Preparacin del material de vidrio y medios de cultivo

1. Lavar en forma respectiva el material de vidrio y enjuagar con abundante agua corriente.
2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada. Dejar escurrir el material sobre una
toalla o papel de
envolver.
3. Preparar 200 mL de CN en un matraz Erlenmeyer de 500 mL y ajustar el pH a 6.5-7.0 con un
potencimetro, agregando con
una pipeta Pasteur poco a poco solucin de HCl 0.1M o solucin de NaOH 0.1M en caso de que el pH sea
ms alcalino o
cido respectivamente. Vaciar 5 mL en cuatro tubos de cultivo con tapn de rosca que se cerrarn sin llegar al
tope.
4. Preparar agar nutritivo (AN) agregando 2.7 g a los 180 mL del CN restante (15 g/L).
5. Calentar el medio en una parrilla con agitacin constante hasta ebullicin (cuidar que no se proyecte) y
vaciar 5 mL de
medio en cuatro tubos con tapn de rosca. Enjuagar de inmediato la pipeta para evitar que se solidifique el
agar.
6. Preparar 200 mL de medio de cultivo PDA en un matraz Erlenmeyer de 500 mL, ajustar el pH del medio a
5.6. Colocar un
agitador magntico y calentar hasta ebullicin, cuidando que no se proyecte o derrame. Vaciar 5 mL de medio
en cuatro
tubos sin rosca que se taparn con tapn de algodn y gasa.
7. Preparar 200 mL de medio de cultivo EMB en un matraz Erlenmeyer de 500 mL. Colocar un agitador
magntico y calentar
hasta ebullicin. NOTA: Cuidar que no se derrame!
Esterilizacin de materiales y medios de cultivo
1. Las cajas Petri y pipetas envueltas con papel estraza se colocarn en un horno a 150C durante 2 horas.
Despus de sacarlas,
dejar enfriar y abrir los paquetes nicamente en rea asptica (cerca del mechero).
2. Los medios de cultivo se esterilizarn en autoclave de acuerdo con las siguientes instrucciones:
a. Revisar que el agua en la autoclave est limpia y el nivel coincida con la marca en el tubo indicador. En
caso necesario
cambiar o aadir agua destilada.
b. Conectarla y poner la perilla de control en calentamiento mximo. Con el uso de guantes de asbesto,
acomodar los
medios y materiales en la canasta de la autoclave y colocarla dentro.
c. Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posicin encontrada y esperar a que salga el vapor por
el orificio
de purga, despus cerrarlo con la vlvula.
d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121C o 15 lbs /in2 de presin y mantener estas
condiciones durante
15 minutos. Revisar continuamente el manmetro y regular el control de temperatura a valor medio o mnimo.
e. Apagar la autoclave y dejar que la presin baje al valor de cero. Quitar la vlvula y con la ayuda de guantes
de asbesto,
abrir cuidadosamente la tapa, desde la parte trasera para evitar que el vapor caliente cause quemaduras.
Vertido de los medios en cajas Petri y solidificacin.
1. Cerrar los tubos con tapn de rosca, los que contienen agar se colocarn en una superficie inclinada para
que el medio
solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo.
2. Enfriar los medios de cultivo de los matraces hasta una temperatura aproximada de 45-50C, que coincide
con la posibilidad
de sostener el matraz en la palma de la mano sin quemarse.
3. Limpiar la mesa con solucin de alcohol al 70% (v/v), encender mecheros y colocarlos a una distancia de
50 cm. Verter

