eadie-Hofstee de laJ5U ~jes~rdica de los lotes 2 y 5 de

lipasa cruda de Rkmiehei.
En la Tabla 18 se recogen los valores de las constantes cinticas, correspondientes a
la actividad estersica de los lotes de lipasa cruda de Rh.miehei estudiados.

Tabla 18: Constantes cinticas de la actividad estersica de la lipasa cruda de RJz.miehei.

LOTE

5
5

KM

~cat

[1v!]de pNPA

(mmol/min mgprot)

(92)10~
(71)1W3

(112)
(122)

Como se observa en la Tabla 18 el valor de las constantes cinticas es muy semejante

en los dos lotes analizados. Esto indica que, independientemente del lote de Lipozym?
1 OOOOL

utilizado, la afinidad de la lipasa por el sustrato

(KM)

es semejante y la constante

cataltica (kcat) es tambin semejante, lo que indica una buena homogeneidad en la protena
cruda de partida.
Tras comprobar la similitud de la actividad estersica especfica y de las constantes

172

Resultados y Discusin

cinticas de los diferentes lotes de lipasa cruda de Rh.miehei (Lipozym? lOOOOL), empleados

a lo largo de la presente Tesis Doctoral, se puede concluir que el lote utilizado no es un factor
diferendador a considerar en la actividad esterasca.

La actividad estersica de la lipasa inmovilizada Lipozym& 1M20 no se pudo

determinar con este mtodo, ya que al ser un slido insoluble es imposible medir la evolucin
de la reaccin con el espectrofotmetro Uy-visible, puesto que las partculas de Lipozyme~
1M20 interfieren en la medida de absorbancia, provocando una dispersin de luz que
imposibilita las medidas.

IV.1.3.- DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD TIPASICA

En la presente Memona se ha hecho mayor hincapi en el estudio de la actividad

lipsica de la lipasa de Rh.miehei, ya que para seguir el transcurso de la reaccin no se

emplean mtodo espectrofotomtricos, sino mtodos de valoracin volumtrica, en los que se
pueden utilizar lipasas en cualquier estado fisico. Por esta razn, la actividad lipsica se ha
utilizado como indicador del grado de modificacin funcional sufrida por la enzima tras los
procesos de semipurificacin e inmovilizacin desarrollados en esta Memoria.
Como se indic en la parte experimental, la actividad lipsica se determin empleando
tres mtodos; dos de ellos basados en la hidrlisis de aceite de oliva (sustrato Sigma;
emulsin de aceite de oliva al 50%

(y/y)

y uno basado en la hidrlisis de tributirna.

IV.1.3.a.- Hidrlisis de aceite de oJiva

En la hidrlisis del aceite de oliva catalizada por la lipasa de Rkmiehei se sigmeron
dos mtodos; en uno de ellos (mtodo A) el cido liberado se neutraliz en el transcurso de

la reaccin empleando un pH-stato (ver 11L3.3.a.1.); mientras que, en el otro mtodo (B) la
valoracin se hizo a punto final, valorando el cido liberado al final de la reaccin <ver
11L3.3.a.2.).

173

Caracterizacin de a lipasa de RILmlehei

IV.1.3.a.1.- Mtodo A
Determinacin de la actividad UDsica esoecifica
Siguiendo esie mtodo, basado en la valoracin del cido liberado en el transcurso de

la reaccin se determin la actividad lipsica especfica de los diferentes lotes de lipasa cruda
de Rh.miehei (LipozymJ lOOOOL) Los resultados obtenidos aparecen en la Tabla 19.

Tabla 19: Actividad lipsica especfica (hidrlisis de aceite de oh-va) de la lipasa cruda de
Rb.miehei. Reaccin test: hidrlisis de aceite de oJiva.

LOTE

actividad especfica
(mmol/min mgprot)
(3,5 0,2)l0~

(2,90,1)l0~

(1,60,1)10~

-4

(2,90,1)10

(2,60,1)1W

Los lotes 1, 2. 4 y 5 presentan una actividad lipsica especfica similar, dentro del
error experimental, mientras que el lote 3 presenta menor actividad, como ocurri en la
actividad estersica (Tabla 17). Este hecho se tuvo en consideracin en posteriores estudios,
evitando utilizar el lote 3 en procesos en los que la comparacin de la actividad lipsica fuera
fundamental.

Detenninacin de las constantes cinticu1~

Las constantes cinticas

(KM

y koat) se determinaron unicamente con los lotes 2 y 5,

los mismos que se utilizaron para determinar las constantes cinticas de la actividad
estersica. En las Figuras 35 y 36 aparecen las correspondientes representaciones de
Michaelis-Mente y de Eadie-Hofstee de la reaccin de hidrlisis de aceite de oliva catalizada
por la lipasa cruda de Rkmiehei.

174

..

Resultados y Discusin

Velocidad de reooIn <mmol/min)

0.005
rry

-I

0.004

s
0.003

0.002

.~

ldt2

0.001

-4

*~_LdOS~

0.000

0.00

0.02

004

oCdlO@v*UOln

aos
0.10
de aodte U. cifra U)
0.06

012

Figura 35: Representacin de Michaelis-Menten de la actividad lipsica de los lotes 2

de

lipasa cruda de Rb.miehei. Reaccin test: hidrlisis de aceite de gilva

4.23

xl O

3.23

~.

2.24

1.24

0.25

0.028

0A17

0.207

0.296

0.385

v/jjs]
fIgura 36: Representacin de Eadie-Hofstee de la actividad lipsica de los lotes 2 y 5 de
lipasa cruda de Ritmiehet Reaccin test: hidrlisis de aceite de oUva

175

Caracterizacin de la lipasa de RILmehei

En la Tabla 20 se recogen los resultados de las constantes cinticas de esta reaccin

para cada lote de enzima estudiado.

Tabla 20: Constantes cinticas de la actividad lipsica de la lipasa cruda de

RA.miehei.Reaccin test: hidrlisis de aceite de gilva.
LOTE
KM

5
5

El valor de

KM

[Iv!]de aceite oliva

(mmol/min mgprot)

(397)i04
(305)i0-~

(1,00,1)i0~
(0,620,06)1W

(constante de afinidad enzima-sustrato) es similar en los dos lotes; lo

mismo sucede, considerando el error experimental, con el valor de ~ (constante cataltica).

Tras este estudio, se puede concluir que todos los lotes empleados son semejantes
tanto en concentracin de protenas, como en actividad enzimtica (estersica y lipsica),
excepto el lote 3, que fue descartado.

Este mtodo no se pudo emplear para la lipasa inmovilizada (Lipozymet 1M20), ya

que la resma de intercambio aninico (Duolite A-568) utilizada como soporte es de naturaleza

fuertemente cida y surgieron una sene de problemas tcnicos para ajustar el pH a 7 antes de
comenzar la valoracin,

IV.t3.a.2.- Mtodo B
El cido liberado durante la reaccin de hidrlisis del aceite de oliva se valor
volumetricamente al fmal de la reaccin. La velocidad de reaccin se determin por diferencia
entre la muestra problema y un blanco de reaccin.
El objetivo perseguido con este mtodo era la determinacin de la actividad comparada
del derivado inmovilizado comercial (Lipozyme~ 1M20) con la lipasa cruda, ya que en esta
metodologa no era necesario ajustar el pH del medio de reacin y por tanto se evitaba el
principal inconveniente del mtodo A.

176

Resultados y Discusin

Determinacin de la actividad livsica especfica

Las actividades lipsicas especificas de Lipozyme~ 10000L y Lipozym& 1M20
apareceii en la Tabla 21. Esta actividad se expresa en (UI/l mg protena), tal y como se indica
en el protocolo descrito por Tietz6 <ver 11L3.3..a.l)

Tabla 21: Actividad lipsica especifica de la lipasa de Rh,miehetReaccin test: hidrlisis de

aceite de gilva.
actividad especfica

ENZIMA

(UI/ 1 mg prot)
Lipozyme IOOOOL

16t2

Lipozyine 11420

l,0~0 6

Como se esperaba, la actividad lipsica de la lipasa inmovilizada es notablemente

inferior a la de la lipasa cruda. Esto no se debe relacionar con la abrasin del 9,7 % de
proteina <ver Tabla 16) observada, sino posiblemente con el hecho de que no todas las

molculas de enzima adsorbidas son activas. Este tipo de desactivacin ha sido descrita por
Wang y colsY2 para la lipasa de C.rugosa adsorbida y se atribuye a una interaccin
distorsionante entre la proteina y el soporte polar-hidrfilo, establecida en funcin de los datos
de calorimetra de barrido y fluorescencia de superficie273.

El dato de actividad enzimtica obtenido con el derivado 1M20 se ha utilizado para

determinar la carga enzimtica del mismo. Para ello se interpol la actividad lipsica obtenida
con 1 SOOmg de Lipozyme 1M20. en la recta de actividad de la enzima cruda (ver Figura 28)
y se determin que la actividad de este ensayo equivale a (249)mg de protena de lipasa
cruda. De esta forma, se calcul la carga enzimtica de LipozymeX 1M20, expresada ~
funcin de la actividad lipsica retenida, que fue de (0,016+0 006) mg de protena activa en
hidrlisis / mg de LipozymJ 1M20.
Considerando la carga enzimtica estimada para este derivado Lipozym& 1M20 como
0,12 mg protena/mg derivado270 y teniendo en cuenta la abrasin que se produce en medio
acuoso a pH==7,0 (ver Tabla 16>, deberan liberarse a] medio (172)mg de protena, valor
semejante a la cantidad de protena (249)obtenida tras interpolar en la recta de la Figura
177

Caracteriwcin de la Lipasa de Rh.miehei

28.

Por tanto, podra pensarse que la actividad hidroltica observada para Lipozym 1M20

es consecuencia de la total desorcin del contenido protico de dicho derivado durante el

transcurso de la reacin (3h), de forma que la lipasa expulsada al medio se comporta como
enzima libre, manteniendo sta su actividad hidroltica inalterada.

IVX3.b.- Hidrlisis de tributfrmna

La evolucin de la reaccin de hidrlisis de tributirina catalizada por la lipasa de
Rkmiehei se sigui mediante valoraciones volumtricas con un pH-stato (ver 11L3.3.b.>, tal
y como se hizo en el mtodo A anteriormente descrito. Esta metodologa es la recomendada
por Novo-Nordisk para la determinacin de la actividad lipsica262
-

Determinacin de la actividad lipsica especfica

Siguiendo esta metodologa se pudo determinar la actividad especfica de la lipasa
cruda, de las lipasas inmovilizada comercial (Lipozyme~ 1M20) e inmovilizada sobre slice
durante la presente y de la lipasa semipurificada por precipitacin con sulfato amnico y
posteriormente inmovilizada sobre slice. Esto nos permiti comparar las actividades lipsicas
de todas estas enzimas y evaluar las consecuencias de la inmovilizacin y de la
semipurificacin sobre la actividad de la lipasa de Rkmiehei. Este mtodo solo se aplic al
lote 5 de la lipasa cruda (Lipozym& 10000L), ya que se comprob, en los ensayos de
hidrlisis de aceite de oliva, que la actividad lipsica de todos los lotes era semejante.
En este apartado solo comentaremos los resultados obtenidos con las lipasas
comerciales, ya que, los resultados de las lipasas semipurificadas e inmovilizada sobre slice
se comentarn en secciones posteriores. En la Tabla 22 se recogen los resultados de actividad
lipsica especfica en la reaccin de hidrlisis de tributirina para las dos preparaciones
comerciales de lipasa de RJLmiehei cruda e inmovilizada.

178

Resultados y Discusin

Tabla 22: Actividad lipsica especfica de la lipasa cruda e inmovilizada de Rh.mehei.

Reaccin test: hidrlisis de tributirina.

ENZIMA

actividad especfica
(mmol/min mg prot.)
(884)10<

Lipozym IGOQOL
Lipozymet 1M20

(3,80,4)10<

La actividad lipsica especifica de la lipasa cruda es muy superior a la de la enzima

inmovilizada. Como se indic anteriormente (ver Tabla 21), este hecho era de esperar, ya que
las lipasas mmovilizadas por adsorcin presentan una baja actividad en reacciones de
hidrlisis.

Determinacin de las constantes cinticas

Tambin, se determinaron las constantes cinticas de la reaccin de hidrlisis de

tributirina catalizada por la lipasa de Rh.rniehei cruda e inmovilizada sobre una tesina de
intercambio aninico (Lipozyme<~ 1M20). Las representaciones de Michaelis-Mente y de
Eadie-Hofstee aparecen en las Figuras 37 y 38.
v~oeld de maotde, <mmcWn*~)
0.035

Y
o oas

0020

-A--

~0

0.015

0.010

0.005

0.
0.20
0.00

040

060

oonnntmotdn de M&Dflna (U)

Figura 37: Representacin de Michaelis-Menten de actividad lipsica de la lipasa de

Rh.miehei cruda e inmovilizada por adsorcin (11420). Reacin test: hidrlisis de tributirina
179

Caracterizacin de la lipasa deA&na~jg!

0.0305

0.0229

Y
>00153

0 0076

0.0000
0.016

0.090

0.163

0.236

0.309

v/[s]
FIgura 38: Representacin de Eadie-Hofstee de actividad lipsica de la lipasa de RJ,.miehei
cruda e inmovilizada por adsrocin (11420). Reaccin ten: hidrlisis de trihutirina
Los valores de las constantes cinticas (KM y kcat) de la actividad lipsica de ambas
enzimas se recogen en la Tabla 23.

Tabla 23: Constantes cinticas de la actividad lpsca de la lipasa de RJ.miehei cruda e

inmovilizada por adsorcin (flvI2O). Reaccin test hidrlisis de tributirina.
ENZIMA
KM

Lipozyme

10000L

Lipozymet 1M20

[Nf]de tributirina

(mniol/mn mgprot)

(6010)io-3

O 13~00l

(11530)10<

00l4~000l

Las conclusiones obtenidas tras el anlisis de las constantes cinticas de la lipasa cruda
e inmovilizada son semejantes a las del estudio de sus actividades lipsicas especificas. De

esta forma, se confirma, como era de esperar, que la actividad lipsica en la reaccin de
hidrlisis de tributirina es mucho menor para la lipasa inmovilizadapor adsorcin, puesto que
tanto la formacin de la inteifase (cuantificada segn KM53), como el rendimiento de la
reaccin (cuantificada por k

08~) son peores para el derivado inmovilizado LipozymeZ 1M20.

180

Resultados y Discusin

Tras comparar los resultados obtenidos para la lipasa cruda (Lipozymet IOOOOL) con
ambos sustratos (ver Tablas 21 y 22,), se comprueba que el valor de KM vara ligeramente,
siendo algo menor en la reaccin de hidrlisis del aceite de oliva (KM

35 l0~ M), ya que

la formacin de la interfase es m~or para este sustrato debido a su mayor caracter lipoide,
por lo que la afinidad enzima-sustrato es tambin mejor. No obstante, la actividad cataltica
es mucho mejor para la reaccin de hidrlisis de tributirina, con un incremento de ko., 200
veces superior a la reaccin con aceite de oliva (k

0,~~ 6,2 1 0~ mmol/min mg).

IV.1.4.- ELECTROFORESIS
Las electroforesis fueron realizadas por el Dr. Garca-Caero del Departamento de
Bioqumica Analtica del Hospital Puerta de Hierro de Madrid.
En la Figura 39 se muestra la electroforesis de la lipasa cruda de Rh.nnehe
t lOOOOL), realizada ni condiciones reductoras (ver 111.3.5.).
(Lipozyme
La columna de la izquierda corresponde a los patrones de protena utilizados y la
columna de la derecha a la lipasa de Rhaniehei. La flecha indica la banda correspondiente a
30 kD, peso molecular de la enzima analizada.
En la electroforesis se observa que la preparacin comercial, Lipozymet IOOOOL, de
la lipasa cruda de Rh.miehe, presenta gran cantidad de protenas contaminantes de elevado
peso molecular (70-80 kD). Asimismo, aunque en menor proporcin, aparecen proteinas
contaminantes de bajo peso molecular (10k])).
A continuacin, se llevaron a cabo diversos mtodos de semipurificacin con el
objetivo de eliminar las protenas contaminantes. Los resultados obtenidos se comentarn en
el apartado siguiente lvi

181

-a

L
-

2
Caracterizacin de la Lipasa de Rhaniehei

FIgura 39: Electroforesis de la lipasa cruda de RF&rniehei, realizada en condiciones reductoras.

182

Ressellados y Discusin

IV.2.- SEMIPURIFICACTON DE LA LIPASA DE Ah. miehel

Como ya se midc ax la Parte Experimental (ver 111.4.) la presente Tesis Doctoral se
llev a cabo la semipwificacin de la lipasa cruda de Rhizomucor mehel siguiendo dos tipos
de mtodologias:
a).- basados

a>

la separacin de proteinas

a>

funcin de su tamao molecular

(ultrafiltracin y dilisis)

b).- basados ax la separacin protica por diferencias de solubilidad

(precipitacin con sulfato ammca)

IV.2.1 U1SRAFILflACION
La lipasa cruda de Rharnehei se ultrafijitr catorce veces consecutivas (ver 11L4.J.a.),
determinando

wi

cada imo de las residuos obtenidos la concaitracin de protenas remanente

por el mtodo del buret

La membrana semipermeable utilizada separ las molculas de peso molecular inferior
a 0 kD. Esta membrana se eligi con el objeto de eliminar las protenas contaminantes de
menor tamao, ya que el peso molecular de la lipasa de Rkmehet es de 30 kD

En la Figura 40 se representa la progresiva disminucin del contando de protenas en

el residuo obtaiido tras sucesivas ultrafiltraciones.

183

Senwipur4ficacin de la lipasa de Rh.nehei

cuifld dB prasMa. en malteo <mj
22W

18W

14W
12W

8W
Lx,
4W
2W

o
0

10

12

14

men a ehuMmal,
Figura 40: Evolucin del contenido protico de la lipasa de Rh.mehe tras sucesivas
ultrafiltraciones.
Coma se observa en la Figura 40, durante las primeras ultrafiltraciones se produce una
importante disminucin del contwido protico de la lipasa de Rh.miehe, pero a partir de la
novena ultratiltracin se estabiliza la cantidad de protenas del residuo. lo cual indica que ya
se han eliminado practicamaxte todas las protenas de peso molecular inferior a 10 kD, las
cuales representan un 69% de las protenas totales determinadas por el mando del biuret.
Coma se indic anteriormente (ver IV.1.) este mtodo de determinacin de protenas es poco
especifico, ya que el reactivo utilizado forma complejos coloreados de cobre con todos los
pptidos de la preparacin enzimtica. Tras las mltiples ultrafiltraciones se confirma la
existencia de gran cantidad de pequ~os pptidos contaminantes, que reaccionaran con el
reactivo de cobre, por lo que la concentracin de protenas determinada segn este mtodo
es mayor que la determinada por el mtodo de Bradford, ya que este ltimo es un mtodo
basado en la adsorcin del reactivo coloreado a la superficie protica, por lo que es ms
diificii que esos pequfios pptidos sean cuantificados.

124

Resultados y Discusin
IV.2.2.- DILISIS Y CENTRIFUGACION
El objetivo perseguido con este mtodo es, igual que con la ultrafiltracin, la
eliminain de pptidos de bajo peso molecular que acompafian a la lipasa cruda de Rh.mwhe
(Lipozyme 1 OOOOL>
La lipasa no dializada no se pudo congelar por mtodos convencionales debido al
elevado contenido en azcares de la preparacin comercial Lipozymet 1 OOOOL, que retienen
gran cantidad de molculas de agua, con lo que se dificulta el proceso de congelacin. Tras
el proceso de dialisis se logr congelar la lipasa seniipurificada, lo cual ndica que durante
la dilisis no solo se eliminaron protenas de bajo peso molecular, sino tambia azcares que
contaminan la preparacin comercial de lipasa de Rh.miehet.
Como ya se indic en la Parte Experimental (ver 111.4.1.6.) se e
mple una membrana de dilisis adecuada para separar protenas con un peso molecular
inferior a 12-14 kD.
Tras la dilisis se llevaron a cabo sucesivas centrifugaciones a 5000 r.p.m.. Con cada
uno de los sobrenadantes obtenidos se realizaron determinaciones de la concentracin de
protenas y de actividad estersicay lipsica (ver 111.3.2. y III.3.3). La nomenclatura utilizada
para designar las distintas fracciones fue la siguiente:
D

DC

lipasa dializada

sobrenadante dializado

1 centrifugacin

DZC

sobrenadante dializado

2 centrifugaciones

D3C

sobraiadante dializado

3 centrifugaciones

residuo obtenido tras la tercera centrifugacin.

IV.2.2.a.- Determinacin de la concentracin de uroteinas

En la Tabla 24 aparece la concentracin de protenas del lote 2 de partida, de la lipasa
dializada y de los residuos y sobrenadantes obtenidos tras sucesivas centrifugaciones,
obtenidos por el mtodo del biuret.

185

Semipurj/icacin de la lipasa de Rkmiehei

Tabla 24: Contenido protico (segn mtodo del buret) de las ftacciones obtenidas por
dilisis y sucesivas ultrafiltraciones de la lipasa de Rh.rnehei.
fraccin protica

cantidad protenas (mg)

LOTE 2

95518

dializada

27716
residuo

sabrenadante

dializada + 1 centrifugacin

1171

1602

dializada + 2 centrifugacin

501

671

dializada + 3 centrifugacin

487

1,40,2

Tras la dilisis se redujo en un 70% el contenido protico de la lipasa de Rh.mehei.

Como consecuencia de la primera centrifugacin de la ennma dializada, se perdi un 57%
de las protenas. Tras redisolver el residuo (DC) y centrifugarlo de nuevo el contenida
protico pas de 117 mg en DC a 50 mg en D2C, con lo que la reduccin de protenas fue
de nuevo del 57%. Sm embargo, aunque se centrifug por tercera vez el contenido de
protenas del residuo D3C permaneci constante.

Este mtodo de semipurificacin de la lipasa de Rh.mtehei, en funcin del tamao

molecular de las protenas, result ser mucho ms sencillo y breve que el mtodo anterior de
sucesivas ultrafiltraciones. Par esta razon, se continu con la caracterizacin de la lipasa
semipurificada por dialisis y sucesivas centrifugaciones, determinando las actividades
especificas lipsica y estersica.

lV.2.2.b.- Determinacin de 1* actividad estersica

El ensayo de referencia utilizado para determinar la actividad estersica de la lipasa
de RJtmehei fue la reaccin de hidrlisis de acetato de p-nitrofenilo, tal y como se describi
en la Parte Experimental (ver 111.3.2.).
Para determinar la actividad estersica especfica de la lipasa cruda (lote 2) se
consider un intervalo de protenas similar al contenido protica de la lipasa semipurificada,
debido a que la representacin de la actividad estersica de la lipasa cruda frente a la

186

Resultados y Discusin
concentracin de protenas d lugar a una grfica no lineal, la cual a efectos prcticos, se
descompuso en dos intervalos entre O y 0,75 mg/ml y 0,75 y 3 mg/ml (Figura 41), que se
ajustaron a dos rectas para, en funcin del intervalo considerado, emplear ima u otra.

os

30.00

o.)

p.odmnte

20.00

?RECTA

10.00

0.
0.50

1.00
....uw.nS~

1.50

2.00

ufl0

2.50

3.00

Figura 41: Actividad estersica del lote 2 de la lipasa cruda de Rh.mehez.

A continuacin, en la Figura 42 se representa la actividad estersica especfica de la

lipasa de Rh.mehe cruda, dializada, de los sobraxadantes obtenidos tras centrifugar sucesivas
veces la lipasa dializada y del residuo formado tras la tercera centrifugacin.

1S7

Semipur4/icacin de la lipasa de Rh.miehei

vS.Sad a ,~nee., (SMU
Sao

orn
orn
la
.auams, a ,,a... (meW)
Figura 42: Actividad esterdalca de la lipasa de Rh.miehei wmipuriflcada por dilisis y de
los sobrenadantes obtenidos tras sucesivas centrifugaciones
os

os

En la Tabla 25 se recogen estersicas especificas de la lipasa cruda de Blimehel, de

la lipasa dializada, de los sobrenadantes obtaiidos tras centrifugar sucesivas veces la lipasa
dializada y del residuo formado tras la tercera centrifugacin. Asimismo, se indica para cada
enzima, su correspondiente valor de factor de seinipurificacin (F), definido como la relacin
de la actividad especfica de la enzima semipurificada respecto de la enzima cruda.

Tabla 25: ActivIdad esterales eapeciflca de la lipasa de Rh.miehei semipurificada y cmda.

fraccid. pr.tdica

actividad estersic
(mmol/min mgprot)

LOTE 2

201

dializada (D)

221

1,1

dializada + 1 centrif. (DC)

341

1,7

dializada + 2 centrxf (D2C)

162

0,8

dializada + 3 centrt (D3C)

residuo (R)

(a)detenninacn de proteinas por el mtodo del biuret (lI~factor de purificacin

188

Resultados y Discusin
Analizando los resultados indicados en la tabla y figura anteriores se observa que tras
el proceso de dilisis el incremento de la actividad estersica de la lipasa de Rh.mehe es muy
poco siiificativo; solamente tras la primera centrifugacin se obtiene un cierto incremento
de actividad. Por lo que se puede deducir que tras la dilisis se han eliminado protenas no
activas y sustancias contaminantes, que no influan en la actividad estersica de la enzima.
Tanto el residuo como el sobrenadante obtenidos tras la tercera centrifugacin carecen
de actividad estersica, debido a su escaso contenido protico (Tabla 24)

W.2.2.c.- Determinacin de la actividad linsica

En la Figura 43 se representa la actividad lipsica de la lipasa de R/z.mehe cruda,
semipurificada por dilisis y de los residuos obtenidos tras someter a la lipasa dializada a
sucesivas centnfugacones La reaccin test utilizada para determinar la actividad lipsica de
estas enziimas fue la hidrlisis de aceite de oliva, segn el mtodo A, descrito en el apartado
11L3.3.a.1.

~eeae
on

se ,u..e, fl,.,aeu

0,50

1.00

1.50

ZOD

oawetuOti .* pmtetn.s 0wW)

aso

Figura 43: Actividad lipsica de la lipasa de Rh.miehez semipurificada por dilisis y de los
sobrenadantes obtenidos tras sucesivas centiifugaciones. Reaccin test: bidr6Iisis de aceite
de clin.

189

Senuipur4ficacin de la lipasa de R.h.miehei

Tabla 26: Actividad lipsica especfica de la lipasa de Rh.miehei cruda y semipurificada.
Reaccin test: hidrdlimb de aceite de diva.
fracd6n protica
actividad especiflca
Y
(mmol/mn mg prot)
LOTE 2

(2,90,4)l0~

1,0

dializada

(4,40,4)10

0,15

dializada 4 1 centrfligacin

(6,60,8)1W

0,22

A diferencia de lo que sucede con la actividad estersica, la actividad Zipsica sufre

ima considerable disminucin tras el proceso de dilisis. Este hecho debe atribuirse a la
eliminacin de molculas pequeas (azcares, sobre todo) que acompaan a esta preparacin
(Lipozyme lOOOOL), y que son indispensables para el mantenimiento de la actividad lipsica,
ya que permiten la unin de la enzima a la inteifase oleo-acuosa. Este efecto ya ha sido
descrito para la lipasa de C.rugosa por Lamare y colsY, los cuales demostraron que la
eliminacin por dilisis de la lactosa del preparado comercial provoca ima drstica
disminucin de la actividad lipsica, sin afectar a la actividad estersica.

lV.2.3.- SEMIPURIFICACION DE PROTEINAS POR PRIECIPiTACION TRAS

LA ADICION DE SULFATO AMONICO
Como ya se mdic en la Parte Experimental (ver HL 4.2.) se prepar ini gradiente de
disoluciones de la lipasa cruda de Rkmiehe con distinto grado de saturacin de sulfato
amnico. La formacin de precipitado solo seprodujo ai las disoluciones con ms de ini 50%
de saturacin; por tanto, fue con los residuos obtenidos tras centrifugar dichas disoluciones
con las que se llev a cabo la caracterizacin enzimtica.

