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EVALUACIÓN
TOXICOLÓGICA DE
BIOINSECTICIDAS
PRÁCTICA N 2 DE BIOTECNOLOGÍA
PRESENTADO POR:
X CICLO
ICA – PERÚ
2010
PRÁCTICA DE BIOTECNOLOGÍA
PRODUCCIÓN Y EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE BIOINSECTICIDAS
PRACTICA Nº 2:
PRODUCCIÓN Y EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE BIOINSECTICIDAS
I. INTRODUCCIÓN
Las plagas tanto urbanas como rurales son una amenaza constante para la salud y la calidad de
vida humana (Dulmage, et al., l990), son también la causa de grandes pérdidas económicas en los
cultivos (Kaelin, et al., l994). Hasta ahora la única forma eficaz de controlar estos insectos plaga se
basa en la aplicación de pesticidas químicos, aunque ello trae en consecuencia problemas
ecológicos; por tanto el uso irracional de los agroquímicos ha sido causa de contaminación
ambiental en todo el planeta. Una posible alternativa para solucionar este problema es el control
biológico, definido como el uso de un organismo natural o modificado genéticamente y/o sus
productos para reducir los efectos de insectos plaga.
Se ha reportado la existencia de más de 1500 especies de microorganismos entomopatógenos
con potencial para el control microbiano de insectos, en relación a su diversidad se señalan:
hongos, virus, protozoarios y bacterias, en donde las últimas son las de mayor importancia. De las
bacterias la más sobresaliente pertenece al género Bacillus (3).
Bacillus thuringiensis, es una bacteria GRAM positiva esporulada, nativa del suelo, caracterizada
por producir inclusiones paraesporales de constitución proteica (ICP), también denominadas δ-
endotoxinas, con actividad tóxica frente algunas especies de insectos de los órdenes Lepidoptera,
Diptera, Coleoptera, Hymenoptera, Homoptera, Orthoptera, y Mallophaga, y contra otros
organismos, como ácaros, nematodos y platelminos (1).
Desde su descubrimiento en el siglo pasado, B. thuringiensis se ha convertido en el
entomopatógeno más utilizado a nivel mundial, con ventas que representan de 90% del mercado
de bioplaguicidas, y además es aprovechado para obtener plantas resistentes a insectos (2).
En este informe se evaluó en forma rápida y efectiva la actividad insecticida de las proteínas cry,
producidas en un Biorreactor, de la cepa nativa Bacillus thuringiensis var. Kurstaki para ratificar
su valor como alternativa para el control biológico sobre plagas agrícolas.
II. MATERIALES
PROCEDIMIENTO:
REACTIVACIÓN DE LA CEPA
Proliferación celular:
Se sembró en toda la superficie de 1 placa con agar nutritivo e incubó a 37ºC por 24
horas.
Cosecha celular:
a. Añadimos 3 ml de caldo nutritivo en la placa con el cultivo y 5 perlas de vidrio estériles.
Luego movimos las placas suavemente hasta obtener una suspensión celular.
b. Tomamos la suspensión celular y lo colocamos en un frasco schott de 150 ml estéril y
se enrazó hasta 50 ml con caldo nutritivo. Antes, comprobamos la formación de
esporas y cristales de la Cepa, haciendo una coloración con Azul de Comassie.
a. Se colocó 1 ml. del inóculo y el medio base + harina de soya al 0.6% hasta un volumen
de trabajo de 1800ml. en el biorreactor. (Concentración inicial de fermentación
aproximadamente 4.3 104 UFC/ml).
Ci x V1 = CIF x V2
(7.8 x 107 UFC/ml.)x(1 ml.) = (CIF)x(1801 ml.)
PRUEBAS
Tiempo (seg.) Volúmen (ml.)
1.7 40
1.9 38
1.7 42
1.8 44
1.9 40
Promedio = 1.8 seg. Promedio = 40.8 ml.
0.030 min (1.8 seg) ----- 40.8 ml. 1 VVM ----- 1300 ml.
1 min ---------------------- X X ------------ 1800 ml.
Biorreactor en funcionamiento
d. Dejar en reposo por 48 h para que las células esporulen y formen los cristales
proteicos.
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PRODUCCIÓN Y EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE BIOINSECTICIDAS
Con los cristales proteicos se llevará a cabo un bioensayo en el que se pondrán en contacto con
larvas de Spodoptera sp. que son plagas de plantas.
PROCEDIMIENTO:
Se observó la turbidez del medio de cultivo a las 48 horas lo que indicó el crecimiento
bacteriano y después de 48 horas la formación esporas y de cristales proteicos por la
aparición de precipitados en el reactor y aclaración del medio.
