Desenvolvimento de Métodos Por HPLC Fundamentos, Estratégias e Validação

Srie
Apontamentos
Queria B. Cass
Ana ljui^a Gusmo Degani
Desenvolvimento de Mtodos por HPLC

Fundamentos, Estratgias e Validao
Edio revista em dezembro de 2001
Universidade Federal de So Carlos
'
Editora da UFSCar
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS
Oswaldo Baptista Duarte Filho

Reitor
Romeu Cardozo Rocha filho
Vice-Reitor
Oswaldo Mrio Serra Truzzi
Diretor da Editora da UFSCar
EdUFSCar
Editora da Universidade Federal de So Carlos
Conselho Editorial
Joo Carlos Massarolo
Jos Mindlin
Jos Roberto Gonalves da Silva
Lucy Tomoko Akashi
Maria Luisa Guillaumon Emmel
Marly de Almeida Gomes Vianna
Maurizio Ferrante
Modesto Carvalhosa
Paulo Srgio Machado Botelho
Petronilha Beatriz Gonalves e Silva
Oswaldo Mrio Serra Truzzi (Presidente)
Maria Cristina Priore

Secretria Executiva
EdUFSCar - Editora da UFSCar

Via Washington Lus, km 235 Telefax (16) 260-8137 13565-905 - So Carlos, SP Brasil
e-mail: edufscar@power.ufscar.br http://www.ufscar.br/~editora
Q u e z i a B . C a ss
A na L u iz a G u sm o D
egani
D e s e n v o lv im e n to d e M t o d o s p o r
F u n d a m e n t o s , E s t r a t g ia s
So Carlos
^
Editora da UFSCar
2001
HPLC
V a l id a o
2001 Quezia B. Cass e Ana Luiza Gusmo Degani
Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitria da UFSCar
C343d
Cass, Quezia B.
Desenvolvimento de mtodos por HPLC: fundamentos,
estratgias e validao / Quezia B. Cass, Ana Luiza
Gusmo Degani - So Carlos: EdUFSCar, 2001.
77p. - (Srie Apontamentos)
ISBN = 85-85173-61-0
1. Cromatografia lquida. 2. Anlise quantitativa. 3.
Parmetros cromatogrficos. 4. Cromatografia quiral. 5.
Cromatografia preparativa. I. Ttulo.
CDD - 543.0894 (20*)
CDU - 543.544.44
Reviso e Produo Grfica
Artes e Textos
Impresso e acabamento
Departamento de Produo Grfica - Universidade Federal de So Carlos
Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta obra pode ser reproduzida ou transmitida
por qualquer forma e/ou quaisquer meios (eletrnicos ou mecnicos, incluindo fotocpia e
gravao) ou arquivada em qualquer sistema de dados sem permisso escrita da editora.
SUMRIO
1. I ntroduo ..... ..... ......... .............
.. 5
2. T eo r ia ............................................
.. 7
3. P armetros C romatogrficos
.11
4. I nstrumentao _____ _______
.17
5. Slica G e l .....................................
.23
6. F ases Q uimicamente L igadas ..
.25
7. M odos
S eparao ................
.27
8. O tim iza o ..................................
.35
9. E luio G radiente ....................
.41
10. C romatografia Q u ir a l ............
.49
11.
.57
de
C romatografia P reparativa ...
12. T ratamento
de
A m ostras .......
13. V alidao de M todos Analticos
63
71
Desenvolvimento de Mtodos por HPLC: Fundamentos, Estratgias e Validao
1. INTRODUO
A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao. Ela est fundamentada na migrao
diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interaes entre duas
fases imiscveis, a fase mvel e a fase estacionria. A grande variedade de combinaes entre fases
mveis e estacionrias torna-a uma tcnica extremamente verstil e de grande aplicao.
O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilizao atribuda a
um botnico russo, ao descrever suas experincias na separao dos componentes de extratos de
folhas. Neste estudo, a passagem de ter de petrleo (fase mvel) atravs de uma coluna de vidro
preeenchida com carbonato de clcio (fase estacionria), qual se adicionou o extrato, levou
separao dos componentes em faixas coloridas. Este provavelmente o motivo pelo qual esta
tcnica conhecida como cromatografia (chrom - cor e graphie - escrever), podendo levar
errnea idia de que este processo seja dependente da cor.
Apesar deste estudo e de outros anteriores, os quais tambm poderiam ser considerados
precursores do uso desta tcnica, a cromatografia foi praticamente ignorada at a dcada de 30,
quando foi redescoberta. A partir da, diversos trabalhos na rea possibilitaram seu aperfeioamento
e, em conjunto com os avanos tecnolgicos, a levaram a um elevado grau de sofisticao, o qual
resultou no seu grande potencial de aplicao em muitas reas.
A Crom atografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE/HPLC) surgiu como a aplicao de
cromatografia lquida s teorias e instrumentaes desenvolvidas originalmente para a cromatografia
gasosa.
Baseando-se na teoria da cromatografia gasosa, de que a eficincia de uma separao aumenta
com a dim inuio do tam anho da partcula da fase estacionria, surgiu, na dcada de 60, a
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia.
Em 1952, M artin e Synge ganharam o prmio Nobel pelo desenvolvimento do primeiro
tratamento matemtico da teoria cromatogrfica e, com o avano da tecnologia, foi possvel aplicar
esta teoria ao desenvolvimento da cromatografia lquida.
A principal diferena entre a cromatografia lquida clssica e a cromatografia lquida de alta
eficincia a utilizao de fases estacionrias com micropartculas (10, 5 ou 3 m) esfricas, de
preferncia. Estas fases,' por serem muito menos permeveis, tornaram necessria a utilizao de
bombas para a eluio da fase mvel.
A utilizao destas novas fases estacionrias, associada ao desenvolvimento da instrumentao,
levou esta tcnica a uma melhor performance em termos de resoluo, quantificao e deteco em
um menor tempo de anlise.
Referncias
DEGANI, A.L.G.; CASS, Q.B.; VIEIRA, P.C. (1997). Cromatografia: Um breve ensaio. Qumica
Nova na Escola, v.7, p.21-25.
LOUGH, W.J.; WAINER, I.W. (1995). High Performance L iqu id Chromatography, Fundamental
Principies and Practice. Glasgow, Blackie Academic & Professional. p. 1-276.
2. TEORIA
A separao cromatogrfica baseia-se na migrao diferencial dos componentes de uma mistura,
que ocorre devido s diferentes interaes entre duas fases imiscveis, a fase mvel e a fase
estacionria, e no alargamento de bandas, que dependente de processos fsicos e no da diferena
de equilbrio.
A migrao diferencial resulta da diferena de equilbrio dos analitos entre as duas fases
imiscveis e determinada pelos fatores que afetam este equilbrio: composio da fase mvel,
composio da fase estacionria e tem peratura da separao. Mudanas em um ou mais destes
parmetros levam a alteraes na migrao diferencial.
Os processos fsicos responsveis pelo alargamento de bandas so: difuso de Eddy (ou de
mltiplos caminhos), transferncia de massa da fase mvel, transferncia de massa da fase mvel
estagnada, transferncia de massa da fase estacionria e difuso longitudinal.
Difuso de Eddy - A permeabilidade microscopicamente diferente da fase estacionria causa
o alargamento das bandas como conseqncia dos diferentes caminhos seguidos pela fase mvel
(Figura 2.1a).
Transferncia de massa da fase mvel - Refere-se s diferenas de fluxo em um mesmo
caminho seguido pela fase mvel, ou seja, entre as partculas, o fluxo central maior do que os
adjacentes a elas, levando a diferenas de transferncia de massa e, conseqentemente, ao alar
gamento de bandas (Figura 2.1b).
Transferncia de massa da fase mvel estagnada - Com partculas porosas tem-se fase mvel
estagnada. As molculas do soluto que se difundem para essa fase mvel transferem-se mais
lentamente do que aquelas que no se difundem, resultando no alargamento da banda (Figura 2.1c).
Transferncia de massa da fase estacionria - Resulta das diferenas de difuso das molculas
nos poros da fase estacionria (Figura 2.1 d).
Difuso longitudinal - decorrente do fato de que as molculas do soluto tendem a se
difundir randomicamente em todas as direes. Este fenmeno geralmente no tem importncia,
sendo significativo apenas em baixos fluxos (Figura 2.1e).
b
V
?
< 9
<9
(9
0
Figura 2.1 Ilustrao dos processos fsicos responsveis pelo alargamento de bandas.
8 EdUFSCar - Apontamentos
2.1 A Banda Cromatogrfica

Em cromatografia lquida, as bandas devem seguir uma distribuio gaussiana, sendo a
concentrao do soluto calculada pela seguinte frmula:
(2 . 1 )
em que:
Fy = a velocidade de fluxo
O = o desvio-padro da distribuio
M = a massa injetada
tr = o tempo de reteno
A Figura 2.2 mostra que, seguindo a distribuio gaussiana, as larguras de picos so calculadas
por intermdio de tangentes que vo do ponto de inflexo at a linha de base e, sendo assim, a
largura de um pico na linha de base (w j corresponde a 4o, enquanto na meia altura (w05), a 2,354o.
1,2
1.1
1.0
0,9
0,8
0,7
0,6
2o
0,5
2,354a
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
- 4 - 2
'4- wb*
Figura 2.2
Esquema da distribuio gaussiana de uma banda cromatogrfica.
2.2 Reteno (R)

uma medida quantitativa da migrao, sendo definida pela razo entre a velocidade da
amostra (u j e a velocidade da fase mvel ( u j, isto ,
Se a frao de molculas da amostra na fase mvel for igual a zero (R = 0), no haver migrao
e ux= 0. Por outro lado, se a frao de molculas da amostra na fase mvel for igual a 1, as molculas
da amostra movem-se na mesma velocidade do solvente, R = 1.
Assim, o R em cromatografia lquida pode ser definido de acordo com a Equao 2.3 mostrada
abaixo.
Pode tambm ser relacionado com a frao do nmero de molculas na fase mvel em qualquer
tempo.
R = /m= Nm+Ne
(2-4)
Tempo de reteno (tr) - E a medida entre o ponto de injeo e o mximo do pico.

Tempo morto (tj - o tempo de eluio de um soluto no retido. (Mede o tempo necessrio para
que este soluto seja detectado, desde o ponto de injeo.)
Na Figura 2.3 esto esquematizadas as medidas relacionadas ao clculo dos parmetros de
separao.
t,
Figura 2.3 Esquematizao das medidas relacionadas ao clculo dos parmetros de separao.
Referncias
GILBERT, M.T. (1987). High Performance Liquid Chromatography. Bristol, Whight. p.5-11.
RILEY, C.M. (1995). Efficiency, retention, selectivity and resolution in chromatography. Ini
WAINER, I.W.; LOUGH, W.J., eds. High Performance Liquid Chromatography, Fundamental
Principles and Practice. Glasgow, Blackie Academic & Professional, p. 15-35.
SNYDER, L.R.; KIRKLAND, JJ. (1979). Introduction to Modern Liquid Chromatography. 2.ed. New
York, John Wiley and Sons. p. 15-82.
SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L. (1997). Practical HPLC Method Development.
2.ed. New York, John Wiley and Sons, p.21-58.
11
3. PARAMETROS CROMATOGRAFICOS
3.1 Fator de Reteno (k)
Medida adimensional e fundamental da reteno em cromatografia lquida. E definido como
a razo entre o nmero de molculas do soluto na fase estacionria e o nmero de molculas do
soluto na fase mvel, sendo:
N,
k = ^N*
(3.1)
A combinao das Equaes 2.3, 2.4 e 3.1 leva ao desenvolvimento da Equao 3.2, que
correlaciona o fator de reteno (k) de um soluto com o seu tempo de reteno (tr) e o tempo de
reteno de um soluto no retido (tj:
R=
t.
R=
(2.3)
N"
N + N
t
tr
(2.4)
Nn
Nm+N.
t0(Nm+N.) = Nmx t r
toXNn,+t0 xNa =Nmx t r
t0 x N , = N mx t r - N mx t 0
t xN, = Nm(tr - 10)
Ne = t r-. t o
Nm
tn
Ne
,,
ecomo ik =
(3.1),
Nm
k = - -
(3.2)
3.2 Nmero de Pratos (N)

Cada prato corresponde a uma etapa de equilbrio do soluto entre as duas fases. Mede a
eficincia das condies cromatogrficas, atravs dos tempos de reteno obtidos e do alargamento
de bandas. Este parm etro norm alm ente utilizado para avaliar a performance da coluna,
admitindo-se uma escolha adequada das condies.
N= ( i )
(3.3)
g _ w0 _ w b
2,354
Ento,
N = 16
't *
vwby
N = 5,54
(3.4)
(3.5)
Como o valor de N aproximadamente constante para diferentes bandas em um

cromatograma, o alargamento das bandas aumenta proporcionalmente com o aumento do tempo
de reteno.
A utilizao da largura do pico na meia altura mais simples, por no exigir a extrapolao
das linhas tangentes ao ponto de inflexo, sendo tambm mais exata.
Altura Equivalente a um Prato (H)

E a correlao entre o nmero de pratos tericos e o tamanho da coluna. Utilizada para
comparao de eficincia entre colunas de diferentes comprimentos.
H =
N
(3.6)
Altura do Prato Reduzido (h)

Correlaciona a altura equivalente a um prato terico com o dimetro das partculas, sendo
utilizado para a comparao de eficincia entre colunas de diferentes comprimentos, empacotadas
com partculas de diferentes dimetros.
As Equaes 3.6 e 3.7 mostram que o nmero de pratos (N) diretamente proporcional ao
comprimento da coluna (L) e inversamente proporcional ao dimetro das partculas (d j.
A obteno do valor de N necessrio separao deve considerar tambm o tempo de anlise
e a presso exercida pela coluna no sistema. A presso diretamente proporcional ao comprimento
da coluna e inversamente proporcional ao dimetro das partculas. Desta forma, aumenta-se N
preferencialmente por intermdio da utilizao de partculas de menor dimetro em colunas de
menor comprimento.
As colunas analticas comerciais tm usualmente 15 ou 25 cm, sendo empacotadas com
partculas de 5 ou 10 p.. Colunas com partculas de 3 JX e comprimentos menores do que 15 cm
tm sido usadas para anlises rpidas.
Os nmeros de pratos das colunas comerciais variam entre 25.000 e 50.000 pratos/m.
Disperso Extracoluna (o^

E o alargamento causado por difuso no injetor, no detector e/ou na tubulao.
a e - i n j + a det + C T enc
(3.8)
13
Como o alargamento de bandas aumenta com o aumento da reteno, as contribuies ante

riores so significativas apenas para valores baixos de k. Volumes extra coluna inferiores a 10% do
volume do pico so ideais.
Os equipamentos atuais so configurados de forma a evitar volume morto. So utilizadas
tubulaes com 0,8 mm d.i. antes do injetor e 0,3 mm d.i. depois dele.
Assimetria de Picos (As)

Embora no prevista teoricamente, extremamente comum. Suas principais causas so: a
m istura dos mecanismos de reteno, a incom patibilidade da amostra com a fase mvel e/ou
estacionria e a existncia de volume morto no topo da coluna. E calculada da seguinte forma:
b f
A. = -
(3.9)
Figura 3.1 Esquema e equao para o clculo da assimetria de um pico.
H divergncias quanto posio em que a assimetria deve ser calculada. H recomendaes

para que a mesma seja calculada tanto a 5% como a 10% da altura do pico, como mostra a Figura
3.1.
3.3 Fator de Separao (a)

Mede a seletividade da separao para duas bandas adjacentes. E a relao entre seus fatores
de reteno, sendo calculado da seguinte forma:
k2
-]
(3.10)
Pode ser alterado por variaes na fase mvel e/ou estacionria, temperatura, pH e fora inica.
Resoluo (Rs)
Mede a qualidade da separao. Leva em conta as larguras das bandas, alm de seus respectivos
tempos de reteno. Pode ser estimada ou medida de trs formas:
Por intermdio das equaes a seguir, para picos bem resolvidos (Rs > 1,0)
Rs =1,18-
(3.12)
Por comparao com curvas de resoluo padro (0,4 < Rs < 1,3) (Figura 3.2)
1/1
1/4
1/16
R s= 0,6
R, - 0,8
R, = 1.0
R, = 1,25
Figura 3.2 Curvas de resoluo padro.
Por intermdio de clculos baseados no vale entre duas bandas, os quais fornecem valores
mais precisos para 0,8 < R < 1,5 (Figura 3.3 e Tabela 3.1)
Figura 3 .3 Esquema para a medida da altura das bandas e do vale entre elas.
15
Tabela 3.1 Estimativas do valor de Rs baseadas na altura do vale entre duas bandas (hv expresso como a
porcentagem dele em relao ao menor pico).
Rs
hv(%)
3
5
8
10
15
20
30
40
50
60
70
80
1/1
1,46
1,35
1,26
1,22
1,14
1,07
0,97
0,90
0,83
0,78
0,73
0,68
de acordo com a razo entre as bandas (hi/fe)

2/1
4/1
8/1
*.
.1,50
1,42
1,48
1,52
1,40
1,33
1,45
1,29
1,41
1,35
1,21
1,27
1,33
1,21
1,15
1,27
1,06
1,12
1,19
0,98
1,06
1,12
0,92
1,00
1,07
1,02
0,87
0,95
0,82
0,90
0,97
0,78
0,86
0,93
16/1
1,47
1,39
1,33
1,24
1,18
1,12
1,08
1,03
0,99
Resoluo de linha de base alcanada com valores Rs ^ 1,5. Importante a obteno da

resoluo necessria com o menor tempo de anlise. O Rs desejado deve corresponder, ao tipo de
aplicao da separao, ou seja, anlise qualitativa, quantitativa ou separaes preparativas.
Referncias
GILBERT, M.T. (1987). High Performance Liquid Chromatography. Bristol, Whight. p.5-11.
RILEY, C.M. (1995). Efficiency, retention, selectivity and resolution in chromatography. In:
WAINER, I.W.; LOUGH, W.J. eds. High Performance Liquid Chromatography, Fundamental
Principles and Practice. Glasgow, Blackie Academic & Professional, p. 15-35.
SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J. (1979). Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2.ed. New
York, John Wiley and Sons. p. 15-82.
SNYDER, L.R., KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L. (1997). Practical HPLC Method Development,
17
4. INSTRUMENTAO
A instrum entao necessria para HPLC extremamente sofisticada, m uito diferente dos
aparelhos utilizados pela Cromatografia Lquida Clssica. A Figura 4.1 mostra os componentes
fundamentais de um equipamento para HPLC.
Atualmente, existem equipamentos totalmente computadorizados. So divididos em mdulos,
que podem ser controlados individualmente ou por computador. Os softwares disponveis so
capazes de detectar problemas de funcionamento e tambm a necessidade de troca de alguma pea.
O desenvolvimento de colunas com fases estacionrias preparadas com partculas de menor

dim etro, as quais ofereciam maior resistncia passagem de fase mvel, tornou necessria a
utilizao de sistemas de bombeamento mais eficientes. As primeiras bombas utilizadas, conhecidas
como bombas de baixa presso, produziam fluxos pulsantes, sendo inadequadas para tal fim.
Uma bomba de HPLC precisa ser capaz de produzir fluxo constante e reprodutvel, sem pulsos,
nas altas presses necessrias, e ser resistente s fases mveis utilizadas.
As bombas analticas atuais operam em presses de no mximo 500 bar (7000 psi), em fluxos
de 0,01-10 mL/min, e so feitas de ao inoxidvel (tubulaes e demais partes), safira, cermica,
quartzo ou titnio (pistes), rubi (assentos das check valves) e teflon (selos) e outros polmeros.
4.1 Bombas
Existem dois tipos de bombas para HPLC: as bombas que produzem fluxo varivel a uma
presso constante e as que produzem fluxo constante a uma presso varivel, sendo as ltimas as
utilizadas em HPLC.
Bombas de presso constante