IV.23.s.- Determinacin de a concentracin de nroteinas

La determinacin de la concentracin de protenas de los precipitados obtenidos se
realiz por el mtodo de Bradford, ya que el mtodo del biuret no era vlido en este caso
debido a las posibles interferencias que podran producirse entre el reactivo del biuret y el
sulfato amnico.
En la Tabla 27 aparecen los resultadas de concentracin de protenas de los residuos

190

1
1
Resultados y Discusin
(dializadas y no dializados) obtenidos por precipitacin de las protenas con diferentes grados
de saturacin con sulfato amnico. Los resultados se expresan en miligramos de protena por
mililitro de disolucin, ya que estos residuos se recogieron y se diluyeron en tampn Tris-HCl
(50 mM) pH8,0.

Tabla 27: Concentracin de protenas de la lipasa semipurificada por precipitacin con sulfato
amnico y posterior dilisis. Mtodo de Bradford.
% saturacIn con sulfato
precipitado NO dializado
precipitado dializado
amnico

(mg/mi)

(mg/mi)

50 %

0,720,04

0,450,03

60 %

2,210,03

1,370,04

70 %

2,310,03

1,630,03

80 %

3,800,04

1,740,05

LOTE 5

7,760,01

Tras el anlisis de los resultados obtenidos se puede observar que existe una relacin
directa entre el grado de saturacin con sulfato amnico y la concentracin de protenas
precipitadas, ya que cuanto mayor es el porcentaje de saturacin mayor es la concentracin
del precipitado protico. Al aumentar la concentracin de sulfato amnico se eliminan ms
molculas de la superficie protica para solvatar las molculas de sal, provocando la
agregacin de mayor cantidad de molculas de enzima. Tambin se observa que tras la
dilisis, la cantidad de protenas disminuye sensiblemente, especialmente en los precipitados
con mayor contenido protico.

Con el fin de comparar las actividades especificas de la lipasa cruda de Rb.miehe: y

la lipasa semipurificada se aplic un factor de coaccin para expresar los miligramos de
protena segn el mismo mtodo de determinacin protica (mtodo de Bradford). Dicho
factor de conversin, aplicado a la actividad expresada en cantidad de protenas segn el
mtodo del biuret, fue (8,50,9),valor calculado al correlacionar los valores de la
concentracin de protenas obtenidos por ambos mtodos (ver Tabla 15) Los valores de
actividadespecfica y constante cataltica (kCBt) en los que se ha aplicado dicho factor se
indicarn por ini asterisco (*).
191

Semiputificacbn de la lipasa de Bkrnhti

IV.L3.br ElectraforeliS
En la Figura 44 aparece la electroforesis de la lipasa de Rh.miehei semipurificada.
t~.

<kbr

Figur 44: Electroforntis SDS~PAGE en condiciones reductoras de la lipasa de Rh.miehei

seinipurificada por precipitatifl con sulfato amoniCO.
Las dos primeras bandas desde el lado derecho de la electroforesis corresponden al
patrn de protenas Las bandas 3 y 4 correpondai a la lipasa semipurifkada por precipitaClOfl
en una solucin con un 50 % de saturacin de sulfato amnico; las siguientes bandas
corresponden a la lipasa de Rh.miehe semipurificada con mx 60, 70 y 80 % de saturacin de
sulfato amnico, respectivamente.
En estas electroforesis. se observa que la enzima purificada por precipitacin con ini
50% dc sulfato amnico presenta una banda intensa <90%) ni la zona correspondiente al peso
molecular de a lipasa de R.mMhei (3OkD).
En los otros preparados la bandas a 30 lcD sigue siendo la ms significativa, pero al
aumentar la cantidad de sulfato amnico utilizado, aumenta la intensidad de las bandas
contaminantes de peso molecular superior, debido a que el proceso de agregacin protica es
mayor.
Tras el estudio de estas electroforesis, se puede concluir que la precipitacin de la
lipasa cruda comercial de Rb.mehei (Lipozym> 1000014 con un 50% de saturacin de
sulfato amnico pennite la purificacin casi total de dicha lipasa.

W.2.3.c,- Determinacin de 1. actividad estersica

Una vez conocida la concentracin protica de cada uno de los residuos obtenidos tras
la precipitacin con sulfato amnico, seprocedi a la determinacin de la actividad estersica
remanente, para analizar el grado de modificacin de esta actividad tras el proceso de

192

Resultados y Discusin
semipurificacin, que est determinado por el factor de semipurificacin (F).

Determinacin de la actividad esterszca especifica

En la Figura 45 se representan las rectas de variacin de la velocidad de la reaccin
de hidrlisis del acetato de p-nitrofenilo frente a la concentracin de protenas de la lipasa
cruda de Rh.miehe y la lipasa semipurificada por precipitacin con distintos procentajes de
saturacin con sulfato amnico. En la Figura 46a y 46b se representan las rectas de actividad
estersica de la lipasa semipurificada porprecipitacin con sulfato amnico sin y con posterior
dilisis
necead

,s,

<049

U.U

&O4

.ana~

0.06

arns.

0.12

0.1B

45: Comparacin de la actividad estersica especfica de a lipasa Rhsnrehei cruda y

seniipuriflcada por precipitacin con distintos grados de saturacin de sulfato amonico.

Figura

193

Semipu4fcacin de la lipasa de Rh.mieIaei

v~OCI6

vedad 6. manido, (ad14St)

6s r..octi (nS*ditD

It-

It.

8.0

6.0

4.0

2.0

0.
0.04

~a*ad,

0.06
peCis

0.12

0.16

0,00

(a,fl*

0.04

0.06

nsflpasa*efl

0.12

Figura 46: Actividad estersica esDecfica de la lipasa semipunficada por precipitacin con
distinto grado de saturacin de sulfato amnico. A) sin posterior dilisis, 8) con posterior
dilisis.

En la Tabla 28 se recogen los valores de actividad estersica especfica para cada

residuo, tanto dializado como sin dializar. La actividad especfica se expres por cantidad de
protenas determinadas segn el mtodo de Bradford.

Tabla 28: Actividad estersica esnecifica de la lipasa de RA.nnehei cruda y semipunficada

por precipitacin con distinto grado de saturacin de sulfato amnico (con y sin posterior
dilisis).

precipitado
dializado
(mmol/min mgprot)

32128

5,3

6810

1,1

60%

676

1,1

112

0,2

70 %

7214

1,2

92

0,1

80 %

402

0,6

161

0,2

saturaci6n con
sulfato am6nico
(%)

precipitado NO
dializado
(mmol/min mgprot)

50 %

LOTh 5

(a) se aplic

605(*)

.1 factor de corteoc~, (frS.5O.9)par. expresar la catdad de protena nga .1 mtodo de Bradford.

194

0.16

Resultados y Discusin
A la vista de estos resultados, se puede concluir que la precipitacin de las protenas
con un 50% de saturacin de sulfato amnico supone un importantsimo incremento de la
actividad estersica can respecto a la lipasa cruda. Por el contrario, la precipitacin con mayor
cantidad de sulfato (60 y 70 % de saturacin) supone una minima modificacin de la
actividad, respecto de la lipasa cruda y una disminucin de esta actividad estersica cuando
la saturacin es del 80% (Figura 45 y 46a)
Como resultado de la dilisis posterior (Figura 46b) se produce una fuerte prdida de
la actividad estersica de la ennma. Este hecho confirma los resultados negativos, en cuanto
a la actividad estersica del proceso de dilisis, comentado anteriormente (ver JV.2.2.b.; Tabla
25).

Determinacin de las constantes cinticas de la actividad estersica

A contnuacin, se determinaron las constantes cinticas de la reaccin de hidrlisis
del acetato de p-nitrofenilo catalizada por la lipasa de Rh.miehez cruda y sernipurificada con
un 50% de saturacin de sulfato amnico. Se eligi esta enzima semipurificada porque fue
la que present mayor actividad estersica.

En la Figura 47 se representan las curvas de Michaelis-Menten de la actividad

estersica de la lipasa cruda de Rb.mie/ze y semipurificada con un 50 % de saturacin con

sulfato amnico. En la Figura 48 se muestra la representacin lineal de Eadie-Hofstee de la
ecuacin de Michaelis-Menten.

195

Semipur4flcacin de la lipasa de Rhaniehei

i.

m..dM (mfl*SqI

loo

So

so

2
4
.ceanfldde

io

12

a ea a pesOs

14
<sip

II

Figura 47: Curvas de Michaelis-Mente de actividad estersica de la lipasa Rh.miehei cruda

y semipurificada por precipitacin con sulfato amnico al 50% de saturacin.

99.2

14.4 -

>

49.6

24.8 -

0.0
5.2

10.9

16.6

22.3

28.0

V/[js]
Figura 48: Representacin de Badie-Hofatee de actividad esterdaica de la lipasa Rhaniehe
cruda y semipunficada por precipitacin con sulfato amnico al 50% de saturacin.

196

Resultados y Discusin
En la Tabla 29 aparecen los resultados obtenidos, comparados con los valores de la
lipasa antes de la semipurificacin.

Tabla 29: Constantes cinticas de actividad estersica de la lipasa cruda y seinipurificada

por precipitacin con un 50% de sulfato amonhco.
ENZIMA
KM
[Nf]

(mmol/min mgprot)

cruda

(7l)l0~

102l7(*)

SP

(71)10-a

827

(*) se aplic el factor de correccin (frS,50,9)para expresar la cantidad de protena segn el mtodo
de Bradford.
Analizando las constantes cinticas se observa que la lipasa de Riianehei, tras el
proceso de semipunfcacin por precipitacin con un 50% de saturacin de sulfato amnico
conserva su comportamiento cintico de actividad estersica, puesto que el valor de las
constantes cinticas (k~~ y KM) es similar para la lipasa cruda y para la lipasa semipurificada,
dentro del error experimental. Por el contrario, se produce mx aumento mx incremento notable
de la actividad estersica especfica (Tabla 28), expresada por cantidad de protena, debido
a la eliminacin de impurezas contaminantes.

IV.2.3.d.- Determinacin de la actividad linsica

IV.2.3.d.1.- Hidrlisis de aceite de oliva
Para comparar la actividad lipsica de las lipasas de Rh.mehe semipurificadas, con
distinto grado de saturacin de sulfato amnico, se emple como reaccin test la hidrlisis
de aceite de oliva siguiendo el mtodo A (ver I1L3.3.a.J.).
En la Figura 49 se representan las rectas de variacin de la velocidad lipsica, en la
reaccin de hidrlisis de aceite de diva, de la lipasa cruda (lote 5) y de la lipasa
semipurificada por precipitacin con distintos grados de saturacion con sulfato amnico. En
las Figuras 50a y SOb se representan tambin la actividad lipsica de la lipasa semipurificada
por precipitacin sin y con postenor dilisis.

197

Semipurificacin de a lipasa de Rhaniehei

b~.eIada

ma.d

<nus~d.~D

0.0630

0.06

0,10

ng a ~s

0.15
<a~

020

49: Comparacin de la actividad lipasica especfica de la lipasa Rh.miehe, cruda y

semipurificada por precipitacin con distintos grados de sauracin de sulfato amnico.
Reaccin test: bidr6liais de aceite de oliva (mtodo A)

Figura

vddad a andn

~e.eae a ,...s. (nuuson

(%WWSISqI

C.ooa

C.C

0.04
0.06
0.06
0.10
.wmnflddn de rSIe
(MflS)

0.12

0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
.awwtudn de putme pe4

Figura 56: Actividad lipsca especfica de a lipasa semipunficada por precipitacin con
distinto grado de saturacin de sulfato amnico. A) sin posterior dilisis, E) con postenor
dilisis. Reaccin test: hdr6liss de aceite de oliva (mtodo A)
198

0.12

Resultados y Discusin
En la Tabla 30 se recogen los valores de las actividades lipsicas especficas de los
precipitados proticos obtenidos, tanto dializados como sin dializar, en la reaccin de
hidrlisis de aceite de oliva.
Tabla 30: Actividad lipsica especfica de la lipasa de Rh.mehei semipurificada por
precipitacin con sulfato amnico (con y sin posterior dilisis). Hidrlisis de aceite de ojiva
(mtodo A)
saturacin con
sulfato amnico
(%)

precipitado NO
dializado (mmol/min
mg)

precipitado dializado
(mmol/min mg)
F

50 %

(7,Ot0,2>l0-~

3,2

(2,00,4)l0-~

0,9

60 %

(2,80,2)10~

1,3

(0,60,1)l0~

0,3

70 %

(3,00,2)1&

1,4

(0,4tO,2)lO-~

0,2

80 %

(2,lO,2>l0-~

1,0

(0,30,1)l&

0,1

LOTE 5
(2,20,3)l0-3(*)
F factor de punficacin
(*) se aplic el factor de correccin (f=8,50,9)para expresar la cantidad de protena segn el mtodo
de Bradford.
De estos resultados se puede deducir que la purificacin por precipitacin con sulfato
amnico al 50% de saturacin d lugar a una protena con mayor actividad lipsica especfica
que la lipasa cruda comercial (Lpozymet lOOOOL) (Tabla 19). No obstante, el proceso de
dilisis reduce la actividad lipsica (hidrlisis de aceite de oliva), tal como se observ en la
seccin anteriormente (ver IV.2.c; Tabla .26). As pues, se puede concluir que la
purificacin de la lipasa de Rh.miehei por dilisis reduce la actividad lipsica debido
probablemente a la eliminacin de molculas de polisacridos unidos a la protena no
covalentemaxte, y que favorecen la unin de la lipasa (glicoproteina) a la interfase oleoacuosa, proceso indispensable para el desarrollo de la actividad lipsica de las lipasas.

IV.2.3.d.2.- Hidrlisis de tributirina

Al intentar determinar las constantes cinticas de la reaccin de hidrlisis de aceite de
oliva catalizada por la lipasa de Rh.mwhe semipurificada por precipitacin con sulfato
amnico al 50% de saturacin, surgieron grandes problemas debido a la poca sensibilidad del

199

Semipur~ftcacin de la lipasa de Rh. ,niehei

mtodo para medir la variacin de la actividad al variar ligeramente la concentracin de
sustrato. Por esta razn se utiliz el mtodo de hidrlisis de tributimna (ver HL 3.3.sfr.) que
presenta ~ma mayor sensibilidad y es el mtodo recomendado por el laboratorio NovoNordislO62, productor de los lipasas comerciales Lipozyme 1M20 y 1 OOOOL para estudiar la
actividad lipsica de esta enzima,

Determinacin de la actividad bsica

Una vez comprobado que el procedimiento experimental de semipurificacin con el
que se obtienen mejores resultadas de actividad lipsica fue saturando la enzima con un 50%
de sulfato amnico se repiti la senpurificacin bajo esas condiciones, pero a mayar escala
y se determino su actividad lipsica especfica por la reaccin de hidrlisis de tributirina. Los
resultados de estos ensayos, para la lipasa cruda de Rh.miehei (lote 5) y senpurifcada (SP),
aparecen en la Figura 51. representando las rectas de velocidad de reaccin (hidrlisis de
tributirna) frente a concentracin de protenas, determinada por el mtodo de Bradford.
~vdcad
0.010

0.000

O r~ds

(nwuS*tg

0.004

0.006

.ewSuutdn* peCis.

0.012

fiS

coja

Figura 51: Rectas de actividad lipsica de la lipasa cruda de Rh.mtehe y semipurificada por
precipitacin con un 50% de saturacin con sulfato amnico. Reaccin test: hidrlisis de
tributirina.

200

Resultados y Discusin
El valor de las pendientes de dichas rectas, que determinan la actividad lipsica
especfica de la lipasa cruda y semipurificada aparecen en la Tabla 31.

Tabla 31: Actividad lipsica especfica de la lipasa de Rkmiehei cruda y seniipurificada por

precipitacin con un 50 % de saturacin de sulfato amnico. Reaccin test: hidrlisis dc

tributirina.

(mmol/min mg)

0,750,04(*)

1,0
2,6

7 (factor de puficacn)
se aplic el factor de correccin (f=8,50,9)para expresar la cantidad de protena segn el mtodo
de Bradford.
Tras la semipurificacin por precipitacin, con mx 50% de saturacin de sulfato
amnico, se produce un importante aumento en la actividad de la lipasa de Rh.miehe en la
reaccin de hidrlisis de tributirina. El factor de semipurificacin (F) expresado en funcin
de la actividad lipsica es semejante en las dos reacciones test utilizadas: hidrlisis de aceite
de oliva (F= 3,2)(ver Tabla 30) y de tributirina (F==2,6)(ver Tabla 31)

Determinacin de las constantes cinticas de actividad lwsica

Una vez determinada la actividad lipsica especfica de la lipasa de Rh.miehe cruda
y semipurificada (SP) se llev a cabo la determinacin de las constantes cinticas de la

reaccin de hidrlisis de tributirma catalizada por dichas enzimas.

En la Figura 52 se representan las curvas de Michaelis-Menten para ambas lipasas y
en la Figura 53 aparece la representacin de Eadie-Hofstee, con la cual se representa
linealinente la ecuacin de Michaelis-Menten.

201

Semipunficacin de la lipasa de Rh.nuiehei

vdodd de nad, (nwnStn*U
00100

0.0060

0.0060

0.0040

0.0000
0.00

0.05.

0.10

.eufluSdn

015

ca

CZ

0.30

Ss fhddn. MI

Figura 52: Comparacin de las cunas de actividad lipsica do la lipasa cruda y

semipunflcada por precipitacin con sulfato amnico al 50% de saturacin, ajustadas a la
ecuacin de Michaulis-Menten, Reaccin test: hidrliuis de tributiriua.
0.0103

0.0077

>0,0051

0.0026

0.0000~

0.018

0.062

0.105

0.148

0.19 1

v/[s]
Figura 53: Representacin do Sadie-Hofatee de actividad lipsica do la lipasa Rh.miehei cmda
y semipurificada por precipitacin con sulfato amnico al 50%. Reaccin test: hidrlisis
de tributirina.
202

Resultados y Discusin
Los valores de las constantes cmticas de actividad lipsica de la lipasa de Rh.mehe
cruda y semipuririfcada por precipitacin con un 50% de saturacin de sulfato amnico (SP)
aparecen en la Tabla 32.

Tabla 32: Constantes cinticas de la lipasa cruda y semipurificada por precipitacin. Reaccin
test: hidrlisis de tributina.
ENZIMA

KM
[Nf]

cruda

0,060,01

(mmol/min mg)
l,I00,08(*)

SP
0,060,01
3,80,3
(9 se aplic el factor de correccin (f=850,9)pafa expresarla cantida~i de proteitia segn el metodo
de Bradford.
Como ocurra con la actividad estersica (ver 1V2.3.a., Tabla 29), el valor de la
constante de Michaelis

(KM)

es igual para ambas enzimas debido a que la concentracin de

sustrato en la interfase es similar en ambos casos. Por el contrario, el nmero de recambio

(ko) es superior para la enzima semipurificada debido al aumento de la actividad lipsica
como consecuencia de la eliminacin de contaminantes.

l?V.2.3.d.- Estudio de la estabilidad trmica de la lipasa de Rh.miehei cruda

seminurificada

Una vez analizada la variacin de la actividad lipsica y estersica de la lipasa de

Rh.miehei cruda y semipurificada se estudi la termoestabilidad de dichas enzimas. Dicho
estudio se aplic unicamente a la lipasa senuipurificada por precipitacin con un 50% de
sulfato amnico porque fue la enzima semipurificada ms activa y sobre la que se han
centrado los estudios posteriores.
Como se indic en la parte experimental (ver HL5.3.), las enzimas se mantuvieron a
diferentes temperaturas (37 y 50 0C) en mx medio similar al de la reaccin de hidrlisis de
tnbutirina, reaccin test de anlisis de la termoestabilidad de la lipasa de Rh.nnehez cruda e
mmovhzada.
Las curvas de desactivacin enzimtica obtenidas se ajustaron a una ecuacin de
decrecimiento exponencial simple (ecuacin 29), para lo cual se utiliz el programa EXFIT

203

Sentipur4flcacin de la lipasa de Rh.miehei

del paquete integrado SIMFIT versin 4

Acti{idad residual

254

A e~ + c

[29)

Para explicar los resultados obtenidos se utiliz el modelo de Henley y Sadana274,

representado en el Esquema 25:

~*

Ei
(12

Esquema 25: Esquema do desactivacin enzimtica.

donde lc~ y k

2 son las constantes cinticas de desactivacin; E, E1 y E2 son las actividades

especficas de la enzima y de los intermedios formados durante el proceso de desactivacin

y a1 y

son las relaciones entre las actividades especificas de la enzima y cada uno de los

intermedios de desactivacin,

1=

E1/E y a2= EjE

Estos autores consideran que la constante del ajuste (A), a un tiempo determinado es
el promedio de las actividades especficas de cada estado (ecuacin 30), siendo E0 la actividad
mical a t0

a1E1 ~-2 E2
[30)

E0
Esta constante puede expresarse en funcin de los parmetros iniciales como se indica
en la ecuacin 31, en la que se consideran decrecimientos exponenciales simples para
describir

204

Resultados y Discusin
En las Figuras 54 A y B se representan la evolucin de la actividad residual de ambas
enzimas a 370C (Figuras A) y 500C (Figura 8).
ESTASUDAD A 0 C
ESTABILIDAD A 37

Acatad mudad <3<)

A.vf dad ,ndud <3<)

120

-4-

10

30
40
60
Ssupo <ha

60

70

10

20

30

40

10

Figura 54: Curvas de desactivacin de la lipasa de Rh.mehe cruda y senxipurificada por

precipitacin con un 50% de saturacin de sulfato amnico. A) a 37 0C y B) a 50 0C.
A partir de los ajustes obtenidos se calcularon los valores de los parmetros de dicha
ecuacin: constante del ajuste (A), relacin de actividades (a

1), constante cintica de

desactivacin (k1) y actividad remanente (c

205

que aparecen en la Tabla 33.

Semipur4flcacin de la lipasa de Rh.miehei

Tabla 33: Parmetros de desactivacin enzimtica a 37 y so 0C de la lipasa de Rh.mehe
cruda y semipurificada por precipitacin con un 50% de sulfato amnico.
ENZIMA
-T
A
a
1
k
0C)
(%)
(%)
(Ir)
(%)
(
cruda
37
575
433
0,270,05
292
SP

37

924

7,70,3

0,0470,006

cruda

50

887

120,9

0,380,03

6,60,4

50

963

40,01

0,170,01

A la vista de estos resultados se observa que aunque el proceso de desactivacin

enzuntica es ms lento para la lipasa semipurificada (SP>, ya que su constante de
desactivacin (k) es menor a ambas temperaturas, esta enzima (SP) es menos termoestable
debido a la prdida total de su actividad con el tiempo, puesto que su actividad remanente
final (c) es cero, mientras que la lipasa cruda amxque se desactiva ms rapidamente al
principio mantienen cierta actividad.
Desde el punto industrial, aunque la lipasa semipuriificada es ms activa y el mtodo
de obtencin es muy sencillo y de bajo coste, presenta el gran invonveniente de su baja
estabilidad a lo largo del tiempo, por lo que se someti a un proceso de inmovilizacin con
el objeto de incrementar su estabilidad y permitir su utilizacin a gran escala.

IV.2.4.- CONCLUSIONES OBTENIDAS TRAS LA SEMIPURIFICACCION DE

LA LIPASA DE RJtmiehei
Tras semipurificar la lipasa de PJuniehei por tres mtodos distmtos dos de ellos
basados en la separacin de proteinas en funcin de su tamailo molecular y otro en funcin
de su solubilidad, se puede concluir que la metodologa ms adecuada es la precipitacin de
protenas por saturacin can sulfato amnico. Este mtodo es experimentalmente ms sencillo
que las sucesivas ultrafiltraciones y los resultados obtenidos son ms satisfactorios que los
obtenidos tras el proceso de dilisis y sucesivas centrifugaciones, ya que tras la dilisis se
produce una importante prdida de la actividad lipsica, aunque no vara la actividad
esterrica.

206

Resultados y Discusin
La lipasa de Rh.m,ehei se semipurific utilizando distintas cantidades de sulfato
amnico (expresadas en porcentaje de saturacin), obteniendo los mejores resultados con un
50% de ~saturacin.El contenido protico del precipitado en estas condiciones fue menor que
el de los precipitados obtenidos con mayor saturacin de la sal, debido a que el grado de
purificacin alcanzado fue mayor, como se comprob tras el anlisis de los precipitados por
electroforesis, ya que el precipitado obtenido con un 50% de saturacin presentaba una banda
en la zona de 30 kD, correspondiente al peso molecular de la lipasa de Rh.mehe (3OkD),
teniendo en cuenta el posible error experimental. De esta forma, se confirma la total
purificacin de la lipasa cruda comercial de Rh.mehe (Lipozymet lOOOOL) por un mtodo
experimental muy sencillo (precipitacin con un 50% de saturacin de sulfato amnico).
Adems, se comprob que la lipasa purificada presentaba mayor actividad lipsica y estersica
que la lipasa cruda.

Todos estos precipitados fueron posteriormente dializados, pero los resultados de

actividad enzimtica, lipsica y estersica fueron muy pobres, por lo que se decidi considerar
el proceso de semipurificacin sin posterior dilisis. En conclusin, el mtodo ptimo para
semipurificar la lipasa de R.h.miehet, entre los analizados en la presente Tesis Doctoral, ha
sido la semipurificacin por precipitacin con un 50 % de saturacin de sulfato amnico.

Esta metodologa se escal con gran reproducibilidad y se analiz en profundidad el

comportamiento de la lipasa semipurificada obtenida. Para cuantificar el grado de
semipwfficacin se utiliz el factor de semipurificacin (F), que relaciona la actividad de la
enzima semipurificada con la actividad de la enzima cruda. Este factor es algo mayor para
la actividad estersica (F=5,3) que para la actividad lipsca lipsica (hidrlisis de aceite de
oliva F=3,2 e hidrlisis de tributirina F=2,6) y en todos los casos el factor de semipurificacin
es superior a la unidad, lo que indica que se ha producido un aumento considerable de la
actividad enzimtica.

El estudio de las constantes cinticas de la actividad estersica (hidrlisis de acetato

de p-nitrofenilo) muestra un comportamiento semejante para la enzima cruda y la

207

Semipur4ficacin de Ii lipasa de RA.miehei

semipurificada. Respecto a la actividad lipsica, se ha producido mi aumento del nmero de
recambio (k~~) tras el proceso de semipurificacin, debido probablemente a la eliminacin de
contaminantes interfaciales.

Por ltimo, se analiz la estabilidad de la lipasa semipurificada por precipitacin con

un 50% de sulfato amnico a 37 y 500C y se observ la prdida total de su actividad lipsica
a ambas temperaturas, mientras que la lipasa cruda mmtiene tna actividadremnmente. Desde el punto
de vista industrial es un inconveniente de gran importancia.

As pues, en conjunto, sepuede considerarque el nuevo biocatalizador obtenido presenta

mejores caractersticas en las reacciones de hidrlisis de los sustratos estndar que la lipasa
cruda, aunque su termoestabilidad es menor.

208

Resultados y Discusin

117.3.- INMOVILIZACION DE LA LIPASA DE

Ahizomucor miehel

La lipasa de R.h.mtehe se inmoviliz por unin covalente a un soporte de slice (ver

114.6. y 1115.), previamente activado por el mtodo de la 2,4,6-tricloro-l,3,5-triazina (TCT>,
como muestra el esquema siguiente:

Cl
2

OH

14

N
>CJ

O
Activacin
delasflice

CI

Slice

)CI

INMOvILIZACION

Enz-NH2

a,

2,4,6-tricloro-1 ,3,5-Iriazina
Esquema 25: inmovilizacin de la lipasa de Rh.miehet por enlace covalente con slice,
previamente activada va TCT
En la presente Tesis Doctoral se sigui este mtodo de inmovilizacin de la lipasa de
Rh.mehe por enlace covalente, con el objeto de comparar sus caractersticas y actividad con
el derivado comercial (LipozymJ 1M20) de lipasa de Rh.mniehei inmovilizada por adsorcin
sobre una resina de intercambio aninico (Duolite-A568).