entre 20 y 25 mL de cada uno de los medios en tres cajas Petri en esta zona asptica. Dejar que los medios
solidifiquen.
Prueba de esterilidad de materiales
1. Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, as como un tubo de CN y PDA durante 1 minuto en zonas no
aspticas (patio, aulas,
comedor) y etiquetarlas.
2. Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, as como un tubo de CN y PDA durante 1 minuto en zona aspticas
(cerca del
mechero) y etiquetarlas.
3. Colocar los tubos y las cajas Petri en una incubadora ajustada a 30C durante 24-48 horas. Las cajas Petri
se colocarn con
la tapa hacia abajo.
4. Revisar los tubos y cajas Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparicin de turbidez,
nata superficial
y/o depsito de material en el fondo de los tubos con medio lquido, as como la formacin de colonias
microbianas en la
superficie de los medios slidos.
Resultados
A. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento
regular y (+++)
crecimiento abundante.
B. Describir la morfologa de las colonias en el Cuadro 1.
C. Discutir los resultados con base en la efectividad de la esterilizacin y manejo de los materiales.
Control de calidad de los medios de cultivo:
2. nombre de la casa proveedora, fecha de recibo, fecha de expiracin, nmero de lote y fecha en que se
abri el frasco.
2. Cada lote preparado de medio de cultivo se debe probar antes de su uso rutinario, mediante la inoculacin
de microorganismos cuyo comportamiento se conoce, tanto para reacciones positivas, como negativas. Para
esto pueden utilizarse cepas bacterianas control de la ATCC (American Type Culture Collection). Se debe
guardar un registro de los resultados obtenidos.
3. Para el agar Mueller-Hinton, empleado como medio de soporte para realizar la prueba de susceptibilidad
por el mtodo de difusin en agar (Mtodo de Bauer and Kirby), el control de calidad debe extenderse hacia la
determinacin de las concentraciones de timina/timidina, la concentracin de cationes, as como en medir la
profundidad del agar y que sta sea igual en todo el plato de agar.
4. La concentracin adecuada de timina/timidina se monitoriza utilizando la cepa de Enterococcus
faecalis ATCC 29212 y el disco de trimetoprin sulfa.
5. La concentracin adecuada de cationes se monitoriza utilizando la cepa de Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853 y el disco de gentamicina.
6. Las pruebas bsicas de control de calidad de los medios preparados deben incluir: medicin del pH,
pruebas de esterilidad, capacidad de crecimiento y reaccin, aspecto, dureza y profundidad del agar.
Cuadro N 1
Control de medios de cultivo

Control de Calidad de reactivos:

1 Un elemento fundamental en el trabajo diario del laboratorio de microbiologa lo constituyen los reactivos,
tanto comerciales como de preparacin domstica, que son utilizados en la caracterizacin de
microorganismos. Por ello, deben efectuarse controles diarios con las bacterias tipo y seguir estrictamente las
indicaciones en cuanto a almacenamiento de los reactivos, metodologa de la prueba y tiempo de lectura. Es
recomendable que los reactivos comerciales sean examinados inmediatamente cuando se abre un nuevo lote
o vial y llevar un registro de su funcionamiento.
2 El registro de funcionamiento debe efectuarse en forma diaria o al menos cada vez que se efecta la
prueba.
.Control de calidad de equipos:
1 Todos los instrumentos utilizados en el laboratorio deben estar respaldados por un programa de control de
calidad y de mantenimiento preventivo y correctivo, basados en las instrucciones del fabricante y los
procedimientos establecidos. Debe mantenerse un registro de todo lo realizado al respecto, con el nombre del
instrumento, fecha, resultado y comentarios.
2 Debe redactarse un manual de procedimientos operacionales que incluya:
2.1 Listado de los equipos con nombre, marca, modelo, nmero de serie, fecha de recibo y nmero de
inventario de la institucin.
2.2 Registro del mantenimiento preventivo y correctivo, periodicidad de la inspeccin y fallas del instrumento.
3 Debe incluirse un apartado de correccin de fallas y acciones correctivas efectuadas.
4 Instrucciones de uso del instrumento, redactadas en forma clara y en el idioma de los usuarios. Incluir
precauciones de seguridad, procedimientos de limpieza, cuidado del instrumento y acciones correctivas.
En el cuadro No 2 se presentan los aspectos que deben controlarse en los diferentes equipos y su
periodicidad.
Cuadro N 2
Control del equipo y sus mediciones

Supervisin del personal:

1 El personal es el factor ms importante en la calidad del trabajo en el laboratorio de microbiologa. Este
personal debe tener una dedicacin y actitud positiva hacia el trabajo, capacidad acadmica, actualizacin
constante y contar con los elementos indispensables para su labor.
2 Debe existir una ficha tcnica de cada trabajador donde se registren los posibles accidentes sufridos, as
como las infecciones suscitadas al manipular secreciones u organismos infecciosos. Adems, se recomienda
realizar estudios radiolgicos y colocacin de PPD, en aquel personal ligado al trabajo con Mycobacterium
tuberculosis.
Control de calidad externo:
1 Es recomendable que los laboratorios de microbiologa puedan participar en programas de evaluacin
externa. Estos programas miden la capacidad del laboratorio para evaluar una muestra desconocida y llegar a
un resultado seguro.
2 Estos controles de calidad externos pueden ser nacionales o internacionales.

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http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S1017-85462005000100002&script=sci_arttext