Pneumticas
Bombas em que o lquido deslocado mediante a presso exercida por um gs inerte alta
presso.
No so utilizadas em HPLC por fornecerem fluxos variveis e com pulsao, devido ao seu
mecanismo de ao, mas so muito utilizadas para o empacotamento de colunas, pelas altas presses
geradas.
18 Edil FSCar - Apontamentos
Bombas de fluxo constante

Seringa
Funciona de maneira anloga a uma seringa, sendo o mbolo movido por um motor, que
possibilita o deslocamento do lquido a um fluxo constante.
s cmaras (seringas) possuem capacidade limitada de fase mvel, embora existam modelos
para at 500 mL.
No so mais utilizadas por uma srie de fatores, tais como: a necessidade de recarregamento
constante da cmara de solvente ou troca deste e o tempo requerido para que ela chegue ao fluxo
nominal.
Atualmente, tm sido utilizadas em micro HPLC, pela ausncia de pulsos.
Recprocas
Representam 85% das bombas utilizadas em HPLC. Tambm so chamadas de bombas de
pisto ou diafragma.
O funcionamento destas bombas baseia-se em um pisto, movido por um motor eltrico, que
empurra a fase mvel atravs do sistema cromatogrfico (Figura 4.2).
Safda de
fase mvel
fase mvel
Figura 4.2 Esquematizao de uma bomba recproca.
O grande problema destas bombas a produo de fluxos pulsantes, decorrentes do movimento

de ida e volta do pisto.
Bombas com dois ou mais pistes e o uso de sistemas de amortecimento foram desenvolvidos
para contornar a pulsao.
O uso de bombas com apenas um pisto, sendo este muito pequeno, j se tornou mais comum
que o modelo anterior, de dois pistes, por ser mais simples e muito eficiente.
4.2 Injetores
Inicialmente, a introduo da amostra era feita com microsseringas, de maneira anloga
Cromatografia Gasosa.
Atualmente, so utilizados injetores de vlvula e, embora existam diversos modelos no mercado,
o princpio de operao de todos o mesmo.
A ala de amostragem (loop) de tais vlvulas pode ser externa ou interna. As alas externas nada
mais so que tubulaes de volume preciso, as quais podem ser trocadas para que se permita a
injeo de diferentes volumes de amostra.
Estas vlvulas possuem duas posies. Na posio LOAD, a amostra injetada na ala de
amostragem com uma seringa de ponta rombuda, sendo o excesso imediatamente descartado (Figura
4.3a, entradas 1-6-3-2).
19
Seringa com amostra

P o s i o
LOAD
Seringa com amostra
P o s i o
in je c t
Descarte
Descarte
Sada para
a coluna
Sada para
a coluna
Entrada de
fase mvel
4
Entrada de
fase mvel
Figura 4.3 Injetor de vlvula, a) Posio LOAD e b) posio INJECT.
A posio INJECT abre a vlvula para que a fase mvel empurre a amostra para a coluna (Figura
4.3b, entradas 4-3-6-5).
A lavagem da ala de amostragem, antes da injeo da amostra, com aproximadamente dez
vezes o volume desta, recomendvel, de modo a assegurar a remoo de possveis resduos.
Estas vlvulas, embora caras, possibilitam a injeo de amostras nas presses necessrias a estes
sistemas, com grande eficincia e preciso.
So facilmente automatizveis, por interm dio de motores eltricos ou pneumticos,
controlados por computador. Estes injetores automatizados so denominados auto-injetores e so
capazes de injetar um grande nmero de amostras sem a presena do analista, alm de operaes
como diluio, derivatizao ou adio de reagentes.
4.3 Detectores
A funo destes equipamentos a deteco dos compostos vindos do eluente da coluna.
Algumas das caractersticas desejadas ao escolher um detector so: alta sensibilidade, alta
seletividade, linearidade; baixo limite de deteco e estabilidade frente a mudanas na composio
da fase mvel e na temperatura.
Os detectores para HPLC so classificados em duas categorias: os que detectam propriedades
existentes tanto na fase mvel como nos solutos (no-seletivos) e os que apenas detectam
propriedades inerentes ao soluto (seletivos). A limitao em relao utilizao de detectores
universais reside no fato de que muitas vezes as propriedades do soluto e da fase mvel so similares.
UV-Visvel
E o detector mais utilizado em HPLC.
Princpio: absoro de luz ultravioleta ou visvel, por parte da amostra, quando nela passa
radiao eletromagntica.
E um detector seletivo para molculas que possuem cromforos.
H trs diferentes tipos de equipamentos, operando de acordo com o princpio descrito acima:
os fotmetros de comprimento de onda fixo, os espectrofotmetros e os detectores por arranjo de
fotodiodos.
Os fotmetros de comprimento de onda fixo tm sua aplicao restrita a molculas que
absorvam no comprimento de onda em que eles trabalham.
Os espectrofotmetros so mais versteis, permitindo a escolha do comprimento de onda mais
adequado a cada anlise. Estes equipamentos podem emitir apenas luz ultravioleta, de 190-600 nm,
atravs de lmpadas de deutrio, como tambm na regio do visvel, de 350-900 nm, utilizando-se
lmpadas de tungstnio.
Os detectores por arranjo de fotodiodos fornecem espectros no UV-Vis do eluente da coluna

em determinados intervalos de tempo. So especialmente teis para o desenvolvimento de mtodos,
por possibilitarem uma varredura da regio UV-Vis em uma nica corrida cromatogrfica, para
medidas de pureza de pico e para a anlise de amostras desconhecidas.
Recomenda-se a utilizao do comprimento de onda mximo do analito, desde que este seja
superior a 220 nm, pois abaixo deste valor geralmente observa-se interferncia da fase mvel.
Embora alguns eluentes possibilitem a anlise em comprimentos de onda mais baixos (por exemplo,
acetonitrila/gua - 200 nm), sugere-se a utilizao do comprimento de onda de um cromforo mais
fraco, em um comprimento de onda mais alto. A Tabela 4.1 mostra os comprimentos de onda
mnimos para que no se observe interferncia da fase mvel.
Tabela 4.1 Comprimento de onda mnimo dos solventes mais utilizados.
Solvente
Acetona
Acetonitrila
Benzeno
Tetracloreto de carbono
Clorofrmio
Ciclohexano
ter etlico
Dimetilsulfxido
Etanol
Acetato de etila
Hexano
Metanol
Pentano
1-Propanol
Tetraidrofurano
Tolueno
Agua
UV (nm) mnimo
330
200
280
265
245
210
220
270
210
255
200
210
200
210
215
285
190
Fluorescncia
Princpio: emisso de energia fluorescente por um soluto que foi excitado por radiao UV.
Baseia-se no fato de que, quando uma molcula absorve luz e um eltron promovido a um estado
de maior energia, existe uma srie de caminhos pelos quais esta energia pode ser dissipada.
Normalmente, esta energia perdida por sua transferncia s molculas vizinhas. Entretanto,
algumas molculas podem perder apenas parte da energia indo ao mais baixo nvel vibracional do
estado excitado. A energia restante pode ser perdida pela emisso de um fton, sendo este processo
denominado de fluorescncia.
um detector seletivo, para molculas que fluorescem, ou seja, sistemas aromticos policclicos
ou que contenham duplas ligaes conjugadas mltiplas.
Devido ao seu princpio de operao (emisso de luz), muito mais sensvel e seletivo que o
UV (absoro).
Os com prim entos de onda de absoro e emisso devem ser escolhidos pelo espectro de
fluorescncia do(s) soluto (s).
Podem ser feitas reaes de derivao pr ou ps-coluna, para que o analito se torne
fluorescente. A fluorescamina e o cloreto de dansila so reagentes muito utilizados para tal fim.
21
ndice de refrao
Princpio: mede a diferena no ndice de refrao da fase mvel e do eluente vindo da coluna.
E um detector no-seletivo, sensvel a variaes na temperatura, presso, fluxo e composio
da fase mvel. Apresenta baixa sensibilidade e difcil de estabilizar, sendo inadequado para eluio
gradiente.
E muito utilizado em anlises de amostras que no absorvem no UV e no fluorescem e em
cromatografia preparativa.
Infravermelho
Princpio: absoro de luz infravermelha (4000 cm_1-670 cm '1), por parte da amostra, quando
nela passa radiao eletromagntica. Esta radiao causa apenas movimentos vibracionais na
molcula e estes so caractersticos dos grupos presentes na mesma.
E um detector no-seletivo, mas apresenta uma srie de limitaes, como necessidade de
eliminao do solvente, material de fabricao da cela e limite de deteco alto.
Embora muitas das limitaes venham sendo contornadas pela evaporao do solvente e pelo
uso de transformadas de Fourier (FT-IR), este detector muito pouco utilizado.
Polarmetro e dicrosmo circular

Princpio: medem o efeito da luz plana ou circularm ente polarizada sobre compostos
oticamente ativos.
So equipamentos seletivos, especficos para a deteco de compostos quirais.
So teis para a determinao da ordem de eluio de pares enantiomricos, sendo possvel a
determinao da configurao absoluta destes, por dicrosmo circular, por intermdio de regras
empricas ou no empricas.
Enquanto o polarmetro opera em qualquer comprimento de onda, por dicrosmo circular a
amostra s vista nos comprimentos de onda em que ela absorva energia.
Eletroqumicos
Princpio: baseiam-se em interaes eletroqumicas teis deteco do analito por HPLC.
Medem a condutncia do eluente (Detectores de Condutividade) ou a corrente associada oxidao
ou reduo dos solutos (Amperomtrico, Coulomtrico).
Embora todos sejam detectores eletroqumicos, esta designao usualmente empregada para
aqueles que medem a corrente no fluxo da clula (Amperomtrico, Coulomtrico).
So detectores seletivos, para solutos inicos, oxidveis ou redutveis, e apresentam alta
sensibilidade e baixos limites de deteco.
No se popularizaram como esperado, devido necessidade de manuteno peridica dos
eletrodos e clulas e complexidade de operao, sendo, entretanto, m uito utilizados em
cromatografia de troca inica (Detector de Condutividade) e em pesquisas biomdicas.
As condies adequadas so determinadas experimentalmente observando-se a resposta dada
pelo detector para uma srie de potenciais aplicados.
Espalhamento de luz (light-scattering)

Princpio: envolve a nebulizao do eluente vindo da coluna em um aerossol, seguido de
vaporizao do solvente para produzir pequenas partculas que sero detectadas em uma cela de
espalhamento de luz. A intensidade da luz espalhada depende do tamanho das partculas formadas
no tubo de aquecimento, que, por sua vez, depende do tamanho das gotcuias formadas durante o
processo de nebulizao. A interao da luz com a partcula depender de seu tamanho, forma e
propriedades superficiais.
um detector no-seletivo, destrutivo.
muito utilizado para a deteco de cidos graxos e para anlises de pureza.
Espectrometria de massas
A utilizao deste detector vem se tornando comum, apesar do seu alto preo, da necessidade
de um operador especializado e dos gastos com manuteno.
um detector universal, embora destrutivo, que apresenta alta sensibilidade, fornece a massa
molecular dos solutos e permite a elucidao estrutural destes.
Pode ser utilizado como um detector extremamente seletivo, fixando-se um on molecular. A
utilizao de MS-MS permite a fragmentao dos ons j formados, fornecendo informaes
estruturais e aumentando a seletividade.
Devido incompatibilidade entre o fluxo lquido vindo da coluna e o alto vcuo existente em
tais equipamentos, necessria a utilizao de uma interface. Vrias so as interfaces disponveis,
bem como os mtodos de ionizao e os analisadores de massa.
o detector ideal para estudos de bioequivalncia.
Ressonncia magntica nuclear

Combina o poder de separao da HPLC s informaes estruturais obtidas pela RMN.
No um detector de uso rotineiro, devido dificuldade encontrada em sua hifenao
HPLC. O desenvolvimento de interfaces adequadas tem sido investigado, de modo a contornar os
problemas em relao ao tempo necessrio para a aquisio de dados e a supresso dos sinais do
solvente.
Referncias
FIELDEN, PR. (1992). Recent Developments in LC Detector Technology. /. Chromatogr Sei, v.30,
p.45-51.
LINDSAY, S. (1989). High Performance Liquid Chromatography. New York, John Wiley and Sons.
p.9-50.
LLOYD, D.K. (1995). Instrumentation: Detectors and Integrators. In: WAINER, I.W.; LOUGH,
W. J. eds. High Performance Liquid Chromatography, Fundamental Principles and Practice.
Glasgow, Blackie Academic & Professional, p. 14-142.
NOCTOR, T. (1995). Instrumentation: Pumps, Injectors and Column Design. In: WAINER, I.W.;
LOUGH, W.J. eds. High Performance Liquid Chromatography, Fundamental Principles and
Practice. Glasgow, Blackie Academic & Professional, p.97-113.
SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L., Practical HPLC Method Development, 2.ed. New
York, John Wiley and Sons. p.59-99.
23
5. SILICA GEL
Slica gel a matria-prima mais importante das fases estacionrias da cromatografia lquida.
E um material extremamente verstil, podendo ter sua superfcie alterada por derivao qumica,
possibilitando, desta forma, a criao de diversos tipos de fases estacionrias com diferentes
mecanismos de separao.
E um polmero composto por tomos tetradricos de silcio conectados entre si por tomos
de oxignio (ligaes siloxano, Si-O-Si), tendo grupos silanis (Si-OH) de diferentes tipos (Figura
5.1a, b, c) em sua superfcie.
a
OH
SI
i \
HO.
\
PH
Si
OH.............
OH
'
Si
! '
Si
I
Figura 5.1 Tipos de silanis. a) Livre; b) geminai; e c) com ligaes de hidrognio.
E uma forma amorfa, altam ente porosa e parcialmente hidratada de slica, preparada
usualmente pela hidrlise cida do silicato de sdio, seguida por emulsificao em uma mistura
lcool/gua e subseqente condensao, quando ento lavada e seca para uso.
As condies de preparao da slica gel (pH, catalisadores, temperatura) determinaro suas
propriedades. As caractersticas mais importantes, reguladoras de sua performance cromatogrfica,
so: tamanho mdio de partcula, formato da partcula, rea superficial especfica, tamanho do poro,
pH, nmero de grupos silanis e a presena de ons metlicos.
A superfcie da slica funo de suas condies de preparao. Slicas com grande nmero
de silanis livres (Figura 5.1a) so mais cidas que as slicas com grupos hidroxilados (Figura 5.1b
e 5.1c). A Tabela 5.1 mostra uma escala da acidez relativa de diferentes slicas comerciais. Deve-se
ter em mente que slicas cidas so boas para compostos cidos e ruins para bsicos, e vice-versa.
Tabela 5.1 Escala da acidez relativa de algumas slicas comerciais.
Zorbax RX
Vydac
Rsil
Nucleosil
Polygosil
Novapak
m-Bondapak
Supelcosil DB
Spherisorb 2
LiChrosorb
Chrompack
Hypersil
Perkin-Elmer
Supelcosil
Zorbax
Micropak
Menos cida
Mais cida
Suas partculas podem ser esfricas (Figura 5/2a) ou irregulares (Figura 5.2b). O uso de
partculas esfricas, embora mais caras, tem sido preferido, por estas apresentarem maior
durabilidade e eficincia.
Figura 5.2 Partculas a) esfricas e b) irregulares.
A slica gel utilizada como fase estacionria em cromatografia no modo normal, no sendo
recomendado seu uso com fases mveis aquosas.
Devido alta polaridade da gua e sua forte afinidade com os grupos silanis da superfcie
da slica, mesmo a presena de pequenas quantidades de gua altera o comportamento
cromatogrfico de tais colunas, causando a desativao da slica.
Colunas de slica no podem ser usadas em pH > 8, pois ela comea a se tornar solvel.
As principais desvantagens do uso de colunas de slica esto associadas gua. Alm da
impossibilidade de seu uso na fase mvel, sua presena em traos afeta profundamente a
reprodutibilidade das anlises. Outro problema sua inadequao ao uso em eluio gradiente.
Referncias
SCOTT, R.P. W. (1993). Silica Gel and Bonded Phases: Their Production, Properties and Use in LC.
New York, John Wiley and Sons. p. 1-261.
New York, John Wiley and Sons. p.54-83.
25
6. FASES QUIMICAMENTE LIGADAS

So as fases estacionrias mais utilizadas atualmente.
A alta polaridade da slica tornava difcil a separao de compostos polares. Para contornar este
problema, foram inicialmente desenvolvidas fases com lquidos, geralmente leos, mecanicamente
aderidos em um suporte inerte. Estas fases apresentavam baixa eficincia e reprodutilidade.
As fases quim icam ente ligadas foram desenvolvidas visando eliminao destas falhas,
buscando-se fases estacionrias que pudessem reter os solutos por meio de outros tipos de interao
que no a polaridade. A proposta inicial era a produo de fases que mimetizassem as fases lquidas
aderidas, sendo estveis, eficientes e reprodutveis.
A superfcie da slica pode ser modificada de vrias maneiras:
1. Por reao dos grupos silanis com um lcool, produzindo um alcoxisilano.
si OH
R OH
-------
Si O
2. Por halogenao dos grupos silanis e posterior reao com um nuclefilo, produzindo, por
exemplo, um alquilaminosilano.
Si
OH
S 0 2CI 2
-------- ^
Si
Cl
R NH2
Si NH R
3. Por reao com organosilanos, levando formao de ligaes siloxano.
__
Si
0Et
OH
Si OEt
---/
Si
Si
OH
|
OEt
OH
\
---------------- O
gj
2) CH3OH/H20
\
1) Refluxo em
tolueno
Si
\ /
Das formas descritas acima, a ltima a mais utilizada. Enquanto a primeira leva a um produto
pouco estvel, facilmente hidrolisvel, a formao da ligao siloxano muito conveniente por
produzir uma fase consideravelmente estvel.
A variao da cadeia lateral do organosilano possibilita a preparao de uma grande variedade
de fases estacionrias a serem utilizadas nos diferentes modos de separao. Grupos octadecil, octil
e propil, na cadeia lateral, so usados na preparao de fases estacionrias a serem utilizadas no modo
reverso, enquanto grupos aminoalquil, fenil e cianopropil so utilizados na derivao de slica, com
aplicabilidade em modo reverso ou normal. Grupos diis na cadeia lateral so teis preparao
de fases para cromatografia em fase normal e excluso.
A utilizao de grupos octadecil leva formao da fase octadecilsilano, conhecida por ODS
ou C18, sendo esta a fase mais utilizada em HPLC analtico. A presena deste grupo torna a fase
apoiar, em relao slica no derivada.
A reteno nestas fases dependente da quantidade de carbono presente, geralmente expressa

em porcentagem. Desta porcentagem e da quantidade de silanis residuais depender a qualidade
da separao a que se aplica.
Esta derivao, por razes estricas, no atinge todos os grupos silanis. Os grupos silanis
restantes, em alguns casos, ao interagir com o soluto, causam rabeamento dos picos. Este problema
pode ser minimizado reagindo-se a slica, aps a derivao, com trimetilclorosilano, que, por ser
menor, tem acesso a alguns destes grupos, formando trimetilsilanos, embora no seja possvel a
derivao de todos os grupos silanis. Este processo chamado capeamento (end capping. Em
cromatografia por pareamento de ons, recomendvel a utilizao deste tipo de fase.
Referncias
p.9-50.
SCOTT, R.P.W. (1993). Silica Gel and Bonded Phases: Their Production, Properties and Use in LC.
SNYDER, L.R.; KIRKLAND, JJ. (1979). Introduction to Modern Liquid Chromatography. 2.ed. New
York, John Wiley and Sons, p.269-348.
27
7. MODOS DE SEPARAO
A classificao da cromatografia lquida de acordo com a fase estacionria levou a uma grande
variedade de tipos. A primeira grande diviso feita foi: cromatografia de adsoro e cromatografia
de partio, referindo-se s fases estacionrias slida e lquida, respectivamente.
No caso das fases estacionrias serem lquidas, estas podem estar simplesmente adsorvidas sobre
um suporte slido ou imobilizadas sobre ele. No primeiro caso, a cromatografia referida como
cromatografia de partio. A cromatografia de partio perdeu espao para a cromatografia de fases
quimicamente ligadas, devido maior estabilidade conferida por estas quando comparadas com as
fases lquidas adsorvidas. Estas fases com suportes modificados so consideradas parte por dife
rirem dos outros dois modos em seu mecanismo de separao.
O grande desenvolvimento conseguido a partir das fases lquidas quimicamente ligadas fez com
que estas sejam as fases majoritariamente usadas em HPLC analtico.
A separao de uma mistura por HPLC se d por uma ou mais interaes entre o soluto, a
fase estacionria e a fase mvel, as quais podem ser pontes de hidrognio, interaes eletrostticas
e hidrofbicas ou foras de Van der Waals, entre outras. Os modos de separao podem ser
classificados de acordo com a natureza destas interaes. So eles: cromatografia em fase reversa,
em fase normal, por pareamento de ons ou por troca inica e por excluso.
A escolha do modo mais adequado separao de um soluto baseada em sua natureza, peso
molecular, polaridade e carter inico.
7.1 Modos de Reteno