Como ya se indic en la Introduccin (ver II.4.6) la inmovilizacin de enzimas por

unin covalente se basa en la activacin previa de determinados grupos qumicos del soporte,
que posteriormente reaccionarn con grupos nuclefilos de la protena. Los grupos funciona]es
de las protenas implicados con mayor frecuencia en este proceso de inmovilizacin son los
grupos E-amino de los residuos de lisina, situados hacia el exterior de la superficie protica.
Utilizando la informacin estructural de la lipasa de Rh.mrehe depositada por Brady
y cclx. ~ en el Banco de Datos de Proteinas se analiz la disposicin de los residuos de usina
en la estructura de esta enzima, como se indic en la Introduccin al estudiar la estructura de
la lipasa de Rh.miehe (ver II.3.3.h; Figura 23).

En la Tabla 34 se indica la posicin de estos residuos de lisina en la estructura

primaria de la lipasa de Rh.mehei y el grado de accesibilidad de cada uno de ellos al
disolvente, de acuerdo con la informacin recogida en la Tabla 4. (ver lL3.3.l~)
209

Innwvilir.acin de La Lipasa de RA.miehei

Tabla 34: Posicin y accesibilidad de los residuos de usina de la lipasa de Rh.miehe.

posici6m en estructura V

grado de accesibilidad (A)

50

112

53

83

73

10

106

90

109

78

131

144

137

Todos los residuos de lisna de la lipasa de Riunehe: se colocan en la zona externa

de la proteina debio a su caracter polar, excepto la usina 137 que est completamente
enterrada, lo que permite la unin covalente de esta enzima a la slice previamente activada.
Asimismo, se comprueba que ningn residuo de lisma se coloca en la tapadera y en zonas
adyacentes al centro activo, por lo que no se impedir la normal actividad de la lipasa de
Rh.,niehe tras el proceso de inmovilizacin por enlace covalente.

Una vez comprobado que la lipasa de Rhan:ehe, no presentaba ningn inconveniente

estructural para ser inmovilizada por enlace covalente con slice se llev cabo este
procedimiento y se inmoviliz la lipasa cruda y semipurificada por precipitacin con un 50%
de saturacin con sulfato amnico (SP). A continuacin, se analiz la actividad lipsica de
los derivados obtenidos, como catalizadores de la reaccin de hidrlisis de tributirina y se
estudi su termoestabilidad respecto a la enzima de partida. Asimismo, se compar la
.

actividad lipsica de estos derivados inmovilizados por unin covalente y el derivado

comercial (Lipozymet 1M20) inmovilizado por adsorcin.
La nomenclatura utilizada para designar los derivados inmovilizados fue la siguiente:
lipasa cruda (Lipozymet IOOOOL)

Cruda

>

SP

lipasa semipurificada por precipitacin con un 50% de saturacin de

-+

sulfato amnico

210

Resu/lados y Discusin

1MW

lipasa inmovilizada por adsorcin (Lipozyme 1M20)

SIL-C

SP

lipasa seniipurificada por precipitacin con un 50% de saturacin de

lipasa cruda inmovilizada por enlace covalente

sulfato amnico
SR-SP

lipasa semipurificada e inmovilizada por enlace covalente

IV.3.l.- SEGUIMffNTO DEL PROCESO DE INMOVILIZACION

Durante el proceso de inmovilizacin se hizo un seguimiento de la concentracin de
protenas en el sobrenadante, utilizando el mtodo del biuret y la actividad lipsica especifica
de dichas protenas en la reaccin de hidrlisis de tnbutirma (ver 1L3.3.b.) con el fin de
determinar el tiempo ptimo de mmovihzacn En la Figura 55 se representan los resultados
obtenidos durante el proceso de mmovilizacn
..sa a ru.

(miS

a,fadMpftk.

300

husa s
0.10

275
0.08
sc

0.06
30
0.04

176

150

0.02
125
100

10

20

20

50

0.00

Figura 55: Evolucin del proceso de inmovilizacin de la lipasa de Rh.miehe por enlace

covalente con slice activada.

Durante la inmovilizacin la concentracin de protenas en el sobrenadante fue
disminuyendo. A partir de las 30 horas la concentracin de proteina libres se estabiliz

211

fnmovliracin dc la Lipasa de Rh.miehei

debido a la saturacin del soporte, por lo que el proceso de inmovilizacin se detuvo a las 48
horas, tiempo tras el cual se consider que ya se haban formaso las uniones multipuntuales
enzima-soporte.

La actividad especfica de las protenas no inmovilizadas se matuvo constante durante

el proceso, lo cual indica que las protenas que se van uniendo al soporte mantienen toda su
actividad y no han sido desnaturalizadas durante el proceso de inmovilizacin.
En la Tabla 35 se recogen los resultados del proceso de inmovilizacin,

Tabla 35: Inmovilizacin de la lipasa de Rkmiehei por enlace covalente con slice,
previamente activada con 2,4,6-tricloro-1,3,5-triazina (TCT).
imnovilizaci,
(V.)

(mg)

carga enzinatiea
(mg prot/
mg soporte)

actividad
retenida<
(%)

237

0,045

96

3,6

11

526

0,028

59

soporte
(g)

protena
inicial

(#)i~idad retem~a especfica, referida a la actividad de la lipasa cruda en la reaccin de hidr6lisis

de tributfrma.
Al realizar el proceso de inmovilizacin a mayor escala no se obtuvieron los mismos
resultados. El grado de inmovilizacin, que est determinado por el valor del porcentaje de
inmovilizacin y por la carga enzimtica del derivado, fue mayor en el proceso a menor
escala, debido a que el volumen de la reaccin es menor, lo cual favorece la agregacin
enzinxtica y la unin de mayor cantidad de protenas al soporte. Por el contraro, la actividad
retenida del derivado obtenido a pequ~a escala es menor, aunque su carga enzimtica sea
mayor, debido a que la mayor acumulacin de protenas sobre el soporte y su agregacin
dificulta la accesibilidad del sustrato a los centros activos de la enzima, con lo cual aunque
un derivado presente mayor carga enzimtica su actividad retenida puede ser menor.
La actividad retenida de los derivados inmovilizados sobre slice es muy baja si se
compara con los resultados obtenidos al inmovilizar la lipasa de C.cylndracea comercial
segn esta metodologa

56%)u6,

ya que ambos derivados presentan cargas enzimticas

semejantes (0,047 mg de lipasa de C.cyhndracea/mg de soporte). Estos resultados de actividad

retenida tan dispares pueden ser debidos a las diferencias estructurales de ambs lipasas

212

Resultados y Discusin

Tabla 36: Propiedades estructurales de las lipasas de

Rh.mzehe y

de

C.cylndracea.

propiedades estructurales

lipasa de RA.n,iehei

lipasa de C.cylindracea

peso molecular (kD)

30

62

pto.isoelctrico

5,0-5,8

Lisinas

17

IV.3.2.- COMPARACION DE LOS DERIVADOS INMOVILIZADOS DE LA

LIPASA DE Rkmiehe
A continuacin se hizo un estudio comparativo de la lipasa de Rh.m;ehe inmovilizada
por unin covalente a un soporte de slice (SIL-C) y el derivado comercial de dicha lipasa
inmovilizada por adsorcin sobre ima resma de intercambio aninico (Lipozyme 1M20). Lo
que permiti comparar la efectividad de diferentes mtodos de inmovilizacin.
La reaccin test utilizada para determinar la actividad lipsca de los derivados
inmovilizados fue la hidrlisis de tnbutinna (ver 11L3.3.b.)
En la Figura 56 se representan las rectas de actividad lipsica de ambos derivados.

vS@SdeW se tu..ddn <giuuSt,Sn)

0.030

0.020

0.015

0.010

0.006

0.

2.0

osad

3.0

4.0

6.0

7.0

de pvuWnae (~S

Figura 56: Actividad lipsica de la lipasa de Rhsniehe inmovilizada por enlace covalente
sobre slice y por adsorcin sobre una resma de intercambio aninico.
213

&

Inmovilizacin de La lipasa de Rh.miehei

En la Tabla 37 se recogen los valores de las correspondientes pendientes que equivalen

a la actividad lipsica especfica de cada derivado y que se han representado en la figura
anterior.

Tabla 37: Actividad lipsica especfica de los derivados inmovilizados de la lipasa de

Rh.miehei por enlace covalente y por adsorcin.Reaccin test: hidrlisis de trihutirima
ENZIMA
actividad lipsica especfica
(mmol/min mgprot)
Sil-C

(4,80,3)1 0~

1M20

(3,80,4)o~

La actividad lipsica especfica del derivado inmovilizado sobre slice unido por enlace
covalente fue superior a la actividad del derivado comercial Lipozyme 1M20, inmovilizado
por adsorcin a pesar de su menor carga sazimatica (carga enzimtica de 1M20
y de Sil-C

0,12 mg/mg

0,028 mg/mg). Este hecho confirma que el derivado obtenido por unin

covalaxte es ms estable en medio acuoso que el obtenido por adsorcin, ya que el primero
no pierde carga enziintica por estar unida covalentemente y el segundo si (ver IV.1.J.b.;
Tabla 16).

Determinacin de las constantes cinticas de actividad trisica

A continuacin se determinaron las constantes cinticas de ambos derivados en la
misma reaccin de hidrlisis de tributirina, con el fin de analizar la afinidad por el sustrato
de estos derivados inmovilizados.
En La Figura 57 se representan las correspondientes curvas de Michaelis-Menten y en
la Figura 58 la representacin lineal de Eadie-Hofstee.

214

Resultados y Discusin

veoded de m.e&, (mmd4,A~I

0.035

0.00

0.10

0.20
~nt~,

0.30

0.40

de fhsttne

fl

0.50

Figura 57: Curvas de Michaelis-Menten de actividad lipsica de la lipasa de Rhniehei

inmovilizada por enlace covalente sobre slice y por adsorcin sobre una resma de intercambio
aninico. Reaccin test: hidrlisis de trihutirina.

0.0309
<A
0.0232

>0.0154

<4

0.0071

0.0000

0.013

0.083

a.154
v/[sJ

0.224

0.294

Figura 58: Representacin de Eadie-Hofstee de actividad lipsica de la lipasa de Rh.miehei

inmovilizada por enlace covalente sobre slice y por adsorcin sobre una resma de intercambio
aninico. Reaccin test: hidrlisis de tributirina.
215

Inmovilizacin de La lipasa de Rh.n,iehei

En la Tabla 38 aparecen los valores de las constantes cinticas de la reaccin de

hidrlisis de tributirina catalizada por la lipasa de Rh.miehe inmovilizada por adsorcin
(1M20)

y por enlac covalente (SIL-C)

Tabla 38: Constantes cinticas de actividad lpsica de los derivados inmovilizados por enlace
covalente y por adsorcin. Reaccin test: hidrlisis de tributirina.
ENZIMA

kM
[M]

(mmol/min

mgprot)

Sil-C

(952)l0~~

(8,9l)I0~

11420

(il530)i0~~

{141)I(V

Los resultados de la Tabla 38 puede deducirse que la inmovilizacin covalente va

2,4,6-tricloro-l,3,5,-triazina, llevada a cabo sobre slice no es distorsionante pues el derivado
obtenido presenta unos valores de kM y k~~1 semejantes a las del derivado adsorbido
(Lipozyme 1M20. Por ltimo, s se comparan estas constantes cinticas con las
correspondientes a la lipasa cruda de Rhniehei (Tabla 23) se observa que la kM es semejante
para ambas enzimas y que el valor de k,8~ es superior para la lipasa cruda, ya que aunque la
afinidad de la lipasa de Rkmiehei por la tributirina no vara tras el proceso de inmovilizacion.
la velocidad de reaccin si vara.
As pues, el derivado inmovilizado sobre slice (SIL-C) puede considerarse mejor
biocatalizador que el derivado comercial 1M20 en la reaccin de hidrlisis de tributirina,
puesto que se obtienen resultados semejantes en cuanto a actividad lipsca aunque las cargas
enzimticas son muy diferentes (1M20 (0,12 mg/mg) y SIL-C (0,028 mg/mg), sin que se altere
la especificidad de la enzima.

IV.3.3.- ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD TERMICA DE LA LIPASA DE

Rh.miehei INMOVILIZADA SOBRE SIILICE
Para analizar la estabilidad de la lipasa de Rh.rniehei inmovilizadapor unin covalente
a un soporte de slice se almacen dicho derivado a diferentes temperaturas (37 y 50 oc) en
un medio de caractersticas semejantes al medio de la reaccin test de actividad lipsica. La
reaccin test utilizada para determinar la actividad lipsica remanente del derivado

216

Resultados y Discusin

mmovilizado fue la hidrlisis de tributirina, catalizada por el derivado SIL-C tras un

determinado tiempo de almacenamiento en las condiciones indicadas.

La desactivacin del derivado inmovilizado se analiz a dos temperaturas diferentes:

37 0C temperatura de la reaccin test y a una temperatura exterma (50 0C).
Las curvas de desactivacin enzimtica de la lipasa cruda e inmovilizada (SIL-C) se
ajustaron a una ecuacin de decrecimiento exponencial simple, como la utilizada en el estudio
de la estabilidad trmica de la lipasa de Rh.niiehei cruda y semipurificada (ver IV.2.3.d.;
ecuacin 29), mediante el programa EXFIT del paquete integrado SIMFIT versin 4.0

Actividad residual

A ekt

254.

[29]

En las Figuras 59 A y E se comparan las curvas de desactivacin de la lipasa de

Rh.miehei cruda e inmovilizada por enlace covalente con slice (SIl-C) a 37 oc y

so

oc,

respectivamente.
ESTABILIDAD A 37 c

ESTABILIDAD A 50 C

Acii vfdad rosidued (3()

__

-U--?

A.tiVidsd rnidu
120

(30

-l

elz olida
SIL-C

80

60

40
A
20V-

10

20

-C~J~ffiffi
30

O
40

50

S.mpo piorno)

10

20

30

Oempo picrao)

40

Figura 59: Curvas de desactivacin de la lipasa de Rhniehei cruda e inmovilizada por unin
covatente con slice (SIL-C). A> a 37 oc y B) a 50 0C.
217

60

Inmovilizacin de la lipasa de Rh.miehei

Estas curvas de desactivacin indican que en todos los casos (a 37 y 50 0C) se alcanza
una actividad residual constante (c) y como se indic en el estudio de estabilidad de la lipasa
de Rh.miehei semipurificada (SP) (ver 11K2.3.d.) los datos experimentales de la desactivacin
enzimtica para las diferentes temperaturas analizadas se ajustaron a una ecuacin de
decrecimiento exponencial simple, siguiendo los modelos 3 y 8 descritos por Henley y
Sadana215.

E ~-* Ei

E2

a
1=

E1 lE

Esquema 26: Modelo de desactivacin de la lipasa de Rh.miehei cruda e inmovilizada sobre slice.
266 imovilizada sobre slice, la cual se
Esto no ocurre con la lipasa de C.cylindracea
desactiva siguiendo un modelo lineal, hasta perder toda su actividad.

A partir de los ajustes obtenidos se calcularon los valores de los parmetros de dicha
ecuacin: constante del ajuste (A), relacin de actividades (a

1), constante cintica de

desactivacin (k1) y actividad remanente (c

a), que aparecen en la Tabla 39.

Tabla 39: Parmetros de desactivacin enzimtica a 25, 37 y 50

cruda e inmovilizada sobre slice.

ENZIMA

0C)

(%)

1
(%)

0C

de la lipasa de Rh.miehei

k
(h~)

a2
(%)

(
cruda

50

887

120,9

0,3 80,03

6,6+04

SiI-C

50

576

434

0,080,02

244

cruda

37

575

433

0,270,05

292

Sil-C

37

427

589

1,50,6

562

La diferencia entre ambas enzimas reside en el hecho de que los estados intermedios
de desactivacin (E

1 y E) de la enzima inmovilizada son ms activos, ya que los parmetros

218

Restelados y Discuston

de actividad relativa (a, y a) son mayores. Evidentemente, cuanto mayor es la temperatura

de almacenamiento, menor es la actividad residual (c

= 2),

ya que est ms prxima a la

temperatura de desnaturalizacin enzimtica.

Los resultados ms destacados, en cuanto al incremento de la estabilidad enzimtica
tras el proceso de inmovilizacin se observan a 50 0C, ya que a esa temperatura las
diferencias entre los valores de las actividades relativas (aa) y las actividades remanentes (a)
son ms acusadas.
Tras analizar todos los parmetros de la ecuacin monoexponencial decreciente a la
cual se ajust el proceso de desactivacin enzimtica de los biocatalizadores estudiados se
comprob que se babia logrado el objetivo fundamental del proceso de inmovilizacin, que
es el aumento de la estabilidad de la enzima, ya que en ambos casos (37 y 50 0C) la actividad
residual remanente fue significativamente superior para el derivado inmovilizado (SIL-C).

Por tanto, se puede concluir que tanto la lipasa cruda de Rh.miehei como la
inmovilizada sobre slice por unin covalente (SIl-C) siguen el mismo modelo de
desactivacin (Esquema 26), de lo que se deduce que el procedimiento de inmovilizacin
seguido no provoca distorsiones en la lipasa de Rh.miehei, tal y como cabra preveer teniendo
en cuenta la ubicacin de los residuos de lisina por los cuales se produce la unin covalente
soporte-enzima, los cuales se sitan alejados del centro activo de la lipasa de Rh.inehe (ver
1L3.3.h.; Figura 23)

LY.3.4.- INMOVILIZACION DE LA LIPASA DE Rh.mehei SEMIPURIFICADA

Como ya se indic en la Seccin IV.2. de la presente Memoria, tras llevar a cabo

diversos mtodos de semipurificacin de la lipasa de Rh.miehet, se determin que el mtodo
de semipurificacin por precipitacin con un 50% de saturacin de sulfato amnico era el ms
adecuado. Aunque la lipasa semipurificada por ese procedimiento result ser ms activa que
la lipasa cruda, su estabilidad fue peor (ver 1V2.3.d.), por lo que se procedi a inmovilizarla,
con el fin de incrementar su estabilidad y poder as utilizarla a nivel industrial.
La lipasa de Rh.miehei se semipurific a mayor escala siguiendo esa metodologa y
posteriormente se mmovliz por enlace covalente con slice, previamente activada va 2,4,6tricloro- 1 ,3,5-triazina (TCT).
219

Inmovilizacin de la lipasa de Rh.miehei

En la Tabla 40 se comparan los resultados obtenidos al inmovilizar la lipasa de

Rh.miehei cruda y semipurificada.
Tabla 40: Inmovilizacin por enlace covalente con slice, de la lipasa de Rh.miehei cruda
(SIIL-C) y semipurificada por precipitacin con un 50% de saturacin de sulfato amnico
(SIL-SP).
ENZIM

soporte
(g)

protinicia
(mg)

carga enz.
(mg prat
/mg soporte)

nmov.
(%)

actividad
retenda~>
(%)

237

0,045

96

3,6

tI

526

0,028

59

Sil-C

Sil-SP
2,2
10
0,0013
28,6
12,5
(+) actividad retenida especifica, referida a la actividad de la lipasa cruda en la reaccin de hidrlisis
de tributirina.
El porcentaje de actividad retenida se determin analizando la actividad lipsica
especifica de las lipasas, cruda y seinipunficada, antes y despus de la inmovilizacin. La
reaccin de referencia fue la hidrlisis de tributirina.
Puede observarse que el rendimiento del proceso de inmovilizacin de la lipasa
semipurificada es menor que el de la lipasa cruda, aunque la actividad lipsica retenida es
mayor, tal y como caba esperar al inmovilizar una enzima ms pura y ms activa.

Actividad trisica especfica

En la Figura 60 se representa la actividad lipsica de los derivados inmovilizados por
enlace covalente con slice en la reaccin de hidrlisis de tributirina.

220

Resultados y Discusin
VWOOWAd do ro.ooIn (mmrl/mm)
0.on

4
0.10

evtad a~

Figura 60: Actividad lipsica de la lipasa de Rh.miehei cruda y semipurificada, inmovilizadas

ambas sobre slice. Reaccin test: hidrlisis de tributirina.
En la Tabla 41 aparecen los valores de actividad lipsica especfica de ambas enzimas
(cruda y semipurificada) inmovilizadas por enlace covalente. Estos valores de actividad
especifica corresponden a la pendiente de las rectas representadas en la Figura 60.
La actividad lipsica especfica indica el valor de actividad lipsica por miligramo de
proteina, determinado por el mtodo de Bradford, por lo que el valor de actividad de la lipasa
cruda (inmovilizada y no inmovilizada) se multiplic por el factor de correcin (8,50,9).
Tabla 41 Actividad lipsica especfica de la lipasa de Rh.miehe cruda y semipurificada e
nmovhzadas sobre slice. Reaccin test: hidrlisis de trihutirina.
ENZIMA
actividad lipsica especfica
(mmol/min mgprot>
cruda

0 75+0,03 (*)

Sil-C

(4,l0,2)l0.2(*)

SP

2,00,1

SiL-SP
0,250,001
(*) se aplic el factor de correccin (f=8,50,9)para expresar la cantidad de protena segn el mtodo
de Bradford.
221

Inmovilizacin de la lipasa de RN.mielsei

Tras el estudio comparativo de la actividad lipsica de los derivados inmovilizados de

la lipasa cruda y semipurificada se confirma que el derivado seniipurificado es ms activo,
como se esperaba, iuesto que la enzima de partida era ms activa y la actividad retenida del
derivado es tambin superior.

Determinacin de las constantes cinticas

A continuacin se determinaron las constantes cinticas de la actividad lipsica de
ambos derivados

en la reaccin de hidrlisis de tributirina con el fm de analizar su

comportamiento cintico y su afinidad por el sustrato tributirina.

En la Figura Ellas curvas de Michaelis-Menten, linealizadas en la Figura 62 mediante
el modelo de Eadie-Hofstee.
voe dad de ,e.coln (mmc/mln)
0.012

0.10

0.2)

0.30

0.50

qonoonfraoln de tflhuDdnaU)

Figura 61: Curvas de Michaelis-Menten de actividad lipsica de la lipasa de Rh.mzehei cruda

y semipurificada, inmovilizadas sobre slice. Reaccin test: hidr6tisis de tributirina

222

Reste fiados

y Discusin

0.0150

0.0105

~- 0.0059

0.0014

.0031
0.012

0.036

0.084

0.180

0.132

v/[s]
Figura 62: Representacin de Eadie-Hofstee de actividad lipsica de la lipasa de R/tmniehei

cruda y semipurificada, inmovilizadas sobre slice. Reaccin test: hidrlisis de tributirina.

En la Tabla 42 se recogen los valores las constantes cinticas de la reaccin de
hidrlisis de tributirina, catalizada por los derivados inmovilizados sobre slice de la lipasa
cruda (SIL-e) y seniipurificada (SIL-SP) de Rh.mxehe

Tabla 42: Constantes cinticas de actividad lipsica de os derivados inmovilizados sobre

slice de la lipasa cruda y semipurificada de Rh.iniehei. Reaccin test: bidrlisis de
tributirina.
ENZIMA

KM
[M]

Sil-C

(952)lO~~

Sil-SP

(21050)l0-~

(mmol/min mgprot)

(758>10.3(*)
0,5+0 1

(*) se aplic el factor de correccin (f=8,50,9)para expresar la cantidad de protena segn el mtodo
de Bradford.
Al comparar los valores de las constantes cinticas

(KM

y k0~1) para ambos derivados,

se observa que las constantes del derivado SIL-SP son mayores y que el aumento ms
importante se produce en la constante cataltica (k~81), la cual incrementa en seie veces su
223

Inmovilizacin de la lipasa de Rh.miehei

valor, mientras que KM experimenta un aumento del doble de su valor. Por otra parte,
comparando estos resultados con los obtenidos con las lipasas no mmovilizadas (Tabla 32)
se observa que el valor de
enzima cruda

0,06M y

el derivado SIL-SP

(KM

KM

KM

no varia tras la inmovilizacin de la lipasa cruda

de SIL-C

de SP

(KM

de la

0,09M), mientras que aumenta notablemente para

0,06M y KM de SIL-SP

0,21M). Esta diferencia en la

evolucin del valor de KM tras la inmovilizacin de estas enzimas puede ser debido a la
eliminacin de los azcares y pequeos pptidos que contaminan la preparacin comercial,
por lo que al inmovilizar la enzima semipurificada la formacin de la interfase necesaria para
el reconocimiento del sustrato se modifica, fenmeno que se traduce en un aumento del valor
de

KM

de SIL-SP.
Asimismo, se puede considerar el hecho de que al inmovilizar la lipasa cruda y debido

a la gran cantidad de molculas de glcidos que acompaan a la protena, es factible que se

origine cierta competencia entre las usinas de la proteina y los grupos hidroxilo de los
azucares por unirse a los puntos activados del soporte (slice activada va TCT), de forma que
la inmovilizacin de la lipasa cruda se podra producir a travs de los azcares, dando lugar
a un derivado (SIL-e) similar al obtenido por adsorcin, pues el centro activo no es
modificado. Sin embargo, en el caso de la enzima semipurificada, al estar desprovista de
azcares, la unin covalente al soporte activado se produce unicamente a travs de sus
residuos de Usina, por lo que se podra alterar ms facilmente el centro activo de la lipasa,
modificacin que se traduce en un aumento del valor de la constante de afinidad (KM) del
derivado SIL-SP respecto de la enzima SP, pero que a su vez tambin provoca un aumento
de k0,~
IV,3.4.a.- Estudio de la estabilidad trmica de la lipasa de Rh.mehe
semipurificada e inmovilizada sobre silice (SIL-SP
Una vez comprobado el incremento de la actividad de la lipasa semipurificada de
RJi.miehei tras el proceso de inmovilizacin, se procedi al estudio de la estabilidad de dicho
0C, tras un periodo de almacenamiento a dichas temperaturas en un medio
derivado a 37 y 50
semejante al de la reaccin de hidrlisis de tnbutinna, reaccin de referencia para el estudio
de la evolucin de la desactivacin enzimtica.

224

Reste/lados y Discusin

En las Figuras 63 A y B se comparan las curvas de desactivacin trmica de la lipasa

de Rhaniehe seniipurificada (SP) y de los derivados inmovilizados por unin covalente sobre
slice dela lipasa cruda (SIL-C) y de la semipurificada (SIL-SP) medidas a 370C y a 50 oc,
respectivamente.

