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CLASES Y MTODOS DE COLORACIN

PRACTICA N2

GRUPO: MAYUJAKE
MARIA CAMILA ASSIA ORTIZ
YUCELYS CONTRERAS SINCELEJO
JAVIER RUIZ CONTRERAS
KEVIN ALMANZA HERNANDEZ
DAVID GUEVARA BENITEZ

CARLOS GARCIA MOGOLLON


INGENIERO DE ALIMENTOS

UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE INGENIERIA
PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
SINCELEJO-SUCRE
2015.
Laboratorio de Microbiologa Industrial, Universidad de Sucre

RESUMEN
Esta prctica consiste en aplicar las clases y mtodos de coloracin para la
identificacin y caracterizacin de bacterias en el laboratorio de Microbiologa. La
observacin puede realizarse por diferentes procedimientos como son la
observacin directa de microorganismos in vivo o el tratamiento mediante
tinciones. Estos procesos van dirigidos a incrementar el contraste y por
consiguiente a optimizar el resultado. Se realiz tincin Simple para identificar
morfolgicamente las bacterias y tincin Diferencial para observar los dos tipos de
divisin en Gram positivas y Gram negativas y establecer diferencias entre estas;
posteriormente se describieron los pasos a seguir para una correcta tincin de las
muestras y su respectiva observacin en el microscopio.

Palabras Claves: Tincin, identificacin,


Diferencial, Simple.

Gram positivas, Gram negativas,

1. INTRODUCCIN
Las bacterias se observan mediante microscopio ya que son microorganismos. Su
observacin morfolgica sin teir es confusa debido a que sus clulas y
estructuras no pueden diferenciarse.
El estudio microscpico de las bacterias se facilitara notablemente al tratarlas con
colorantes o tintes, haciendo una mejor apreciacin de la forma, estructuras
celulares y tamao relativo de los microorganismos teidos. Se recomienda antes
de la tincin fijar la muestra para que las clulas a observar no se pueden mover y
as podemos obsrvalas en un solo lugar de la placa que montamos.
Para teir los microorganismos se dispone de un gran nmero de compuestos
orgnicos coloreados (colorantes). En general son un tanto complejos en su
estructura molecular. Una clasificacin prctica de estos compuestos es de
acuerdo a su comportamiento qumico, es decir, cida, bsica y neutra, de tal
forma que los colorantes cidos tian a los componentes celulares bsicos y los
colorantes bsicos tian los componentes celulares cidos.
Las coloraciones pueden ser simples y diferenciales, debido a que la morfologa
de las bacterias es amplia y dependiendo que queramos reconocer, diferenciar
utilizarnos un tipo de tincin especifica.

Laboratorio de Microbiologa Industrial, Universidad de Sucre

2. OBJETIVO
GENERAL
Aplicar los mtodos de coloracin para el reconocimiento de bacterias.
ESPECIFICOS
Identificar las diferentes morfologas bacterianas mediante la observacin
microscpica como primer parmetro de identificacin microbiolgica
Realizar coloraciones simples y diferenciales mediante las tcnicas
convencionales de tinciones bacterianas para una caracterizacin celular
adecuada.
Adquirir destreza en la diferenciacin de bacterias Gram positivas y Gram
negativas mediante la tincin de Gram.

3. PROCEDIMIENTO
Diagrama de flujo.
Se cubri el frotis con
el colorante ,azul de
metileno, durante 2
minutos.
Se elimin el exceso
de colorante
coloracin simple ( azul
de metileno)

CLASES Y
METODOS DE
COLORACIN

se dej secar al aire y se


observaron resultados

realizar un frotis
de un cultivo
bacteriano y fijar
la muestra a la
llama

coloracin diferencal
(tincin de Gram)

se cubri el frotis con


los colorantes: cristal
violeta (1 min),
solucin de lugol
(1min), alcohol-cetona
(15 s) y safranina
(30s)

Laboratorio de Microbiologa Industrial, Universidad de Sucre

4. RESULTADOS
Tincin simple: se observaron bacterias redondas y ovaladas (fig.1)

Morfolog
a celular

Figura 1: bacterias observadas con objetivo 40x


TINCION DIFERENCIAL: En esta tincin se observaron Bacterias Gram negativas
y Gram positivas teidas de rojo y azul respectivamente (fig.2)

Pequeas coloraciones
azules y rojas.