A reteno em cromatografia lquida dependente das interaes entre soluto-fase mvel,
soluto-fase estacionria e fase mvel-fase estacionria. Assim, a escolha do modo de separao
depende da escolha da fase estacionria e da fase mvel para cada classe de soluto.
Dois modelos de reteno em cromatografia lquida foram propostos. O primeiro por Scott
e Kucera, interao-solvente, e o segundo por Snyder, competio-solvente. Os dois modelos so
equivalentes, uma vez que ambos consideram que, em uma dada separao, a interao do soluto
com a fase estacionria permanece constante e, portanto, a reteno determinada pela composio
da fase mvel.
7.2 Cromatografia no Modo Normal

A fase estacionria mais polar que a fase mvel; o oposto ocorre em cromatografia no modo
reverso. Os solventes usados so normalmente uma mistura de solventes orgnicos sem a adio de
gua. As fases estacionrias so adsorventes orgnicos (slica, alumina) ou fases polares quimicamente
ligadas (ciano, diol, fenil, amino).
Os dois modelos de reteno, interao-solvente (Figura 7.1a) e competio-solvente (Figura
7.1b), tm sido usados com sucesso para descrever o efeito da fase mvel em cromatografia lquida
no modo normal. Independentemente do modelo usado, a reteno em fase normal aumenta com
o decrscimo da polaridade da fase mvel.
Embora molculas inicas ou ionizveis possam ser separadas por cromatografia no modo
normal, a aplicao majoritria tem sido para molculas neutras.
As molculas hidrofbicas (menos polares) so eludas prim eiro, enquanto as molculas
hidroflicas (mais polares) so mais retidas. O oposto acontece em cromatografia no modo reverso.
Grandes mudanas em seletividade so conseguidas por alterao na fase mvel ou estacionria.
o modo de separao preferido, por isso, para separaes de ismeros de posio ou estereoismeros.
Quando a dissoluo da amostra apresenta problemas em solventes polares e dificulta a injeo

no modo reverso de eluio, a separao no modo normal recomendada. Devido maior facilidade
no manuseio da amostra em solventes orgnicos, para o isolamento, em separaes preparativas
o modo mais aplicado.
A fora de diferentes misturas de solventes para eluio no modo normal pode ser medida
experimentalmente e representada por . A Tabela 7.1 lista alguns dos solventes mais usados em
cromatografia, tendo slica gel como fase estacionria. A fora relativa para os solventes em outras
fases estacionrias segue o mesmo caminho.
Tabela 7.1 Fora (e ) e seletividade de alguns solventes.
Solvente
Hexano, heptano
Clorofrmio
Diclorometano
ter etlico
Medi -butil ter
Acetato de etila
Dioxano
Acetonitrila
THF
1 ou 2-propanol
Metanol
e
0,00
0,26
0,30
0,38
0,48
0,48
0,51
0,52
0,53
0,60
0,70
Localizao
No
No
No
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
a) a basicidade irrelevante para solventes no-localizados

b) apresenta diferente seletividade devido ao grupo doador de prtons
Basicidade
a
a
a
Sim
Sim
No
Sim
No
Sim
b
b
29
O solvente para eluio no modo normal selecionado escolhendo-se um solvente fraco e

misturando com um solvente forte para conseguir a fora desejada.
A presena de traos de gua na fase mvel provavelmente a causa mais comum da pobre
reprodutibilidade na reteno quando se trabalha no modo normal, especialmente quando se usa
slica no modificada como fase estacionria. Este problema tem sido resolvido trabalhando-se com
solventes anidros com um volume conhecido de gua, metanol ou cido actico para desativar os
grupos silanis mais reativos da fase estacionria. Alm de melhorar a reprodutibilidade, melhora
o formato do pico. O mesmo efeito pode ser conseguido adicionando-se trietilamina, essencial na
separao de aminas em slica gel.
O uso de slicas quimicamente modificadas em eluio no modo normal tem sido preferida,
uma vez que elas oferecem stios especficos de interao com o soluto, alm de oferecer uma
superfcie mais homognea quando comparada com a slica gel, que tem uma variedade de grupos
silanis de diferentes polaridades. As fases quimicamente ligadas so teis para cromatografia de
compostos moderadamente polares, entretanto, estes solutos podem tambm ser eficientemente
resolvidos no modo reverso de eluio, e a escolha entre eluio no modo normal ou reverso ,
usualmente, mais dependente da matriz que do soluto.
7.3 Cromatografia no Modo Reverso

Enquanto na cromatografia em fase normal a fase estacionria mais polar que a fase mvel,
no modo reverso a fase mvel mais polar que a fase estacionria. A cromatografia em fase reversa
a mais utilizada em HPLC, uma vez que permite a separao de uma grande variedade de solutos
e o uso de fases mveis aquosas. A fase mvel mais comumente utilizada uma m istura de
acetonitrila/gua, sendo a acetonitrila, quando necessrio, substituda por m etanol ou
tetraidrofurano (THF). O uso de apenas esses trs solventes deve-se pequena quantidade de
solventes orgnicos miscveis com gua. J no modo normal, h uma maior variedade de solventes
disponveis.
O princpio da reteno em fase reversa a hidrofobia. A separao em fase reversa se deve
principalmente a interaes entre a parte no-polar do soluto e a fase estacionria, isto , repulso
desta parte do soluto pela fase mvel aquosa.
A aplicao da teoria solvofbic de Sinanoglu, por Horvth e colaboradores, cromatografia
de fase reversa provavelmente o tratamento mais completo do assunto. A teoria engloba elementos
dos modelos de solvente-interao e solvente-competio, levando em considerao todas as
interaes entre soluto-solvente-fase estacionria que levam reteno.
A reteno em fase reversa aumenta com o aumento de gua na fase mvel. O logaritmo do
fator de reteno, k, para um determinado soluto varia linearmente com o volume de solvente
orgnico na fase mvel de acordo com a equao:
logk = logkw- S O
(7.1)
kw o fator de reteno quando o solvente 100% aquoso. O coeficiente de inclinao, S, pode

ser usado para indexar a fora do solvente em fase reversa. A relao mostrada na equao abaixo
pode ser feita, sendo k o fator de reteno de um soluto de referncia quando O igual a 1.
S = logkw -lo g k s
(7.2)
Estas relaes so mantidas somente quando variaes da ordem de 0,3 so feitas. Para maiores
variaes deve-se usar uma relao quadrtica:
log k = log kw + A O + BO2
(7.3)
A fora do solvente em fase reversa depende no s do percentual de B, mas tambm do tipo

de solvente orgnico usado. Devido limitao de miscibilidade, o nomgrafo a seguir (Figura 7.2)
tem sido amplamente usado para ajustar a fora entre os trs solventes mais comumente utilizados
em fase reversa. E importante ressaltar que a fora do solvente em fase reversa aumenta com o
decrscimo da polaridade do solvente. Assim, gua (solvente mais fraco) < metanol < acetonitrila <
tetraidrofurano < diclorometano. Diclorometano, por no ser sluvel com gua, no usado em
fase reversa, mas por ser um solvente muito forte , s vezes, usado para limpar as colunas de fase
reversa que foram contaminadas por solutos fortemente retidos.
Acetonitrila, alm de poder ser usada em uma baixa faixa de absoro no ultravioleta, apresenta
solues aquosas com baixa viscosidade, o que desejvel; Assim, juntamente com metanol e THF,
estes so os solventes mais usados para controlar a seletividade e separao no modo reverso de
eluio.
ApM /u n
AON/ttjU
0,----,----1
10 20----1
30----,----1
40 50----1
60----1
70----1
80----1
90----1
100
MaHM/M n
T H p /h n
Me0 H/H20
20
10
40
20
60
80
100
,----- 1----- 1------ 1------- 1--------1

30
40
50
60
70
80
90
100
l------1------1----- 1----- 1----- 1------ 1------ 1------ 1-------1-------1
Figura 7.2 Nomgrafo para alterao de solventes no modo reverso.
Quando, por algum motivo, no se usa gua na fase mvel, usando fases estacionrias apoiares,
a cromatografia dita cromatografia no-aquosa de fase reversa. Ela s usada quando se trabalha
com solutos muito hidrofbicos, como lipdios e polmeros, e o solvente normalmente consiste em
uma mistura de solventes polares, como acetonitrila ou metanol (solvente A), com um solvente mais
fraco (B), como THF, clorofrmio, diclorometano, acetona, metil--butil ter. A reteno, neste caso,
tambm alterada pelo percentual de/ou o tipo B.
7.4 Cromatografia de Compostos lnicos

Separaes cromatogrficas de compostos inicos tendem a ser mais complicadas que a de
molculas neutras, mas, por outro lado, o espaamento de bandas usualmente conseguido com
maior facilidade. A separao de compostos ionizveis pode ser conseguida por supresso da
ionizao ou, ento, por completa ionizao e separao por pareamento de ons ou por troca inica.
Estas duas ltimas opes tambm se aplicam a ons.
Em cromatografia de fase reversa, a reteno diminui para compostos mais hidroflicos, assim,
quando um cido ou uma base so ionizados, eles se tornam menos hidrofbicos e, conseqente
mente, a reteno reduzida. Assim, com o aumento de pH, a reteno para cidos diminui e para
bases aumenta.
Quando o pH igual ao pKa de um composto, este se encontra parcialmente ionizado. Todas
as mudanas de reteno ocorrem dentro de uma faixa de 1,5 unidade de pKa Fora desta faixa, o
composto ou est ionizado ou est no ionizado, e a reteno no muda muito. A situao mais
complicada para compostos que contm m ltiplos grupos cidos ou bsicos. Para compostos
anfteros, a reteno pode ser ainda mais complexa. A molcula mais hidroflica quando a carga
total de ons zero, ou seja, maximamente ionizada (Figura 7.3).
31
pH
Figura 7.3 Relao terica entre o fator de reteno (k) e o pH da fase mvel.
Devido maior facilidade, a prim eira alternativa de separao para molculas ionizveis a
supresso da ionizao e eluio no modo reverso. A adio de um par inico deve ser considerada
quando a primeira alternativa falhar. E im portante ressaltar que, dependendo da concentrao do
contra-on, h uma contnua transio entre modo reverso e par inico. A cromatografia de par
inico e de fase reversa tem vrias propriedades em comum. As fases estacionrias e mveis so as
mesmas, diferindo sim plesm ente na adio do contra-on. A crom atografia de troca inica
usualmente a ltim a alternativa a ser examinada para compostos ionizveis.
A reteno em cromatografia de par inico dependente da concentrao e hidrofobicidade
do contra-on. Dois mecanismos de separao tm sido propostos para a reteno em par inico.
O primeiro modelo assume que o par inico formado na fase mvel e a separao ocorre pela
distribuio do par entre as fases estacionria e mvel. O segundo modelo assume que o contraon primeiro adsorve na fase estacionria e o par inico feito por uma interao dinmica do soluto
com a m onocamada do contra-on adsorvido. Ambos os mecanismos de reteno propostos so
possveis e a expresso matemtica para a relao fator de reteno k e concentrao do contra-on
a mesma nos dois modelos propostos.
Grupos residuais de silanis na fase estacionria representam stios adicionais de reteno. O
grupo silanol fracamente cido, com pK na faixa de 4 a 6, e, portanto, interage com os solutos.
Estas interaes so particularm ente im portantes em par inico, pois podem levar reteno
irreversvel do soluto ou do contra-on, e devem ser evitadas pelo uso de fases estacionrias capeadas.
7.5 Cromatografia de Troca Inica

E o mtodo de escolha para anlise de ons inorgnicos e, s vezes, tambm o preferido para
a anlise de pequenos ons orgnicos.
A reteno em troca inica se d por atrao eletrosttica entre os ons na fase mvel e os ons
de carga oposta na fase estacionria. As fases estacionrias so referidas como resinas trocadoras de
ons e so classificadas em aninicas e catinicas (fortes e fracas). As aninicas fortes tm usualmente
um on amnio quaternrio imobilizado, enquanto a catinica forte tem um cido sulfnico, sendo
ionizados na faixa completa de pH. As resinas aninicas fracas apresentam aminas imobilizadas,
enquanto as catinicas fracas tm cidos carboxlicos.
As resinas catinicas so usadas para separao de catons como bases protonadas, enquanto
as aninicas so usadas para a separao de nions ou solutos acdos.
As primeiras resinas foram feitas de materiais peliculares e atualmente so de slica ou de
polmeros porosos. Enquanto as de slica tm maior resistncia mecnica, as polimricas tm
resistncia degradao em pH alto.
A reteno em troca inica determinada pelo pH da fase mvel. Fora inica, temperatura
e a natureza dos ons do tampo so tambm um fator importante.
Se a fase estacionria for denominada R" (catinica) ou R (aninica), podemos representar a
reteno como mostrado abaixo: a) para troca catinica e b) para aninica, considerando potssio
e cloro como contra-ons da fase mvel e o soluto um on univalente.
a) X+ + R_K+ <=>X+R" + K+
b) X" + r +c r <=>x_R++ cr
Assim, a reteno pode ser diminuda pelo aumento da concentrao do tampo, e este efeito
tanto maior quanto maior for a carga inica do soluto. A fora inica da fase mvel alterada
para conseguir diferenas em reteno e em seletividade. Como a reteno se d por atrao
eletrosttica, s molculas ionizadas so retidas. Assim, para cidos, um aumento de pH leva a maior
ionizao e, conseqentemente, a maior reteno em troca aninica, enquanto o decrscimo do pH
favorece a reteno de bases em troca catinica.
A adio de solventes orgnicos pode ser explorada e, como em fase reversa, a reteno e a
seletividade so alteradas.
7.6 Cromatografia de Excluso

E usada especialmente para: separao preliminar de amostras complexas visando isolar ou
purificar polmeros, na anlise de polmeros para observar a presena de dmeros, trmeros etc. ou
para estimar o peso molecular de polmeros sintticos ou naturais.
A separao por excluso requer que o tamanho do poro da fase estacionria seja
adequadamente selecionado de acordo com o tamanho das molculas que se pretende separar. As
molculas pequenas devem penetrar nos poros, enquanto as molculas grandes devem ser excludas
de todos os poros da fase estacionria. As de tamanho intermedirio sero s parcialmente excludas.
A resoluo em cromatografia de excluso determinada pela reteno em decorrncia do
tamanho molecular e pela eficincia da coluna ou, em outras palavras, largura de banda. Assim, o
critrio importante em cromatografia de excluso a distribuio do tamanho dos poros. Qualquer
interao com a fase estacionria levar reteno e a um aumento de volume de reteno, assim a
reduo de interaes com a fase estacionria deve ser conseguida quando se usa a cromatografia
de excluso para determinao de peso molecular.
A escolha do solvente em cromatografia de excluso requer somente que o soluto seja solvel
no mesmo e que este tenha baixa viscosidade, alm de compatibilidade com o soluto e a fase
estacionria. Em HPLC, as fases estacionrias que podem ser usadas em cromatografia de excluso
so slica gel, slica derivada ou polmeros rgidos.
A determinao da massa molecular relativa feita por intermdio de calibrao com polmeros
de massa molecular relativa conhecida.
A escolha da fase estacionria apropriada importante porque a faixa de massa molecular
relativa que pode ser separada em uma nica coluna de somente 1,5 unidade de log e, assim, vrias
colunas de excluso so usualmente necessrias.
33
Referncias
GILBERT, M.T. (1987). High Performance Liquid Chromatography. Bristol, Wright, p. 125-225.
RILEY, C.M. (1995). Modes of Chromatography. In: WAINER, I.W.; LOUGH, W.J. eds. High
Performance Liquid Chromatography, Fundamental Principles and Practice. Glasgow, Blackie
Academic & Professional, p.36-78.
SCOTT, R.P.W. (1993). Silica Gel and Bonded Phases: Their Production, Properties and Use in LC.
SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L. (1997). Practical HPLC Method Development,
35
8. OTIMIZAO
As Equaes 3.10, 3.11 e 3.12 so usadas para medir o grau de separao, mas no relacionam
os parmetros cromatogrficos com a resoluo.
A equao abaixo relaciona os parmetros cromatogrficos k, (X e N com a resoluo. Uma
separao pode ser otimizada sabendo-se como a resoluo varia experimentalmente com estes
parmetros.
R'*B)-D^7k
<81>
A otimizao de uma separao feita alterando-se os parmetros cromatogrficos, de acordo

com a equao bsica da resoluo, mostrada abaixo, em busca da resoluo necessria. O primeiro
e mais fcil parmetro a ser alterado o fator de reteno, seguido pelo fator de separao. Em
ltimo caso, torna-se necessria a alterao no nmero de pratos tericos.
Como estes parm etros no so interdependentes, pode-se variar os trs parmetros
cromatogrficos conjuntamente ou separadamente.
8.1 Resoluo x Fator de Reteno (k)

Considerando a equao bsica da resoluo (Equao 8.1), sabendo que migrao diferencial
requer reteno preferencial das molculas do soluto pela fase estacionria, isto , que o termo
k/(l+k) seja diferente de zero, e que a resoluo depende da migrao diferencial dos componentes
da amostra para bandas adjacentes, razovel dizer que Rs proporcional a k/(l+k).
Quando k inicialmente pequeno (k < 1), a resoluo aumenta rapidamente com o aumento
de k, mas para valores de k > 5 ela pouco afetada. Para valores altos de k, Rs pode ser aumentado
pelo seu decrscimo.
O fator de reteno (k) , normalmente, o primeiro parmetro cromatogrfico a ser ajustado.
Ele no deve ser muito pequeno, pois isto significa que o composto pouco interage com a fase
estacionria, nem muito grande, por causar alargamento das bandas. Um k muito pequeno significa
que a fase mvel muito forte e/ou o soluto tem pouca interao com a fase estacionria, enquanto
um k muito grande significa que a fase mvel muito fraca e/ou o soluto tem muita afinidade com
a fase estacionria.
E im portante ressaltar que, em separaes de misturas complexas pelo m odo isocrtico,
raramente sero obtidos valores ideais de k para todos os componentes da amostra, sendo
recomendvel o uso de eluio gradiente.
O fator de reteno em fase reversa pode ser aumentado pelo aumento do percentual de gua
e, conseqentemente, diminudo pelo acrscimo do percentual do modificador orgnico. A troca
de uma fase C18 por uma C8 tambm pode ser feita para alterar o fator de reteno.
A Figura 8.1 ilustra a influncia da porcentagem de gua nos fatores de capacidade obtidos
na anlise de uma srie de benzoatos.
No modo normal de eluio, o aumento do fator de reteno conseguido pelo aumento do
percentual do solvente de maior polaridade. Fases estacionrias de diferentes polaridades tambm
podem ser usadas para conseguir a desejada reteno.
Em cromatografia de compostos ionizveis, o pH deve ser alterado para o ajuste de k. A
concentrao do contra-on tambm influencia.
Convm lembrar que slicas de diferentes manufatores apresentam diferentes graus de acidez
e, portanto, as fases preparadas a partir destas slicas apresentaro reteno diferenciada.
Figura 8.1 Influncia da porcentagem de gua no fator de reteno.