ESTABILIDAD A99

ESTABILIDADASO C

:08

A.6~d
del raldual <%)

Acdvfds4 roWdual (%)

120

120

10

2%

lSGlLrnrpuod

10

2)
30
Uompo <horno)

40

50

Fitura 63: Curvas de desactivacin trmica de la lipasa de Rh.mehei semipuflcada (SP)

y de los derivados inmovilizados (SIL-C) y (SR-SP) a (A) a 370C y (B) a 500C. Reaccin
test: hidrlisis de trihutirina.
Como se observa en las Figuras anteriores tras el proceso de inmovilizacin covalente
se produce un importante incremento de la estabilidad de la lipasa de Rh.miehei
semipurificada, logrndose el objetivo propuesto al desarrollar este proceso de inmovilizacin,
que era el auniento de la estabilidad de la lipasa de R/wniehet semipurificada.
Con el fin de cuantificar los resultados obtenidos se procedi, como se indic
anteriormente a ajustar los datos experimentales de desactivacin representados en las Figuras
63 A y B a una ecuacin monoexponencial decreciente (ecuacin 29)
Una vez determinado el valor de cada uno de estos parmetros se realiz un estudio

225

Inmovilizacin de la lipasa de Rh.miehei

comparativo de la termoestabilidad de la lipasa de Rh.miehei y de todos sus derivados

obtenidos a lo largo de la presente Tesis Doctoral. Los valores correspondientes a los
parmetros de la ecuacin de desactivacin enzimtica para la lipasa de Rhaniehet cruda,
semipurificada (SP) e inmovilizada por enlace covalente sobre slice, tanto cruda (SIL-C)
como semipurificada (SIL-SP) se recogen en la Tabla 43.
Tabla 43: Parmetros de desactivacin enzimtica a 37 y 50 0C de la lipasa de R/iniehei
semipurificada e inmovilizada sobre slice (Sil-SP); la lipasa cruda y la lipasa cruda
inmovilizada sobre slice (Sil-fi)

r
0C)
(

A
(%)

a
1
(%)

k
(It1)

c=ct2
(%)

37

575

434

0,270,05

292

SP

37

944

6,10,2

0,0420,004

SiI-C

37

427

589

1,50,6

562

Sil-SP

37

5233

483

0,160,01

483

CRUDA

50

887

121

0,3 80,03

6,6+04

SP

50

962

4,00,1

0,270,02

Sil-C

50

576

434

0,080,02

244

Sil-SP

50

383

624

0,100,03

572

ENZIMA

CRUDA

Tras el anlisis de los datos de la Tabla 43 se lleg a la conclusin de que tras la

mmovilizacin de la lipasa semipurificada de Rh.miehe (SIL-SP) se increment notablemente
la estabilidad de dicha enzima con respecto a la lipasa semipurificada (SP) y con respecto al
derivado SIL-C, obtenido al inmovilizar la lipasa cruda. Con el derivado SIL-SP se obtuvieron
los mayores valores de actividad remanente (a

2) a las dos temperaturas estudiadas. El

0C, ya que a elevadas temperaturas el
mcremento de la estabilidad es ms notable a 50
proceso de desactivacion. ennmtica es tambin mayor, por lo que la diferencia de la
constante de desativacin (k) de la lipasa semipurificada e inmovilizada sobre slice con
respecto a la constante de desactivacin de las otras enzimas es ms marcada, que a 37 0C.
En conclusin, el proceso de inmovilizacin por enlace covalente con slice,
previamente activada va TCT, es un magnifico sistema de estabilizacin de la lipasa de

226

Resultados y Discusin

Rh.rniehei, puesto que los derivados obtenidos resultaron ser mucho ms estables, siendo esta
diferencia ms notable a elevadas temperaturas. Adems, se ha logrado el objetivo principal
de la inmovilizacin de la lipasa semipurificada, que era el incremento de su estabilidad, por
lo que se solvent el inconveniente planteado para la aplicacin, desde el punto de vista
industrial, de esta enzima semipurificada que aunque es ms activa que la lipasa cruda, result
ser muy poco estable. Por todo ello este nuevo derivado de la lipasa de Rh.miehei
semipurificada e inmovilizada, es un biocatalizador ptimo para su utilizacin industrial en
procesos de hidrlisis,

227

Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs)

iVA.- RESOLUCION ENANTIOSELECTiVA DE AINEs

Como se indic en la Introduccin de esta Memoria (ver 1L2.7.c.1.) uno de los
objetivos actuales de la Industria farmacutica es la obtencin de frmacos homoquirales. En
la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo la resolucin enantioselectiva de mezclas
racmicas de cidos (R,S) 2-arilpropinicos o de sus steres correspondientes, utilizando como
biocatalizador la lipasa de Rh.nnehez Asimismo, se ha analizado con detalle la influencia de
las diversas variables que intervienen en la reaccin y que pueden modificar el rendimiento
y el grado de enantioselectividad de la misma.

Las estrategias seguidas fueron dos:

1).- Hidrlisis enantioselectiva en medio acuoso, a partir del correspondiente
ster racmico.

2).- Esterificacin enantioselectiva, a partir del cido racmico, mediante

reacciones de esterificacin en medio orgnico.

W.4.1.- ENANTIOSELECTIYIDAD DE LA LIPASA DE Rkmiehei

En la bbliografia se recoge diversa informacin acerca de la enantioselectividad de
la lipasa de Rh.miehei. Algunos autores han trabajado con cidos quirales, obteniendo
resultados dispares acerca de la enantiopreferencia de esta enzima, mientras que los que se
han centrado en el estudio de alcoholes quirales han obtenido resultados ms homogeneos.
Entre los trabajos realizados con cidos auirales se encuentran los realizados por Sih
y cols.24024 los cuales observaron que en la reaccin de hidrlisis del ster metlico del (R,S)
Naproxeno, la lipasa de R.miehe suministrada por el laboratorio Amano actuaba,
preferentemente, sobre el enantimero R de dicho ster, coincidiendo con lo indicado por
Paloma y cols.247276 en las reacciones de hidrlisis y transesterificacin del Ketoprofeno,
utilizando la lipasa de Rh.miehei suministrada por los laboratorios Amano y Novo-Nordisk.
Por el contarlo, Mustranta242 observ una enantiopreferencia opuesta, hacia el enantimero 5,
en la reaccin de esterificacin del (R,S) Ibuprofeno con alcohol amilico. Esta misma
enantiopreferencia de la lipasa de Rh.mehei se observ en la reaccin de esterificacin de

228

Resultados y Discusin

(R,S) Ibuprofeno con 1-propanol, trabajando en condiciones supercriticas utilizando anhidrido

carbnico como disolvente241. Estos dos ltimos autores utilizaron la lipasa suministrada por
el labortorio Novo-Nordisk.
Otros autores han llevado a cabo reacciones enantioselectiva de esterificacin277~ y de
transesterificacin2lTh utilizando alcoholes cuir

y como catalizador la lipasa de Rh.miehei

de Novo-Nordisk, observando en todos los casos una enantiopreferencia hacia el

estereoismero R, aunque con diferente grado de enantioselectividad segn fuera la naturaleza
del alcohol estudiado, debido a la formacin de un complejo acil-enzima, caracterstico para
cada cido, cuya estructura y orientacin influye directamente en el proceso de aproximacin
posterior de los enantimeros del alcohol2m, favoreciendo de esta forma la esterificacin con
un determinado ismero del alcohol.

Estos resultados dispares difcilmente pueden atribuirse al efecto de variables aquirales,

como las que constituyen el medio de reaccin; sino que lo ms probable es que sea debido
al distinto origen y/o grado de purificacin de las preparaciones enzimticas comerciales.
Como ya se ha indicado, en las reacciones llevadas a cabo por los autores antes citados se
utilizaron lipasas de Rhanehei procedentes de distintos laboratorios (Novo-Nordisk y Amano).
El diferente origen de la preparacin enzimtica puede ser un factor importante en la
modificacin de la enantiopreferaicia de esta lipasa, ya que como observ Sonnet277 el grado
de enantiopreferencia de la lipasa de Rh.mehei en la reaccin de esterificaccin de cido
octanico con ()2-octanol en hexano, varia segn el laboratorio suministrador de la
enzima; as la lipasa de Novo-Nordisk presentaba una gran enantioselectividad, la lipasa de
Gist Brocades una enantioselectividad media y la lipasa de Amano una enantioselectividad
muy pobre.

IV.5.- HIDROLISIS ENANTIOSELECTiV DE ESTERES DE

CIDOS (RS> 2-ARIIJPROPIONICOS

Con el objeto de obtener el enantimero farmacologicamente activo (S(+)) de los
AINES derivados del cidos (R,S) 2-arjpropinico y de acuerdo con la informacin recogida
en la bibliografa, acerca de la enantiopreferencia de la lipasa de Rh.mehe del laboratorio

229

Antiinflamatorios no esteroWeos <AINEs)

Novo-Nordisk; se plante como primera estrategia el desarrollo de la reaccin de hidrlisis

enantioselectiva de los steres racmicos de dichos cidos.
Como sustratos de esta reaccin se emplearon los steres butlicos de los cidos (R.S)
2-arilpropinicos. La reaccin de hidrlisis de dichos steres fue catalizada por la lipasa de
Rhaniehei nativa (Lipozymet 10000L) e inmovilizada por adsorcin sobre una resma de
intercambio aninico (Lipozyme 1M20) en medio acuoso a pH neutro, 370C y 143 horas de
reaccin, segn el mtodo 13 de hidrlisis enzimtica de steres descrito en la Parte
Experimental de esta Memoria (ver 111.7.2.)
Los rendimientos de la reaccin (expresada en porcentaje de cido liberado) y la
enantioselectividad del cido liberado (expresado en exceso enantiomrico (ee)~ asi como el
valor del coeficiente enantiomrico (E) (ver 1I.2.5.b.1.) aparecen en la Tabla 44.

Tabla 44: Resultados de la hidrlisis de los steres butilicos de los cidos (R,S) 2anpropinicos cataiizada por la lipasa de Rh.miehe (143 Ii).
ester botlico de

enzima

rend.
(%)

ee
(%)

IBUPROFENO

cruda

13,60,6

9,00,3(5)

1,2

1M20

562

3,00,1(5)

1,1

cruda

20,10,4

512(5)

3,5

1M20

98,60,1

271(5)

>50

cruda

679

301(5)

3,2

1M20

cruda

564

612(R)

9,4

1M20

771

572(R)

>50

2-FENIiLPROPIONICO
NAPROXENO

KiETQPROFENO

Las reacciones de hidrlisis de los steres butilicos de los cidos (R,S) 2.anpropinicos presentaron numerosos e importantes problemas tcnicos. La formacin
y mantenimiento de la emulsin fue muy dificil, por lo que las reacciones fueron muy poco
reproducibles, obtenindose resultados muy dispares en los numerosos ensayos realizados.
Asimismo, no es aconsejable la utilizacin de la lipasa inmovilizada (Lipozyme 1M20) en
medio acuoso, de acuerdo con los resultados obtenidos en los estudios de su actividad lipsica

230

Resultados y Discusin

(ver IV. 1.2.) y los estudios de desorcin (ver IV.1.1.h.). El elevado rendimiento obtenido con
esta enzima inmovilizada puede ser consecuencia de la desorcin de la proteina de este
derivado tras 143 h de reaccin y de la actuacin de la lipasa desorbida, por lo que ser muy
difcil controlar el desarrollo de la reaccin y determinar la influencia del proceso de
desorcin en el rendimiento de la reaccin de hidrlisis.
Aunque la enantioselectividad de estas reacciones era la deseada, obtenindose el cido
S(+) farmacologicamente activo, (excepto con el Ketoprofeno), debido a los importantes
mconvenientes tcnicos de esta reaccin de hidrlisis y su difcil reproducibilidad se vari la
estrategia seguida y se llev a cabo la reaccin inversa de sntesis enantioselectiva de los
correspondientes steres en medio orgnico.

IV.5.1.- ACTIVIDAD DE LA LIPASA DE Rkmiehei SEMIPUIRIFICADA E

INMOVILIZADA
Utilizando como reaccin de referencia la hidrlisis del ster butlico de (R,S)
Ibuprofeno a pH=8, 37 0C y 143 min. se analiz la actividad hidroltica de la lipasa de
Rh.miehei inmovilizada por unin covalente con silice (SIL-C) y esta misma lipasa
semipunficada por precipitacin con un 50% de saturacin con sulfato amnico y
posteriormente inmovilizada por el mismo mtodo (SIL-SP).
Para poder comparar la actividad hidroltica de dichas enzimas se determin la
actividad especfica (mnxol cido liberado/mm mg proteina determinadas por el mtodo de
Bradford) de cada una de ellas. En la Tabla 45 se recogen los resultados de rendimiento
(mmol cido/mm mg protena) y execeso enantiomrico

231

(00)

obtenidos con cada lipasa.

Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs)

Tabla 45: Actividad de la lipasa de Rh.mehei cruda, semipurificada e inmovilizada por

adsorcin y por unin covalente covalente con slice en la reaccin de hidrlisis
enantioselectiva del ster butlico de Ibuprofeno (143 ti)
ENZIMA
actv.especif
ee~~
E
(mmol/mgprot)

(%)

cruda

0,1260,003

7,10,3(5)

1,19

SP

2,980,08

602(5)

>50

11M20

0,0280,002

375(5)

>50

S]IL-C

1,250,01

783(5)

>50

SR-SP

0,290,003

522(5)

>50

Como se indic anteriormente, al semipurificar la lipasa de Ritmnzehei por precipitacin

con un 50% de saturacin de sulfato amnico (SP), se obtuvo una lipasa de mayor actividad
estersica (ver 1V2.3.c.; Tabla 28) y lipsica (ver IV.2.3.d.; Tablas 3Oy 31) en las reacciones
de hidrlisis de sus sustratos especficos (acetato de p-nitrofenilo, aceite de oliva y tributirina).
Asimismo, la actividad de esta lipasa semipurificada en la reaccin de hidrlisis de otro
sustrato no especifico como es el ster butlico de Ibuprofeno tambin aument, como se
observa en los resultados de la Tabla 45. Adems la enantioselectvidad del proceso aument
tras la semipurificacin de la lipasa de Rh.miehe, comcdiendo con lo observado por Moreno
y c&s.2 con la lipasa purificada de C.cyltndracea en la reaccin de hidrlisis del ster
proplico de 2-fenilpropinico. Todos estos resultados indican que, efectivamente, el
biocatalizador ha mejorado notablemente tras el proceso de semipurificacin.
Al inmovilizar la lipasa cruda de Rh.mehe por enlace covalente con slice (derivado
SIL-C) aument el rendimiento. Este aumento del rendimiento puede atribuirse a la
estabilizacin de la emulsin por efecto

de la superficie del soporte, cargada

electrostaticamente. Este resultado es opuesto al observado en la reaccin de hidrlisis de

tributirina (ver Tabla 41), ya que en ese caso el derivado SIL-C result ser menos activo que
la lipasa cruda. Quiz ese comportamiento diferente se deba a que en la reaccin de hidrlisis
de tributirina se solvent el principal mconvenente de las reacciones de hidrlisis, la
formacin correcta de la emulsin, por la adicin de un agente emulsifcante (goma arbiga),
pudindose medir la actividad hidroltica sin la influencia de factores externos o dificultades
tcnicas.
232

Resultados y Discusin

Tras la inmovilizacin de la lipasa de Rh.miehei por adsorcin (1M20) o por unin

covalente (SIL-C y SIL-SP) se obtuvieron una serie de derivados de gran enantioselectividad,
debido probablemente a la alteracin de la conformacin de la enzima, ya que disminuyen sus
grados de libertad, aumentando su rigidez y por tanto su enantioselectividad hacia el ismero
S, que es el enantimero sobre el que trabaja la lipasa cruda de Rh.miehei (Lipozyme
lOOOOL).
Al comparar la actividad hidroltica del derivado inmovilizado por adsorcin
(Lipozyme IM2O) (0,0280,002mmol/min mg) y del derivado inmovilizado covalentemente
(SIL-C) (1,250,01mmol/miin mg) se obtienen resultados muy superiores con el derivado
inmovilizado sobre slice, como ya ocurri en la reaccin de hidrlisis de tributirina (ver
IV I.3.b.; Tabla 22). Este resultado era de esperar, pues el derivado Lipozyme IM2O no es
muy adecuado para catalizar reacciones en medio acuoso, ya que fue diseado para reacciones
en medio orgnico2767.
Tras comparar entre s la actividad hidrolitica de todos los preparados enzimtcos
utilizados (semipurificados, inmovilizados por adsorcin y covalentemente) (Tabla 45) se lleg
a la conclusin de que la preparacin ms indicada para llevar a cabo la reaccin de hidrlisis
del ster butilico de Ibuprofeno es la lipasa seniipurificada por precipitacin con sulfato
amnico (SP).

233

Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs)

1V.6.-SINTESIS

ENANTIOSELECTIVA

DE

ESTERES

DE

CIDOS (RS> 2-ARILPROPIONICOS

Otra metodologa seguida para la resolucin enzimtica de las mezclas racmicas de
AINEs derivados del cido (R,S) 2-arilpropinico se bas en la sintesis enantioselectiva de
los steres correspondientes. Dicha metodologa permiti adems, analizar el comportamiento
de la lipasa de Rh.miehei en medio orgnico.
El estudio de estas reacciones se estructur en los siguientes apartados:
1).- estudio de la influencia de las variables de operacin.
2).- estudio de la influencia de las variables discontinuas o estructurales.

Para llevar a cabo todos estos estudios se estableci una reaccin estndar de sintesis
de steres con las siguientes caractersticas:
cido

alcohol

(R,S) Ibuprofeno (0,125 M)

.->

disolvente

1-butanol
*.

ciclohexano (10 mi)

lipasa cruda de Rh.mtehe (Lipozymee IOOOOL)(0,4 mi)

lipasa inmovilizada de Rh.mehei (LipozymetlM20)(300 mg)
temperatura > (37 0C)
tiempo de reaccin

El

>

(72 h)

anlisis del rendimiento de reaccin y del exceso enantiomrico se describe en la

Parte Experimental de esta Memona (ver 111.8.3.,).

ITV.6.i.- ESTUDIO DE LAS VARIABLES DE OPERACION

DISEO ESTADISTICO DE EXPERIMENTOS
Para estudiar las variables de operacin que pueden influir en la reaccin de sntesis
del ster butlico de (R,S) Ibuprofeno en ciclohexano, catalizada por la lipasa de Rh.miehei
tanto libre como inmovilizada, se utiliz un anlisis factorial denominado Diseo estadstico
de Experimentos, que es un mtodo de variacin mltiple en el cual, todos los parmetros
objeto de estudio varan simultneamente de forma programada. De este modo se realiza un
234

Resultados y Discusin

estudio eficiente y racional de las variables elegidas en todo su intervalo y se obtiene

informacin adicional de los efectos debidos al conjunto de dos o ms variables26t.
sta metodologa ya fue empleada por Garca y coL?78 para analizar la influencia de
las variables (temperatura, presin y concentracin de catalizador) en la sntesis del oleato de
oleilo, catalizada por la lipasa inmovilizada de Rh.miehei (Lipozyme~ 1M20).
En la presente Tesis Doctoral se analizaron ms variables y se compararon las
actividades de la lipasa cruda e inmovilizada de Rh.miehei.

FV.6.1.a.- Lipasa cruda de Rh.miehei <Lipozvm LOOOOU

Las variables consideradas fueron:
relacin molar (cido:alcoholXXA>
tiempo reaccin (h)

(~<B>

temperatura (0C> <Xc)

velocidad agitacin (r.p.m.) (Xc)
enzima libre <ni> <U
disolvente (mi) (NF)
Los valores mximo, mnimo y central para cada una de estas variables aparecen en
la Tabla 46.

Tabla 46: Variables y valores considerados en el Diseo estadstico de Experimentos para

la lipasa cruda de Rh.miehei
VARIABLES

(~)

P.C.

(-)

4:1

1:1

:4

10 h

8 Ii

6 h

57 0C

37 oc

17 0C

velocidad agitacin {X~)

700 rpm

500 rpm

300 rpm

enzima libre (Xc)

1,6 ml

1 ml

0,4 ml

disolvente <NF)

15 ml

10 ml

5 ml

relacion cido:alcohol(X,)
tiempo reaccin <X~}
temperatura (Xc)

Los experimentos fueron realizados de forma aleatoria segn un modelo factorial de

2~. En total se realizaron 16 experimentos combinando de forma aleatoria los valores mximos
235

Antiinflamatorios no esteroideos (4INEs)

y mininos de cada variable y 3 experimentos con el valor central (C.P.) de cada variable. En
la Tabla 47 se muestran los valores mximos y mnimos de cada variable para cada
experimento, as corno el rendimiento de cada reaccin, expresado en porcentaje de ster
producido.

Tabla 47: Diseo factorial: Matriz experimental para la (pasa cruda de Rh.miehe.
P

5<,,

3
4

-4-

O
0
O

-4.

-4-

4-

10
11

+
+

+
+

1,57

.4-

15,82

12
13
14
15

-4-

3,79

4-

4-

4-

4-

-~-

0
0
0

0
0
0

0
0
0

0
0
0

1-6--.
17
18
19

~-

0
0

0
0
0

1,94

3,55

14,43

19,13
O

5,03
.J4,62.
49,96
54,44
59,61

continuacin, se realiz un analisis estadstico utilizando el programa

STATGRAPH269. Los valores de los coeficientes estimados para cada variable obtenidos tras
dicho anlisis estadstico se recogen en la Tabla 48. Estos coeficientes se compararon con el
error experimental obtenido, equivalente a la desviacin estndar de los resultados de las tres
reacciones realizadas con los varlores medios de cada variable. Generalmente cuanto mayores
son los valores de los coeficientes en relacin con el valor de desviacin estndar, mayor es
la influencia de las variables sobre el rendimiento de la reaccinZ~.

236

Resultados y Discusin

Tabla 43: Analisis estadstico del Diseo de Experimentos realizado para la lipasa cruda de
Rh.miehe
Nmero de experimentos: 16
Grados de libertad 15
Resultados del analisis estadstico:
5,30
b~ =b~ =-0,43
bA = 0,05
bAC = bRE = 6,82
b~ =6,64
bC= 1,28
bD =084

bBC =b~ =bDF =0,85

bA=b~=~l,52

=7,92
b=-169
F

bCD=bnF=

bE

b El) =b CF
b DE =b AY

Anlisis del punto central (t de Student)

nivel de confianza: 95 %

-0,37

1,48

-0,87

C~ =54,7%
t

(cv=0,05) = 2,9

S =48

limites de confianza: 10.0

Asimismo, se analiz la influencia de cada variable en la reaccin a travs del mtodo
280 (Figura 64). Segn esta metodologa los puntos que no se ajustan al modelo de
de Daniels
probabilidad estadistica, es decir, que no se ajustan a la recta de regresin repreentada, son
las variables que ms influyen en el proceso.
pomw,taJ. aoumgdaGvo
99 9

99

95

80

20

o
-2.00

0.00

2.00

400

8.00

8.00

docto.

Figura 64: Mtodo de Daniel para la reaccin de sntesis del ster butilico de (R,S)
Ibuprofeno catalizada por la lipasa cruda de Rh.miehei
237

Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs)

Segn el anlisis estadstico (Tabla 46) y el mtodo de Daniel (Figura 64) las variables
que ms influyen en la reaccin de sntesis del ster butlico de Ibuprofeno catalizada por la
lipasa cruda de Rltiehei son: el tiempo de reaccin (b5= 6,64), la cantidad de enzima (bE
7,92) y la relacin entre ambas variables (bBE 6,82>.
A la vista de estos resultados el rendimiento de la reaccin de esterificacin catalizada
t 10000L) se puede expresar en funcin de las
por la lipasa cruda de Rhjniehei (Lipozyme
variables ms influyentes, segn la ecuacin 31.

Rendimiento (%)

5,30

7,92 X

5 + 6,64 3%

6,82X~

[31]

El significado fisico del efecto positivo en el rendimiento, del tiempo de reaccin y

de la cantidad de enzima son evidentes. Por lo que se refiere a las otras variables analizadas
se pudo deducir que:
a).- La no influencia de la velocidad de agitacin

(XE)

y de la cantidad de disolvente

(3%) indica que la reaccin no es controlada por la difusin interparticular ni por la difusin
en el seno de la reaccion.

b).- Por ltimo, la baja influencia de la temperatura de reaccin puede ser debida a que
en el intervalo de temperatura considerado no se produzca una variacin apreciable de la
actividad de la lipasa cruda de RJi.miehei.
t 1M2O~
IV.6A.b.- Linasa inmovilizada de R.miehei (tipozvme
Un estudio paralelo realizado con la lipasa de Rh.mehei mmovlizada por adsorcin,
podra conducir a resultados similares o diferentes, en funcin del grado de influencia del
soporte en la actividad enzimtica. En este estudio se consideraron las mismas variables que
en el caso anterior, pero tambin se analiz la posible influencia de trazas de agua en el
medio, ya que varios autores han descrito su importancia en la actividad de esta enzima

231-284

Esta variable no se consider para la lipasa cruda, ya que era una disolucin acuosa y por
tanto la adicin de agua no tena nngim efecto sobre el proceso.
Los valores mximo, mnimo y central para cada variable aparecen en la Tabla 49.

238

Resultados y Discusin

Tabla 49: Variables y valores considerados en el Diseo estadstico de Experimentos para la

lipasa inmovilizada de Rh.miehei (1M20).
VARIABLES
relacin cido:alcohol (XA)
tiempo reaccin (X3)

(~4-)

P.C.

(-)

4:1

1:1

1:4

24 h
37 0C

18 Ii
17 0C

500 rpm

300 rpm

30 h
0C
57
700 rpm

temperatura (Xc)
velocidad agitacin (X0)
enzima inmovilizada (XE)
disolvente (3%)
agua (X0)

450 mg

300 mg

150 mg

15 ml

10 ml

5 ml

0,6 ml

0,3 ml

O ml

En la Tabla 50 se recogen los valores mximos y mnimos de cada variable para cada
experimento, as como el rendimiento de cada reaccin, expresado en porcentaje de ster
sintetizado.
Tabla 50: Diseo factorial: Matriz experimental para la lipasa inmovilizada de Rh.miehe
(1Mb)
1
1

1,
-~
-

5<

5<

5<
-

5,71

O
50,08
11,41
9,68

37,65

O
30,03
21,12
13,19

8
9
10
11

+
+

+
+

12

13
14

24,36

69,92

--

4-

4-

4-

4-

4-

4-

0
0

0
0

0
0

0
0

0
0

0
0

0
0

3
4

15

L&.-
17
18

o
9,14
3,17

35,91
46,87

Con los datos obtenidos en cada reaccin se realiz un anlisis estadstico (Tabla 51)
239

Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs)

y se aplic el mtodo de Daniel (Figura 65); con lo que se pudo determinar el grado de
influencia de cada variable en la reaccin de sntesis en medio orgnico catalizada por la
lipasa mmovilizada de Rltrntehei (Lipozyme 1M20).

Tabla 51: Analisis estadstico obtenido del Diseo estadstico de Exeprunentos realizado para
la lipasa inmovilizada de Rh.miehei (INflO)
Nmero de experimentos: 16
Grados de libertad: 15
Resultados del analisis estadstico:
l,~ =18,03
bA = -1.69
=

7.35

8.40

~ = b20 = -10.57
bl)Q = bnE = -10.23
bBc=bDE=bAF=
-0.30
= b00 = bEF = -9.41
bBD = b~ = bFG = -2.27
bCn=bBE=bAG= 5.86
bAY=bBo =bnF = -0.34
=

bAC

b1, =-0.O7
bE = 17.96
bF

-1,48

= -25,9

Anlisis del punto central (t de Student)

nivel de confianza: 95 %
Cm= 43,5 %
t2 (a=0,05) = 2,9
S~ =6,6
lmites de confianza: 13,7
pcennt<. aoumufrilvo
99.9

99

95

80

50

20

o
-30.00

-20.00

-10.00

0.00

10.00

20.00

.f.a

Figura 65: Mtodo de Daniel para la reaccin de sntesis del ster butlico de (R,S)
Ibuprofeno catalizada por la lipasa inmovilizada de Rh.nsiehe(1M20)
240

Resultados y Discusidn

Una vez analizados los resultados obtenidos con el Diseo estadstico de

Experimentos, se puede concluir que las variables ms influyentes en la reaccin de
esterifiCacin son: la cantidad de enzima (bg= 17,96), y el agua aadida (b= -25.93). Adems,
se observa un ligero efecto positivo del tiempo de reaccin (bB~ 7,35) y de la temperatura
(b0= 8,40), pero no llegan a alcanzar un nivel de significancia mayor del 95 Vo.
As pues, las condiciones ms favorables para la reaccin catalizada por la lipasa
inmovilizada de Rh.mnehei serian: una temperatura elevada, sin adicin de agua al medio, una
elevada concentracin de enzima y, obviamente, un tiempo largo de reaccin.
A la vista de estos resultados el rendimiento de la reaccin de esterificacin catalizada
por la lipasa inmovilizada de Rh.miehe (Lipozym 1M20) se puede expresar segn la
sigmente ecuacin:

Rendimiento (%)

18,03 + 17,96

XB - 25,93 XG

[32]

Tras el estudio de la influencia de las variables de operacin que pudieran influir en

la reaccin de sntesis del ster butlico de (R,S) Ibuprofeno, aplicando la metodologia del
Diseo estadstico de Experimentos, se puede concluir que la cantidad de enzima y el tiempo
de reaccin son los factores que ms influyen en la reaccin catalizada por al lipasa cruda de
Rh.miehei, mientras que la cantidad de enzima y el agua aadida al medio de reaccin son
los factores ms influyentes en el proceso catalizado por la lipasa cruda de Rh.miehei.

* * * ** * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ** * * * * * * * * * *

Para analizar con ms detalle las variables ms influyentes en la actividad de la lipasa

de Rh.miehei cruda e inmovilizada, de acuerdo con los resultados obtenidos en el Diseo de
Experimentos se utiliz la metodologa denominada OVAl (One Variable At Time
influencia de cada variable por separado), por la cual se analiza una determinada variable
dentro del intervalo de trabajo, mientras las dems variables permanecen constantes. Las
variables analizadas fueron las sigmentes
* cantidad de enzima
*

tiempo de reaccin
241

Antiinflamatorios no esteroideos (AIMEs)

*

temperatura

agua aadida al medio

relacin molar de sustratos (cido:alcohol)

En estas ensayos se analiz la influencia de la variable estudiada tanto en el

rendimiento de la reaccin, como en la enantioselectividad del proceso.

IV.6A.a.- Influencia de la CANTIDAD DE ENZIMA

Como inidc el Diseo estadstico de experimentos, la cantidad de lipasa utilizada es
un factor influyente en el rendimiento de la reaccin de sntesis de steres. El estudio
detallado de

influencia en la evolucin de dicha reaccin permiti determinar la carga

enzimtica equivalente del derivado inmovilizado (Lipozymet 1M20) en funcin de su
actividad smtetasa en medio orgnico. Para ello, se llev a cabo la sntesis del ster butilico
5~Li

de Ibuprofeno en ciclohexano a 37 0C, catalizada por diferentes concentraciones de enzima

cruda de Rhanehei. Las reacciones se pararon tras 48 b de reaccin.

IY.6.1.a.1.- Lipasa cruda de Rh.miehei

En la Figura 66 se representa el rendimiento de la reaccin, expresado en porcentaje
de ster sintetizado, frente a la concentracin de protenas de la lipasa cruda de Rhanehei,
,andmI.nt en ster (%)
100

80

80
NO
40

20

20

40

lOO

cantidad de protenas (mg>

Figura 66: Influencia de la cantidad de proteina en la sntesis del ster butilico de Ibuprofeno
catalizada por la lipasa cruda de Rh.tniehei (t.~ 48h).

242

Resultados y Dscuswn

Los resultados obtenidos se ajustaron a la siguiente ecuacin de segundo grado:

(3,70,7)x2

(1,540,09) x

(9l)lO~~

[33]

De la Figura 66 se deduce que, para cantidades de lipasa superiores a 80 mg de

protena (VrlO

mi) se estabiliza el rendimiento

de la reaccin, debido a la

enantioselectividad de la lipasa de Rh.miehei. La relacin entre el rendimiento de la reaccin

y la cantidad de protena es lineal hasta el 50% de rendimiento; a partir de ese punto,
disminuye la concentracin del enantimero preferido (S) y la lipasa comienza a actuar sobre
el otro enantimero (R), pero debido a la menor afinidad de la lipasa por este ltimo
enantimero la velocidad de reaccin disnnnuye La enantiopreferencia por el enantimero
8 es la misma que la descrita en la reaccin de hidrlisis del ster butlico de Ibuprofeno (ver
Tabla 45,), en la cual se hidroliza a mayor velocidad el ster S.

IV.6.1.a.2.- Lipasa inmovilizada de R.miehei (Lipozyme~ 1MW)

A continuacin, se llev a cabo la misma reaccin de sntesis catalizada por distmtas
cantidades de derivado inmovilizado de Rh.mehe (Lipozym 1M20) El rendimiento
obtenido en dichas reacciones se interpol en la curva de segundo grado (Figura 65>,
aplicando la correspondiente ecuacin 33. En la Tabla 52 se recogen los rendimientos de
dichas reacciones y el valor de actividad sintetasa residual del derivado mmovhzado

(Lipozyme~ 1M20) (mg de protena activa/mg de Lipozym& 1M20).

Tabla

Actividad retenida de la lipasa de Rh.miehei inmovilizada (Lipozymet 1M20) en

la reaccin de esterificacin del Ibuprofeno con 1-butanol
52:

cantidad de Lipozyme* ffiflfl

(mg)

activ.residual
rendimiento

(mg prot activa!

(%)

mg derivado)

150

341

0,196

300

452

0,139

450

683

(*)

(*)No se pudo determinar la carga enzimtica de la reaccin catalizada por 450 mg de derivado
inmovilizado porque el rendimiento obtenido estaba fuera del intervalo de actividad de la lipasa cruda.

243

Antiinflamatorios no esteroideos (ANEs)

El valor medio de la actividad retenida del derivado inmovilizado, expresado en

funcin de la cantidad de protena activa por cantidad de derivado fue (0,170,04)mg de
protena activa/mg de Lipozyme 1M20. Este valor es semejante a la carga enzimtica del
mismo derivado determinada por Vazquez y cok270, que fue de 0,12 mg de protena/mg de
LipozymJ 1M20, por lo que se puede concluir que toda la lipasa de Rhanehei unida al
soporte por adsorcin mantiene su actividad sintetasa inalterada. Adems, se comprob que
la enzima inmovilizada de este derivado no se desorba en medio orgnico (ciclohexano) (ver
IV.1.1.b.; Tabla 16,). Por el contrario, la actividad lipsica retenida en la reaccin de hidrlisis

de aceite de oliva, de este derivado (0,016 mg de protena activa/mg de Lipozyme 1M20)

se puede deber a la fraccin enzimtica desorbida al medio de reaccin (ver IJfll.3.a.2.).
Tras este estudio se puede concluir que la lipasa de Rh.mehei inmovilizada
(Lipozyme 1M20) es muy activa en la reaccin de sntesis de steres en medio orgnico, pero
pierde gran parte de su actividad cuando trabaja en medio acuoso, residiendo la actividad
hidroli.tica en la fraccin protica que se desorbe al medio.

FV.6.1.a.3.- Influencia en la enantioselectividad

Factor de enantioselectividad (FE)
Con el fin de determinar la enantioselectividad alcanzada en reacciones de segundo
orden, en las que la velocidad de reaccin depende de la concentracin de dos sustratos, como
ocurre en la reaccin de sntesis de steres, se defini un nuevo parmetro de
enantioselectividad que relaciona la velocidad de reaccin de una determinada enzima sobre
cada uno de los enantimeros de una mezcla racmica
Este nuevo parmetro se denomin factor de enantioselectividad (FEl. que se defme
como la relacin entre el exceso enantiomrico medido exverimentalmente tras un
determinado tiempo de reaccin y el exceso enantiomrico terico que se obtendra si la
enzima fuera enantioespecifica, considerando la conversin calculada para ese mismo tiempo
de reaccin.

rendimiento
=

[34]

100-rendimiento

244

FE = e.

pnctk.

1 ee~~

[35]

Resultados y Discusin

El mximo valor de FE es 1 y se alcanza cuando la conversin es superior al SO

%.

En ese momento la enzima deja de ser enantioselectiva y comienza a utilizar el enantimero

no prefrente, por lo que disminuye el valor de FE. Hasta el 50 % de conversin el valor de
FE aumenta proporcionalmente con el tiempo de reaccin, si la enzima es enantioselectiva.

A continuacin, se representa el exceso enantiomrico de cido remanente (ee) (Figura

67A) y el factor de enantioselectividad (FE) (Figura 67B) alcanzados en la reaccin de
esterificacin enantioselectiva del (R,S) Ibuprofeno frente a la cantidad de protena. La
cantidad de protenas del derivado inmovilizado se estableci utilizando el valor de carga
enzimtica en funcion de la actividad sintetasa (0.170,04) mg protena activa mg de
Lipozyme~ 1M20.

exceso onantjcmrftc <ea)

factor enantlomdoo <Fa)

lOO

80

2.00

1.60

60

-t

50
40

1.20

o so

20

4-4...

20

40

60

0.40

aavdS

ob

so

100

oandded de protena (ma>

000
0

20

40

80

80

oandSd de protena (mg>

Figuras 67: Representacin de la enantiaselectividad ((A) ce y (E) FE) en la sntesis del ster
butilico de (R,S) Ibuprofeno a 48 h, catalizada con cantidades variables de lipasa cruda e
inmovilizada de Rh.miehei

245

100

Antiinflamatorios no esteroideos (ALVEs)

Como se observa en la Figura 67A, con ambas lipasas existe una relacin inversa entre
la cantidad de protenas del biocatalizador y la enantioselectividad, expresada en funcin de
FE, parmetro que Yelaciona el exceso enantiomrico (ee) y el rendimiento en ester de la
reaccion.
Asimismo, puede observarse (Figura 67B) que la enantioselectividad de la lipasa cruda
de Rh.miehei es ms uniforme debido a su menor actividad. El valor de FE de las reacciones
catalizadas por esta enzima se estabiliza en 0,8 para un intervalo de protenas amplio (entre
10 y 70 mg). Por el contrario, en las reacciones catalizadas por la lipasa inmovilizada se
produce una brusca variacin de FE, al variar la cantidad de protena debido a su mayor
actividad. La drstica disminucin de FE es debida a que el rendimiento alcanzado es superior
al 50 % (68%), lo que mdica que la enzima ha dejado de actuar selectivamente sobre el
enantimero S.
Comparando ambos biocatalizadores, desde el punto de vista industrial, el derivado
inmovilizado (Lipozyme 1M20) es el ms ventajoso en esta reaccin de sintesis del ster
butilico de Ibuprofeno, ya que se obtiene la mxima enantioselectividad y rendimiento en
ster, con la menor cantidad de derivado, como se deduce de la Figura 67A.

IV.6.1.b.- Influencia dcl TIEMPO DE REACCION

El

tiempo de reaccin es una de las variables de operacin que ms influyen en la

reaccin de sntesis de steres, segn se desprende del estudio del Diseo de Experimentos.
Como era de esperar, al aumentar el tiempo de reaccin aumenta tambin el
rendimiento. Con el fin de comparar la actividad de las dos lipasas comerciales de R.h.mehei
(cruda (Lipozyme lOOOOL> e inmovilizada (Lipozyme~ 1M20)) se llev a cabo un estudio
de la evolucin de la reaccin estndar de sntesis del ster butilico de Ibuprofeno a lo largo
del tiempo.

El rendimiento de la reaccin se expres en mmoles sintetizados por mg de protena.

debido a que la concentracin de protenas de ambas lipasas es diferente:
* enzima cruda (Lipozyme~ 1 OOOOL) * (642)
mg protena/ml
t 1M20) 4 0,12 mg protena/mg 270
* enzima inmovilizada (Lipozyme

246

Resultados y Discusin

En la Figura 68 se representa el rendimiento de cada reaccin frente al tiempo.

rernrni.Mo (mmd.. ..tedmg protena)
1

0.04

>-

0.03

0.02

k
0.01

0.00

>tj ~
0

tiempo

60

80

Figura 68: Evolucin de la reaccin de sntesis del ster butilico de Ibuprofeno, catalizada
por la lipasa de Rh.miehei cruda (Lipozyme lOOOOL) e inmovilizada (Lipozymet 1M20).
La curva obtenida para cada enzima se ajust a una cintica de primer orden
(rendimento
(V

A (1~ekt))y se determmo el valor de la velocidad inicial de cada reaccin

A k).
Para analizar la enantioselectividad de las dos enzimas se determin el valor de exceso

enantiomrico (ee) y factor de enantioselectividad (FE) tras 72 h de reaccin, valores que,

junto con el rendimiento obtenido a ese tiempo y la V0 de cada reaccin se recogen en la
Tabla 53.

247

Antiinflamatorios no esteroideos <AINEs)

Tabla 53: Resultados de rendimiento, enantioselectividad (ce) y (FE) y velocidad inicial (y0)
de a recacin de sntesis del ster butilico de t Ibuprofeno,
catalizada por a lipasa cruda
1M20) de Rh.miehe.
(Lipozyme
IOOOOL)
e
inmovilizada
(Lipozyme
ENZIMA
t
rcnd.
ce
FE
(Ii)

CRUDA

IM 20

(Vs)

(mmol/h mg prot)

(%)

48 ti

332

492

1,0

72 Ii

685

683

0,3

48 h

452

784

0,98

72 ti

664

854

0,4

0,4

10~

0,7 0

La velocidad inicial de la reaccin estndar de sintesis de steres catalizada por la

lipasa de Rh.miehei cruda e inmovilizada fue muy similar. Al analizar el rendimiento de cada
reaccin expresado en porcentaje de ster sintetizado, sin considerar la concentracin de
protenas de cada biocatalizador, se observa que el rendimiento alcanzado tras 48 h de
reaccin, es menor para la lipasa cruda, debido probablemente a su menor enantioselectividad,
como ya se observ en la seccin anterior, lo que hace que la reaccin se desarrolle ms
lentamente hasta alcanzar el 50% de conversin, punto en el cual ambas enzimas actan sobre
el enantimero R no preferente, disminuyendo la velocidad de reaccin y alcanzando en
ambos casos el mismo rendimiento (72h). Este proceso se expresa por el valor del factor de
enantioselectividad (FE), que a 48h de reaccin es practicamente uno, lo que indica que
ambas enzimas son totalmente enantioespecificas. A 72 h de reaccin se ha superado el 50%
de conversin, las enzimas actan sobre el enantimero no preferentemente y disminuye
drasticamente el valor de FE hasta 0,4 y 0,3 respectivamente.
Tras este estudio comparativo de la actividad de las dos preparaciones comerciales de
la lipasa de .Rh.mehe (cruda (Lipozyme 1 OOOOL) e inmovilizada (Lipozyme 1M20)) se
lleg a la conclusin de que ambas enzimas presentan la misma actividad y
enantioselectividad en la reaccin estndar de sntesis de steres, catalizada por 300 mg de
Lipozym& 1M20 y 0,4 ml de Lipozymet 10000L. Asimismo, se observa que la influencia del
tiempo de reaccin en la conversin es lineal en todo el intervalo, lo que explica el elevado
nivel de significancia obtenido en el Diseo estadstico de Experimentos.

248

Reshados y Discusin
IV.6.1.c.- Influencia de la TEMPERATURA

La temperatura es una de las variables que ms influyen en la actividad de la lipasa

inmovilizada de Rh.miehei (Lipozymet 1M20), segn se comprob en el Diseo de
Experimentos (ver IV.].). Por esta razn se estudi con detenimiento su influencia en la
reaccin de sintesis del ster butilico de (R,S) Ibuprofeno en ciclohexano, catalizada por la
lipasa inmovilizada y cruda de Rh.mehei, lo cual permiti, adems comparar la influencia de
la temperatura en la actividad y enantioselectividad de ambas enzimas.
El intervalo de temperaturas considerado fue entre 4 y 100 0C; ms amplio que el
analizado por Svanholm28 y Eigtved278 (25-80 0C) para ambas lipasas de Rh.miehei. De esta
forma se estudi la influencia de temperaturas extremas.
En las Figuras 69 y 70 se representan los resultados obtenidos en la reaccin de
sntesis del ester butlico de Ibuprofeno, tras 24 horas de reaccin, a diferentes temperaturas.

LIPASA CRUDA
-

50

40

40

50

e
3%
n
e
e

u
O
0

30

30

ti

o
e

.1

2O~

20

~/

<5

i0~

al
0

-1-.
L

20

40

60

Temperatura

<o)

10

li~J

80

100

Figura 69: Rendimiento (%) y enantioselecvidad (ce) de la reaccin de sntesis del ster
butilico de Ibuprofeno catalizada por la lipasa cruda de RIs.miehei a diferentes temperaturas
(tiempo reaccin 24h).

249

>

Antiinflamatorios no esteroideos <~4INEs)

LIPASA INMOVILIZADA

dM20

100

100

80

80
<8
3%
n

~1

t
so

60

o
0
0

1.

o
0
gAO

40~
e,
o

<2.
20

20

20

40

60

80

100

Ten?portr. (O)

Figura 7tRendimiento (%) y enantioselectividad (ee) de la reaccin de sntesis del ster

butilico de Ibuprofeno catalizada por la lipasa inmovilizada (MiO) de Rh.miehe a
diferentes temperaturas (tiempo reaccin 2410.
Una de las principales ventajas de la inmovilizacin enzimtica es el aumento de la
termoestabilidad de los derivados respecto de la lipasa cruda. Este hecho se observa en las
Figuras 69 Y 70, ya que la temperatura de mxima actividad de la lipasa inmovilizada de
Rhanzehez (Lpozymet 1M20) fue de 70W; mientras que el intervalo trmico de mayor
actividad para dicha lipasa cruda fue entre 37 y 60 0C.
La productividad de una lipasa depende de su actividad y

su velocidad de

desactivacin, as como del tipo de reaccin. Dado que la velocidad de desactivacin aumenta
con la temperatura como consecuencia de la desnaturalizacin protica, a partir de esta
temperatura (60-70W) se produce una brusca disminucin de la actividadenzimtica, llegando
a ser practicamente nula a 80 y 100 0C.
La documentacin facilitada por el laboratorio Novo-Nordisk, suministrador de la
lipasa cruda e inmovilizada de Rh.mehei, indica que en la reaccin test de hidrlisis de
tributirina la temperatura ptima de trabajo para la lipasa cruda es de 35-50W y para la
250

Resultados y Discusin

misma lipasa inmovilizada es de 70 0C 251 Estos resultados coinciden tambin con los
resultados obtenidos por Eigtved2 en la reaccin de sintesis de ceras y
en la
reaccin~ de interesterificacin del aceite de coco con estearina de palma, los cuales
observaron que en ambas reacciones la temperatura de mxima actividad de la lipasa
inmovilizada de Rh.rniehei (Lipozyme 1M20) fue 70 0C.
Asimismo, Gandhi y cols.2 llevaron a cabo la reaccin de sntesis del laurato de
laurlo catalzada por la lipasa cruda de Rh.mehei (Lipozymet 10000L), obteniendo la
mxima actividad sintetasa en el intervalo de 40-50 0C, mientras que a 29 0C la actividad era
menor y a 60 0C, aunque el rendimiento de la reaccin es mximo durante las primeras horas
de reaccin, ste se estabiliza y resulta ser muy inferior al rendimiento final obtenido a menor
temperatura.
Aunque la mxima actividad enzimtica de la lipasa inmovilizada se alcanz a 60 0C
y puesto que el intervalo de mxima actividad de la lipasa cruda se encuentra entre 37 y 60
0C la reaccin estndar utilizada en la presente Tesis Doctoral se llev a cabo a 37 0C, con
el fin de evitar la evaporacin del disolvente orgnico y minimizar los procesos de
desnaturalizacin protica, como indicaron Manjn y coL?

IV.6.1.c.1.- Influencia de la temperatura en la enantioselectividad

En las Figuras 69 Y 70 se observ que tanto la lipasa cruda como la lipasa
inmovilizada de Rh.meihei alcanzan los valores mximos de exceso enantiomrico (ee) en el
intervalo de temperaturas 37-600C, produciendose una brusca disminucin de la
enaitioselectividad del proceso a temperaturas superiores.
Con el Fm de estudiar con mayor profundidad la influencia de la temperatura en la
ennatioselectividad de la lipasa de Rh.mehei se represent la variacin del factor de
enantioselectividad (FE) frente a la temperatura (Figura 71)

251

Antiinflamatorios no esteroideos (Al/VEs)

faoto, on.ntiomnoc <FE)
1.60

Li:

A
1.20

INca

0.80

w<

xx

e
0.40

0.00

40

L
60

60

100

tenpettt,w (O)

Figura 71: Variacin de factor de enantioselectividad con la temperatura, para la lipasa de

Rh.mehe cruda e inmovilizada (11M20).
En la Tabla 54 se recogen los valores de exceso enantiomrico (ee), factor de
enantioselectividad (FE) y rendimiento alcanzado en las reacciones realizadas en un intervalo
de temperaturas entre (4 y 100 0C).
Tabla 54: Grado de enantioselectvidad o (ee y FE) y rendimiento (%) de la reaccin de
sintesis del ster butlico de Ibuprofeno (24h), catalizada por la lipasa cruda e inmovilizada
de Rhanzehe.
T

enzima
Temp.

FE

read.
(%)

inmovili
ee<~

FE

(%)

9,90,1

(%)
6,40,2

0,6

11,60,

30

241

261

0,8

412

552

0,8

37

302

402

0,9

453

753

0,9

50

281

411

1,0

564

783

0,6

60

343

422

0,8

621

823

0,5

1,50,1

0,900,03

0,6

491

452

0,4

6,40,1

0,300,01

0,05

271

12,10,5

0,3

(0C)

80
100
(*)

rend.
(%)

enzima

erada

ce dl &d6 reaanent
252

16,10,6

1,2

Resullados y Discusin

En la Figura 71

se observa una correlacin inversa entre el factor de

enantioselectividad y la temperatura para la lipasa inmovilizada de R/trniehei, mientras que

la lipas cruda se produce un aumento lineal de este factor con la temperatura hasta alcanzar
un mximo valor mximo a 50 0C, diminuyendo drasticamente a partir de esa temperatura.
Esta correlacin inversa entre la temperatura y la enantioselectividad, expresada a
travs del coeficiente enantiomrico (E), definido para reacciones de primer orden (ver
1L2.5.b.l.,). se ha observado en otras lipasas como la de C.cylindracea

288

la de Peepacea

289

y la lipasa pancretica porcina290, coincide con las previsiones postuladas por Otto291. Segn
este autor, la disminucin de la enantioselectividad es consecuencia de la deformacin que
sufre la cavidad donde se sita el centro activo de las lipasas al aumentar la temperatura del
medio.
Asimismo se observa que a 37 oc se obtuvo el mismo valor de FE para ambas
enzimas, por lo que la reaccin estndar de sntesis de steres butilicos de cidos (R,S) 2arilpropinicos se llev a cabo a esa temperatura.

IV.6.1.d.- Influencia de la CANTIDAD DE AGUA EN EL MEDIO

Como ya se indic en la Introduccin de la presente Memoria (ver II.2.6.c) el agua
desempea un papel fundamental en las reacciones enziniticas que se desarrollan en medio
orgnico. En la reaccin de sntesis enantioselectiva del ster butlico de (R,S) Ibuprofeno,
catalizada por la lipasa inmovilizada de Rh.miehei (Lipozym& 1M20), la concentracin de
agua en el medio de reaccin es la variable que ms influye en la actividad de dicha enzima
segn se dedujo en el estudio de las variables de operacin tras aplicar la metodologa del
Diseo estadstico de Experimentos. Segn este estudio, la presencia de agua en el medio es
muy perjudicial para la actividad sintetasa de esta lipasa (b

0 = -25,9; ver Tabla Si), No

3, la cuestin principal consiste en determinar la

obstante, como indicaron Zaks y Klibanov

minima cantidad de agua necesaria para que una determinada enzima mantenga su
conformacin nativa y, por tanto, su actividad. Por ello hay que analizar y considerar la
hidrofilia del soporte y del medio de reaccin.

253

Antiinflamatorios no esteroideos (AJNEs)

El soporte del derivado LipozymJ 1M20 es una resma de intercambio aninico, que
fue especficamente seleccionada con el fm de que fuera capaz de retener el agua esencial
para la lipasa de~ Rh.miehei98. El contenida en agua de Lipozymet 1M20 es de
aproximadamente un 10% (p/p), concentracin ptima para el desarrollo de la actividad de
este derivado en medio orgnico251.
La cantidad de agua que contiene el derivado 1M20 se cuantific siguiendo dos
metodologias:
*

la tcnica de Karl-Fische~

el mtodo descrito por Rizzi y cols.293 que se basa en el secado del derivado

mmovilizado, durante 48 h, en un desecador a vacio que contiene

>2v,

en polvo (ver Ifl.9.2.).

La medida de la cantidad de agua perdida se hizo por diferencia de pesada, antes y despus
de calentar el derivado desecado durante 3h a 105 oc en un horno.

Tabla 55: Contenido en agua del derivado inmovilizado (1M20) de la lipasa de Rh.miehe
MIETODO

contenido en agua (%)

Karl-Fischer

9,8 %

secado a vaco con P

20,

8,6 %

El resultado obtenido por ambas metodologas fue similar, alrededor de un 10 % ~/p),

251.
como se describe en la bibliografa
IV.6.1.d.1.- Isotermas de adsorcin
Con el Fm de establecer la cantidad de agua esencial para el desarrollo de la actividad
de la lipasa de Ritmehe se utiliz un mtodo sencillo que permitiera establecer las
condiciones ptimas de hidratacin, en trminos de actividad de agua (a.), que requiere esta
enzima para desarrollar al mximo su actividad. Para ello se realiz la isoterma de adsorcin
de la lipasa de Rh.meher inmovilizada (Lpozym 1M20) tanto en aire, como en ciclohexano,
disolvente orgnico utilizado en la reaccin estndar de sintesis de steres.

254

Resu hados y Discusin

060

0.50

y.)

n,as
a,ad,a-o

~O.AO

ci

E
e

0.30

O
O.),>

ci

eci

0.20

0.40

0.60

acdvldad de agua (i4

1 00

Figura 72: Isotermas de adsorcin de la lipasa inmovilizada de Rh.ndehei (IM2S) con y sin
1 ml de ciclohexano anhidro.
Puede observarse en la Figura 72 como las isotermas de la lipasa inmovilizada (1M20)
realizadas en aire y en ciclohexano se cruzan en a.~

0,3, lo que implica un cambio de

tendencia del sistema para valores de a~ por encima y por debajo de ese valor.
Para bajos niveles de hidratacin (a~< 0,3), tanto el ciclohexano seco como el derivado
1M20 adsorben agua, por lo que la isoterma en ciclohexano va por debajo de la isoterma en
aire. Por el contrario, para valores de a.~ > 0,3, el cclohexano se encuentra saturado de agua.
y rechaza las nuevas molculas que se van aadiendo. Debido a este comportamiento del
disolvente, para una determinada cantidad de agua aadida se alcanza un valor de a~ muy
superior en el sistema en aire20
Segn lo observado por Valivety y cok.20 la isoterma del derivado inmovilizado
Lipozyme> 1M20 es similar a la isoterma de la resma de intercambio aninico, soporte de este
derivado inmovilizado. Por tanto, en este la mayora de las molculas de agua se adsorben
sobre la superficie libre del soporte, siendo posteriormente distribuidas a las molculas de
protena adsorbidas en su superficie.

255

Antiinflamatorios no esteroideos (ANEs)

Para comprobar el grado de influencia del soporte en la adsorcin de molculas de

agua se realiz la isoterma de la lipasa cruda de Rh.miehei (Lipozyme~ 10000L) en aire y en
ciclohexano anhdr. Esta lipasa es una disolucin acuosa y presenta un elevado contenido
en azcares, por lo que fue extremadamente complejo liofilizara, ya que no se pudo congelar
por procedimientos convencionales. Aunque fmalmente se logr desecar congelndola a -180
con nitrgeno lquido (ver 111.9.2.).

En la bibliografa se recogen algunas isotermas del derivado inmovilizado de

Rh.miehei (Lipozyme~ 1M20)09212 pero no se ha encontrado ninguna informacin acerca
de la lipasa cruda de Rltmiehet, debido probablemente a las dificultades experimentales antes
mencionadas.

1.80

()

1.60

1.40

1.20

Q)

1
u
o,

Eo,
m
o,

ff~ agta

1.00

0.80

0.60
0.40

0.20
0.20

0.40

0.60

0.80

1 .00

0.00
0.00

aodvf dad de agua (alt)

Figura 73: Isotermas de adsorcin de la lipasa cruda de Rh.nuiehei con y sin 1 ml de

ciclohexano anhidro.
Las isotermas de la lipasa cruda de Rh.mehe en aire y en ciclohexano son muy
similares, lo que indica que en este caso las molculas de agua no son captadas por el
disolvente oxgnico sino por las protenas. En las primeras fases de la isoterma al aadir

256

Resultados y Discusin

pequeas cantidades de agua se producen importantes variaciones en el valor de

lo que

indica que la enzima cruda, forzada a llegar a un extremo de deshidratacin muy acusado
tiende & rehidratarse con avidez, fenmeno que en parte es dificultado por la presencia del
disolvente, pus ste rechaza las molculas de agua y provoca que la rebidratacin de la
enzima sea ms dificil. No obstante, este fenmeno es mucho ms acusado que en e] caso del
derivado inmovilizado ya que para alcanzar un valor de a. superior a 0,4 es necesario aadir
mayor cantidad de agua a la lipasa cruda, como se observa en la Figura 74, en la que se
superponen las isotermas de ambas enzimas.