Figura 2: bacterias enfocadas a resolucin 40x

5. ANALISIS DE RESULTADOS
Tincin simple
Este tipo de tincin se basa en la afinidad del colorante por los componentes
celulares. Utiliza un solo colorante (azul de metileno) usado para destacar el
microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares
bsicas; preferentemente es de tipo bsico y contiene un cromgeno (compuesto
que da color al tinte) con carga positiva, ya que la pared celular de las bacterias
posee componentes con carga negativa que atraen y enlazan el cromgeno. Se
utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las clulas absorbern el
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colorante y quedarn teidas del mismo color. Por tanto, la tincin simple mejora la
observacin de la clula completa. [1]
TINCION DIFERENCIAL
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una
solucin de Cristal Violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son
lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las
clulas, tanto las Gram positivas como las Gram negativas, estn teidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de Lugol (yodo-yoduro
potsico). El ingrediente activo aqu es el I2; el KI simplemente hace soluble el I2
en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el
Cristal Violeta. De nuevo tanto las clulas Gram positivas como las Gram
negativas se encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus la
decoloracin, usando una mezcla de Alcohol - Cetona, sustancias en las que es
soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (Gram positivos) no se
decoloran, mientras que otros (Gram negativos) lo hacen. La diferencia esencial
entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin;
esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias
Gram negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la
membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana
citoplasmtica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano
es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora.
Las clulas Gram positivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas
(tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente,
provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la
pared celular. Despus de la decoloracin las clulas Gram positivas son todava
azules, pero las Gram negativas son incoloras. Para poner de manifiesto las
clulas Gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un
colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la
coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las
Gram positivas permanecen azules. [2]

6. CONCLUSINES

Se identific mediante coloracin simple la forma de las bacterias presentes en


la muestra.

Se realizaron coloraciones simples y diferenciales mediante las tcnicas


convencionales de tinciones bacterianas y se logr observar una
caracterizacin celular adecuada.
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Se determin si las bacterias de la muestra eran Gram positivas o Gram


negativas.
7. CUESTIONARIO
a. Describa el fundamento de la tincin de Gram, describiendo (grafica) la
morfologa de las estructuras bacterianas.
La tincin de Gram divide a las bacterias con pared del Dominio Bacteria en
dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo Gram positiva y bacterias
con pared de tipo Gram negativa. [3]

Comparacin de las envolturas


celulares bacterianas.
Arriba: Bacteria Gram-positiva. 1membrana citoplasmtica, 2peptidoglicano, 3-fosfolpidos, 4protenas, 5-cido lipoteicoico.
membrana citoplasmtica (membrana
interna), 2-espacio periplasmtico, 3membrana externa, 4-fosfolpidos, 5peptidoglicano, 6-lipoprotena, 7protenas, 8-lipopolisacridos, 9porinas.

b. Describa una tcnica de tincin para observar endosporas bacterianas.


Tincin de esporas. Esta tincin permite poner de manifiesto la endospora
bacteriana, una forma de resistencia producida por algunos gneros de
bacterias Gram positivas. Las endosporas aseguran la supervivencia de
estas bacterias en condiciones desfavorables (altas temperaturas,
desecacin, radiaciones ultravioletas, gamma y agentes qumicos), durante
largos periodos de tiempo. Se conocen como endosporas bacterianas
porque se originan en el interior de los microorganismos.
c. Describa una tcnica para observar cpsulas bacterianas.
La mejor tcnica para visualizar cpsulas se basa en realizar una tincin
negativa utilizando tinta china o nigrosina, colorantes que no penetran en la
clula sino que ennegrecen el medio. Las clulas se observan brillantes, sin
teir y se aprecia una zona clara alrededor de las mismas. En ocasiones se
utiliza un colorante posterior para resaltar las clulas.
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d. Describa una tcnica para observar flagelos bacterianos.


La tincin de flagelos de Leifson es una tincin simple que usa un colorante,
la rosanilina y cido tnico que engrosa los flagelos para que puedan verse.
Es imprescindible fijar las clulas con formol y realizar la tincin muy
cuidadosamente para poder observar los flagelos.
e. Describa una tcnica para observar mohos y levaduras.
Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor
aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras
muestras. Segn fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se
emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales
clnicos. Tambin se emplea para aumentar la visualizacin de los
elementos morfolgicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos
laboratorios ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones.
Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana, segn
la fuente luminosa que se utilice.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
LUNA, Gilma Janeth.
Manual operativo de Anlisis Microbiolgicos para
alimentos. Fondo Editorial Fundacin Universidad de Bogot Jorge Tadeo Lozano.
Bogot-Colombia. 1994.
Microbiologa. Prescott Harley Klein. Quinta edicin. McGraw-Hill
Biologa de los microorganismos. Brock. 10a edicin. Pearson Prentice Hall.

[1] Zynnon. Scribd [blog]. Copyright:Attribution Non-commercial. Feb 09, 2012


[Consulta
7
septiembre
2015].
Disponible
en
http://es.scribd.com/doc/80998594/Tincion-Simple#scribd
[2] E. Santambrosio. Tincin y observacin de microorganismos. Universidad
Tecnolgica Nacional. 2009. [Consulta 7 septiembre 2015]. Disponible en
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practic
o4.pdf

Laboratorio de Microbiologa Industrial, Universidad de Sucre

[3] Wikipedia: the free encyclopedia [Wiki en Internet]. St. Petersburg (FL):
Wikimedia Foundation, Inc. 29 jul 2015. [Consulta 7 septiembre 2015]. Disponible
en: https://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria_Gram_positiva

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