Eluente Me0H/H20 : a) 90:10; b) 80:20; c) 70:30; e d) 60:40.
8.2 Resoluo x Fator de Separao (a)

O fator de separao (a) uma medida termodinmica da separao. E definido piara dois picos
como a relao entre os coeficientes de distribuio, relacionando a separao pico a pico.
A seletividade da separao normalmente ajustada aps o ajuste de k, e deve manter o k
conseguido. Para este fim, so utilizados nomgrafos. O nomgrafo da Figura 7.2, no Captulo 7,
usado para fase reversa e o nomgrafo mostrado na Tabela 8.1, para fase normal.
Tabela 8.1 Nomgrafo com misturas de solventes para fase normal.
Solvente
Composio, por volume, para que *= 0 3
#
A
n-hexano
0,01
Tetracloreto de
carbono
0,18
45
Clorofrmio
Tetraidrofurano
Acetonitrila
0,40
55
2-propanol
Metanol
A*
55
80
75
55
35
25
65
70
85
65
25
0,65
0,82
45
20
35
0,95
0,22
75
45
0,45
0,27
0,29
0,37
0,44
0,64
0,64
15
30
0,77
0,94
* Ae = e B - eA
Alteraes em a so feitas levando-se em considerao as interaes do soluto com o solvente,

resultantes de suas caractersticas, tanto no m odo reverso quanto no m odo normal. Snyder
classificou os solventes de acordo com estas caractersticas e produziu os tringulos de seletividade
37
dos solventes, comumente usados em cromatografia para o modo reverso e para o modo normal.
De modo geral, maior seletividade ser obtida variando-se de um pice a outro do tringulo.
As propriedades do solvente que afetam a seletividade em cromatografia lquida no modo
reverso so: acidez, basicidade e polaridade. Baseado nestas propriedades, Snyder desenvolveu o
tringulo da seletividade (Figura 8.2).
Os vrtices do tringulo representam as propriedades anteriormente citadas. O seu uso pressupe
que bastam somente trs solventes para que se consiga a seletividade desejada, e isso justifica a utilizao
de apenas acetonitrila, metanol e tetraidrofurano como modificadores orgnicos em fase reversa.
Figura 8.2 Tringulo da seletividade - modo reverso.
Um exemplo da aplicao deste tringulo mostrado na Figura 8.3:
(min.)
(min.)
Figura 8.3 Exemplo da seletividade obtida com a troca de solvente, a) 50% MeOH/HJO', b) 25%
THF/Hfi. Compostos: 1. p -nitrofenol, 2. p-dinitrobenzeno, 3. nitrobenzeno e 4. benzoato de metila.
A Figura 8.4 mostra um esquema, sugerido por Kirkland, para a otimizao sistemtica da
separao. Este procedimento mantm constante a fora do solvente, m isturando-se estes trs
solventes em todas as propores. O primeiro cromatograma feito utilizando-se uma porcentagem
de acetonitrila, tal que 0,5 < k < 20. Com o uso do nomgrafo (Figura 7.2), vo sendo feitas outras
corridas cromatogrficas at que se obtenha a seletividade desejada.
Figura 8.4 Esquema para otimizao da separao em fase reversa.
No modo normal, grandes mudanas em seletividade so conseguidas alterando-se o solvente

mais polar do eluente. Enquanto acidez, basicidade e polaridade governam a seletividade no modo
reverso, a capacidade do solvente em se ligar com a fase estacionria (localizao) a responsvel
pela seletividade no modo normal.
A Tabela 7.1 apresenta a classificao dos solventes mais usuais para o modo normal em relao
a sua localizao e basicidade.
A otimizao de uma separao no modo normal pode ser feita da mesma forma que no modo
reverso, utilizando-se o tringulo da Figura 8.5. A utilizao de solventes que estejam nos vrtices
do tringulo levar a maiores alteraes em seletividade.
Solventes
no-localizados
Solventes
bsicos
Solventes
no-bsicos
Figura 8.5 Tringulo para otimizao da separao - modo normal.
39
A seletividade pode tambm ser alterada quando os solutos so ionizveis, por adio de um
contra-on, para formao de um par inico. Variao de pH e temperatura so tambm fatores
importantes para conseguir seletividade com estes solutos.
A seletividade pode ainda ser alterada por troca da fase estacionria, levando-se em
considerao as interaes especficas, resultantes de cada tipo de fase: C lg, slica, aminopropilslica,
ciano, fenil, diol etc. e/ou por interaes com os grupos silanis residuais nas fases quimicamente
derivadas. E importante salientar que uma troca na fase estacionria tambm afetar a reteno e,
portanto, k deve ser reajustado.
8.3 Resoluo x Nmero de Pratos Tericos (N)

O efeito do nmero de pratos tericos (N) na resoluo dado pela sua raiz quadrada, de
acordo com a equao bsica da resoluo.
Para uma determinada condio de operao, N aproximadamente constante para diferentes
bandas em um crom atograma, sendo fcil perceber que a largura das bandas aum entar
proporcionalmente com o tempo de reteno, enquanto as bandas, em separaes por eluio
gradiente, tendem a ter a mesma largura.
Como mostra a frmula:
N-jj
(3.6)
N diretamente proporcional ao tamanho da coluna (L) e inversamente proporcional altura

dos pratos tericos (H). Conseqentemente, mantendo-se os outros parmetros constantes, um
aumento de L resulta em um aumento de N, e quanto menor for H, maior ser o valor de N. Os
fatores que favorecem a obteno de baixos valores de H so: utilizao de colunas de partculas
pequenas, fluxos de fase mvel baixos, fases mveis pouco viscosas, altas temperaturas de separao
e separao de pequenas concentraes de amostra.
Referncias
LOUGH, W.J.; WAINER, I.W. (1995). Method Development and Quantitation. In: WAINER,
I.W.; LOUGH, W.J. eds. High Performance Liquid Chromatography, Fundamental Principies and
Practice. Glasgow, Blackie Academic & Professional. p. 143-167.
SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; Glajch, J.L. (1997). Practical HPLC Method Development, 2.ed.
New York, John Wiley and Sons. p.85-121.
SNYDER, L.R.; CARR, P.W.; RUTAN, S.C. (1993). Solvatochromically based solvent-selectivity
triangle. J. Chromatogr. A, 656, p.537-547.
41
9. ELUIO GRADIENTE
A eluio gradiente feita aumentando-se a fora da fase mvel durante a separao
cromatogrfica. Faz-se necessria quando se trabalha com misturas complexas com solutos que
possuem uma grande variedade de fatores de capacidade, k.
Gradientes binrios so os mais usados e podem ser formados em uma variedade de modos
como ilustrado pela Figura 9.1, mas usualmente o gradiente linear resolve a maioria dos problemas
a que se aplica.
Figura 9.1 Exemplos de curvas para eluio gradiente.

A eluio isocrtica normalmente preferida gradiente devido a uma srie de desvantagens
atribudas ao uso de gradiente, tais como:
1. O equipamento para uso de gradiente mais complexo.
2. No pode ser usado com alguns detectores.
3. O desenvolvimento e a otimizao so mais complexos, pois tm um nmero maior de
variveis a ser examinadas.
4. O tempo de anlise prejudicado pelo tempo que deve ser concedido para reequilbrio da
coluna e normalmente se tm problemas com a linha de base.
5. No possvel aplic-lo a todos os tipos de fases estacionrias e a combinao fase mvel/
fase estacionria deve ser cuidadosamente selecionada.
6. A transferncia de mtodo complicada, pois as diferenas entre os equipamentos podem
afetar muito a separao conseguida.
9.1 Gradiente versus Isocrtico

Apesar dos problemas inerentes eluio gradiente, muitas separaes somente so possveis
com o uso de gradientes. Saber quando a eluio isocrtica deve ser preterida em relao eluio
gradiente muito importante no desenvolvimento de um mtodo.
A eluio gradiente recomendada nas seguintes situaes:
1.
2.
3.
4.
Amostras com uma ampla faixa de k (0,5 < k < 20).

Amostras contendo interferentes com valores de k altos que aumentem o tempo de anlise.
Solues diludas em um solvente fraco.
Separaes de macromolculas: protenas, peptdeos, polmeros sintticos etc.
A eluio gradiente pode tambm ser feita exclusivamente para determinar a fora da fase mvel
a ser usada em eluio isocrtica.
A Figura 9.2a mostra uma separao na qual solutos com altos fatores de capacidade so
apresentados em um mesmo cromatograma com solutos com baixos fatores de capacidade. Qualquer
aumento na fora da fase mvel para alterar o k dos solutos com alto fator de reteno ir diminuir
42 EdUFSCar Apontamentos
ainda mais o k dos solutos com baixo fator de reteno e ir provavelmente prejudicar a resoluo
obtida para os compostos do incio do cromatograma. Esta uma situao tpica em que a eluio
gradiente (Figura 9.2b) preferida isocrtica.
Separaes em que se tm interferentes com altos fatores de reteno podem levar perda da
seletividade devido ao acmulo dos solutos retidos nas condies de eluio isocrtica. Nestes casos,
a eluio gradiente preferida, mesmo sendo a separao dos compostos de interesse conseguida
com sucesso em eluio isocrtica.
10
20
Figura 9.2 Exemplo de uma separao a) isocrtica e b) gradiente.

Amostras diludas dissolvidas em um solvente fraco podem ser injetadas em grandes volumes
se a eluio for feita em gradiente. A amostra se concentra no topo da coluna durante a injeo e
volumes relativamente grandes de amostra so possveis. Com eluio isocrtica tambm possvel
realizar este tipo de concentrao, mas a mistura da amostra com a fase mvel usualmente leva a
um alargamento de bandas maior do que em eluio gradiente.
Molculas com alto peso molecular so preferencialmente separadas por eluio gradiente. A
separao deste tipo de amostras em eluio isocrtica altamente sensvel a pequenas mudanas
na fase mvel, tornando difcil o controle da reteno.
Princpios da separao gradiente

Em eluio gradiente, a fora da fase mvel aumenta durante a separao cromatogrfica, o
que significa dizer que o k decresce enquanto a banda migra na coluna.
43
Assim como em eluio isocrtica, o valor de k importante para cada banda, mas em eluio
gradiente o valor de k ser aquele de quando a banda migrou metade do comprimento da coluna e
representado por k*.
E im portante ressaltar que, em eluio com gradiente linear, tm-se valores de k*
aproximadamente constantes e, assim, as bandas em eluio gradiente so de mesma largura.
Os valores de k* podem ser estimados a partir de condies experimentais.
k. = _ 2 0 t _
Vm(A%B)
(9.1)
em que (t) tempo de gradiente; F (mL/min), fluxo; V , volume morto; e A%, a diferena entre
o % final de 6 e o % inicial.
A equao se aplica a molculas com peso molecular entre 100 e 500 Da, ou seja, S 4.
O volume morto pode ser calculado com a seguinte equao;
V = 0,5Ld?
(9.2)
O volume m orto s vezes calculado multiplicando-se o t pelo fluxo. Conhecer o volume

morto da coluna im portante para poder calcular quanto de fase mvel deve ser usada para
equilibrar a coluna.
Efeito da inclinao do gradiente

A resoluo aumenta inicialmente quando k* aumenta, mas assim como em eluio isocrtica,
quando se passa do valor ideal do fator de reteno, as bandas comeam a alargar e aumenta-se o
tempo de anlise.
O efeito da inclinao do gradiente pode ser melhor medido por Gt, ou seja, a inclinao
corrigida do gradiente.
_
Vm(A%B)
G. =
c,
r G
(9.3)
A combinao das Equaes 9.1 e 9.3 permite que a Equao 9.4 seja representada da seguinte
forma:
, 20
k -Q -
(9-4>
Se o fluxo e as dimenses da coluna no mudarem, a inclinao do gradiente (%min) pode

ser medida como:
o/
= -
A%B
% min
(9.5)
Esta medida usada para descrever mudanas na separao decorrentes do aumento ou

diminuio na inclinao do gradiente.
Q ualquer valor de k* pode ser selecionado de acordo com as condies experimentais,
portanto, a Equao 9.4 pode ser representada pela Equao 9.6.
k ^ 2 0 ^ 2 -
% m in
(9-6)
E importante observar que um aumento na inclinao do gradiente similar a um aumento

no percentual do solvente B em eluio isocrtica.
Como em eluio isocrtica, o primeiro parmetro que deve ser otimizado em busca de uma
melhor resoluo o fator de reteno, k*, e s ento a seletividade, CX, e as condies de separao,
N, devem ser alteradas.
Efeito da faixa do gradiente

A faixa do gradiente refere-se diferena entre os percentuais final e inicial do solvente forte.
Gradientes exploratrios so usualmente feitos com amplas faixas de gradiente, 5% a 100% de B
(B sendo, por definio, o solvente forte).
No recomendado que se use 100% de solvente aquoso em colunas de fase reversa, uma vez
que isto deteriora mais rapidamente a performance da coluna. De qualquer modo, a faixa do
gradiente deve ser ajustada para no se perder tempo no incio do gradiente, por comear com um
gradiente muito fraco. O tempo de terminar o gradiente deve tambm ser considerado para que ele
no termine antes da eluio dos solutos mais retidos.
O desenvolvimento de uma separao gradiente

Otimizao sistemtica pode ser feita como na separao isocrtica. Vale a pena seguir estes
passos:
1. Selecione as condies iniciais. O primeiro gradiente deve usualmente ser amplo (5-100%
de B). Otimize para obter k* > 2, com um Gs no muito alto. Para molculas pequenas,
tG = 20 min recomendado.
2. Ajuste a faixa do gradiente para minimizar o tempo de anlise. Elimine os tempos vazios
no incio e fim do gradiente. Troque tG em proporo a A% de B.
3. Otimize a separao. Aumente N aumentando tG ou tamanho da coluna e/ou diminuindo
o tamanho da partcula e o fluxo. Mantenha k* constante ou tG (F/Vm) enquanto faz estas
mudanas.
4. Avalie o melhor modo de reequilibrar a coluna.
Consideraes importantes
Uma mudana na inclinao do gradiente ou no formato, que venha alterar k*, pode ser feita
para otimizar diferentes partes do cromatograma. O controle de espaamento de bandas, por
alterao de k ou k*, um parmetro muito mais poderoso em eluio gradiente do que em eluio
isocrtica. O espaamento de bandas pode ser alterado por mudana no tipo de solvente, fase
estacionria, pH e temperatura. Em par inico, a concentrao do contra-on tambm fator de
importncia, assim como em eluio isocrtica.
Em eluio gradiente importante lembrar que k* depende das dimenses da coluna e do fluxo
e, conseqentemente, se o tamanho da coluna ou o fluxo for alterado, a separao pode ser afetada
de duas importantes maneiras:
1. O nmero de pratos ser alterado de forma previsvel e
2. k* e talvez o fator de separao a sero afetados.
Assim, uma vez que k* tenha sido ajustado para alterar as condies da coluna, este deve ser
mantido constante para no se perder em (X o que se ganhar em N.
k* mantido constante mantendo-se Gt constante. Isto pode ser convenientemente feito
variando o tempo do gradiente tG quando se muda o fluxo (F) ou o tamanho da coluna (V ^. Se a
coluna for aumentada por um fator qualquer, este mesmo fator deve ser usado para o aumento do
tQ. Quando se diminui o fluxo por um dado fator, este fator tambm deve ser usado para aumentar
o tempo do gradiente.
45
Em fase reversa, o tGtimo pode ser calculado da seguinte forma:
Pode-se manter k* constante variando tG na mesma proporo em que A% de B alterado.