1.40

1.20

1.00

u
0.80
ci

E
ci

0.60

ci

0.40

0.20

0.00
0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

cvfad de agua (a.~

Figura 74: Isotermas de la lipasa de RA.miehel cruda e immovilizada, con 1 ml de

ciclohexano anhidro.
Como se observa en la Figura 74 la primera parte de ambas isotermas es semejante,
pero a partir de aproximadamente a~= 0,4 las isotermas se separan. Este hecho ndica que en
la primera fase de la isoterma, correspondiente al agua fuertemente ligada a la enzima el agua
se adsorbe preferentemente sobre la protena, pero a partir de una actividad de agua superior
a 0,4 las molculas son aceptadas por el soporte, por lo que la isoterma del derivado
inmovilizado crece ms lentamente.

257

Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs)

17V.6A.d.2.- Influencia de la a~ en la actividad de la lipasa de Rh.miehei.

Para analizar la influencia de la actividad de agua del biocatalizador en el desarrollo
de la reaccin de sntesis del ster butilico de Ibuprofeno en ciclohexano se siguieron dos
metodologas:
a).- pre-equilibrando la lipasa a un determinado valor de a~
b).- sin pre-equihbnar la lipasa a un determinado valor de a.~

A).- Pro-equilibrio de la lipasa de Rh.pnehez a un determmado valor de a~

A continuacin, se realizaron una serie de reacciones, ajustando y equilibrando
previamente ambas lipasas a determinados valores de actividad de agua (0,3; 0,5 y 0,8).
En las Figuras 75 y 76 se representan los rendimientos de la reaccin atndar de
sntesis de la lipasa cruda e inmovilizada de R.h.rniehez para determinados valores de a,~.

mndmanft on ~ater t~)

1.20

50

100

150

200

250

300

U.mpc (IPwu.~>

Figuras 75: Rendimiento de las reacciones de sntesis del ster butlico de Ibuprofeno
catalizadas por la lipasa cruda de Rh.miehei pro-equilibrada a valores de a.~ de 0,3; 0,5 y 0,75

258

Resu hados y Discusin

ra,dml.nto en .ter <~)

120

100

80

60

20

40

Guapo <bodugI

80

60

Figuras 76: Rendimiento de las reacciones de sntesis del ster butlico de Ibuprofeno
catalizadas por la ~pasainmovilizada (1M20) de Rhsniehei pre-equilibrada a valores de a~
da 0,3; 0,5 y 0,75.
En la Tabla 56 se recogen los valores de rendimiento y exceso enantiomrico de las
reacciones de sntesis ajustadas a un determinado valor de a~.

Tabla 56: Rendimiento y exceso enantiomrico de la reaccin de sntesis del ester butlico
de Ibuprofeno catalizada por la lipasa de Riuniehez cruda e inmovilizada, ajustadas a valores
de a~ de 0,3; 0,5 y 0,8 respectivamente (tiempo reaccn= 72 h).
enzima

cruda

enzima
rend (%)

inmnoviliza

rend (%)

ce (%)

ee (%)

a.~= 0,3

0,3030,005

0,390,0]

951

713

=0,5

0,420,06

0,240,01

871

793

a~ 0,75

0,320,03

0,180,007

881

692

En la Tabla 56 se observan notables diferencias en la actividad de la lipasa cruda e

inmovilizada de Rh.miehei. El redimiento de la reaccin catalizada por la lipasa cruda
deshidratada es practicamente nulo tras 72 h de reaccin, por lo que se d~aron transcurnr

259

Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs)

estas reacciones durante 262 h, aunque el rendimiento alcanzado fue de aproximadamente el

1 % para todas las actividades de agua analizadas, como se observa en la Figura 75. Esta
prdida de actividad debe ser consecuencia de las condiciones tan drsticas de desecacin a
que fue sometida la lipasa cruda, que provocaran importantes alteraciones en la conformacin
de la lipasa, que no se recuperaron a pesar de la rehidratacin de la enzima. Esta lipasa,
aunque muestra una tendencia ascendente en cuanto a su actividad a tiempos muy largos de
reaccin, solamente llega al 1% de rendimiento.
Por el contrario, la lipasa inmovilizada incrementa su actividad de forma espectacular
tras equilibrara hasta valores fijos de a~ (Figura 76). Aunque las diferencias en cuanto al
rendimiento de las reacciones, a diferentes valores de actividad de agua, son insignificantes,
como se observa en la Figura anterior, al analizar los resultados recogidos en la Tabla 55 a
un tiempo fijo de 72 h se observa que al aumentar el contenido en agua (a.~= 0,5 y 0,8) se
produce una ligera disminucin de la actividad enzimtica, como ya fue descrito por Mono?96
debido a que para elevados valores de la preparacin enzimtica est tan hidratada que
se obstaculiza la libre difusin de los sustratos hidrofbicos hasta el centro activo de la
enzima, disminuyendo la velocidad de la reaccin. Asismimo Klibanov y Zaks82 observaron
que cuando se alcanza el lmite de la solubilidad de una determinada enzima en agua las
moculas de enzima tienden a formar aglomerados desprovistos de actividad cataltica. Efectos
similares fueron descritos por Vazquez y cok.270.

B).-

Sin

ore-equilibrio de la lipasa de Rh.nehei a un determinado valor de a.~

Para estudiar el comportamiento del sistema con diferentes valores de agua se procedi
a realizar una serie de experimentos consistentes en cuantificar el rendimiento de diferentes
reacciones de esterificacin de Ibuprofeno con butanol en ciclohexano (ambos previamente
desecados (ver hL 1.2), utilizando como biocatalizador diferentes preparaciones del derivado
mmovilizado 1M20, desecado y con un exceso de agua, con el Fm de compararlos con el
comportamiento del sistema habitual, esto es, el derivado 1M20 utilizado sin manipulaciones
previas.

Para poder establecer un parmetro relativo que defina la cantidad de agua que lleva
el derivado 1M20, se utiliz el valor de .bin sea medido directamente, o bien a travs de
260

Resultados y Discusin

la isoterma correspondiente, a partir de la lectura del valor de a~ segn el contenido en agua

del sistema.
As en la siguiente grfica (Figura 77) se muestran las conversiones obtenidas con 3
sistemas diferentes:
a).- catalizador 1M20 convencional (a~=0,382)
b).- catalizador 1M20 desecado (=
0,138)
e).- catalizador 1M20

mg de agua (a.? 1)

+ 300

1? E<~~

fit~ ~W~Z
(B~l)

mmoles ster sintetIzado

1.3

40

tiempo O~

Figura 77:: Rendimiento obtenido en la reaccin de sntesis del ster butilico de Ibuprofeno,
catalizada por el derivado inmovilizado 1M20 convencional, desecado y con exceso de agua.
Como puede observarse, el resultado obtenido es sensiblemente diferente. As, para

el valor ms bajo de ~
se observa una menor conversin, as como un cierto comportamiento
sigmoidal, con un periodo de inflexin o latencia, mientras que para el sistema estndar (a.r
0,3 82) se observa el caracteristico comportamiento de cintica de pseudoprimer orden. Por su
parte, para el derivado hidratado (=1), el rendimiento obtenido se sita en una zona
intermedia entre los otros dos casos. A la vista de estos resultados se puede concluir que,
cuando el sistema biocataltico se lleva a bajos valores de a.~, a medida que progresa la

261

Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs)

reaccin, esto es, se va formando el ster butlico del Ibuprofeno, al mismo tiempo se va
generando agua. Puesto que en esta zona de la isoterma la curva del sistema en aire queda
por encima de la del ciclohexano se puede considerar que el agua que se va generando es
atrapada por el ciclohexano, y por tanto, no puede rehidratar correctamente a la enzima, por
lo que el rendimiento obtenido no es excesivamente bueno.
Para el caso del catalizador en su estado estndar (=0,3 82), la situacin del derivado
est muy prxima al punto de corte de ambas isotermas del derivado 1M20 en aire y en
cclohexano. Este hecho implica que el agua que lleva el catalizador per se (10% (p/p))25
puede ser compartida entre en catalizador y el disolvente, de forma que se puede considerar
que esta es la zona ptima de trabajo del derivado Lipozyme~ 1M20.
Para elevados valores de ~el agua en exceso, que debera inhibir la reaccin de
smtesis de steres por la ley de accin de masas, es rechazada por el ciclohexano, que no la
disuelve, impidiendo que llegue hasta el biocatalizador, modulando as el efecto inhibitorio
esperado y, por tanto, permitiendo el desarrollo de la sntesis de steres. Vazquez y cok270
mdican que se produce una drstica reduccin de la velocidad inicial de la reaccin de sntesis
del laurato de geranilo, catalizada por Lipozymet 1M20 al saturar este derivado enzimtico
con agua utilizando isooctano saturado en agua como disolvente. El hecho de que el
disolvente est saturado en agua provoca este efecto inhibitorio, ya que la enzima desecada
capta con avidez el agua del disolvente, siendo activa desde el primer momento y provocando
su rpida inhibicin. Las molculas de agua en exceso se colocan alrededor del derivado
mmovilizado formando una serie de capas: segn va aumentando el grosor de estas capas se
dificulta el acceso del sustrato hasta la enzima, debido a la baja solubilidad de estos sustratos
en agua, por lo que se produce una disminucin en la velocidad de la reaccin estudiada por
Vazquez y co/sM70. En nuestro caso, dado que la enzima y el disolvente han sido desecados
previamente, ambos compiten por las molculas de agua, por lo que se produce un perodo
de latencia en la actividad que coincide con la rehidratacin lenta inicial del derivado.
En la Figura 78 se muestran dos microfotografas en las que se puede comparar el
estado del derivado inmovilizado Lipozyme 1M20 antes y despus de la reaccin de
esterificacin, desarrollada en isooctano saturado en agua270

262

Resultados y Discusin

(a)

(h>

Figura 78: Microfotografias en las que se muestra el estado del derivado inmovilizado 1M20,
a tiempo cero (A) y tras la tercera reutilizacin (B). Las flechas sealan las molculas de
270

agua

En la Figura 78B se observan las molculas de agua dispuestas alrededor del derivado
mmovilizado Estas imagenes confirman el efecto fsico del agua al acumularse sobre el
denvado 1M20

En conclusin, para ambas metodologas, sin y con previa equilibracin del derivado
de la lipasa de RJi.mehe inmovilizado por adsorcin sobre una resina de intercambio aninico
(Lipozym& 1M20), se obtienen mejores resultados para valores de a.~ 0,3-0,4 (punto de corte
de las dos isotermas de este derivado en aire y en ciclohexano (Figura 72).
Asimismo, si el derivado mmovilizado 1M20 se pre-equilibra a un determinado valor
de ~
se obtienen mejores conversiones globales que si el catalizador no se pre-equilibra. Esto
indica que en el segundo caso el pre-equilibrio del derivado se produce en el transcurso de
la reaccin de esterificacin, por lo que la velocidad micial de esta reaccin es menor, debido
a la existencia de un periodo inicial de latencia.

263

Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs)

IV.6.1.e.-. Influencia de la RELACION MOLAR DE SUSTRATOS (cido/alcohol

Para estudiar la influencia de la concentracin de los sustratos de la reaccin de
sntesis de steres, catalizada por la lipasa de Rh.miehei cruda e inmovilizada (1M20) se
realizaron una serie de reacciones en las que se vari la concentracin de uno de los dos
sustratos de la reaccin estndar de sintesis (cidoz= (R,S) Ibuprofeno y alcohob butanol),
manteniendo constantes las otras condiciones de reaccin.
Sin embargo, la cuantificacin de las reacciones se llev a cabo de forma distinta,
monitorizando la disminucin de la concentracin de cada enantimero del cido (LS)
Ibuprofeno por HPLC con columna quiral (ver IILS.3.). La determinacin del rendimiento de
la reaccin se realiz considerando la disminucin de la concentracin de cada enantimero
del cido durante el transcurso de la reaccin. Para dicha determinacin se hizo una
calibracin previa obtenida al representar las reas integradas de cada enantimero en los
cromatogramas correspondientes frente a la concentracin de cada ismero (Figura 79). El
clculo de la concentracin de cada enantimero se hizo dividiendo entre dos la concentracin
total de cido utilizado. En la Figura 79 se representa la recta de calibrado, que result ser
la misma para los dos enantimeros, dado que el cido de partida es una mezcla racmica.

rea enantm.ra
1E+7
1

SE+6

GE+6

rea enantimero=(l,2+0,02)lOE+7 * [Pv!]+ (3,3+0,5)IOE+5

N= 58
R= 0,979
ttab. 1,67
texp. 51,2
F tab.= 2,79
E exp. 2625

L
fi

4E+8

2E+6

3=

OE+0
0.00

0.20

0.40

0.60

0.60

concentracin enantinero fbi)

Figura 79: Recta de calibrado para determinarla concentracin de cada enantimero del (R,S)
Ibuprofeno.

264

Resultados y Discusin

[V.&l.e.1.- Estudio de a variacin de concenfracin de butanol

En una primera serie de reacciones se vari la concentracin de butanol en un
intervalo comprendido entre O,l25M y l,25M
0.09
0.08
0.07
0.06
o

<a
<u

0.05

o
b

0.04
0.03

0.02
0.01
0.00
0

50

100

150

200

250

50

100

150

200

250

150

200

250

t(h)

t(h)
0.09

0.09

0.08

0.08

0.07

0.07

0 08

~0.06

0.05

~a. os
b 0.04
<u

~0.04
u
<u
-0.03

~0 03

0.02

0.02

0.01

0.01

0.00

0.00
0

50

100

150

200

250

Kb)

50

100

t(h)

Figura SO: Disminucin de la concentracin de los ennatimeros R y S del (R,S) Ibuprofeno

en el curso de la reaccin de esterificacin con butanol, catalizada por la lipasa cruda de
.Rh.miehei. Variacin relaciones molares cido/alcohol: 1/1; 1/2; 1/5 y 1/10.

265

AntiinjZamatorios no esteroideos <AINEs)

La concentracin de (R,S) Ibuprofeno se mantuvo constante a 0,1 25M; esta serie de

reacciones fueron catalizadas por la lipasa cruda de Rh.miehef. Las curvas representadas en
la Figura SO, en las que se reperesenta la disminucin de la concentracin de cada
enantimero del cido durante la reaccin de sntesis del ster butlico se ajustaron a un
modelo exponencial decreciente: [cido R o S] = A ekt, utilizando el programa EXiFIT, dentro
del paquete integrado SIMFIT versin 4.0

254

De esta forma se calcularon las velocidades

iniciales (V0) de disminucin, que se inidean tambin en la Figura 80.

De igual forma, se realiz una serie de reacciones de esterificacin con

concentraciones variables de butanol, catalizadas por la lipasa inmovilizada de Rh.miehei
(IMZO), que fueron seguidos con la msima metodologa.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 81, en la pgina siguiente.

266

Resultados y Discusin

0.09

0.09

0.08

0.08

0.07

0.07

0.06

0 06

0.05

5~0.05

u 0.04
<u
-4
0.03

-0.03

0.02

0.02

0.01

0.01

0.00

0.00

~0.04
<u

50

100

150

200

20

40

t(h)

60

80

100

t(h)

0.09

0.09

0.08

0.08

0.07

0.07

0.06

0.06
~005

o 0.05

o.

0.04

~0.04

~~003

<u
~003

0.02

0.02

0.01

0.01

0.00

0.00

<u

50

100

150

200

t(h)

50

100

150

200

t(h)

Figura 81: Disminucin de Ja concentracin de los ennatimeros R y 5 del (R,S) Ibuprofeno

en el curso de la reaccin de esterificacin con butanol, catalizada por la lipasa inmovilizada
Rh.miehei (1M20). Variacin relaciones motares cido/alcohol: 1/1; 1/2; 1/5 y 1/10.

267

Antiinflamatorios no esteroideos (Al/VEs)

Tal y como se indic en la seccin 1L2.S.b.1., a] comentar los parmetros de

enantioselectividad descritos en la bibliografa se hizo referencia al coeficiente de
enantioselectividad (E), que correlaciona las velocidades de conversin de dos enantimeros
de un sustrato en condiciones de primer orden. Este coeficiente, para el estudio llevado a cabo
en la presente Tesis Doctoral, corresponderla

al cociente obtenido al dividir los valores de las

velocidades iniciales de esterificacin para cada ismero. Los valores obtenidos aparecen en
la Tabla 57.
Tabla 57: Velocidades iniciales (Milt) de esterificacin de das ismeros del (R,S)-Ibuprofeno,
al variar la concentracin de butanol. [(R,S)-Ibuprofeno1~~~
= O,125M (constante).
enzima
cid/OH
1/1

cruda

enzima

Inmoviliza

V
0(7R)
VS)
(Mli)
(Mli)
(1,51O,O6)1O~ (2,340,O8)1O-~

E
15,5

1JR)
(Mli)
(1,90,3)I0~

V,(S)
1)
(N01
(1,150,01)10.2

E
6,0

/2

(I,70,2)10~

(5,550,03)10-

32,6

(1,10,4)10-

(6,440,01)10-

5,7

1/5

(1,53O,3)1O~

(1,20,2)10-

7,8

(1,50,2)10-

(7,8O,4)10

5,2

1/10

(5,70,5)l0-~

(1,66O,02)I0~

29,1

(2,70,9)I0~

(2,90,08)10-

10,7

Tras estudiar los resultados obtenidos, se observa como los efectos inhibitorios del
exceso de alcohol se manifiestan fundamentalmente para elevadas concentraciones del mismo
(relacin 1/lo), en el caso del enantimero R, mientras que para el enantimero 5, sobre el
que la esterificacin transcurre de forma ms enantioselectiva, dichos efectos se observan a
menores concentraciones de butanol, concretamente, para la relacin 1/5 al utilizar la lipasa
cruda y para la relacin 1/2 en el caso de la lipasa inmovilizada (1M20). En la bibliografa
se recogen296 los efectos inhibitorios del butanol sobre la lipasa inmovilizada, el cual se
atribuye al hecho de que se produce la sustitucin de molculas del escudo de agua que rodea
a la lipasa por molculas de butanol, provocando un cambio en la constante dielctrica del
medio y, por tanto, desnaturalizando la enzima.
Del mismo modo, Chulalaksananukul y cols.2 analizaron el efector inhibitorio del
exceso de alcohol, etanol en su caso, en la reaccin de esterificacin del cido olico,
catalizada por

la lipasa inmovilizada de Rh.mehe (1M20). Estos autores plantearon el hecho

de esta inhibicin como resultado de la imposibilidad para formar el complejo acil-enzima.

268

Resultados y Discusin

No obstante, Vazquez y cols.270 no observaron niguna inhibicin por exceso de geraniol en

la esterificacin del cido lurico catalizada por LipozymJ 1M20.

Tras el estudio realizado en la presente Tesis Doctoral, cuyos resultados se recogen
en las Figuras 80 y 81 y en la Tabla 57, se observa, como ya se indic, que el efecto
inhibidor del butanol a elevadas concentraciones es ms acusado para la lipasa inmovilizada
(1M20). Por otra parte, para la lipasa cruda, un aumento de la concentracin al doble (relacin
1/2) produce una mejora en la enantioselectividad de la enzima, obtenindose un incremento
del doble en el valor del parmetro de enantioselectividad (E). En condiciones 1/10, el
comportamiento enantioselectivo de la lipasa cruda es muy bueno (E

29,1), aunque a costa

de perder mucha actividad.

En conclusin, se puede pensar que dado que el paso determinante de la velocidad de

reaccin es la formacin del complejo acil-enzima, se puede suponer que la sustitucin de
molculas de agua por butanol en el microentomo del biocatalizador parece favorecer la
interaccin de la lipasa cruda de RJa.miehej con el enantimero S(+) de Ibuprofeno, hasta una
relacin de sustratos (1:2), disminuyendo la actividadpara concentraciones mayores; mientras
que en el caso de la lipasa inmovilizada (1M20) no se observan efectos tan acusados.

W.6.1.e.2.- Estudio de la variacin de la concentracin de (R.S) Ibuprofeno

Adems de analizar la influencia de la variacin de alcohol en la actividad de la lipasa
de Rh.mtehe cruda e inmovilizada se estudi la influencia en el rendimiento de ambas lipasas
de la variacin de la concentracin de cido.
El procedimiento experimental seguido fue el mismo, pero en esta serie de reacciones
no se pudo llevar a cabo la reaccin con una concentracin de cido 1,25 M (relacin 10/1),
catalizada por la lipasa inmovilizada (Lipozym& 1M20), porque se form un aglomerado que
impidi el desarrollo normal de la reaccin.

En las Figuras 82 y 83 se representa la evolucin de las reaccines de esterificacin

con diferentes concentraciones de (R,S) Ibuprofeno. en un intervalo de concentraciones entre
O,125M y l,25M, catalizadas por la lipasa cruda de Rh.miehei (Figura 82) e inmoivlizada
(1M20) (Figura 83). En todas estas reacciones se mantuvo constante la concentracin de
butanol en 0,125M.
269

Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs)

0.40
0.35
0.30

0.90

0.80

~ C~.!

.7

0~TO
0.60

0.25
ph;

1-;

0.20

u
<u

<a>

<u 0.15

-e

REUCION 3/1

0.10

0.05
0.00

50

ACIDOR

ACIDOS

150

100

200

250

50

t(h)

100

150

200

250

150

200

250

t(h)

0.09

0.20

0.08

0.18

0.07

0.16
0.14

0.06

0.12

~0. 05

0.04

0.10

1>

<o 0.08

<u
-~0.03

-.4

0.06

0.02

0.04

0.01

0.02

0.00

0.00
0

50

100

150

200

250

50

100

tal)

t(h)

Figura 82: Disminucin de a concentracin de los enantimeros R y 5 deI (R,S) Ibuprofeno

en el curso dc la reaccin de esterificacin con butano!, catalizada por la lipasa cruda dc
RI.&miehei. Variacin relaciones molares cido/alcohol: 1/1; 1/2; 1/5 y 1/10.

270

Resultados y Discusin

0.40
0.35
0.30
0.25
ph;

<a>

1.~
<U

0.20
015
0.10
0.05
0.00
0

50

100

200

150

ti)
0.09

0.20

0.08

0.18

0.07

016

~0.06

014

~O05
0

0.12
0010

.0.04
<u
~0 03

0.08

0.02

0.06
0.04

0.01

0.02

0.00

0.00
0

50

100

150

200

tal)

50

100

150

200

t(h)

Figura 83: Disminucin de la concentracin de los enantimeros R y S del (R,S) Ibuprofeno

en el curso de Ja reaccin de esterificacin con butanal, catalizada por Ja lipasa inmovilizada
de Rh.miehei (1M20). Variacin relaciones molares cido/alcohol: 1/1; 2/1; 5/1.

271

Antiinflamatorios no esferoides (Al/VEs)

En esta serie de reacciones tambin se ajustaron las curvas representadas en las Figuras
83

y 84 a un modelo exponencial simple y se calcularon las velocidades iniciales de

desaparicin de cada enantimero del cido en cada reaccin, todo ello con el programa
EXFIT. Asimismo, se determin el coeficiente de enantioselectividad (E) de cada reaccion.
Los resultados obtenidos aparecen en la Tabla 58.

Tabla 58: Velocidades iniciales (MIt) de esterificacin de los dos ismeros del (R,S)
Ibuprofeno, variando su concentracin inicia]. [butanol] ~ 0,125M (constante).

acM/OH

1/1

enzima

cruda

4(R)
(Mb4)

4(S)
~I)

(1,510,O6>I0-~ (2,340,08)10- 15.5

2/1

(1,30,2)1O~

(3,430,01)10- 26,4

511

(4,00,2)10-

>100

10/1

(4,30,2)10-

>100

enzima

umovdlza

4(R)
(Mli)

4(5)

(1,90,3)10-

(1,510,O6)1O~

6,0

(1,80,2)10-

(1,510,06)10-2 7,06

(4,70,9)10-

(1,510,06)10-

>100

Como puede observarse, para el ismero R el efecto obtenido al aumentar la

concentracin de (R,S) Ibuprofeno es bastante similar para el caso de la lipasa de Rh.mzehei
cruda e inmovilizada (1M20), ya que practicamente deja de ser utilizado par ambas enzimas,
Esto es debido a que al estar el cido en exceso las enzimas utilizan el enantimero preferente
5, sin necesidad de utilizar el otro enantimero R.
Por otra parte, para el ismero S, s se observan comportamientos diferentes de las dos
enzimas. La enzima inmovilizada (1M20) se inhibe por exceso de cido a partir de una
relacin 5/1. Este hecho coincide con los resultados obtenidos por Vazquez y cola.0, que
tambin obervaron un efecto inhibidor del cido en la reaccin de esterificacin del cido
lnrico con geraniol, catalizada por la lipasa inmovilizada de Rh.mehei (Lipozynie 1M20).
No obstante, la enzima cruda no es inhibida por el exceso de cido.

Para visualizar mejor los resultados obtenidos en todas las reacciones estudiadas (en
en la serie de variacin de cido y en la serie de variacin de alcohol) catalizadas por la
lipasa de Rh.miehei cruda e inmovilizada (1M20) se realiz la Figura 84, en la que se recoge
de forma conjunta los datos expuestos en la Tablas 57 y 58.

272

Resultados y Discusin

-mm-

0.014

0.014

0.012

0.012

0.010

0.0 10

0.008

mt
-0.008

0.006

go.oos

0.004

0.004

0.002

0.002

0.000

0.000

>1

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

10

12

1.4

0.0

0.1

i~~

-I

0.3

04

0.5

0.6

0.7

fibuprofono), M

butanol), M
0.006

0.2

0.006

e
0.005

LIPOZVMS 100001
ESTERR

0.005

ESTER E

0.004

0.004

mt

o-

003

~.003

>1

0.002

0.002

cl
0.001-

0.001

~[1
a-

0.000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.000

1.2

0.0

1.4

(butanol), M

0.1

0.2

0.3

04

05

06

fibuprofeno), M

Figura 84: Representacin de la velocidad inicial de cada reaccin frente a la concentracin del
sustrato cuya concentracin yana.

273

qq

Antiinflamatorios no esteroideos <AINEs)

Como puede observarse en la Figura 84, para la enzima cruda al aumentar la

concentracin inicial de (R,S) Ibuprofeno se observa un aumento de la velocidad inicial de
esterificacin del S(-4-> Ibuprofeno, con un comportamiento perfctamente michaeliano, por lo
que se calcularon las corerspondientes constantes cinticas (V~~ = (4,70,1)o3 Mil y KM

(5,70,6)10.2 M))

Se logra as un gran aumento de la ennatioselectividad de la lipasa cruda de Rh.miehei

para altas concentraciones de cido (E>100), pero de forma diferente a la serie de reacciones
de variacin de la concentracin de alcohol, pues en este caso tanto la enzima cruda como
la inmovilizada mantienen su actividad muy elevada.

Como conclusin de este apartado es de destacar el gran aumento de la

enantioselectividad y conversin logrado para las reacciones catalizadas por la lipasa cruda

de Rh.mehe al aumentar la concentracin inicial de cido. Este efecto no es tan acusado para
la enzima inmovilizada 1M20, puesto que existe un efecto inhibidor al aumnetar la
concentracin de cido, lo cual puede ser debido a problemas de solubilidad en condiciones
5/1 y que imposibilit el desarrollo de la reaccin de relacin de sustratos 10/1

lV.6.2.- ESTUDIO DE LAS VARIABLES CONTINUAS O ESTRUCTURALES

Las variables continuas o estructurales analizadas fueron

a).- el disolvente orgnico
b).- los sustratos:

el alcohol
el cido (R,S) 2-arilpropionico

Para este estudio se utiliz la metodologa OVAl, segn la cual se modifica una
variable, la que es objeto de estudio, mientras las dems permanecen constantes.
Asimismo, se analiz la influencia de la variacin de estas variables tanto en el
rendimiento de la reaccin estndar de sntesis del ster butilico de Ibuprofeno, como
la enantioselectividad de dicha reaccin.