Conservar a T° de congelación
PROCEDIMIENTO:
1. Recolección de larvas.
2. Identificación de larvas
Características Macroscópicas de
Spodoptera sp.
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PRODUCCIÓN Y EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE BIOINSECTICIDAS
Homogenización
Tubos Centrifugados con el
Complejo Espora - Cristal
5. Bioensayo:
Se lavó cuidadosamente con agua destilada estéril la superficie de las hojas que servirán
de alimento de las larvas a ensayar.
Empleamos 2 vasos de vidrio de 1 litro cubierta con un tul en la parte superior: uno de
ellos se utilizará como ensayo (E) y el otro como control negativo (N).
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PRODUCCIÓN Y EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE BIOINSECTICIDAS
Observamos cuidadosamente la ingestión de las hojas por parte de las larvas y anotamos
el tiempo de efecto de la toxina hasta un lapso de 72 horas y anotar los resultados.
III. RESULTADOS
A. Cultivo de la Bacteria
C. Bioensayos
TABLA N°1
Suceptibilidad de diferentes especies larvas de Lepidopteros frente a toxinas de Bacillus
thuringiensis durante 72 horas.
HORAS
Tipo de Larva Evaluación 0.5 1 2 4 6 12 24 48 72 T
Heliothis Positivo G1 - - - - - - - 1 1 2
Negativo G1 - - - - - - 1 - - 1
G2 - - - - - 1 2 2 2 7
Spodoptera G3 - - - - 3 2 5 5 - 15
Positivo G4 - - - - - - 1 4 5 10
G6 - - - - - - 3 4 2 9
G2 - - - - - 2 2 4 4 12
G3 - - - - 1 - - - - 1
Negativo G4 - - - - - - - 1 9 10
G6 - - - - - - - - - 0
G7 - - - 1 - 2 3 3 1 10
Onmiodes Positivo G5 - - - 2 - 3 - - 5 10
G7 - - - - - - 2 5 3 10
Negativo G5 - - - - - 2 2 - 6 10
* Resultados esperados
TABLA N°2
Suceptibilidad de Spodoptera sp. (Grupo 2) frente a toxinas Bacillus thuringiensis durante
72 horas.
HORAS
Evaluación 0.5 1 2 4 6 12 24 48 72 Total
Ensayo - - - - - 1 2 2 2 7
Negativo - - - - - 2 2 4 4 12
GRÁFICO N°1
Número de larvas muertas vs tiempo en días.
LARVAS
DÍAS
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IV. DISCUSIÓN
La acción citotoxica en las larvas destinadas al bioensayo produjo un total de 7 larvas muertas
encontrando resultados similares con el grupo 6 en el cual, a través de un mismo bioensayo,
termino con un total de 9 larvas muertas.
En relación del grupo 3 afirmamos que obtuvimos solo un 50 % del total de muertes que logro
este grupo, el cual llego a 15 larvas muertas por la actividad de la biotoxina. Con respecto a las
muertes obtenidas en los grupos 4, 5 y 7, por acción del bioinsecticida, observamos que no
obtuvimos mucha desventaja con dichos grupos.
Por último el desarrollo obstaculizado de las larvas, con respecto a su condición de control,
manifestó que las muertes de las larvas control se debieron a factores de nutrición y/o mala
manipulación (muerte por aplastamiento). Y es así que nuestro grupo en conjunto con el grupo
4, 5 y 7 representaron más del 50 % de los grupos que obtuvieron muertes altas en el trabajo
control.
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V. CONCLUSIONES
Las dosis de toxina obtenidas a partir de 1.52 x 1012 fue eficiente contra las larvas plaga.
Las larvas presentaron una característica general: el abdomen se torno más oscuro que el
resto de su cuerpo, ya que la larva tiene acción citotoxica en el tracto digestivo originando
deshidratación aquí.
Las larvas control tuvieron una importancia relevante ya que se mantuvieron vivas hasta la
falta de alimento pero demostrando la efectividad de la toxina.
VI. REFERENCIAS
1. Feitelson, J; J. Payane y L. Kim. 1992. Bacillus thuringiensis: Insectos y más allá. Biotecnology
10(3), 271-275.
2. Schnepf, E; N. Crickmore; J. Van Rie; D. Lereclus; J. Baum; J. Feitelson; D.R. Zeigler y D.H.
1998. Bacillus thuringiensis y su cristales proteicos pesticidas. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62,
775-806.