Otimizar o formato do gradiente normalmente requer um grande nmero de experimentos e
o ganho quase sempre marginal, quando comparado ao gradiente linear na inclinao correta.
Para reequilibrar a coluna necessita-se normalmente usar em torno de 5 a 10 vezes o volume
da coluna de fase mvel.
Cuidados experimentais
A escolha da fase estacionria um item importante em eluio gradiente. Recomenda-se que
eluio no modo reverso seja preferida. O uso de slica no recomendado para gradientes
com eluio no modo normal e, sim, o uso de fases quimicamente ligadas. O uso de uma fase
estacionria muito polar pode causar alteraes nas bandas por reteno do solvente polar pela fase
estacionria. A Figura 9.3 exemplifica este problema. Em cromatografia de par inico, no se
recomenda o uso de gradientes, pois os aditivos usados na fase mvel prejudicam o equilbrio da
coluna e, conseqentemente, a performance do gradiente.
Gradiente
inicial
isopropanol
Figura 9.3 Efeito do uso de slica como fase estacionria com gradiente hexano/isopropanol.
Um gradiente em branco deve sempre ser feito para observar a compatibilidade dos solventes
com a deteco escolhida e para observar a presena de artefatos e tambm de material retido no
topo da coluna por uso de fases mveis mais fracas que as do gradiente escolhido. Diferenas em
absorbncia causam alteraes na linha de base, especialmente quando THF usado como fase mvel
em gua devido a sua absorbncia abaixo de 250 nm. Quando as diferenas so grandes pode-se
adicionar ons inorgnicos como nitrito, nitrato ou azida ou ainda ons orgnicos como formiato
ou acetato, que so altamente hidroflicos e servem para minimizar a diferena de absorbncia entre
os solventes A e B.
Diferentes equipamentos apresentam diferentes volumes entre o misturador e a coluna. Estes
volumes, conhecidos como VD, precisam ser considerados pois afetam os tempos de reteno na
transferncia de mtodos, de acordo com suas diferenas. Aumentar VD equivalente a ter um tempo
adicional isocrtico no incio do gradiente. E importante considerar que auto-injetores, de um modo
geral, aumentam o VD, assim como este volume , tambm, alterado pelas mudanas da ala de
amostragem no injetor manual. Assim sendo, importante que o VDseja especificado no proce
dimento do mtodo para que o mesmo possa ser bem transferido. Pode-se tambm atrasar a injeo
da amostra por um tempo (tD) igual a F X VD, fazendo assim que a amostra e o gradiente cheguem
ao topo da coluna em tempos iguais, o que equivale a dizer que o efeito de VD foi eliminado na
separao.
Usando gradiente para determinar se a eluio deve ser

isocrtica ou gradiente
Um gradiente inicial de ampla faixa pode servir para determinar:
1. Se o uso de eluio isocrtica prefervel eluio gradiente.
2. Sendo a eluio isocrtica prefervel, estimar qual o percentual de B que dar o k desejvel
para os compostos-problema.
3. Quando a eluio gradiente a escolhida, estimar o percentual de B para comear e terminar
o gradiente.
Snyder e Dolan desenvolveram uma metodologia para o uso de gradientes de ampla faixa para
servir de guia no desenvolvimento de mtodos por HPLC. Para isso, algumas condies bsicas so
recomendadas: o uso de colunas Cg ou Clg de 15 X 0,46 cm, gradiente de 5% a 100% de acetonitrila com um tempo de gradiente de 60 min e fluxo de 2 mL.min-1. Deve ser observado se a
amostra muito hidroflica (muitas bandas perto de t_) ou se muito hidrofbica, ou seja, se eluio
em fase reversa no aconselhvel.
Com o cromatograma (Figura 9.4) inicial determina-se a diferena de tempos de reteno pela
diferena t - tM. A razo Atr/tGdetermina se o uso de eluio isocrtica possvel. Como sabemos
que 0,5 < k < 20, ou seja, A t/tGdeve ser menor que 0,40 ou, em outras palavras, a faixa de reteno
deve ser menor que 40% do tempo do gradiente.
4----------- At, -------------
Figura 9.4 Cromatograma do gradiente inicial para desenvolvimento de mtodo.
A Tabela 9.1 lista os valores mximos permitidos de tapara eluio isocrtica baseados nos
valores de t . No exemplo dado por Snyder e Dolan, o tn de 9,5 min enquanto o t^ de 24,5
min, assim o Atr/tc de 0,25. Usando a Tabela 9.1 observa-se que o tn mximo permitido para
0,5 < k < 20 de 32 min, enquanto para 1 < k < l Ode 22. Considerando a faixa de 0,5 < k <
20, pode-se desenvolver a separao em eluio isocrtica.
47
Tabela 9.1 Avaliao dos tempos de reteno obtidos no gradiente inicial.

t(min)
<1,5
2
3
4
5
7
10
15
20
25
30
35
40
>40
Incerteza
Valores aceitveis de tn (min) para

0,5 < k < 20
1 <k< 10
a
a
8
17
21
12
24
14
26
16
29
19
33
23
38
29
44
35
49
40
54
45
50
59
64
55
b
b
3 min
5 min
Condies: coluna 15 x 0,46 cm; gradiente 596-100% ACN-H20 em 60 min; 2 mL/min

a) reteno muito baixa
b) reteno muito alta
A Tabela 9.2 permite estimar o k para a ltima banda eluda. O t de 24 min no primeiro
gradiente feito (Figura 9.5). Usando a Tabela 9.2, para um k = 20, a fase mvel de 29% de
acetonitrila deve ser usada. O cromatograma mostrado a seguir exemplifica a separao conseguida
em eluio isocrtica.
Figura 9.5 Cromatograma da separao de benzenos substitudos em

eluio isocrtica usando 29% de acetonitrila: gua (v/v).
Para desenvolvimento de mtodos por eluio gradiente, o cromatograma da Figura 9.4 permite
estimar os valores de % de B inicial e final a partir dos valores de tra e tra. As estimativas esto listadas
na Tabela 9.3. importante notar que a % de B final depende de Gg. Por isso, recomenda-se que
a % de B final seja mantida em 100% at que se determine o Gg.
Tabela 9.2 Estimativa da % de B para eluio isocrtica, baseada no tempo de reteno do ltimo pico ( t d o
gradiente inicial.
_____________________________% de B
_____________________
t (min)
k=5
k = 10
k = 20
______________________(% ACN)_______________(% ACN)_______________(% ACN)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
0
12
22
30
38
46
54
62
70
78
86
94
100
6
19
29
37
45
53
61
69
77
85
93
100
-
5
14
22
30
38
46
54
62
70
78
86
94
Condies: coluna 15 x 0,46 cm; gradiente 5%-100% ACN-H20 em 60 min; 2 mL/min
Tabela 9.3 Estimativa das % inicial e final de B para eluio gradiente, baseadas no tempo de reteno do
primeiro ou do ltimo pico no gradiente inicial.
tM, tn(min)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60b
%inicial B
3
11
19
27
35
43
51
59
67
75
83
%final B*
14
22
30
38
46
54
60
68
76
84
100
Condies: coluna 15 x 0,46 cm; gradiente 596-100% ACN-H20 em 60 min; 2 mL/min

a) para gradientes acentuados, a % de B deve ser calculada de outra forma
b) reteno muito alta; condies inadequadas
Referncias
p.152-167.
SNYDER, L.R.; DOLAN, J.W. (1996). Initial experiments in high-performance liquid chroma
tographic method development. I. Use of a starting gradient run. J. Chromatogr. A, 721, p.3-14.
49
10. CROMATOGRAFIA QUIRAL

(com Ana Lcia Bassi & Maria Elizabeth Tiritan)
A descoberta da tridimensionalidade das molculas, a partir da separao dos enantimeros de
uma mistura racmica de um sal de cido tartrico em 1848, por Pasteur, marca uma nova era,
despertando um grande interesse nos cientistas.
Com o desenvolvimento da estereoqumica, compreendeu-se que a quiralidade pode ser conferida
a uma molcula por intermdio de outros centros que no o carbono, alm de eixos e planos.
Elementos como o silcio, enxofre, fsforo e nitrognio tambm podem formar estruturas com
imagens especulares no superponveis, embora nem sempre a separao de seus enantimeros seja
possvel.
Os sulfxidos no so planares e, se forem assimetricamente substitudos, devido a altas
barreiras de racemizao, iro existir como enantimeros, estveis temperatura ambiente. Aminas
com diferentes substituintes tambm so quirais, embora no sejam estveis temperatura ambiente
por possurem baixas barreiras de racemizao. Amidas e imidas, dependendo do tamanho de seus
substituintes, podem existir como enantimeros estveis temperatura ambiente.
Receptores e enzimas interagem seletivamente s diferenas configuracionais. Prometazina
um exemplo raro de droga que apresenta a mesma atividade biolgica e potncia para ambos os
enantimeros, no que concerne a sua atividade anti-histamnica.
A obteno de enantimeros puros, entretanto, representa um grande desafio Qumica
Moderna, devido s propriedades termodinmicas similares dos mesmos.
Desta forma, o desenvolvimento de tcnicas para a obteno de enantimeros puros, seja por
sntese assimtrica ou por resoluo de misturas racmicas, tem sido objeto de diversos estudos. Os
avanos tecnolgicos possibilitaram a anlise e separao de enantimeros, dando-se ento a devida
importncia s consideraes estereoqumicas.
Conseqentemente, a habilidade de separar enantimeros tanto em condies analticas quanto
preparativas de importncia crucial. Felizmente, um grande avano foi conseguido a este respeito,
nas ltimas dcadas, por intermdio da cromatografia lquida de alta eficincia.
A maneira clssica para a separao de enantimeros por cromatografia a derivao das
misturas enantiomricas para a formao de misturas diastereoisomricas, que podem ser separadas
usando-se fases estacionrias aquirais.
Embora esta metodologia tenha a vantagem de usar fases convencionais, a formao da mistura
diastereoisomrica nem sempre fcil e, em condies de cromatografia preparativa, tem-se o
inconveniente de isolar os diastereoismeros, que devem ento fornecer os enantimeros, tornando
o processo indireto e trabalhoso.
Recentem ente, a metodologia que tem se m ostrado mais atrativa para a separao de
enantimeros a separao direta. Esta metodologia vale-se predominantemente do uso de colunas
quirais.
A resoluo direta de enantimeros possvel desde que exista reconhecimento quiral entre a
mistura racmica e o seletor quiral. Este seletor quiral deve associar-se preferencialmente a um dos
enantimeros, e tanto pode estar ancorado fase estacionria como pode ser um aditivo adicionado
fase mvel. No segundo caso, a fase estacionria no precisa ser quiral. Muitas misturas racmicas
podem ser separadas em colunas aquirais convencionais por adio de um aditivo quiral fase
mvel.
O mecanismo de separao de enantimeros por cromatografia quiral est fundamentado na
diferena de energia entre os complexos diastereoisomricos transitrios formados entre o seletor
quiral e os enantimeros do soluto. As diferenas em estabilidade destes complexos transitrios levam
a diferentes tempos de reteno dos enantimeros na coluna. O enantimero que forma o complexo
menos estvel elui prim eiro. A diferena de energia livre de formao dos adsorbatos
diastereoisomricos formados deve ter um valor satisfatrio para que ocorra separao.
Colunas quirais tm sido utilizadas eficientemente tanto em cromatografia gasosa quanto em

cromatografia lquida de alta eficincia.
O sucesso obtido com este mtodo tem sido grande e vrias colunas quirais comerciais tm
sido usadas para a resoluo de um grande nmero de produtos farmacuticos e intermedirios
sintticos em geral. A cromatografia lquida de alta eficincia tem se destacado, quando comparada
CG, devido maior diversidade de fases quirais que tm sido desenvolvidas para aplicao em
HPLC.
Basicamente, as fases estacionrias quirais so preparadas a partir de molculas ou polmeros
quirais, adsorvidas ou quimicamente ligadas a um suporte, usualmente slica.
A enantiosseletividade apresentada pelas fases estacionrias quirais polimricas freqentemente
depende da alta ordem estrutural dos polmeros quirais, sendo difcil prediz-la apenas pelas
caractersticas da unidade monomrica, ao passo que o comportamento de fases estacionrias quirais
constitudas de molculas previsvel em alguns casos.
Experincias tm mostrado que, s vezes, somente um tipo de interao necessrio para que
ocorra a discriminao quiral. Pontes de hidrognio, como nico tipo de interao, podem ser
suficientes para que ocorra resoluo ptica, e isto pode ser explicado por uma diferena na
constante de equilbrio dos adsorbatos diastereoisomricos formados, devido a um dos enantimeros
ser forado a uma conformao no favorvel pelo stio de interao quiral. Isto comum em
interaes de enzimas com substratos.
Apesar de existirem vrias teorias para explicar o mecanismo de reconhecim ento quiral,
modelos simples no so suficientes para explicar todas as observaes de enantiosseletividade, de
modo que diferentes modelos precisam ser investigados para racionalizar resultados de diferentes
experimentos. Estudos cada vez mais sofisticados tm sido feitos, como modelo molecular com
clculo de energia dos adsorbatos intermedirios, estudos de RMN, mecanismos estatsticos, raio
X e anlise de superfcie.
As primeiras fases comerciais, preparadas a partir de molculas quirais e conhecidas como fases
estacionrias quirais do tipo Pirkle (Figura 10.1), tm seu mecanismo de reconhecimento quiral
baseado na formao de um complexo diastereoisomrico entre o seletor quiral e as molculas do
soluto, por intermdio de interaes atrativas como ligao de hidrognio, interaes 11TC, dipolo etc.
Interao dipolo-dipolo
Figura 10.1 Representao de fase estacionria do tipo Pirkle e as interaes da fase com o soluto.
Baseado nos resultados obtidos na primeira gerao de fases quirais, Pirkle desenvolveu a teoria
de reciprocidade, que diz: A interao diastereoisomrica que permite a uma coluna derivada de
um dado composto quiral A resolver uma determinada mistura racmica B tambm permite coluna
derivada do composto quiral B resolver a mistura racmica A. Este fato levou ao surgimento da
segunda gerao de fases estacionrias quirais de Pirkle, derivadas de N-(3,5-dinitrobenzoil)
aminocidos (7C-cido, in nature). As fases mais bem-sucedidas foram preparadas a partir de
fenilglicina (DNBPG) ou leucina (DNBLeu), na forma inica ou covalente, ligadas 3aminopropilslica (APS).
51
A terceira gerao de fases quirais de Pirkle (jt-bsica, in nature) foi resultado direto da teoria
de reciprocidade, em que o seletor quiral foi escolhido entre os solutos com melhor resoluo em
DNBPG e DNBLeu.
Novas fases estacionrias foram preparadas, como a W helk-0 1 ( Figura 10.2), com as mesmas
caractersticas das fases Pirkle. Elas tm a N-(3,5-dinitrobenzoil)-4 amino-l,2,3,4-tetraidrofenantreno
imobilizadas slica, de modo que uma fenda pode ligar o enantimero de forma preferencial. A
fenda consiste em sistemas aromticos 7t-cido e 7t-bsico perpendiculares entre si. Estas fases podem
ser usadas no modo normal e reverso de eluio.
Figura 10.2 Fase estacionria Whelk-0 1.

Fases estacionrias quirais foram desenvolvidas utilizando ciclodextrinas.
Ciclodextrinas so oligossacardeos cclicos, produzidos a partir de amido, sob ao de enzimas,
e podem ser obtidas contendo de seis a doze unidades de glicose, mas somente aquelas contendo
seis (a ), sete (|3) ou oito (y) unidades esto comercialmente disponveis. A molcula de ciclodextrina
tem uma cavidade hidrofbica e uma superfcie externa (anel) hidroflica. O anel contm de doze
a dezoito grupos hidroxila secundrios (dependendo do nmero de unidades de glicose na estrutura)
(Figura 10.3).
Uma grande variedade de compostos solveis e insolveis em gua pode se encaixar na cavidade
quiral hidrofbica da molcula da ciclodextrina, formando complexos com diferentes estabilidades,
levando separao enantiomrica.
Inicialmente, a ciclodextrina foi usada como fase estacionria quiral sem nenhum a derivao,
mas, recentemente, derivados como steres, teres e carbamatos ligados em slica tambm se tornaram
fases quirais de sucesso.
Geralm ente, as fases mveis usadas em colunas de ciclodextrina so compostas de ga,
metanol, etanol ou acetonitrila. Tampes de fosfatos e acetatos tambm so usados para melhorar
a eficincia das fases e diminuir o tempo de reteno de solutos aninicos e catinicos.
teres de coroa enantiomericamente ativos, complexados com ctions e quimicamente ligados
slica ou a um outro suporte polimrico, so utilizados na separao de aminocidos e outros
aminos compostos.
Polmeros sintticos, particularmente da famlia polivinlica, possuem uma estrutura de hlice
quiral que pode ser usada em separaes enantiomricas, por intermdio da incluso das molculas
do soluto na cavidade quiral.
Recentemente, Armstrong e seus colaboradores introduziram uma nova classe de seletores
quirais: os antibiticos macrocclicos. Uma variedade de tipos estruturais form a a classe de
antibiticos macrocclicos. Em geral, estes compostos tm massa molecular entre 600 e 2200,
podendo ser cidos, bsicos ou neutros (Figura 10.4).
HO OH
Figura 10.4 Estrutura da avoparcina (cL-avoparcina, R = H, ^-avoparcina, R = Cl).

Vancomicina, tiostreptona, rifamicina B e avoparcina (Figura 10.4), quimicamente ligadas
slica, demonstraram excelente enantiosseletividade para uma grande variedade de compostos quirais.
Estas fases estacionrias tm algumas caractersticas das fases de protenas, porm so mais estveis
e com maior capacidade de carga. So usadas tanto no modo normal como no modo reverso, alm
do polar-orgnico (misturas de solventes polares), o que lhes confere maior aplicabilidade.
Dentre as fases estacionrias quirais polimricas desenvolvidas, citam-se as poliacrilamidas e as
fases de protenas.
Polmeros sintticos, como a poliacrilamida, possuem uma estrutura de hlice quiral que pode ser usada
em separaes enantiomricas, por intermdio da incluso das molculas do soluto na cavidade quiral.
Em fases estacionrias quirais constitudas de protenas, h a formao de um complexo entre
o soluto e a fase estacionria quiral, baseado em combinaes hidrofbicas e polares, mas o
mecanismo de reconhecimento quiral ainda no est bem esclarecido. Estas fases so altamente
seletivas, embora de baixa capacidade de carga, devido pequena quantidade de seletor quiral que
pode ser imobilizado por grama de slica. As fases comerciais disponveis so soroalbumina bovina
(BSA), ovomucide (OVM), soroalbumina humana (HSA) e tXj-cido glicoprotico (AGP).
53
Entre as fases polimricas, merecido destaque deve ser dado s fases de polissacardeos, pela alta
enantiosseletividade que estes tm apresentado diante de uma grande variedade de classes de
compostos quirais.
Basicamente, quatro tipos de derivados podem ser preparados por modificao dos grupos
hidroxila livres do polissacardeo: steres orgnicos, nitratos, carbamatos e teres. Os carbamatos e
steres so os derivados com maior potencial e utilidade como fases estacionrias quirais, podendo
ser ligados ou adsorvidos slica, apresentando neste ltimo caso maior enantiosseletividade.
Este tipo de fase estacionria tambm se vale de interaes atrativas para a separao, como
as fases do tipo Pirkle, mas a formao de complexos de incluso tem uma grande contribuio
no mecanismo de reconhecimento quiral.
A literatura acerca da utilizao de polissacardeos modificados extremamente vasta, tendo
sido preparada uma grande variedade de carbamatos com diferentes substituintes, fornecendo fases
estacionrias quirais de grande aplicabilidade, com alta enantiosseletividade, sendo a celulose e a
amilose os polissacardeos mais estudados.
As reaes de preparao destes derivados normalmente so simples e as colunas obtidas
apresentam boa eficincia (Figura 10.5).
Figura 10.5 Colunas quirais derivadas de carbamatos de polissacardeos.
Tris(benzilcarbamato)s de celulose e amilose tambm tm sido usados com bastante sucesso.