274

en

Resultado y Discusin

IV.6.2.a.- Influencia de ti naturaleza del DISOLVENTE ORGNICO

De acuerdo con lo indicado en la bibliografa (ver 1L2.6.) se eligi como disolvente

de la rea?ccin estndar de sntesis de steres un disolvente apolar, el ciclohexano (logP = 3,2),
ya que se ha comprobado que las lipasas requieren un medio fuertemente apolar (logP

> 2)

para mantener la capa de agua esencial para el mantenimiento de su conformacin nativa y,

por tanto, de su actividad298.
IV.6.2.a.1.- Influencia en el rendimiento.
Asimismo, se analiz la influencia de la naturaleza del disolvente orgnico en la
actividad de la lipasa de Rh.miehei cruda e inmovilizada, relacionando los resultados
obtenidos en estas reacciones con dos parmetros fisicos de los disolventes orgnicos; el logP,
parmetro de polaridad, que se define como el coeficiente de particin en un sistema
octanol/agua)299 y el Volumen molar <y,), parmetro estrico que equivale al volumen,
expresado en litros, que ocupa un mol de disolvente. Este ltimo parmetro indica la
capacidad de solvatacin de un determinado disolvente

299

(Tabla 59).

Tabla 59: Disolventes orgnicos utilizados, valor de sus corespondientes logP y volumen
molar (Vm) y rendimiento de las reacciones de sintesis del ster butilico de Ibuprofeno en cada
disolvente (72h).
DISOLVENTE

log?

VM

dimetilformamida

-1,0

0,08

enz.cruda

enzinnov

dioxano
acetonxtnlo

isobutilmetilceto

1,4

0,05

diisopropilter

2,03

0,14

1,1,1-tuicloroetano

2,49

0,10

11,50,7

422

tolueno

741

572

ciclohexano

651

661

hexano

544

721

heptano

503

42,90,3

iso-octano

492

731

275

cidos (R,S) 2-arifpropinicos <ANEs)

Para analizar la influencia de cada parmetro en el rendimiento de la reaccin se

utiliz el programa estadstico STATGRAPH269; obtenindose las correspondientes matrices
de correlacin (Tablas 60 A y B)):

Tablas 60: Matrices de conelacin de los rendimientos de a lipasa cruda (A) e inmovilizada
(B) de Rh.miehei.
enzima cruda

read.
IogP

enzima inmovilizada (1M20)

rend.

cg?

VM

0,79

0,38

rend.

0,82

cg?

VM

rcnd.

IogP

VM

0,89

0,61

0,82

VM

El parmetro ms influyente en la actividad sintetasa de ambas lipasas es el logP,

parmetro que determina el grado de polaridad de cada disolvente orgnico.
A continuacin, se hizo un ajuste por regresin lineal de dicho parmetro con los
valores de rendimiento obtenidos para cada lipasa. Las ecuaciones de las rectas son las
sigmentes:

1).- Ajuste rendimiento

logP del disolvente.

La.- linasa cruda de R.mehei

rendimiento (%) = (132)logP + (8.5)
n = 33
R = 0,613
t~=7

31 (aO 05) =

[36]

1 70

FIJI(~~..OO

~SND.xC49

5)

289

Ib.- lipasa inmovilizada de R.miehei

rendimiento (%)
n 33

(151)logP
E.

+ (83)

t cxp =11

0,793
(-O 05>

118

170

F131(=035)= 2,89

276

[37]

Resultado y Discusin

En las Figuras 85 A y B se representan las rectas, limites de confianza y lmites de

predicci obtenidos en el ajuste por regresin lineal del rendimiento de cada lipasa en la
reacciir de sntesis del ster butlico de Ibuprofeno frente al logP de los disolventes
analizados.
100

100

_____

(IAl

<

fi

a2

If

160
1i

140

c
0

II

<7

~.

II
60

40-

7<

<7 ~<

20

207

4
7

-2

-1

7
i

<7

~o-

<1

30

<Y

cg P

.1

ej

cg P

Figura 85: Ajuste por regresin lineal de la actividad de las lipasas cruda (A) e inmovilizada
(B) de la lipasa de Rh.miehe frente al log 1 de los disolventes analizados.
Tras analizar la influencia de la polaridad de diferentes disolventes en la actividad de
la lipasa de Rh.mxehe libre e inmovilizada se obtuvo una mejor correlacin (R

0.793)

para

la lipasa mmovilizada de Rh.tniehe, ya que la actividad sintetasa de esta enzima est

directamente relacionada con el caracter apolar del disolvente. Esta correlacin fue menor para
la lipasa cruda (E. = 0,613), ya que la mxima actividad se alcanz con el tolueno (logP =
2,5), y fue disminuyendo ligeramente al aumentar el caracter apolar del medio.

Tanto la lipasa libre como la lipasa inmovilizada de Rh.mehei fueron inactivas con
disolventes poares (dimetilformaimda, dioxano, isobutilmetilcetona y acetonitrilo), con logP
inferior a 2; ya que estos disolventes extraen el agua esencial de la lipasa, provocando la
alteracin de la conformacin nativa de la protena300. Estos res~tados coinciden con lo
indicado por Mille? y Svanholm285 en la reaccin de sntesis del miristato de propilo y
Manjn2 en la sntesis del butirato de etilo. Estos autores trabajaron con la lipasa
inmovilizada de Rhanehez y observaron una marcada diferencia en la actividad de dicha

277

Acidos (R,S) 2-arilpropinicos (AINEs)

enzima en funcin de la naturaleza del disolvente, ya que pasaba de ser practicamente inactiva
con disolventes apolares y muy activa con los disolventes ms apolares.

IN.6.Z.a.2.- Influencia en la enantioselectividad

A continuacin, se analiz la influencia de la naturaleza del disolvente orgnico en la
enantioselectividad de la lipasa de Rh.mehe cruda e inmovilizada. Estos resultados y los
parmetros fsicos de cada disolvente logP y Vm se muestran en la Tabla 61.

Tabla 61: Disolventes orgnicos utilizados, valor de sus corespondientes logP y volumen
molar (Vm) y rendimiento de las reacciones de sntesis del ster butilico de ibuprofeno en cada
disolvente (72h).

DISOLVENTE

Iogl>

VM

enz.cruda
(ee %)

enz.inmov.
(ee %)

dimetilformamida

-1,0

0,08

dioxano

-0,4

0,09

acetonitrilo

-0,33

0,13

isobutilmetilceto

1,4

0,05

diisopropilter

2,03

0,14

9.90,5

32,60,3

1,1,1-tricloroetano

2,49

0,10

47,20,2

671

tolueno

2,5

0,11

534

541

ciclohexano

3,2

0,11

683

854

hexano

3,5

0,13

683

801

heptano

4,0

0,15

722

662

so-octano

4,5

0,17

482

773

Utilizando el programa estadstico STATGRAPH269 se obtuvieron las siguientes

matrices de correlacin (Tablas 62 A y B):

278

Resallado y Discuswn

Tabla 62: Matrices de correlacin de la enantioselectividad de la lipasa cruda e inmovilizada

de Rh.miehe
enzima cruda

ce
ogP
=

enzima inmovilizada (14420)

ce

logP

VM

0,86

0,50

ce

0,82

iogP

VM

VM

ce

logP

VM

0,90

0,57

0,82

El parmetro ms influyente en la enantioselectividad de ambas lipasas es el logP; por

lo que se puede concluir que tanto la actividad como la enantioselectividad de la lipasa de
.Rh.miehei en la reaccin de sntesis de steres en diversos medios orgnicos depende

fundamentalmente de la polaridad del disolvente orgnico.

Tras el ajuste por regresin lineal del logP con los valores de exceso ennatiomrico
obtenidos se obtuvieron las siguientes rectas:

U).- Ajuste exceso enandomrico

logP del disolvente

1 a lipasa cruda de Rh.mehei

-

exceso enantiomrico (ce) (%) = (14+1) logP

n = 33
R 0,739
t ., =

9,4

t13 1
88

(54)

(74)

(38]

,70

(0,05)

=
(a0,05>

2,89

Ib lipasa inmovilizada de Rh.mzehe

-

exceso enantiomrico (ee) (%) = (171)logP

n=33
R=0,821
12

~1,31 (aO.05>

[39]

1,70

FJ1(~v05)= 2,89

En las Figuras 86 A y B se representan las rectas, limites de confianza y lmites de

prediccin obtenidos en el ajuste por regresin lineal del exceso enantiomrico de cada lipasa
en la reaccin de sntesis del ster butilico de Ibuprofeno frente al IogP de los disolventes

279

cidos (R,S) 2-arilpropinicos <,tINEs)

analizados.
loo

loo

so

so

~1

60

c
o

40

40
e

20

o -2

20

-1

o -2

-1

cg P

cg P

Figuras 86: Ajuste por regresin lineal de la actividadde las lipasas cruda (A) e inmovilizada
(B) de la lipasa de Rh.mehe frente al log P de los disolventes analizados
Analizando los resultados obtenidos con los disolventes ms apolares (logP mayor de
2,49) se observa que el comportamiento de estas dos enzimas es similar. En el caso de la
lipasa inmovilizada (Lipozyme 1M20) se produce un aumento del rendimiento y la
enantioselectividad de la reaccin con la polaridad de los disolventes, coincidiendo con lo
indicado por los autores anteriormente citados285287~01. La lipasa cruda (Lipozym& lOOOOL),
cuyo comportamiento con distintos disolventes no ha sido estudiado anteriormente, alcanza
su mxima enantioselectividad con el tolueno (logP = 2,5), descendiendo ligeramente con los
disolventes ms apolares. Por el contrario, el valor del exceso enantiomrico, parmetro que
determina el grado de enantioselectividad alcanzado, alcanza sus valores mximos con los
disolventes ms apolares. Estos resultados parecen indicar que la lipasa de R.miehei

es ms

enantioselectiva con los disolventes ms apolares (logP > 3), por lo que el rendimiento se
mantiene en tomo al 50%, ya que solo reconoce uno de los enantimeros. Con el disolvente
ms apolar (isooctano; logP

4,5) se produce una disminucin drstica de la

enantioselectividad para la lipasa cruda, debido a problemas difusionales que dificultad el

acceso de los sustratos al centro activo de la lipasa enzima.

280

Res,,liado y Discusin

El

disolvente utilizado en la reaccin estndar de sntesis del ster butilico de

Ibuprofeno fue el ciclohexano (logP = 3,2), disolvente apolar intermedio, con el que se
obtuvieion muy buenos resultados tanto de rendimiento como de enantioselectividad con las
dos lipasas y que adems fueron similares para ambas lipasas.
Para analizar la influencia en el proceso de la naturaleza de los cidos (R,S) 2arilpropinicos se utiliz el diisopropilter, debido a la necesidad de utilizar un disolvente en

el que se solubilizaran estos cidos y la lipasa de Rhmiehei fuera activa.

IV.6.2.b.- Influencia de la CADENA ALCOHOLICA

Con el fm de analizar la influencia de la naturaleza del alcohol en la actividad de la
lipasa de Rh.mehe Se llev a cabo la reaccin estndar de sntesis de steres de (R,S)
Ibuprofeno vanando el tipo del alcohol utilizado.

IV.6.2.b.1.- Influencia en el rendimiento de la reaccin

Si se asume

la fonnacin de un complejo intermedio acil-enzima durante la reaccin

de sntesis de steres, el rendimiento final de la reaccin depender de la accesibilidad del

nuclefilo (alcohol, en este caso) al enlace acil-enzima; de ah la influencia de la naturaleza
del alcohol en el rendimiento de estas reacciones.
En la Tabla 63 aparecen los rendimientos finales (72h) de cada reaccin, expresados

en porcentaje de ester sintetizado y en actividad especfica (nnnol ester sintetizados/mg de

protena).
Tabla 63: Actividad de la lipasa cruda e inmovilizada de R.mzehez en la reaccin de
esterificacin del (R,S) Ibuprofeno con diversos alcoholes (72h).
enzima
ALCOHOL

rend
(%)

cruda

enzim

nmnovil

nunol!
mg prot<~

rend
(%)

mmol/
mg proC~

1-butano]

492

0,024

731

0.025

3-metil-1-butanol

612

0,029

251

0.009

1-octanol

331

0,016

341

0.012

2-propanol

100,1

0,005

ciclohexanol

151

0,007

9 actividad expresada en mmo~es ster sintetizado/mg proteina

281

cidos (R,S) 2-arlipropinicos

En la Figuras 87 A y B se muestra el resultado obtenido con cada alcohol a distintos

tiempos de reaccin.

LIPASA INMOVILIZADA <1M201

LIPASA CRUDA
rendn,I.nto en I.t.T

rendm.nto en te, ~4)

(34>

100

40

Sampa (ho,uq?

20

40

,~ fPica~

60

Figuras 87: Rendimiento de la reaccin de esterificacin del (R,S) Ibuprofeno con distintos
alcoholes, catalizada por la lipasa cruda (A) e inmovilizada (E) de Rh.miehe.
Las lipasas especificas, como la lipasa de R.miehei, catalizan las reacciones de
esterificacin preferentemente con alcoholes primarios, mientras que su actividad es muy
pobre con alcoholes secundarios y, al igual que todas las lipasas, no es activa con alcoholes
terciarios302. Por esta razn, en este estudio de la influencia del alcohol en la actividad de la
lipasa cruda e inmovilizada de R.miehei se analizaron diversos alcoholes primarios de
diferente longitud (1-butanol y 1-octanol) y ramificado (3-metil-l-butanol); alcoholes
secundarios aliftico (2-propanol) y cclico (ciclohexanol), pero no se analizaron alcoholes
terciarios.
En las Figuras 87 A y B se observa que la lipasa inmovilizada de Rh.mniehe
(Lipozyme 1M20) no es activa con los alcoholes secundarios utilizados, mientras que la

282

50

Resuliados y Discusin

lipasa cruda presenta una actividad muy baja con dichos alcoholes, en relacin con la
actividad obtenida con los alcoholes primarios. Resultados anlogos han sido descritos por
SvanhoFm285 en la reaccin de esterificacin del cido mirstico, donde obtuvo rendimientos
del 90% con los alcoholes primarios ensayados y rendimientos del 10% con los alcoholes
secundarios.
Los alcoholes primarios estudiados presentan ms de cuatro tomos de carbono, ya que
los alcoholes primarios de cadena corta como el etanol, debido a su alta hidroflia
(logP = -0,24), ejerce un efecto deshidratante sobre la lipasa, disminuyendo su actividad28~03.
Entre los alcoholes primarios, tanto con la lipasa cruda como con la inmovilizada, los
mejores resultados se obtuvieron con 1butanol y los peores con 1-octanol, debido a la
disminucin de la actividad de la lipasa de Rh.miehei al aumentar la longitud de la cadena
alcohlica.
Miller30 tras analizar la actividad de la lipasa inmovilizada de Rh.nehei (Lipozymet
1M20) en la reaccin de esterificacin del cido mirstica con diferentes alcoholes primarios
(con radicales alquilicos y aromticos en la posicin fr con grupos funcionales polares en esa
misma posicin y diversos alcoholes con insaturaciones y grupos aromticos en su cadena),
lleg a la conclusin de que esta enzima admite una gran variedad de sustratos alcohlicos
debido a que su centro activo est rodeado de una gran zona hidrfoba. Por tanto, los
sustratos ms apolares presentarn una gran afinidad por esta regin, favoreciendo el
desarrollo de las reacciones de esterificacin. No obstante, estas conclusiones deben matizarse
tras analizar los resultados representados en las Figuras 87 A y B, dado el menor rendimiento
obtenido con el 1-octanol (logP = 2.90) respecto al 1-butanol (logP = 0.80). a pesar de su
caracter ms apolar, lo que indica que la longitud de la cadena de los alcoholes primarios es
un factor ms influyente en la actividad de la lipasa de Rkmiehei que la polaridad de los
alcoholes.
Tras este estudio se observ que el alcohol ms adecuado para la lipasa de Rh.miehei,
tanto cruda como inmovilizada, es el 1-butanol, ya que con este alcohol se alcanzaron
elevados y semejantes valores de actividad especfica para ambas lipasas: 0,024 mmol/mg con
la lipasa cruda y 0,025 mmnol/mg con la lipasa inmovilizada.

283

Acidos (LS> 2-arilpropioncos

liV.6.2.b.2.- Influencia en la enantioselectividad

Adems de analizar la influencia de la naturaleza del alcohol en el rendimiento de la
reaccin de esterificacin del (R,S) Ibuprofeno se estudi

su influencia en la

enantioselectividad de dichas reacciones.

En la Tabla 64 aparecen los resultados de exceso enantiomrico (ee) y rendimiento en
ster (%\ obtenidos al fmal de cada reaccin (72 Ii).
Tabla 64: Enantioselectividad de la lipasa cruda e inmovilizada de Rh.miehei en la reaccin
de esterificacin del (R,S) Ibuprofeno con diversos alcoholes (7214
enzima

cruda

enzima

inmov

ALCOHOL

rend (%)

ce
(%)

FE

reud
(%)

ee
(%)

FE

1-butanol

492

482

0,5

731

773

0,3

3-meti-1-butanol

612

792

0,5

251

592

1,8

1-octanol

331

431

0,8

341

763

1,5

2-propanol

100,1

0,400,01

0,03

ciclohexanol

151

30,1

0,1

La enantioselectividad alcanzada en cada reaccin est directamente relacionada con

el rendimiento obtenido, ya que las reacciones de mayor rendimiento son tambin las de
mayor enantioselectividad. De ah que los valores de exceso enantiomrico obtenidos con los
alcoholes primarios sean muy superiores a los obtenidos con los alcoholes secundarios.
Los datos de factor de enantioselectividad (FE) obtenidos con cada alcohol no son
comparables, ya que en algunas reacciones a las 72h de reaccin se ha sobrepasado el 50%
de conversin, mientras que en otras todavia no se ha alcanzado.
El 1-butanol fue el alcohol con el que se obtuvieron mejores resultados con ambas
lipasas, por lo que se utiliz en la reaccin estndar de esterificacin.

284

Resafradas y Discusin

liV.6.2.c.- Influencia del ACuDO (RSi 2-ARILPROPIONICO

A continuacin se llev a cabo la sntesis enantioselectiva de los steres butilicos de
diferents cidos (R,S) 2-arilpropinicos, catalizada por la lipasa de R.h.miehei cruda e
inmovilizada. Debido a la escasa solubilidad de estos sustratos, se utiliz un disolvente lo
suficientemente apolar como para que la lipasa de Rhjniehei puediera desarrollar su actividad
y lo suficientemente polar, como para que todos los cidos estudiados fueran solubles; el
disolvente utilizado que reuna todas estas caractersticas es el diisopropilter (logP = 2,03).
El Naproxeno es el cido S(+) 2-(6-metoxi-2-naftil)propinico, pero en esta seccin
y con el fin de simplificar la nomenclatura utilizada, se engloba dentro de la denominacin
de Naproxeno a los dos enantimeros R(-) y 5 ()del cido (R,S) 2-(6-metoxi-2naftil)propinico.

IV.6.2.c.I.- Influencia en el rendimiento de la reaccin.

En la Figura 88 A y 13 se representa la evolucin de la reaccin de sintesis del ster
butilico de cada cido (R,S) 2-arilpropinico frente al tiempo.
LIPASA CRUrV~ ~
LIPASA INMOVILIZADA (1M201

j\\

9n4

,wndmi ente en leer (3<)

rendmiento I.tu <34)

60

50

16

K.f..-Nartcnero
--..

g9

K.tc2jrd,o

40

L~-~Kn.~

.%
1

-}

12

+2

.3

1/2

+4
.~

.9w

s
0

20

40

tiempo (haime)

20

Uempo(he<u.)

60

Figura 88: Evolucin de la reaccin de sntesis del ster butilico de diferentes cidos (R,S)
2-arilpropinicos, catalizada por la lipasa de Rh.miehe cruda (A) e inmovilizada (E).

285

80

Antiinflamatorios no esteroideos

Las curvas de la Figura 88 se ajustaron a un modelo exponencial creciente y se calcul

la velocidad inicial de cada reaccin utilizando el programa EXFIT, del paquete estadstico
SIMIFIT versin 4,0. En la Tabla 64 se recogen los resultados de velocidad inicial (mmoles
ester sintetizado/hora) obtenidos en cada reaccin; as como los valores de logP de cada cido
(R,S) 2-arilpropinico estudiado.

Tabla 64: Velocidad inicial de las reaccines de sntesis de los steres butilicos de diferentes
cidos (R,S) 2-arilpropinicos, catalizada por la lipasa de Rhaniehei cruda e inmovilizada y
logP de cada cido.
enzima cruda
ACIDO

y0

enzima

mmcvi

enant

V,
(mmol ester/ii)

enant

log 1> del

cido

(mmol ester/li)

IBtYPROFENO

3,74

(2,040,3)io~

(7,40,8)l0~

NAPROXIENO

2,83

(1,00,1)o-~

(4,70,3)lO~

K.ETOPROFENO

2,66

(2,50,1)0~

(3,40,3)lOa

Ac. 2-fenllpropionico

1,84

(8,10,7)l0~

(2,30,2)lO~

(enant) enantiopreferencia.

De los datos de la Tabla anterior se puede deducir que la reactividad relativa de los
tres cidos cuyo enantimero S(+) se esterifica preferentemente es la misma para la lipasa de
Rh.pniehei cruda e inmovilizada
(R,S) Ibuprofeno > (R,S) Naproxeno > (R,S) 2-fenilpropinico

siendo la diferencia de reactividad mayor con la lipasa inmovilizada que con la enzima cruda.
Este reactividad relativa puede relacionarse, en principio, con el logP de cada cido,
de forma que el cido ms lipoide ((LS) Ibuprofeno) difunde mejor en el medio de reaccin
(diisopropilter) hacia el Centro activo de la enzima
En el caso del (R,S) Ketoprofeno, que presenta una enantioselectividad opuesta, hacia
el enantimero R, es relativamente ms reactivo que los otros cidos para las reacciones
catalizadas por la lipasa cruda de R.h.miehez. Esta situacin es opuesta en las reacciones
catalizadas por la lipasa inmovilizada (1M20). No obstante, el (R,S) Ketoprofeno es poco
286

Resallados y Discusin

reactivo en ambos casos.

IV.6.2.c.2.- Influencia en la enantioselectividad.

En la Tabla 65 se recogen los valores de los parmetros de enantioselectividad (ee y
FE) obtenidos en las reacciones de sintesis de los steres butilicos de diversos cidos (R.S)

2-arilpropinicos.

Tabla 65~ Enantioselectividad de las reacciones de sntesis de los steres butilicos de los
cidos (R,S) 2-axil propinicos, catalizada por la lipasa de Rh.miehei cruda e inmovilizada.

enzima

cruda

1M20

ACEPO

logP

re,d
(72h)

ce

FE

IIBIJPROFEN

3,74

11 6+07

100,1

13,12

MAPROXEN

2,83

5,70,8

1,050,06

KETOPROFE

2,66

13,80,9

2fenilpropi

1,84

4,50,3

rend
(72h)

ee

FE

422

321

72,41

6,04

272

7,10,3

36,98

91

16,01

201

9,50,2

25,0

261

4,71

131

8,50,1

14,94

Para comprobar que la enantioselectividad de la lipasa de Rh.miehei tanto cruda como

inmovilizada vari con respecto al Ketoprofeno, se realizaron una serie de reacciones
utilizando como sustratos los enantimeros R y S puros de dicho cido, manteniendo
constantes todas las condiciones de la reaccin. Los resultados obtenidos se recogen en la
Tabla 66.
Tabla 66: Rendimiento de a reaccin de sntesis del ster butilico de Ketoprofeno, utilizando
como sustratos los ennatimeros R y S puros de dicho cido.
IiM2O

enzima

cruda

t(h)

E.

t(h)

170

221

167

482

7,30,3

263

302

263

602

15+0 7

408

----

4,50,2

408

287

E.

201

Antiinflamatorios no esteroideos

Como se observa en la Tabla 66 el rendimiento de la reaccin de sntesis del ster

butlico del enantimero 5 de Ketoprofeno fue muy bajo, mientras que en la reaccin de
esterificacin del ismero R el rendimiento obtenido fue muy superior en las dos series de
reacciones, catalizadas por la lipasa de Rhiniehei cruda e inmovilizada (1M20),
respectivamente.
Tras la realizacin de las reacciones con los enantimeros puros de Ketoprofeno
qued confirmado que la enantiopreferencia de la lipasa de Rh.miehei es diferente en el caso
del (R,S) Ketoprofeno, ya que acta selectivamente sobre el ismero R, mientras que para los
otros cidos (R,S) 2-arilpropinicos estudiados reconoce preferentemente el ismero 5.

Como ya se indic en la seccin IV 4.2., la informacin recogida en la bibliografa

acerca de la enantioselectividad de la lipasa de Rhniehei para los cidos (R,S) 2arilpropinicos es bastante contradictoria. Algunos autores como St y cols.2402 observaron
un comportamiento enantioselectivo de la lipasa de Rh.mehei hacia el ismero R del (R,S)
Ibuprofeno. Sin embargo, otros autores24 detectaron una marcada enantioselectividad por el
enantimero 5 de este mismo sustrat. Este diferente comportamiento de la lipasa de
Rh.miehei sobre el mismo sustrato, como se coment anteriormente, puede atribuirse al
diferente origen de las enzimas, ya que la lipasa utilizada por Sih era del laboratorio Amano
y la utilizada por Rantakyl24 y por nosotros proceda del laboratorio Novo-Nordisk.
Sin embargo, Palomer y cols?47276 observaron tambin una modificacin de la
enantiopreferencia de la lipasa de Riurnehel por el ismero R(.-) del Ketoprofeno.

La enantiopreferencia de la lipasa de Ritmiehei por el enantiniero 5 de los cidos

(R,S) 2-arilpropinicos, excepto en el caso del Ketoprofeno, observada en la presente Tesis
Doctoral condujo a la obtencin del ster 5 y el cido R, tras la reaccin de sntesis
enantioselectiva de dichos cidos. Aunque el resultado obtenido fue opuesto al que se
persegua, la obtencin directa del cido S(+), este resultado supuso un importante avance en

288

>

H
H

CONFIG.

E fkcallmol)

anguila <~1

djj41

SFENI

7.141

-55.8

5.09

4.35

REENI

7.141

+55.8

5.09

4.35

CONFORMERO

H
HQ~H

CONFORMERO

CONFIG.

E <kcallmal)

anaulo <.1

d1J~j

d2 <A>

d3 <A

SIBUI

15.94

-55.8

8.41

3.83

RIBUI

15.94

+55.8

8.41

4.324

3.83

HH~

CONFORMERO
SNAPI
SNAP2
RNAPI
RNAP2

CONFIS.

E <kcallmol>

anaulo <9

di <A>

d2 <A>

5
5

-4.01
-4.01
+0.46
-3.27

-54.43
-53.33

9.75
9.75
9.68
9.87

5.93
5.93
5.93
5.93

R
R

+54.31

+54.22

o
-1

CONFORMERO
~Q

o-.

CONFIO.
5

R
R
R

E <kcallmoll
10.58
10.58
9.74
10.58
10.57
9.76

anaulofl
-51.69
-51.69
-56.38
51.69

105.70
56.10

di <A>
9.75
9.75
9.79
9.75
9.74
9.81

anaulo <~>
81.2
-67.0
-128.23
67.4
124.0
126.0

Antiinflamatorios no esteroideos

Dado que los cuatro sustratos son reconocidos por la lipasa de Rh.,niehet, se puede
suponer que el lugar de reconocimiento debe tener unas dimensiones tales que permitan la

entrada del sustrato ms voluminoso. As pues, el tunel de reconocimento del grupo arilo debe

A, puesto que es la longitud de los enantimeros ms

una anchura y una altura como minmo de 5,93 A cada

tener una profundidad de la menos 9,8

largos (Naproxeno y Ketoprofeno) y

una de ellas para permitir la entrada del sustrato ms voluminoso (Naproxeno). Las
dimensiones del lugar de reconocimiento del grupo arilo, diseadas en funcin de los estudios
conformacionales de los cidos (R,S) 2-arilpropinicos se representan en la Figura 90 A.