Os derivados de amilose, em geral, tm demonstrado um maior poder de discriminao quiral que
os trisbenzilcarbamatos de celulose. A fase tris[(S)-l-etilfenilcarbamato] de amilose tem se mostrado
muito eficiente na resoluo de diversas classes de compostos (Figura 10.6).
CO
noo
O
^
N^
Coluna: tris (S)-l-etilfenilcarfoamato de amilose em

APS-nucleosil (500 , 7 um)
Fluxo: 0,5 mlymin
Eluente: Hex/2-propanol (95:05)
Figura 10.6 Cromatograma da separao de uma amida axial quiral.
A 3-aminopropil slica tem sido aceita como o suporte ideal para estas fases. Este suporte
decresce as interaes no estereosseletivas e aumenta a estabilidade da cobertura, por fornecer
condies para a formao de pontes de hidrognio. Matlin e colaboradores demonstraram que, em
muitos casos, o uso de slica no derivada e octadecil slica oferece vantagens quando comparado
com a APS. Para a resoluo de sulfxidos quirais, entretanto, a APS mostrou melhores resultados
quando comparada slica no derivada. Isto se deve provavelmente a interaes no estereosseletivas
dos sulfxidos com os grupos silanis livres.
As colunas de polissacardeos tm sido usadas no modo normal ou reverso de eluio.
Recentemente demonstrou-se que estas colunas podem ser usadas em eluio multimodal, ou seja,
no modo normal, polar orgnico ou reverso sem perda de performance e com diferena em
seletividade em cada um dos modos, o que aumenta a sua aplicabilidade.
Referncias
ALLENMARK, S.G.; ANDERSSON, S. (1994). Proteins and peptides as chiral selectors in liquid
chromatography. J. Chromatogr. A, 666, p.167-179.
ARMSTRONG, D.W.; TANG, Y.; CHEN, S.; ZHOU, Y.; BAGWILL, C.; CHEN, J.R. (1994).
Macrocyclic Antibiotics as a New Class of Chiral Selectors for Liquid Chromatography. Anal.
Chew., 66, p. 1473-1484.
CASS, Q.B.; TIRITAN, M.E.; BASSI, A.L.; CALAFATTI, S.A.; DEGANI, A.L. (1997).
Discriminao Quiral por CLAE em Carbamatos de Polissacardeos: Desenvolvimento,
Aplicaes e Perspectivas. Qum. Nova, n.20, v. 1, p.49-57.
CASS, Q.B.; BASSI, A.L.; MATLIN, S.A. (1999). First Direct Resolution of Gossypol Enantiomers
on a Chiral HPLC Phase. Chirality, n. l l, v. 1, p.46-49.
CASS, Q.B.; DEGANI, A.L.G.; CASSIANO, N. (2000). The Use of a Polysaccharide-Basead
Column on Multimodal Elution. J. Liq. Chromatogr & Rel. Technol., n.23, v.7, p. 1029-1038.
55
CHANG, S.C.; REID III, G.L.; CHEN, S.; CHANG, C.D.; ARMSTRONG, D.W. (1993).
Evaluation of a new polar-organic high-performance liquid chromatographic mobile phase for
cyclodextrin-bonded chiral stationary phases. Trends Anal. Chem, n.12, v.4, p.144-153.
CLEVELAND, T. (1995). Pirkle-Concept Chiral Stationary Phases for the HPLC Separation of
Pharmaceutical Racemates. J. Liq. Chromatogr., n.18, v.4, p.649-671.
CURRAN, D.P.; HALE, G.R.; GEIB, S.; BALOG, A.; CASS, Q.B.; DEGANI, A.L.G.;
HERNANDES, M.Z.; FREITAS, L.C.G. (1997). Rotational features of carbon-nitrogen bonds
in axially chiral o-ferf-butyl anilides and related molecules. Potential substrates for the prochiral
auxiliary approach to asymmetric synthesis. Tetrahedron Asymmetry., n.8, v.23, p.3955-3975.
DRAYER, D.E. (1993). The Early History of Stereochemistry. In: WAINER, I.W. ed. Drug
Stereochemistry: Analytical Methods and Pharmacology. 2.ed. New York, Marcel Dekker Inc. p. 1-24.
EKBORG-OTT, K.H.; KULLMAN, J.P.; WANG, X.; GAHM, K.; HE, L.; ARMSTRONG, D.W.
(1998). Evaluation of the Macrocyclic Antibiotic Avoparcin as a New Chiral Selector for HPLC.
Chirality, n.10, p.627-660.
ELIEL, E.L.; WILEN, S.H. (1994). Stereochemistry of Organic Compounds. New York, John Wiley
& Sons Inc. p. 1-1210.
MISLOW, K. (1967). On the Stereomutation of Sulfoxides. Record of Chemical Progress, n.28, v.4,
p.217-240.
MUTTON, I.M. (1994). Chiral HPLC in Pharmaceutical Industry. In: SUBRAMANIAN, G. ed.
A Pratical Approach to Chiral Separations by Liquid Chromatography. Weinheim, VCH. p. 115-179.
OKAMOTO, Y.; YASHIMA, E. (1998). Polysaccharide Derivatives for Chromatographic Separation
of Enantiomers. Angew. Chem. Int. Ed., n.37, p. 1020-1043.
OKAMOTO, Y.; HATANO, K.; ABURATANI, R.; HATADA, K. (1989). Tris(4-f-butylphenylcarbamate)s of Cellulose and Amylose as Useful Chiral Stationary Phases for Chromatographic
Optical Resolution. Chem. Lett., p.715-718.
OKAMOTO, Y.; KAIDA, Y. (1994). Resolution by High-Performance Liquid Chromatography
Using Polysaccharide Carbamates and Benzoates as Chiral Stationary Phases. J. Chromatogr. A,
666, p.403-419.
PIRKLE, W.H.; POCHAPSKY, T.C. (1989). Considerations of Chiral Recognition Relevant to the
Liquid Chromatographic Separation of Enantiomers. Chem. Rev., 89, p.347-362.
TAYLOR, D.R. (1991). Is There a Rational Basis For Selection and/or Design of Chiral Stationary
Phases For High-Performance Liquid Chromatography? In: STEVENSON, D.; WILSON, I.D.
eds. Recent Advances in Chiral Separations. New York, Plenum Press, p.5-14.
WAINER, I.W. (1993). HPLC Chiral Stationary Phases for the Stereochemical Resolution of
Enantiomeric Compounds. The Current State of the Art. Clinical Pharmacology, n.18, p.347362.
WELCH, C.J. (1994). Evolution of Chiral Stationary Phase Design in the Pirkle Laboratories. J.
Chromatogr. A, 666, p.3-26.
57
11. CROMATOGRAFIA PREPARATIVA

Embora a cromatografia tenha sido originada como uma tcnica preparativa, desenvolvida por
Tswett, para o isolamento de compostos puros de amostras complexas, os avanos da cromatografia,
nos ltimos anos, tm sido maiores em sua aplicao como uma tcnica analtica para a identificao
e quantificao de compostos do que como uma tcnica de isolamento.
A cromatografia preparativa apresenta problemas inerentes a ela e depende da aplicao da
separao ou, em outras palavras, de quanto se deseja, isolar.
A crom atografia preparativa pode servir para o isolamento de poucos miligramas, para
elucidao estrutural ou para o isolamento de gramas ou quilogramas, requerendo, neste ltimo caso,
diferentes perspectivas no desenvolvimento da separao. Enquanto, no primeiro caso, o que importa
a eficincia da separao, no segundo, o importante a quantidade de material isolado por tempo
de trabalho.
11.1 Estratgias de Separao

Quando se deseja isolar pequenas quantidades de amostra com uma grau de pureza alto,
trabalha-se em condies analticas fazendo-se o escalonamento necessrio para a separao
preparativa. Nestes casos, usa-se uma coluna semi (0,7 ou 0,8 X 25 cm d.i.) ou preparativa (2,2 X
25 cm d.i.) com o mesmo material da coluna analtica, ou seja, slica de 5 ou 10 p.m de tamanho
de partcula, e trabalha-se sem sobrecarga da coluna para a obteno de mxima eficincia.
Quando se deseja separar grandes quantidades de amostra, utilizam-se colunas de menor
eficincia, slicas de 20-40 |lm de tamanho de partcula, mas com maior capacidade de carga, e
trabalha-se com a coluna em sobrecarga para uma maior produtividade.
Quando se obtm uma resoluo de 1,25 em separao analtica, sabe-se que isso corresponde
a uma resoluo de quase linha de base, entretanto, em separaes preparativas, este valor indica
uma separao difcil. Pouca sobrecarga pode ser conseguida com esta resoluo, j que esta se
deteriora rapidamente com o aumento de carga.
Considerando que o fator de separao, a , o parmetro com maior impacto na resoluo,
este deve ser otimizado para se poder trabalhar em sobrecarga.
E importante ressaltar que, quando se trabalha em sobrecarga, tanto o fator de reteno, k,
quanto o fator de separao, (X, diminuem drasticamente, mas o efeito da velocidade da fase mvel
na resoluo pouco sentido. Assim, mxima produtividade conseguida trabalhando-se em
condies de sobrecarga em altos fluxos.
Colunas com slicas de menor tamanho de partcula perdem eficincia mais rapidamente que
slicas de partculas maiores, mas, por outro lado, so mais eficientes para a separao de pequenas
quantidades de amostra. O grfico da Figura 11.1 exemplifica o efeito da carga no nmero de pratos
para duas colunas, uma com slica de 10 |im e outra de 40 |Im.
Analisando-se o grfico da Figura 11.1 nota-se que a coluna com partculas de 10 |im mais
eficiente para todas as cargas de benzofenona adicionadas, mas esta diferena quase desaparece
quando se trabalha com grandes cargas de massa.
A assimetria da banda aumenta com o aumento da carga. Esta perda de simetria mais drstica
para colunas mais eficientes e isto se deve aos efeitos termodinmicos, que so responsveis pelas
mudanas no comportamento das bandas. As Figuras 11.2a e b mostram esses efeitos.
Benzofenona (mg)
Figura 11.1 Efeito da carga no nmero de pratos da coluna.
25 mg
200 mg
300 mg
100 mg
500 mg
Figura 11.2 Perfis das bandas obtidas com o aumento da carga. Amostra: benzofenona; fase mvel: hexano/acetato
de etila (99,05:0,5); fluxo: 45 mL/min; a) coluna com partculas de 10 p. e b) coluna com partculas de 40 fl.
Newburger e colaboradores chamam a ateno para o fato de que, independente da simetria
dos picos, quando dois compostos so quimicamente muito similares e de difcil resoluo, tero
isotermas do mesmo tipo e de valores similares. Para esse tipo de mistura, quando a coluna
sobrecarregada com um composto, como se o outro tambm estivesse sobrecarregado na parte da
coluna onde as bandas se sobrepem. O comportamento, neste caso, no ser mais linear e a eluio
59
de cada um dos componentes ser influenciada pela do outro e dependente da concentrao relativa
dos dois componentes. Como conseqncia, a banda do primeiro composto elui mais cedo e mais
estreita do que seria se a mesma quantidade do composto tivesse sido injetada pura. O uso de
colunas altam ente eficientes deve, nestes casos, ser considerado para que se possa ter m aior
produtividade com boa pureza.
Para separaes com fator de separao entre 1,5 e 1,7, uma carga de 20 mg/g considerada
um valor adequado, mas no para separaes com um baixo valor de (X, se a eficincia no puder
ser comprometida.
O escalonamento de uma separao analtica para uma separao preparativa pode ser feito
usando por base os volumes das colunas analticas e preparativas. Desta forma, o fator de
escalonamento, S, pode ser calculado pela seguinte equao:
s = Rplp
Ra La
em que R e RAso os dimetros e Lp e LA, o comprimento das colunas preparativas e analticas,
respectivamente. E recomendado que se trabalhe com colunas com o mesmo material de
empacotamento. Na separao analtica, o par de picos com a menor resoluo deve servir para
definir a carga que se trabalhar na separao preparativa. Melhor carga pode ser conseguida quando
se trabalha com reciclo. Com reciclo, o escalonamento pode ser inteiramente diferente, uma vez que
se coletam fraes da amostra e/ou se descartam impurezas durante os ciclos.
A Figura 11.3 exemplifica uma separao de 100 mg de amostra conseguida por uso de reciclo.
Figura 11.3 Exemplo da separao de 100 mg de um composto por intermdio de reciclo.

Q uanto ao volume e concentrao de am ostra injetados, no h dvida de que
prefervel trabalhar com sobrecarga de concentrao do que com sobrecarga de volume, ou seja,
melhor trabalhar com pequenos volumes de solues concentradas.
A Equao 11.2 mostra como calcular o mximo volume permitido.
w
V o d + k , )
( 11.2)
em que V. o volume morto da coluna e V( pode ser aumentado para trabalhar com sobrecarga de
massa.
H vrias definies, todas muito tericas, de quanto deve ser a carga que uma coluna pode
receber. Em cromatografia preparativa, este limite normalmente aquele no qual no mais se
consegue resoluo suficiente para isolar o soluto na pureza adequada.
E importante, no entanto, no confundir a perda de resoluo com a perda do poder de

deteco, por se estar trabalhando com o detector em alta sensibilidade. Isto particularmente
comum quando se trabalha em alta absorbncia no U.V.
Os cromatogramas mostrados na Figura 11.4 exemplificam o que se pode conseguir em carga
ao trabalhar em um comprimento de onda de menor absorbncia.
Minutos
Minutos
Figura 11.4 Cromatogramas da separao dos enantimeros de uma amida axial quiral em
uma coluna tris[(S)-l-etilfenilcarbamato] de amilose adsorvida em slica APS-hypersil
(15% g/g; 0 ,7 X 25 cm d.i.) usando hexano:2-propanol (98:02) como fase mvel, a) 5 ,7 mg de amostra;
fluxo de 0,5
254 nm. b)' 10,4 mg
300 nm.
mL/min Amr
de amostra; fluxo de 1 mL/min Amx
Enquanto em cromatografia analtica a presena de impurezas que no so detectveis no
compromete a anlise, em cromatografia preparativa elas podero comprometer a anlise, uma vez
que os compostos isolados so normalmente caracterizados por espectroscopia e espectrometria.
Enquanto em cromatografia analtica o modo reverso de eluio o preferido, em
cromatografia preparativa o modo normal de eluio o mais usado. Deve-se ter em mente que,
para o isolamento, os solventes usuais de eluio no modo normal so preferveis. Alm disto, a
solubilidade da amostra, nas concentraes desejadas em preparativa, quase sempre um problema
em solues aquosas.
11.2 Solubilidade da Amostra

Enquanto a solubilidade da amostra quase nunca um srio problema em cromatografia
analtica, em preparativa muitas vezes o que determina o limite a ser injetado, prejudicando,
portanto, a produtividade. A utilizao da fase mvel para solubilizar a amostra a melhor
alternativa, embora nem sempre possvel. Quando a solubilidade da amostra na fase mvel muito
baixa, deve-se ter cuidado para que no ocorra precipitao. O uso de solues supersaturadas deve
ser evitado, pois o soluto se espalha por toda a coluna em grandes quantidades de carga.
61
A pureza do solvente a ser usado em cromatografia preparativa deve ser rigorosamente

controlada. A amostra sai da coluna diluda e, por isso, baixas concentraes de impurezas no
volteis no solvente podem comprometer seriamente a pureza do produto que se est isolando. A
maneira que a amostra ser concentrada deve levar em considerao no s as caractersticas do
solvente que se deseja descartar, mas as propriedades qumicas e fsicas da amostra a ser isolada.
Referncias
DEGANI, A.L.G. (1997). Desenvolvimento de mtodos para a anlise e separao de amidas axiais
quirais, por CLQAE, e estudos de suas barreiras de racemizao. Dissertao (Mestrado) Universidade Federal de So Carlos.
GILBERT, M.T. (1987). High Performance Liquid Chromatography. Whight, Bristol, p.273-290.
NEWBURGER, J.; LIEBES, L.; COLIN, H.; GUIOCHON. (1989). Investigation of the influence
of particle size on the productivity of preparative HPLC columns. In: GRUSSHKA, E. ed.
Preparative-Scale Chromatography. Chromatographic Science Series, Marcel Decker, v.46, p. 141-157.
PINTO, M.M.M.; TIRITAN, M.E.; PINHO, P.M.M.; CASS, Q.B.; GOMES, R.F.; DEGANI,
A.L.G. teres bifenilicos quirais: Resoluo enantiomrca e avaliao da atividade anti-inflamatria.
23a Reunio Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, QO-199.
PORCH, B. (1994). Some specific problems in the practice of preparative high-performance liquid
chromatography. J. Chromatogr. A, 658, p. 179-194.
63
12. TRATAMENTO DE AMOSTRAS

O pr-tratamento a etapa fundamental de uma anlise por Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia. Nesta etapa, prepara-se a amostra para que a mesma esteja livre de interferentes, no
danifique a coluna e seja compatvel com o eluente a ser utilizado.
Independente do tipo da matriz, o isolamento do soluto de uma matriz complexa tem por
objetivo a extrao deste soluto em um lquido.
De um modo geral, a etapa de preparao da amostra a mais demorada do mtodo e a que
leva ao maior nmero de erros e, em conseqncia, deve fazer parte do mtodo como um todo
quando da validao do mesmo.
A preparao envolve normalmente as seguintes etapas: coleta da amostra, secagem, estocagem,
pesagem, diluio volumtrica, remoo das partculas, extrao, derivao. O procedimento a ser
seguido depende da matriz da qual o soluto ser isolado.
As matrizes so classificadas em slidas, semi-slidas, lquidas e gasosas.
As matrizes gasosas so normalmente extradas por borbulhamento do gs em um lquido que
captura o soluto de interesse ou, ento, o gs passado por um suporte slido capaz de extrair o
analito que, posteriormente, extrado com um solvente adequado.
As amostras slidas e/ou semi-slidas exigem, de um modo geral, um maior nmero de etapas,
pois, antes de extrair o analito do slido, muitas vezes faz-se necessria a abertura da amostra.
Diversos modos podem ser usados para extrao de slidos. De um modo geral, o que se
procura dissolv-lo em um solvente, sendo os resduos separados por filtrao, centrifugao etc.
Muitos slidos requerem que uma homogeneizao seja feita antes da solubilizao. O mtodo dos
frascos agitadores funciona bem para amostras bem solveis, mas, s vezes, a abertura da amostra
requer o uso do ultra-som ou de outros mtodos, cujos principais sero abordados nas sees a
seguir.
12.1 Extrao por Soxhlet

E um dos mtodos mais antigos e eficientes de extrao de slidos. A amostra colocada em
um cartucho e extrada por condensao do solvente em refluxo. O Soxhlet feito de forma a sifonar
o solvente toda vez que o compartimento que tem o cartucho preenchido com o solvente. O
processo contnuo e pode ser feito at a completa extrao do analito. E um processo lento, sendo,
de modo usual, de mais de 12 horas.
12.2 Extrao em Fluido Supercrtico

usada para extrair compostos no polares e moderadamente polares de matrizes slidas. A
amostra colocada em um reservatrio por onde passa um fluido supercrtico; depois da
despressurizao, a amostra coletada. Os fluidos que so usados incluem dixido de carbono,
amnio, pentano etc. O dixido de carbono o mais comumente usado. Embora este seja capaz
de extrair uma grande variedade de compostos apoiares, menos eficiente quando se trata de
compostos polares. Assim, a adio de at 10% de solventes orgnicos como metanol, acetonitrila
e diclorometano tem sido feita. As variveis mais importantes que afetam a extrao com fluido
supercrtico so: presso do fluido, tem peratura, fluxo e co-solventes usados. A otimizao da
extrao deve ser feita caso a caso e a literatura tem oferecido uma variedade de mtodos que podem
ser usados como guia para o desenvolvimento da extrao.
12.3 Extrao por Microondas

A amostra extrada por energia de microondas. Usa-se normalmente um solvente de alta
constante dieltrica que absorve energia ou, ento, um solvente de baixa constante dieltrica que
no absorve. No primeiro caso, so utilizadas vasilhas extratoras fechadas (que no absorvem

energia) e, assim, o solvente aquecido a uma temperatura superior temperatura de ebulio, o
que permite a rpida extrao a uma moderada temperatura.
Quando o solvente no absorve energia no microondas, usa-se uma vasilha aberta ou fechada.
Como o solvente no absorve a radiao do m icroondas, sua seleo feita baseando-se na
solubilidade que o mesmo deve fornecer ao analito quando este liberado da amostra que absorve
a radiao. Neste modo, a extrao feita presso atmosfrica ou a baixas presses, sendo utilizada
para compostos lbeis.
As extraes em microondas podem ser controladas por variveis como o solvente extrator, o
tempo de aquecimento, aquecimento em pulso versus contnuo, agitao etc.
12.4 Extrao Acelerada com Solvente

A extrao feita em estufas com vasilhas fechadas em temperaturas na faixa de 50 a 200C e
presses na faixa de 150 a 2000 psi. A extrao rpida e eficiente devido s altas temperaturas e
o consumo de solvente reduzido. Esta tcnica usa um equipamento semelhante ao utilizado em
extrao com fluido supercrtico.
O preparo de amostras slidas, assim como de amostras gasosas, envolve sempre uma etapa
que transforme a matriz em uma matriz lquida. Esta primeira etapa pode fornecer a amostra em
condies de ser injetada no cromatgrafo ou, ainda, requerer as etapas usuais de preparo de
amostras lquidas.
As amostras lquidas so usualmente extradas valendo-se da partio em um solvente imiscvel,
a extrao lquido-lquido, e a extrao em fase slida off-line ou on-line.
O tratamento adequado a ser feito depende da matriz que se est trabalhando e qual se aplica
o mtodo.
12.5 Fluidos Biolgicos