Asimismo, en este tunel cabra perfectamente el cido 2-metildecanico, que es el

sustrato de la lipasa de Rh.mehei ms largo de todos los decritos en la bibliografa para dicha
enzima y que tiene una longitud de 9,8

Ay

una anchura de 5,56

A.

En la Figura 90B se

representa el confrmero de mnima energa de dicho cido, dentro del lugar de

reconocimeinto de arilo diseado en la Figura 90A en funcin de las dimensiones de los
cidos <R,S) 2-arilpropinicos.

292

Resultados y Discusin

5.93k

________________________

_____________________________

9.8

OH

Figura 90: Dimensiones del lugar de reconocimiento del grupo arilo de la lipasa de
Rh.miehei. En la Figura A se sita el Naproxeno y en la Figura E el cido 2-metildecanico.

293

Antiinflamatorios no esteroideos

La diferente enantioselectividad observada en esta Tesis Doctoral no es la priemra vez

que se describe para esta lipasa, como se coment en el apanado IV. 4.1. y al principio de esta
seccin.
Holmquist y cols.89 describieron en 1993 el cambio de enantioselectividad del

enantimero 5 al R en las reacciones de hidrlisis del 2-metil-decanoato de 1-heptilo y del

2-metil-decanoato de bencilo, catalizadas por la lipasa de Rh.miehei. Estos autores atribuyen
este cambio de enantioselectividad a la diferente interaccin del alcohol con la tapadera de
la lipasa, ya que la mutacin del residuo Arg-86 de la tapadera a GluS7 provoca la alteracin
de la enantioselectividad de las reacciones de hidrlisis estudiadas,

Dado que en nuestro caso el sustrato quiral es el cido y no el alcohol se procedi al

estudio de las variaciones de energa producidas al girar determinados enlaces que se
consideraron crticos en la molcula de R(-) Ketoprofeno y de S(+) Ketoprofeno para poder
acoplarse al centro activo de la lipasa de RJi.mehe.

En la Fiura 91 se indican los 3 giros realizados en la molcula de Ketoprofeno

utilizando para ello la Dinmica Molecular.

294

Resultadosj Discusin

H
H
COOH

Figura 92: Giros realizados en la molcula del (LS) Ketaprofeno

A continuacin se indica la variacin de energa producida al realizar cada uno de los

giros indicados en la Figura 92 y el ngulo de giro de cada enlace.

GIRO 1

GIRO 2

Angula de gira

ngulo de gira

(~)

(34)

a0

a0 + 700

336

330

0+70

0 -4- 180~

2.1

340

a0 + 250~

301

4,5

a0 + 32O~

4.8

0,8

a0 + 25O~

a0+360

0
a

a0+l80

ilE

(0)

O
cz0+360

295

Antiinflamatorios no esteroideos

GIRO 4

GIRO 3
ngulo- de giro
(0)

ngulo de giro
(0)

Al
(%)

a,,

a0 + l20~

43

a0 + 1800

1,6

a0 + 1800

a0 + 24O~

8,0

a0 + 270~

a0+310

O
0,3
-

0,6

57

40,7

a0+360

Al
(%)

cr0+360

De estos resultados se puede obtener las siguientes conclusiones:

a).- Del giro 4 se deduce que el grupo carboxilo tiene practicamente total libertad de
giro para acoplarse al centro activo de la enzima.

h).- Del giro 3 se deduce que el enlace que une el centro estereognico con el primer
carbono aromtico tiene cierta dificultad de giro, con dos mximos a (a

1200) y (a0

3100) y dos minnnos a a0 y (a0 + 1800)

e).- De los giros 1 y 2 se deduce que los dos bencenos presentan gran dificultad de
giro, por lo que dificilmente podr alterarse su conformacin para acoplarse al centro
activo de la enzima.

De forma anloga se realiz el estudio de los giros de los enlaces de la molcula de

Naproxeno. Se eligi esta molcula entre los cidos 2-arjpropinicos para los que la lipasa
de Rh.rniehei es 5-enantioselectiva porque el anillo de naftaleno es el radical ms rgido y por
tanto el que menos alterar su confomacin para acoplarese la centro activo de la lipasa de
Rh.miehei. En la Figura 92 se indican los enlaces de la molcula de Naproxeno que se han
rotado en este estudio

296

Resultados y Discusin

H
H

o
H
H

Figura 92: Giros realizados en la molcula de (R,S) Naproxeno

A continuacin se indican los ngulos de giro realizados y la diferencia de energa

producida tras cada giro
GIRO 1

GIRO 2

ngulo de giro
(O)

Al
(%)

ngulo de giro
(0)

Al
(%)

a0

a0

a0 +600

11

a0 + 600

73

a0 + 1200

94

1,1

a0 + 1800

45

a,, + 1200
a0+ 180~

a0 + 2500

12

74

a0 + 3000

6,1

a0 +3600

a0 + 2400
0
a0+300
a,,+3600

297

2,2

0,1
O

Antiinflamatorios no esteroideos

GIRO 3
ngulo de giro

Al

(O)

a,,

-2,8
a,,-4- 1200

11,4

av4- lSO~

4,3

a,, + 2400

0,9

a,, + 3000

57

a,,+3600

De estos resultados se puede deducir que las barreras energticas de los giros de la
molcula de S(+) Naproxeno son pequeas, por lo que esta molcula podr acomodarse con
facilidad en el centro activo de la lipasa de Rh.mehei.
Resultados anlogos de diferencia de energa (AB) se obtuvieron para los giros del
cido (R,S) 2-fenlpropinico y del (R,S) Ibuprofeno.

* ** * * * * * * * * ** * * * * ** * ** ** * * * ** * * ** * * * * ** * *******

** * * *

A continuacin se superpusieron los enantimeros S(+) del cido 2-fenilpropinico,

del Iburpofeno y del Naproxeno por el carbono estereognico y por el primer anillo aromtico
de estas molculas.

En las Figuras 93 A y B se representan los enantimeros S(+) Ibuprofeno y el cido

5(4) 2-fenilpropinico superpuestos y analizados desde distinto ngulo. En la Figura A se
analiza su disposicin en un plano y en la Figura B se representa su disposicin girando dicho
plano un ngulo de

9Q0

298

II

Figura

93:

Enantimeros S(+) Ibuprofeno y cido S(+) 2-fenilpropinico superpuestos.

Como se observa en la Figura 93 los dos enantimeros analizados se superponen

totalmente. Los restos carboxilo, metilo y los hidrgenos de ambas molculas se disponen en
la misma zona espacial y los anillos aromticos se solapan por completo.

A continuacin se superpusieron los enantimeros S(+) Ibuprofeno y S(+) Naproxeno,

tambin a travs del centro estereognico y del primer anillo aromtico de cada molcula, tal
y como se representa en la Figura 94.

299

Antiinflamatorios no esteroideos

300

-a

Figura 94:

Enantimeros S(+) Ibuprofeno y S(+) Naproxeno superpuestos.

En esta Figura se observa tambin que las dos molculas se superponen totalmente,
disponindose sus restos carboxilo, metilo e hidrgeno en la misma zona y solapandose el
resto fenilo del S(+) Ibuprofeno con el primer anillo aromtico del naftaleno de la molcula
de S(+) Naproxeno.
Asimismo, se observa que las zonas finales de las dos molculas presenta unas
dimensiones muy similares. Esta zona se sita en el lugar de reconocimiento del grupo arilo
en la lipasa de Rh.mehe, de lo que se deduce que aunque el Naproxeno es ms voluminoso
que el Ibuprofeno, su disposicin en el centro activo de la enzima es muy similar

301

-w

Antiinflamatorios no esteroideos

302

(.

Figura 95: Enantinieros S(+) Naproxeno y R(-) Ketoprofeno superpuestos.

A continuacin se analizaron las caractersticas estructurales de los enantimeros R

y 5 de Ketoprofeno, con el fin de deternnnar la causa del cambio de enantiopreferencia de
la lipasa de Rh.mehe cuando acta sobre el (R,S) Ketoprofeno. Para ello se superpusieron
los dos enantimeros de Ketoprofeno sobre el S(+) Naproxeno, que es el enantimero 5 ms
volummoso.
En la Figura 95 A se observa que los grupos metilo e hidrgeno de los enantimeros
R(-)Ketoprofeno y S(+)Naproxeno se colocan hacia lados opuestos, mientras que los grupos
carboxilo de ambos se colocan en la misma zona, tal y como se observa en la Figura A.
Asimismo se puede comprobar que la zona aromtica de los dos enantimeros presenta una
disposicin muy similar, y que el resto benzoilo del R(-) Ketorpofeno est girado de forma
que queda muy prximo al anillo de naftaleno del S(+) Naproxeno.

303

~1,

Figura 96: Enantim eros S(+)Naproxeno y S(+)Ketoprofeno superpuestos.

En esta Figura se superpuso el S(+) Naproxeno sobre el mismo enantimero de
Ketoprofeno. En este caso se observa que la estructura de los dos enantimeros es muy
diferente, ya que los restos carboxilo, metilo e hidrgeno de ambos se disponen en zonas
opuestas. Sin embargo el factor ms llamativo es la disposicin del resto benzoilo del
S(+)Ketoprofeno, que est muy alejado del naftaleno del S(+)Naproxeno, a diferencia de lo
que se observ al superponer el enantimero R(-)Ketoprofeno. Como se comprob en la
pgina 295, el giro 1 de la molcula de Ketoprofeno est muy impedido ya que requiere
mucha energa. Como consecuencia de la rigidez de ese enlace el enantimero
S(+)Ketoprofeno no puede entrar en el tunel de reconocimiento del grupo arilo en la lipasa
de Rh.miehei y por eso esta lipasa varia su enatiopreferencia en el caso del Ketoprofeno.

304

d=6.98A

d = 5.93A

Figura

97:

Dimensiones de los enantinieros S(+)Naproxeno y S(+)Ketoprofeno superpuestos.

305

Antiinflamatorios no esteroideos

Para comprobar las dimensiones del enantimero S(+) Ketoprofeno se midi la anchura
de la Figura 96 en la que se superpusieron los enantimeros S(+)Naproxeno y
S(+)Ketoprofeno. Como se observa en la Figura 97 la anchura de la zona aromtica del S(+)
Ketoprofeno es muy superior (6,98

A)

a las diemensiones calculadas en la Figura 90 para la

zona de reconocimiento de los grupos arilo en la estrucutra de la lipasa de Rh.mehe, que se

calcul fue de 5,93

A.

Por todo ello se puede concluir que el factor determinante del cambio

de enantiopreferencia de la lipasa de Rh.mehe respecto del (R,S)Ketoprofeno fue la gran

distancia de la zona arilo del enantimero S(+)Ketoprofeno debido a la disposicin de su resto
bencilo y a la imposibilidad de giro de su enlace.

306

Resu liados y Discusin

SOMERO

SOMERO R

Figura 98: Disposicin de os enantimeros R y S de los cidos (R,S) 2-arilpropinicos en

el centro activo de a lipasa de Rh.mehez.
Asi pues se puede concluir a nivel cualitativo que:
a).- los sustratos flexibles (R,S) Ibuprofeno; cido (R,S) 2-fenilpropinico y (R,S)
Naproxeno se acomodan con facilidad al tunel de reconocimiento del grupo arilo de la lipasa
de Rh.,rnehei.

b).- la enantioselectividad observada para los cidos (R,S) 2-arilpropinicos indicados

en el apartado anterior

enantimero S

>

enantimero R) viene controlada por los subsitios

de reconocimiento del hidrgeno y del metilo, ya que estos subsitios del centro activo de la
enzima reconocen mejor a estos grupos en la configuracin S. Como se representa en la
Figura 98 el ismero S se acopla perfectamente, mientras que el grupo metilo del ismero R
tiene mayor impedimento para acoplarse y el hidrgeno queda totalmente suelto en el centro
activa.

c).- Por el contrario, en el caso de la molcula rgida, (R,S) Ketoprofeno. es la

geometra del grupo arilo la que determina qu enantimero puede unirse, siendo para este
compuesto el ismero R(-). Esto explicara cualitativamente el cambio de enantioselectividad
observada.
307

Antiinflamatorios no esteroideos <AJNEs)

IV.6.3.- ACTIVIDAD DE LA LIPASA DE Rkmiehei SEMIPURIFICADA E

INMOVILIZADA
Tras analizat las variables de operacin y estructurales que participan en la reaccin
de esterificacin enantioselectiva de cidos (R,S) 2-arilpropinicos, catalizada por la lipasa
de Rh.nehei cruda (Lipozym& IOOOOL) e inmovilizada por adsorcin sobre una resina de

mtercambio aninico (Lipozym& 1M20) se analiz la actividad de la lipasa de Rh.rniehei

semipurificada por dilisis y por precipitacin con sulfato amnico en esa misma reaccin;
as como la actividad de la lipasa cruda y semipurificada inmovilizadas por enlace covalente
con slice.
Para este estudio se llev a cabo la reaccin estndar de esterificacin (sntesis del
ster butilico de (R,S) Ibuprofeno en ciclohexano a 37 0C). catalizada por Jos diferentes
derivados semipurificados y/o inmovilizados de la lipasa de Rh.rniehei.
Dado que el contenido protico de cada enzima es diferente y con el fin de comparar
el rendimiento obtenido en cada reaccin, se expres el rendimiento en milimoles de ster
formado por miligramo de protena. La determinacin de la cantidad de protenas se hizo por
el mtodo del biuret en unos casos y por el mtodo de Bradford en otros, por lo que se aplic
un factor de conversin (f = 8.5) para unificar criterios y expresar todos los resultados segun
el mtodo de Bradord.
Los resultados obtenidos en el transcurso de cada reaccion se ajustaron a emetcas de
primer orden (y = A (1 ~ekI)) y se calcul el valor de la velocidad inicial (y

0) (y0 = A k) con

el programa EXFIT, del paquete estadstico SIMFIT versin 4.0

254

Asimismo, se analiz la enantioselectividad de cada reaccin. El parmetro utilizado

para este estudio fue el factor de enantioselectividad (FE), definido en la presente Memoria
(ver 1V6.J.a.3.) para determinar la enantioselectividad en un momento determinado de la
reaccin y que permiti comparar los resultados obtenidos con cada enzima.

IV.6.3.a.- Estudio de la actividad de la lipasa de Rh.miehei SEMIILPURIFICADA

Como se indic anteriormente, la lipasa de Rh.mehei (Lipozym? IOOOOL) fue
semipurificada siguiendo dos metodologas:
a~- dilisis y centrifugacin
b).- precipitacin con sulfato amnico
308

Resultados y Discusin

En las Figuras 99

se representan las cinticas de primer orden del rendimiento

obtenido en cada reaccin a lo largo del tiempo. A partir de cada una de estas curvas se
determin el valor de velocidad inicial (y0), que permiti comparar la actividad de cada
derivado semipurificado.
rw,tnUsto <mmch. .S.dn.g p.otSn#
0.04
E

0.03

-49-

nzaud.
rzdSzeda
CC)

E
0.02

0.01

20

40

60

80

Dempa <hcra#

Figura 99: Evolucin de la reaccin de sntesis del ster butilico de Ibuprofeno catalizada por
la lipasa de Rh.miehe cruda semipunticada por dilisis (Dial) y postenor centrifugacin
(DC).
,.a.a
ra..s
ar/,..sd.w
o.

a
Figura 100: Evolucin de la reaccin de sntesis del ster butlico de Ibuprofeno, catalizada
por la lipasa de Rh.miehei cruda y sempunficada por precipitacin con sulfato amonco.

309

Antiinflamatorios no esteroideos (AlA/Es)

En la Tabla 67 se recogen los valores de velocidad inicial (y0), factor de purificacin

exceso enantiomrico (ee) y factor de enantioselectividad (FE) obtenidos en la reaccin
estndar de sintesis de steres catalizada por la lipasa de Rh.miehe cruda y semipurificadas.

Tabla 67: Valores de velocidad inicial (V,,), exceso enantiomrico (ee) y factor de
enantioselectividad (FE) obtenidos en la reaccin de sntesis del ster butlico de Ibuprofeno,
catalizada por la lipasa de Rh.miehei cruda y semipurificada.
ENZIMA
~
ce
FE
(inmoles/mg prot h)
CRUDA

(%X72b)

(7210

3,6 l0~~(~)
3<>
6,6 0
3,4 l0~(~)

1,8

683
12,30,6

0,32
0,75

0,9

5,10,2

0,49

11,9 10~

3,3

15,50,8

0,89

5,5 l0~

1,5

9,20,4

0,63

70 %

2,8 i0~

0,7

5,10,2

0,70

80%

3,9 lO~

1,1

8,00,4

0,61

Dial
DC
50%
60 %

(*) se aplic el factor de correccin (f

8,50,9)para expresar a cantidad de protena segn el mtodo de Bradford.

A la vista de los resultados recogidos en la Tabla 67 y en las Figuras 99 y 100 se

observa que la lipasa semipurificada por dilisis result ser ms activa que la lipasa cruda de
Rh.miehei; mientras que tras la posterior centrifugacin, la actividad sintetasa del derivado

obtenido fue semejante a la de la lipasa cruda.

Analizando los resultados obtenidos con la lipasa semipurificada por precipitacin con
diferentes porcentajes de saturacin de sulfato amnico se observa que el factor de
purificacin (defmido como la relacin de las actividades de la lipasa cruda con cada uno de
los derivados semipurificados) presenta un valor dos veces superior para la enzima
semipurificada con un 50% de saturacin, siendo semejante al de la enzima cruda el de los
biocatalizadores obtenidos por precipitacin con un 60, 70 y 80 % de saturacin con sulfato
amonico.
En cuanto a la enantioselectividad, la lipasa de Rh.mehe tras los diferentes procesos
de semipurificacin mantiene su enantioprefemcia hacia el ismero S(-4-) de Iburpofeno.

310

Resultados y Discusin

IV.6.3.b.-

Estudio de la actividad de la linasa de Rh.mehei INMOVILIZADA

Una vez comprobado que la lipasa semipurificada por precipitacin con un 50% de
saturacin de sulfato amnico era la ms adiva en la reaccin de sintesis de steres se
procedi a su inmovilizacin por enlace covalente sobre un soporte de slice. A continuacin,
se estudi la actividad del derivado obtenido (SIL-SP) en la misma reaccin estndar de
sntesis y se compar con la actividad del derivado inmovilizado sobre slice de la lipasa
cruda de Rh.miehei (Lipozym& lOOOOL). En la Tabla 68 se recogen los resultados obtenidos,
cuya representacin grfica a lo largo del tiempo se muestra en la Figura 10>
,.ndn*nft <mme ..Sr/ mgprctdn.)
0,80

150

100

260

nipa (harma)

Figura 161: Evolucin de la reaccin de sntesis del ster butilico de (R,S) Ibuprofeno
catalizada por la lipasa de Rh.miehei cruda y setnipurificada por precipitacin, inmoivlizaads
ambas por enlace covalente con slice.

311

Antiinflamatorios no esteroideos (AlA/Es)

Tabla 68: Valores de velocidad inicial (y0), exceso enantiomrico (ce) y factor de
enantioselectividad (FE) obtenidos en la reaccin de sntesis del ster butilico de Ibuprofeno,
catalizada por la lipasa de Rh.miehe cruda e inmovilizada sobre slice por enlace covalente.
ENZIMA
ee
FE
(mmoles ester/mgprot Ii)

(%X72h)

CRUDA

3,6 10~3(*)

683

0,32

sp

11,9 IO~

tS,50,8

0,89

SIL-C

0,95 o.3(*)

3,50,1

0,70

SIL-SP

1,7 o~~

1,10,05

0,36

(*) se aphco el factor de corrccin (f= 8,50,9)para expresar la cantidad de protena segn el mtodo de Bradford.

Los das derivados obtenidos tras la inmovilizacin por enlace covalente con slice de
la lipasa de R.h.miehei cruda y semipurificada fueron menos activos que las correspondientes
enzimas no inmovilizadas Por lo que se lleg a la conclusin de que los derivados de la
lipasa de Rh.nnehe mmovilizados por enalce covalente no son adecuados como
biocatalizadores de la reaccin de sntesis del ster butilico de Ibuprofeno.
A la vista de todos estos resultados se puede concluir que para las reacciones de
sntesis de steres de los cidos (R,S) 2-aril-propinicos, los derivados de la lipasa de
Rh.miehei ms adecuados son: la misma lipasa cruda, el derivado inmovilizado comercial

(Lipozymek> 1M20) y la lipasa semipunficada por precipitacin con un 50% de saturacin de

sulfato amnico. Este ltimo derivado result ser, una vez ms, el derivado de mayor
actividad, como ya se observ en las diversas reacciones estudiadas.

312

CONCLUSIONES

313

Conclusiones

Las conclusiones obtenidas tras el desarrollo de la presente Tesis Doctoral son las
sigmentes:

1)-- Se han puesto a punto diversas metodologas de caracterizacin de la lipasa de

Rh.rniehei, basadas en la determinacin de su concentracin de proteinas, su actividad

estersica y su actividad lipsica, que permiten la caracterizacin de dicha enzima de forma

sencilla, eficaz y rpida

2).- Tras la semipurificacin de la lipasa de RJ.miehe por dilisis y sucesivas

centrifugaciones a 5000 r.p.m.. se logra un cierto grado de purificacin de esta enzima. Sin
embargo, aunque su actividad estersica especfica se mantiene inalterada, su actividad
lipsica especfica disminuye notablemente.

3).- Mediante la precipitacin de la lipasa cruda de Rh.miehei con un 50% de saturacin de

sulfato amnico se obtiene una enzima ms pura que por los otros mtodos ensayados. Esta
enzima semipufificada presenta presenta un actividad enzinitica (lipsica y estersica)
superior a la de la lipasa cruda. La sencillez del mtodo de purificacin, su bajo coste y la
elevada actividad enzimtica observada hacen este mtodo muy aconsejable desde el punto
de vista tecnolgico.

4).- Se ha inmovilizado la lipasa de Rhmnehe por unin covalente sobre slice (SIL-C),
obteniendo un derivado de elevada actividad lipsica y estersica. Asimismo, se ha
mcrementado notablemente la estabilidad trmica de esta enzima, lo que hace que este
derivado sea muy interesante para posibles aplicaciones industriales.

5).-

El nuevo derivado inmovilizado de la lipasa de Rh.mwhez es ms activo y estable en

medio acuoso que el derivado comercial (Lipozyme 1M20) obtenido por adsorcin inica
sobre ima resina de intercambio aninico.

315

Conclusiones

6). Tras la inmovilizacin, tambin por unin covalente con silice, de la lipasa de Rh.miehei
semipurificada por precipitacin con sulfato amnico, se obtuvo un derivado (SIL-SP) ms
termoestable que el derivado de la lipasa cruda (SIL-C). As pues la combinacin de la
semipurificacin por tratamiento con un 50 % de saturacin de sulfato amnico y la
inmovilizacin covalente sobre slice constituyen una excelente metodologa que conduce a
la obtencin de derivados activos y estables de la lipasa de Rh.miehei.

7).- Al contrario de lo indicado por diversos autores, la lipasa de Rh.miehe del laboratorio
Novo-Nordisk presenta una marcada enantioselectividad por el ismero R(-) de los cidos
(R,S) 2-arilpropinicos, excepto en el caso del Ketoprofeno. Con el fin de obtener el ismero
S()activo se plante la estrategia de hidrlisis enantioselectiva de los correspondientes
steres butilicos pero debido a numerosos mconvenentes tcnicos, que dificultaban la
formacin corecta de una interfase, elemento fundamental para el desarrollo de la actividad
de las lipasas en medio acuoso, se vari de estrategia

8).- La estrategia alternativa para la obtencin enantioselectiva del ismero S(+) de los cidos
(R,S) 2-arilpropinicos se bas en la sntesis de los correspondientes steres. Debido a la
enantiopreferencia de la lipasa de Rh.rnrehn por el ismero S(+), se obtuvo en todos los
casos, excepto con el Ketoprofeno, el ster 5 y el cido R; pero esta mezcla se puede separar
facilmente por extraccion.

9).-

Se hizo un estudio de la influencia de las variables experimental en la actividad en medio

orgnico de la lipasa de Rhsnehet cruda e inmovilizadapor adsorcin, del cual se dedujo que
para la lipasa cruda la cantidad de enzima y el tiempo de reaccin son las variables ms
influyentes, mientras que para la lipasa inmovilizada (Lipozyme 1M20) son la cantidad de
agua aadida al medio y la cantidad de biocatalizador. A continuacin se realiz un estudio
detallado de la influencia de la cantidad de biocatalizador, del tiempo de reaccin, de la
temperatura y de la cantidad de agua del medio en la actividad de la lipasa de Rhnehei tanto
cruda como inmovilizada (1M20).

316

Conclusiones

10).- Por primera vez se realiz una isoterma de la lipasa cruda de Rh.iniehei, ya que debido
a su elevado contenido en azcares el proceso de liofilizacin y desecacin es muy
complicado.
Tras la rehidratacin de la lipasa cruda de RJz.miehei, esta enzima no recuper su
actividad debido a las graves alteraciones sufridas durante el proceso de desecacion. Por el
contario, la actividad de la lipasa inmovilizada (1M20) aument considerablemente tras su
rehidratacion. Asimismo se comprob que el derivado inmovilizado alcanz su maxima
actividad a valores de actividad de agua (a.,,,) de 0,3, punto de corte de sus correspondienets
isotermas de adorcion realizadas en aire y en ciclohexano.

11).-. Del estudio de la influencia de la relacion molar de sustratos (cido y alcohol) en la

actividad de la lipasa de Rh.miehei se dedujo que el exceso de alcohol provoca la inhibicin
de la lipasa cruda e inmovilizada de forma similar. Sin embargo, la influencia del exceso de
cido es diferente para cada enzima, ya que mhbe la actividad de la lipasa inmovilizada y
por el contrario, provoca un importante aumento tanto de la actividad como de la
enantioselectivida de la lipasa cruda de Rh.,niehei.

12- Del estudio de la influencia de diferentes disolventes orgnicos en la actividad de la

lipasa de RJi.miehei se dedujo que el disolvente mas apropiado es el ciclohexano (log P = 3,2)

13).- Los mejores resultados de la reaccion de esterificacin catalizada por la lipasa de

Rh.miehei, cruda e mmovlizada, se obtuvieron con alcoholes primarios de cadena lineal y
con mas de cuatro tomos de carbono, mientras que con los alcoholes secundarios la lipasa
mmovilizada es inactiva y la lipasa cruda presenta una actividad muy pobre.

14).- Tanto la enzima cruda de Rh.mehe como la inmovilizada por adsorcin mostraron
preferencia por el ismero S(+) de los cido (R,S) 2-arilpropinicos estudiados, excepto en
el caso del (R,S) Ketoprofeno, donde el ismero preferido result ser el R(-).
Con el fin de poder explicar estos resultados se llevaron a cabo diversos estudios de
Dinmica y Mecnica Molecular que indican la posibilidad de que el factor clave para el
317

Conclusiones

reconocimiento de los sustratos sea la correcta disposicin del resto aromtico de la molcula
dentro de un tunel en la estructura de la lipasa de Rhiniehe.
Para los isxheros S(+) de los cidos analizados la ubicacin del resto aromtico y de
las zonas de reconocimiento del metilo e hidrgeno del centro estereognico son los
adecuados. No obstante, los ismeros R(-) tambin son reconocidos por la lipasa de
Rh.miehei, aunque peor, por lo que esta enzima no puede cahficarse como enantioespecifica.
Para el caso especial del (R,S) Ketoprofeno, el ismero R(-) es el preferido puesto que,
aunque las zonas de reconocimiento de metilo e hidrgeno estn alterados, la enorme
dificultad de giro del resto benzoilo de la molcula hace que la disposicin que entra de forma
correcta en el tunel aromtico sea precisamente la del enantimero R(-), ya que la
conformacin del ismero 5(j) es ms voluminosa y no puede entrar.

318

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