A anlise de fluidos biolgicos, particularmente plasma, soro e urina, extremamente usual,
mas demanda um tratamento especfico. A presena de compostos endgenos pode comprometer
a anlise pretendida, especialmente porque a concentrao dos analitos quase sempre muito baixa.
A droga e/ou os m etablitos ligam-se s protenas, mas esta ligao pode ser quebrada por
precipitao. Esta precipitao pode ser feita por uma variedade de mtodos, como: aquecimento;
tratamento com cidos, bases ou solventes orgnicos miscveis com gua, como metanol, acetonitrila
e etanol. A protena precipitada separada aps centrifugao e o sobrenadante , em muitos casos,
injetado diretamente no cromatgrafo ou ento submetido a um determinado mtodo de extrao.
M etablitos so muitas vezes excretados na urina na forma de glucorondeos e requerem
hidrlise enzimtica. Como o percentual de protenas baixo na urina, a remoo destas no
problema e, sim, o grande nmero de compostos cidos e bsicos presentes nela.
Outro material bastante comum para anlise so os tecidos. Estes apresentam muitas das
caractersticas do plasma e do soro, mas requerem prvia homogeneizao. Sais, s vezes, devem ser
usados para a quebra do material celulr. Talvez o maior problema associado anlise de tecidos
seja a determ inao do percentual de recuperao, pela dificuldade de fortificao de forma
apropriada.
Leite outra matriz biolgica extremamente analisada. Assim como no plasma e soro, h
presena marcante de compostos endgenos que interferem com os analitos de interesse, usualmente
presentes em baixa concentrao. A maior dificuldade na anlise desta matriz a presena de grandes
quantidades de compostos graxos, assim, uma extrao prvia com um solvente como o hexano para
a remoo dos lipdios normalmente se faz necessria.
O uso de colunas de acesso restrito (RAM) para injeo direta de fluidos biolgicos tem sido
amplamente investigado.
65
Alimentos
Vrios tipos de frutas e vegetais e alim entos processados tm sido analisados para um a
multiplicidade de fins. A correta amostragem um dos problemas que deve ser considerado antes
do processamento. Grande parte destas amostras so slidas, e devem ser homogeneizadas ou
cortadas antes da extrao. No caso de lquidos e/ou leos, o procedimento inicial de extrao deve
ser cuidadosamente escolhido. De um modo geral, a primeira fase de extrao, requerendo uma
etapa posterior de separao (clean-up).
gua
De diversas fontes e procedncias tem sido examinada para contaminantes orgnicos das mais
diversas classes de compostos. O problema analtico apresentado por esse tipo de amostra, quase
sempre, que tais contaminantes esto presentes em nvel de traos e, assim, a etapa de extrao
em geral associada concentrao da amostra. Extrao lquido-lquido tem sido amplamente
aplicada para o isolamento do analito de interesse e o uso de grandes volumes de gua e de solventes
orgnicos , sem dvida, o maior inconveniente a ser enfrentado. A extrao em fase slida tem sido
aplicada com sucesso, uma vez que um volume grande de gua pode ser passado pelo cartucho,
membrana ou coluna, ficando os compostos orgnicos retidos e posteriormente eludos com um
volume mnimo de solvente orgnico.
12.6 Extrao Lquido-Lquido

E a forma mais comum de preparao de amostra. A extrao dos solutos feita pela partio
da amostra entre dois lquidos imiscveis, sendo normalmente um aquoso e outro orgnico. Os
compostos s sero extrados pela fase orgnica se possurem a necessria lipofilicidade para serem
extrados pelo solvente mais orgnico.
Pela lei de Nernst (Equao 12.1), a distribuio de um composto entre duas fases imiscveis
ser feita de modo que a razo da concentrao permanea constante.
u _ [S]ocg
[S]
(121)
em que KD a constante de equilbrio, enquanto [S] a concentrao do soluto na fase orgnica

e [S].. , na fase aquosa. A frao de soluto extrada, E, na fase orgnica pode ser calculada pela
Equao 12.2:
c
k dv
1+ K dV
( 12-2)
em que V a razo entre o volume de fase orgnica pelo volume de fase aquosa. Para um dado
volume final de solvente, mltiplas extraes so mais eficientes que o uso do mesmo volume total
em uma nica etapa.
A solubilidade do composto a ser extrado deve ser considerada. Como o principal objetivo
a obteno da mxima recuperao com o mnimo de interferentes possveis, recomenda-se que o
solvente escolhido para extrao seja o menos polar da srie, que fornea boa recuperao do analito
com baixa extrao dos interferentes. O ponto de ebulio do solvente extrator deve ser considerado,
uma vez que quase sempre se faz necessria a concentrao dos mesmos. Conseqentemente, ao se
trabalhar com grandes volumes de solventes e amostras de baixas concentraes, a pureza dos
solventes tambm deve ser considerada.
Para compostos ionizveis, alm da polaridade do solvente, o pH deve ser levado em
considerao. A extrao de um cido por uma base, e vice-versa, com posterior extrao com um
solvente orgnico aps neutralizao, tambm tem sido muito utilizada.
Para grandes volumes de extrao, so utilizados os funis de separao apropriados para

extrao lquido-lquido. Extrao contnua usada quando o KD muito pequeno ou quando se
requer um volume grande de solvente e mltiplas extraes se tornam impraticveis. A extrao
contnua feita por refluxo do solvente extrator, seguida por condensao e borbulhamento deste
na soluo do soluto. O solvente contendo o soluto retorna ao reservatrio de aquecimento,
acum ulando o soluto. A retirada contnua do soluto pelo solvente extrator leva a extraes
extremamente eficientes, mesmo para compostos com KD muito baixos.
Quando se trabalha com pequenos volumes de solventes e um grande nmero de amostras,
como nas extraes em fluidos biolgicos, utilizam-se tubos de ensaio e a separao nas duas fases
imiscveis conseguida por centrifugao. Neste caso, o uso de solventes menos densos que a gua
facilita a separao das fases por congelamento da fase aquosa mais densa.
12.7 Extrao em Fase Slida

E feita pela reteno seletiva dos componentes de interesse de uma matriz complexa. Os
mesmos princpios da cromatografia lquida se aplicam, assim, para conseguir a seletividade
desejada. Desta forma, necessria uma adequada seleo da fase slida e da fase lquida. A mesma
variedade de fases que est disponvel em HPLC est disponvel para extrao em fase slida. Assim,
pode-se fazer extraes no modo normal, reverso e troca inica.
A extrao em fase slida usualmente mais eficiente que a extrao lquido-lquido e altos
percentuais de recuperao so conseguidos. Uma melhor separao dos interferentes tambm
obtida. A extrao no modo reverso a mais aplicada, usando fases como Clg, C, ciano, fenil ou
amino. Como somente um pequeno volume de solvente se faz necessrio para a eluio, conseguese uma alta concentrao do analito, e como no se manipula muito a amostra, pois no feita
separao de fases, como na extrao lquido-lquido, eliminam-se erros associados a medidas
inexatas de volumes.
Em princpio, este tipo de extrao pode ser feito como em cromatografia clssica de coluna
com slica ou resinas trocadoras para processar grandes concentraes de amostra e/ou grandes
volumes de solvente, mas o usual que seja feito em microescala com slica gel ou slicas derivadas
na forma de cartuchos ou discos.
Os cartuchos so usualmente empacotados com material de 40 (lm, de alta capacidade de carga
e slica irregular. So descartveis e possuem um espao para a adio da amostra e dos solventes
de condicionamento, lavagem e extrao. Estes so aspirados por seringas ou vcuo. Uma das grandes
desvantagens da extrao em fase slida a pobre reprodutibilidade entre os lotes dos cartuchos.
Os discos tm o aspecto de um filtro de membrana, com 1 mm de espessura e dimetro de 4
a 96 mm. Estes podem ser comprados individualm ente e instalados em um porta-filtro no
descartvel ou ser comprados em unidades descartveis prprias para serem conectados a seringas.
So feitos de poli trifluor etileno (PTFE), de fibra de vidro ou ainda de membrana de cloreto de
polivinila recheada com slica derivada ou resina. Membranas derivadas tambm tm sido usadas.
Estas ltimas so funcionalizadas por intermdio de reaes orgnicas e so feitas de celulose, muito
teis em troca inica.
Os discos tm encontrado grande aplicao em anlise ambiental, especialmente em anlises
de contaminantes orgnicos em gua, as quais utilizam grandes volumes de gua para conseguir a
necessria sensibilidade. Neste caso, os compostos orgnicos so retidos no disco e posteriormente
eludos com um pequeno volume de solvente orgnico.
Cartuchos ou similares tm sido am plam ente utilizados. Estes podem ser trabalhados
manualmente ou de forma automatizada. Independente do modo que se trabalhe, faz-se necessrio
otimizar a reteno e a eluio do analito de interesse e minimizar a presena de interferentes.
67
As etapas usuais em extrao em fase slida so:

1. Condicionamento - ativao da fase estacionria por solvatao.
2. Aplicao da amostra - normalmente espera-se que haja reteno dos solutos de interesse,
enquanto os interferentes da matriz so descartados. Alternativamente, pode-se ter a reteno
dos interferentes e a eluio dos analitos.
3. Lavagem - feita para a remoo de interferentes menos retidos que o soluto de interesse.
Quando se trabalha no modo reverso de eluio, esta etapa feita com gua, tampo e, s
vezes, com uma soluo aquosa com um pequeno percentual de solvente orgnico. No modo
normal, esta etapa feita com um solvente ou misturas de solventes apoiares.
4. Eluio - a eluio do soluto pode ser feita com um solvente forte, no qual k = 0, o que
possibilita pequenos volumes de solvente, aumentando a sensibilidade do mtodo. Isto,
entretanto, pode resultar n eluio de compostos mais retidos que os solutos de interesse,
assim, s vezes prefere-se um solvente de fora intermediria para que estes compostos mais
retidos no eluam. Quando se trabalha com maiores volumes, pode-se posteriormente
concentrar as amostras para obter a necessria sensibilidade.
A Figura 12.1 exemplifica estas etapas.
VI
V
V
Condicionamento
V
Aplicao da amostra
d
V
V
V
Lavagem
1>
VT7
Eluio
Figura 12.1 Etapas envolvidas na extrao em fase slida.
A extrao em fase slida requer que as seguintes etapas sejam avaliadas para desenvolvimento
do mtodo.
1. Seleo do eluente - vrios solventes so testados para a extrao do soluto e o melhor
solvente aquele que oferece um maior percentual de recuperao. O volume necessrio para
a extrao tambm deve ser examinado.
2. Seleo do solvente de lavagem - feita com matrizes fortificadas, testando-se diferentes
solventes. O melhor solvente ser aquele que remover o mximo de interferentes sem eluir
os compostos de interesse. O volume necessrio para lavagem tambm deve ser considerado.
3. Avaliao de interferentes da m atriz - feita com uma matriz em branco eluda aps a
lavagem com o solvente previamente selecionado. Se interferentes estiverem presentes, a
etapa de lavagem deve ser modificada ou, ento, troca-se o solvente de eluio.
4. Avaliao do percentual de extrao - feita por comparao entre uma soluo padro e a
matriz fortificada. Uma baixa recuperao pode significar que os analitos interagem com a
matriz e/ou outros parmetros devem ser otimizados.
Os cromatogramas a seguir (Figura 12.2) mostram um exemplo de uma extrao de drogas do
plasma no modo reverso de eluio. Neste caso, os plasmas fortificados e os brancos (1 mL) foram
transferidos para cartuchos de extrao Bakerbond SPE light octadecil (100 mg) previamente
condicionados com metanol (2 mL) e gua (2 mL). Aps a adio do plasma, os cartuchos foram
secos por aspirao sob vcuo e ento lavados com soluo saturada de cloreto de sdio (1 mL),
gua (1 mL), soluo aquosa 20% de acetonitrila (1 mL), gua (1 mL), antes de serem extrados
com metanol (1 mL). Os extratos de metanol foram ento evaporados sob nitrognio e os resduos
foram reconstitudos com 150 |Xl de hexano:etanol (90:10 v/v). Ento, 120 |Il destas solues foram
transferidos para os inserts (200 p.1) do injetor automtico e 50 p.1 foram injetados para a anlise
por HPLC.
a
Figura 12.2 Cromatogramas da a) amostra em soluo e da b) amostra extrada do plasma.
Independentemente do mtodo que se esteja usando para fazer a extrao em fase slida, o
fluxo de solvente no deve ser m uito rpido para perm itir que o soluto interaja com a fase
estacionria. Este fluxo deve ser controlado quando se deseja obter boa preciso entre as extraes.
Para grandes nmeros de amostras, a melhor opo a automatizao do processo. Vrios equi
pamentos permitem tal automao.
12.8 Injeo Direta

Visando simplificar, economizar tempo e dim inuir o manuseio, novas maneiras de prtratamento de amostras em matrizes biolgicas, envolvendo a injeo direta das mesmas, tm sido
extensamente investigadas.
Em relao injeo direta de amostras biolgica?, h dois tipos de abordagem diferentes.
69
A primeira refere-se ao uso de fases mveis micelares, capazes de solubilizar protenas ou

colunas comuns, as quais eram exaustivamente lavadas aps um certo nmero de injees para a
remoo das protenas precipitadas. Neste caso, admitia-se a deteriorao da coluna com o decorrer
do tempo. Seguindo esta linha, tambm foram desenvolvidos sistemas que utilizavam duas colunas
interligadas por uma vlvula, sendo a primeira coluna para a remoo de protenas e a segunda
apenas para a anlise dos componentes de interesse.
A segunda abordagem envolve o uso de adsorventes especiais. Estes excluem protenas e retm
e separam pequenas molculas. O princpio fundamental destas colunas o confinamento da parte
hidrofbica do suporte na sua regio interna, enquanto a regio externa hidroflica e no-adsortiva
para as protenas. Utilizando-se suportes com pequenos dimetros de poro, as protenas sero
excludas da parte interna, hidrofbica, retensiva para os analitos, atravessando ento a superfcie
externa, hidroflica. Estas colunas combinam os princpios da cromatografia de excluso e da
separao por intermdio de fases quimicamente ligadas para produzir uma Cromatografia de
Superfcie Discriminante. O acoplamento de duas ou mais colunas, com diferentes funes, em um
sistema cromatogrfico definido como Cromatografia Multidimensional. Este tipo de croma
tografia tem sido muito utilizado para a extrao on-line e anlise de amostras em matrizes biolgicas
e tambm na resoluo de problemas de sobreposio de picos.
H trs maneiras predefinidas para a utilizao de Cromatografia Multidimensional.
On-line. consiste na utilizao de duas ou mais colunas, interligadas por vlvulas.
In-line', a utilizao de duas ou mais colunas sem ligaes com vlvulas, similar utilizao
de uma ou mais pr-colunas no sistema.
Off-line', sempre a ltima escolha, quando no se consegue ajustar as condies para um
sistema com colunas acopladas. Separam-se inicialmente os compostos de interesse entre si
e tambm dos interferentes da matriz, coletam-se os mesmos, concentra-se e injeta-se em
um segundo sistema, para anlise.
As fases de acesso restrito (RAM) so classificadas nos seguintes modos:
1. ISRP - quando o material consiste em uma superfcie externa hidroflica e em uma
superfcie interna hidrofbica. As duas superfcies so diferenciadas pelo uso de enzimas que
no conseguem entrar na superfcie interna.
2. SPS - quando o material consiste em uma superfcie externa semipermevel hidroflica de
polioxietileno e uma interna hidrofbica (Clg, C lg, CN, fenil).
3. Dual Zone - quando o material tem a regio externa enriquecida por um material hidroflico
e a interna enriquecida por um material hidrofbico. Isto conseguido utilizando-se um
reagente com um bom grupo abandonador.
4. SHP (Shield H ydrophobic Phase) - quando a fase estacionria consiste em regies
hidrofbicas encravadas por uma regio hidroflica de polioxietileno, tanto na regio interna
quanto na regio externa do material poroso.
5. MFP (Fase Funcional Mista) - quando o material de empacotamento consiste em grupos
hidrofbicos e hidroflicos ligados tanto externamente quanto internamente ao poro.
6. Fases reversas com protenas adsorvidas. Apresentam as mesmas caractersticas de fases
reversas para molculas de pequeno tamanho, mas excluem macromolculas pela repulso
com a protena adsorvida na superfcie externa.
A Figura 12.3 ilustra como as fases ISRP operam.
Independente da fase de acesso restrito usada, uma variedade de matrizes complexas pode ser
diretamente injetada, sem pr-tratamento, eliminando, assim, etapas como precipitao, centrifugao,
evaporao do solvente e dissoluo dos resduos.
As fases de acesso restrito tm sido eficientemente usadas em anlises de drogas, metablitos,
peptdeos e outros compostos orgnicos, em matrizes como plasma, soro, sangue, urina, extratos
de tecidos animais e de plantas, alimentos e amostras ambientais.
Figura 12.3 Vista da superfcie interna do suporte (ISRP).

a) Molcula de protena; b) analito; c) fase externa hidroflica; e d) fase interna hidrofbica.
Cromatogramas tpicos de plasma fortificado com omeprazol e plasma livre de drogas so

mostrados na Figura 12.4. Utilizou-se, neste caso, uma coluna extratora de albumina bovina
adsorvida em slica Hypersil Cg (10 X 0,45 cm), sendo a quantificao dos enantimeros feita em
uma coluna quiral (15 X 0,45 cm) tris-(3,5-dimetilfenilcarbamato) de amilose adsorvido em slica
Nucleosil (500 de tamanho de poro, 5 |1 de tamanho de partcula),
a
b
Minutos
Minutos
Figura 12.4 Cromatogramas representando a) plasma branco e

b) plasma fortificado com amostra-padro de Omeprazol 0,075\lg/mL.
Referncias
GISCH, D.J.; HUNTER, B.T.; FEIBUSH B. (1988). Shielded hydrophobic phase: a new concept
for direct injection analysis of biological fluids by high-performance liquid chromatography, J.
Chromatogr, 433, p.246-268.
HAGINAKA, J. (1991). Drug determination in serum by liquid chromatography with restricted
access stationary phases. Trends in Analytical Chemistry, n.10, v.l, p. 17-22.
MENEZES, M.L.; FELIX, G. (1996). Analysis of organochlorine pesticicides in plain milk using
direct injection on an isrp column, with column switching. J. Liq. Chrom. & Related Technol.,
v.l9, n.l, p.3221-3228.
2.ed. New York, John Wiley and Sons. p. 100-173.
STEVENSON, D. (1995). Sample preparation. In: WAINER, I.W.; LOUGH, W.J. eds. High
Performance Liquid Chromatography, Fundamental Principles and Practice. Glasgow, Blackie
Academic & Professional, p. 168-185.
71
13. VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS

E um processo que fornece uma evidncia documentada de que o mtodo confivel ao que
se aplica. Consiste em uma srie de procedimentos que visam assegurar credibilidade s medidas
obtidas.
A validao de um mtodo uma etapa muito importante e necessria para que o mtodo
desenvolvido possa ser utilizado. A Figura 13.1 mostra um esquema das etapas envolvidas no
processo de desenvolvimento, validao e utilizao de um mtodo analtico.
Figura 13.1 Desenvolvimento, validao e utilizao de um mtodo analtico.

O
desenvolvimento de um mtodo analtico envolve o estabelecimento do procedimento de
extrao e das condies cromatogrficas e a realizao de alguns estudos preliminares quanto
seletividade, sensibilidade e linearidade.
Antes de iniciar a validao de um mtodo deve-se ter resposta para as seguintes questes:
Quais parmetros de validao devem ser avaliados?
Quais procedimentos sero utilizados para avaliar estes parmetros?
Quais os critrios de aceitao de cada parmetro?
Alm dos aspectos anteriormente discutidos, dve-se ter estabelecido o modo a ser utilizado
para a medida da resposta do detector e a forma de padronizao.
A resposta do detector pode ser medida por interm dio da altura ou da rea dos picos.
Enquanto a medida da altura a preferida para anlises de traos, a medida da rea a mais
utilizada. A medida da altura do pico requer que a composio da fase mvel seja precisamente
controlada, ao passo que, para a medida da rea do pico, necessrio um fluxo extremamente
preciso. Com as bombas atuais, no se tm problemas de flutuao do fluxo, por isso as medidas
de rea so preferidas.
Para a medida de altura de picos, recomenda-se a mistura dos eluentes que compem a fase
mvel de forma automatizada, de modo a evitar variaes percentuais.
A correlao entre a resposta do detector, seja na forma da altura ou rea dos picos, e a
concentrao do composto de interesse denominada calibrao. Para a construo de uma curva
de calibrao, necessria a escolha do mtodo a ser utilizado para a preparao dos padres, isto
, a padronizao. A padronizao pode ser feita de trs maneiras, descritas a seguir.
Padro externo
o mtodo mais utilizado, sendo apropriado para amostras que no necessitem de um prtratamento extenso. Consiste na construo de uma curva de calibrao, a partir de solues-padro
com concentraes conhecidas. Deve-se utilizar padres com concentraes similares s esperadas
nas amostras, sendo as anlises feitas na matriz, de modo a assegurar a exatido das medidas.
O
fator de resposta (FR) a mdia dos valores obtidos e o coeficiente angular da reta. A
Figura 13.2 mostra um exemplo de uma curva de calibrao feita a partir de padronizao externa.
Concentrao do anlito ng/mL
Figura 13.2 Curva de calibrao com padronizao externa.
Padro interno
Envolve a adio de um padro a cada amostra a ser analisada. O padro interno um
composto, no necessariamente similar ao analito, mas com reteno prxima e boa resoluo em
relao a este, de alta pureza e estabilidade.
E o mtodo de escolha para amostras que requerem muita manipulao. Nem sempre leva a
medidas mais precisas, devido ao fato de envolver a medida de dois picos, em vez de apenas um.
Sua utilizao especialmente problemtica quando os picos rabeiam.
Para a construo da curva de calibrao, preparam-se as solues-padro contendo diferentes
concentraes do analito e adiciona-se uma concentrao fixa do padro interno.
A Figura 13.3 m ostra um exemplo de uma curva de calibrao preparada a partir de
padronizao interna. O fator de resposta o coeficiente angular da reta, mas as concentraes do
analito podem ser determinadas diretamente na curva.
73
Adio de padro
o mtodo utilizado nos casos em que no possvel a obteno da matriz sem a presena
do composto de interesse. Consiste na adio de diferentes concentraes do analito matriz, que
j contm uma quantidade desconhecida do mesmo. A Figura 13.4 mostra um exemplo de uma
curva de calibrao construda a partir da adio de padro.
o
C
O
-- 500000
ig
1Q. 40000-
SP 30000-
1 20000-
fClQ
oo 10000C0
...........r
0,1
0,2
i------------
0,3
0,4
0,5
Concentrao do analito ng/mL
Figura 13.3 Curva de calibrao com padronizao interna.
Figura 13.4 Curva de calibrao com adio de padro.
Como se pode observar na Figura 13.4, tais curvas no se aproximam do zero (0,0) devido
presena de analito na matriz. A concentrao do analito inerente matriz determinada por
intermdio do intercepto da curva ao eixo y.
Inicialm ente, calcula-se o fator de resposta (FR), que o coeficiente angular da reta. A
concentrao de analito na matriz igual razo entre a rea medida no intercepto com o eixo y e
o coeficiente angular da reta. A seguir, exemplifica-se esta determinao:
FR(coef. angular) = 50000 ~ 30000 = 100000
v
M
'
0,4-0,2
_
concmicai
int ercepto
coef angU|ar
_ 20000
100000
No existe um protocolo geral para a validao de mtodos analticos, uma vez que os critrios
de aceitao variam de acordo com a finalidade da anlise. Desta forma, cada estratgia de validao
especfica para uma dada aplicao, podendo ser realizada de diversas maneiras.
Os parmetros de validao visam conferir credibilidade aos dados gerados, de modo a

garantir que estes expressem o valor real da medida obtida. Normalmente, investigam-se
inicialmente a especificidade, a linearidade, a preciso, a exatido, a recuperao e a
sensibilidade, sendo os estudos de robustez posteriormente realizados. A seguir, os parmetros
anteriormente citados so definidos e os procedimentos utilizados para sua avaliao so
discutidos.
13.1 Seletividade
E a habilidade de um mtodo separar, do composto de interesse, componentes da amostra
que sero visveis no detector.
Assegura que o sinal medido no influenciado por substncias interferentes.
A seletividade determinada analisando-se diversas amostras da matriz (n > 6), para que
se investigue a possvel presena de compostos que interfiram ou se sobreponham ao sinal do
composto de interesse. Avaliaes adicionais incluem anlises de produtos de degradao,
excipientes (frmacos) e impurezas. Em estudos farmacolgicos, examina-se a possvel co-eluio
com metablitos. O uso de detectores de arranjo de fotodiodos ou espectrmetros de massa tem
sido especialmente til para este fim.
13.2 Linearidade
E a capacidade de um mtodo analtico gerar resultados proporcionais concentrao do
composto em questo, dentro de uma faixa analtica especificada (Intervalo Dinmico), sendo
possvel relacionar a resposta do detector concentrao.
E avaliada por intermdio de medidas da amostra em diversas concentraes, ou seja, da
construo de curvas de calibrao. Sua determinao normalmente realizada por intermdio da
anlise de amostras extradas da matriz apropriada em, no mnimo, cinco concentraes diferentes.
Recomenda-se a anlise das amostras em replicata (n > 2).
Aps o processamento dos dados obtidos, a linearidade avaliada por intermdio do clculo
de regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados, e verifica-se o quanto esta reta descreve
os pontos, por intermdio de seu coeficiente de correlao (r). Valores de r > 0,99 so aceitveis
na maioria dos mtodos analticos.
Mtodos que apresentem baixa linearidade devem ser tratados como no-lineares e devem-se
usar outros modelos mais complexos para a calibrao.
13.3 Exatido
E a relao entre o valor encontrado pelo mtodo e o valor aceito como verdadeiro ou de
referncia, sendo calculada pela seguinte frmula:
ExatidO *=
C 0 n C e n ^r a ^ ^ 0
0b tk la
concentraoterica
1 qqo/o
(1 3
1)
'
A exatido pode ser determinada de vrias formas:

Anlise de uma amostra certificada e sua comparao com o valor medido.
Comparao com resultados obtidos por intermdio da utilizao de um mtodo j existente
e de exatido conhecida.
Baseando-se na preparao de uma soluo de concentrao conhecida, por intermdio da
adio de uma determinada quantidade da amostra matriz.
A exatido normalmente determinada por intermdio de, no mnimo, anlises em quintuplicata de trs diferentes concentraes, usualmente uma em baixa concentrao (11096-120% do
75
ponto mais diludo da curva de calibrao), outra em mdia (40%-60% do ponto mais concentrado)
e uma em alta (75%-95% do ponto mais concentrado).
13.4 Preciso
E a habilidade do mtodo de reproduzir o mesmo resultado, embora no necessariamente o
correto, sempre que o procedimento executado.
A avaliao da preciso subdividida em trs etapas, que so diferenciadas pelo intervalo de
tempo em que so feitas as anlises e pelas condies de realizao destas, embora esta classificao
no seja universal.
1. Repetibilidade - mede o grau de variao de uma srie de replicatas de injeo em um curto
intervalo de tempo, ou seja, em uma mesma seqncia, nas condies originais do mtodo.
O procedimento anterior s vezes considerado como uma avaliao da repetibilidade do
equipamento. E um procedimento desnecessrio quando se trabalha com auto-injetor, a
menos que se queira certificar o equipamento. Quando envolve a preparao de mltiplas
amostras de mesma concentrao denominada preciso intradia, por intermdio da qual
se avalia o mtodo em questo.
2. Preciso intermediria - expressa o efeito das variaes dentro do laboratrio devido a
anlises em diferentes dias no consecutivos. Pode incluir medidas feitas em diferentes
equipamentos, por diferentes analistas. Envolve a preparao de mltiplas amostras.
3. Reprodutibilidade - mede a preciso do mtodo quando executado em diferentes la
boratrios.
A preciso de um mtodo por intermdio do desvio-padro e/ou do coeficiente de variao
das medidas obtidas.
Em muitos mtodos, comum a avaliao da preciso por intermdio de medidas de preciso
intra e interdias, para mltiplas amostras. normalmente determinada por intermdio de, no
mnimo, anlises em quintuplicata de trs diferentes concentraes, uma em baixa, uma em mdia
e uma em alta concentrao. Em geral, para um mtodo de anlise de amostras em fluidos biolgicos
ser considerado preciso, os coeficientes de variao no devem ultrapassar 15%, com exceo do
limite de quantificao, quando ele pode chegar a 20%.
13.5 Recuperao
Avalia a eficincia do mtodo de tratamento da amostra. Sua percentagem calculada pela
seguinte frmula:
Re cuperao(%) =
va Orot)tid - x 100%
(13.2)
v a l radicionado
A porcentagem de recuperao determinada por intermdio da comparao de anlises em

quintuplicata de trs concentraes, de amostras extradas com solues-padro no extradas, as
quais representam 100% de recuperao.
Embora porcentagens de recuperao prximas a 100% sejam desejadas, admitem-se valores
menores, por exemplo de 50%-60%, desde que a recuperao seja precisa e exata.
13.6 Sensibilidade
a habilidade de um mtodo distinguir, com determ inado nvel de confiana, duas
concentraes prximas. A avaliao da sensibilidade compreende a determinao dos limites de
quantificao e deteco.
Limite de quantificao
definido como a menor concentrao do composto que pode ser medida com uma preciso
especificada, dentro do critrio de aceitao do mtodo.
Limite de deteco
definido como a menor concentrao do composto que produz uma resposta maior do que
trs vezes o rudo.
13.7 Robustez
a habilidade do mtodo em fornecer resultados inalterados quando sujeito a pequenas
mudanas como diferentes analistas, variaes no pH e/ou concentrao da fase mvel, alteraes
na performance da coluna, temperatura do ambiente etc. Pode ser determinado por intermdio da
anlise individual ou simultnea dos parmetros mais sujeitos variao.
13.8 Consideraes Finais

Ao avaliar a preciso e a recuperao, geram-se os controles de qualidade do mtodo, em baixa,
mdia e alta concentrao. Esses controles devem possuir concentrao dentro da faixa linear
utilizada, embora diferentes das concentraes utilizadas para a construo da curva de calibrao.
Esses controles de qualidade so avaliados quando da utilizao do mtodo, para que se
verifique sua validade. Os parmetros de validao aqui definidos so os mais utilizados, embora
outros parmetros possam ser empregados em funo do problema em questo. Os critrios de
aceitao destes parmetros, entretanto, variam amplamente de acordo com a aplicao qual o
mtodo se refere. Estes critrios devem ser coerentes com a aplicao pretendida, explicitados
numrica e matematicamente. ideal que cada laboratrio elabore seu prprio protocolo de
validao, levando em considerao sua rea de atuao.
Mtodos com a devida seleo dos parmetros de validao e que possuam critrios de aceitao
pertinentes tm qualidade agregada a eles e transmitem confiabilidade aos clientes.
Referncias
CHASIN, A.A.M.; NASCIMENTO, E.S.; RIBEIRO-NETO, L.M.; SIQUEIRA, M.E.P.B.,
ANDRAUS, M.H.; SALVADORI, M.C.; FERNCOLA, N.A.G.; GORNI, R.; SALCEDO, S.
(1998). Validao de Mtodos em Anlises Toxicolgicas: Uma abordagem geral. Revista Brasileira
de Toxicologia, n.ll, v.l, p. 1-6.
GREEN, J.M. (1996). A Practical Guide to Analytical Method Validation. Anal. Chem. News &
Features. p.305A-309A.
JENKE, D.R. (1996). Chromatographic Method Validation: A Review of Current Practices and Procedures.
I. General Concepts and Guidelines. J. Liq. Chrom. & Rei. Technol., n. 19, v.5, p.719-736.
JENKE, D.R. (1996). Chromatographic Method Validation: A Review of Current Practices and
Procedures. II. Guidelines for Primary Validation Parameters. J. Liq. Chrom. & Rei. Technol.,
n.19, v.5, p.737-757.
JENKE, D.R. (1996). Chromatographic Method Validation: A Review of Current Practices and
Procedures. III. Ruggedness, Re-Validation and System Suitability. J. Liq. Chrom. & Rei. Technol.,
n.19, v.l2, p.1873-1891.
77
LOUGH, W.J.; WAINER, I.W. (1995). Method Development and Quantitation. In: WAINER,
1.W. ; LOUGH, WJ. eds. High Performance Liquid Chromatography, Fundamental Principles and
Practice. Glasgow, Blackie Academic & Professional, p. 143-67.
SHAH, V.P.; MIDHA, K.K.; DIGHE, S.; MCGILVERAY, I.J.; SKELLY, J.P.; YACOBI, A.;
LAYLOFF, T.; VISWANATHAN, C.T.; COOK, C.E.; MCDOWALL, R.D.; PITTMAN, K.A.;
SPECTOR, S. (1992). Analytical Method Validation: Bioavaliability, Bioequivalence and
Pharmacokinetic Studies. J. Pharm. Sei., n.81,-v.3, p.309-311.
2.ed. New York, John Wiley and Sons. p.643-713.
Srie
Apontamentos
Desenvolvimento de novos empreendimentos
Equaes diferenciais parciais com M APLE V

Jos Antnio Salvador
Ana Lcia Vitale Torkomian

Edemilson Nogueira
Catlogo de avaliao do nvel de dependncia de

crianas de 4 a 8 anos nas atividades de vida diria
Modelos probabilsticos aplicados engenharia de

produo
Reinaldo Morabito
Thelma Simes Matsukura

Edna Maria Marturano
Estrutura e propriedades dos polmeros
Resistncia dos materiais - volumes 1 e 2
Abigail Lisbo Simal
Jos Sergio Komatsu
Trocadores de calor
Desenvolvimento de mtodos por HPLC - fundamentos,

estratgias e validao
Quezia B. Cass
Ana Luiza Gusmo Degani
Everaldo Csar da Costa Arajo
Introduo ao controle de processos qumicos cm

MATLAB - volumes 1 e 2
Wu Hong Kwong
Estgios em educao fsica: experincias de ao e

reflexo
Exerccios aplicados fsico-qumica dos polmeros
Glauco Nunes Souto Ramos (org.)
Abigail Lisbo Simal
Aes devidas ao vento em edificaes
A cartilha prolog
Joo Alfredo Azzi Pitta
Maria do Carmo Nicoletti
Procedimentos para o bibliotecrio abrir sua pequena

empresa de prestao de servios
Sistemas numricos e tratamento de inteiros no pas

cal
Elaine de Oliveira Machado
Maria do Carmo Nicoletti

Sandra Abid
Hipertexto de mtodos de matemtica aplicada com

MAPLE V
Jos Antnio Salvador
Cultura corporal - alguns subsdios para sua

compreenso na contemporaneidade
Luiz Gonalves Junior
ISBN 85-85173-61-0
Editora da Un^ersiuade Federal de So Carlos

Desenvolvimento de Métodos Por HPLC Fundamentos, Estratégias e Validação

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Desenvolvimento de Métodos Por HPLC Fundamentos, Estratégias e Validação

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Srie

Desenvolvimento de Mtodos por HPLC

Edio revista em dezembro de 2001

Universidade Federal de So Carlos

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

Oswaldo Baptista Duarte Filho

Maria Cristina Priore

EdUFSCar - Editora da UFSCar

2001 Quezia B. Cass e Ana Luiza Gusmo Degani

Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitria da UFSCar

Reviso e Produo Grfica

4. I nstrumentao _____ _______

6. F ases Q uimicamente L igadas ..

8. O tim iza o ..................................

9. E luio G radiente ....................

10. C romatografia Q u ir a l ............

C romatografia P reparativa ...

13. V alidao de M todos Analticos

Desenvolvimento de Mtodos por HPLC: Fundamentos, Estratgias e Validao

Desenvolvimento de Mtodos por HPLC: Fundamentos, Estratgias e Validao

2.1 A Banda Cromatogrfica

Esquema da distribuio gaussiana de uma banda cromatogrfica.

2.2 Reteno (R)

Desenvolvimento de Mtodos por HPLC: Fundamentos, Estratgias e Validao

Tempo de reteno (tr) - E a medida entre o ponto de injeo e o mximo do pico.

Desenvolvimento de Mtodos por HPLC: Fundamentos, Estratgias e Validao

3.2 Nmero de Pratos (N)

Como o valor de N aproximadamente constante para diferentes bandas em um

Altura Equivalente a um Prato (H)

Altura do Prato Reduzido (h)

Disperso Extracoluna (o^

Desenvolvimento de Mtodos por HPLC: Fundamentos, Estratgias e Validao

Como o alargamento de bandas aumenta com o aumento da reteno, as contribuies ante

Assimetria de Picos (As)

Figura 3.1 Esquema e equao para o clculo da assimetria de um pico.

H divergncias quanto posio em que a assimetria deve ser calculada. H recomendaes

3.3 Fator de Separao (a)

Figura 3.2 Curvas de resoluo padro.

Desenvolvimento de Mtodos por HPLC: Fundamentos, Estratgias e Validao

de acordo com a razo entre as bandas (hi/fe)

Resoluo de linha de base alcanada com valores Rs ^ 1,5. Importante a obteno da

Desenvolvimento de Mtodos por HPLC: Fundamentos, Estratgias e Validao

O desenvolvimento de colunas com fases estacionrias preparadas com partculas de menor

Bombas de presso constante

18 Edil FSCar - Apontamentos

Bombas de fluxo constante

Figura 4.2 Esquematizao de uma bomba recproca.

O grande problema destas bombas a produo de fluxos pulsantes, decorrentes do movimento

Desenvolvimento de Mtodos por HPLC: Fundamentos, Estratgias e Validao

Seringa com amostra

Seringa com amostra

Figura 4.3 Injetor de vlvula, a) Posio LOAD e b) posio INJECT.

Os detectores por arranjo de fotodiodos fornecem espectros no UV-Vis do eluente da coluna

Desenvolvimento de Mtodos por HPLC: Fundamentos, Estratgias e Validao

Polarmetro e dicrosmo circular

Espalhamento de luz (light-scattering)

Ressonncia magntica nuclear

Desenvolvimento de Mtodos por HPLC: Fundamentos, Estratgias e Validao

Figura 5.2 Partculas a) esfricas e b) irregulares.

Desenvolvimento de Mtodos por HPLC: Fundamentos, Estratgias e Validao

6. FASES QUIMICAMENTE LIGADAS

A reteno nestas fases dependente da quantidade de carbono presente, geralmente expressa

Desenvolvimento de Mtodos por HPLC: Fundamentos, Estratgias e Validao

4. I nstrumentao _ ___