MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE

UNIVERSIT FELIX HOUPHOUET BOIGNY DE COCODY

UFR BIOSCIENCES

( LaBSA )

ANNEE UNIVERSITAIRE 2014-2015

MICROBIOLOGIE
ALIMENTAIRE
Dr KOUAME Dsir : Maitre- Assistant
UNIVERSITE Flix HOUPHOUET BOIGNY DE COCODY
UFR BIOSCIENCES

Dr KOUAME Dsir : Maitre- Assistant

& Dr KOUAKOU Privat : Assistant

Dr KOUAME Dsir (LaBSA) UFR BIOSCIENCES

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE

ANALYSES
MICROBIOLOGIQUES
DES ALIMENTS :
PRINCIPES,
METHODES DE RECHERCHE
DES GERMES PATHOGENES,
ET CRITERES MICROBIOLOGIQUES

Dr KOUAME Dsir (LaBSA) UFR BIOSCIENCES

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE

PRINCIPES ET BUT DE LANALYSE

MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS
Les aliments sont en gnral contamins par les microorganismes contenus dans lenvironnement.
Si les conditions sont favorables laliment, les microorganismes vont se multiplier et provoquer deux types
daltrations savoir : la qualit marchande et la qualit hyginique.

I/ - LES DIFFERENTS TYPES DALTERATION

A/ - Altration de la qualit marchande

Les microorganismes provoquent des troubles des caractres organoleptiques et physicochimiques sans rendre laliment dangereux pour le consommateur. Sa mise en vidence se fait par le
dnombrement de la flore totale .
Exemple N1 : Pseudomonas marginalis est rencontr sur les feuilles de salade et sur lensemble des
feuilles. Il fait partie de la flore normale des vgtaux mais, sa multiplication excessive peut entraner un
pourrissement de ces feuilles. Ex N3 : Les Levures se dveloppent bien sur les vgtaux sucrs et acides.
Ex. N2 : Les bactries lactiques dont le Leuconostoc mesenterodes est le germe daltration
frquent sur les produits riches en sucre comme la carotte rpe
B/ - Altration de la qualit hyginique
Dans ce cas, le microorganisme en se multipliant rend laliment dangereux pour la sant
publique soit par sa charge, soit par la toxine quelle produit. Ex.N1 : les volailles sont souvent
contamines par Salmonella sp. avec des sources nombreuses ( sol, poussire, matires fcales des
animaux ). Leur multiplication ( S. enteritidis ) peut entraner une infection salmonellique chez le
consommateur Ex N2 : les Staphylococcus et le Vibrio cholerae sont dangereux

II/ - ANALYSE MICROBIOLOGIQUE

Lanalyse microbiologique dun produit alimentaire a pour but, de dceler et de prvenir ces
deux types daltrations. Il est cependant ncessaire de distinguer deux types danalyses qui sont :
lanalyse du produit fini et, lanalyse du produit en cours de fabrication.
1/ - Analyse du produit fini qui a pour but de mettre en vidence les deux types daltration.
Ce sont des analyses ralises par les laboratoires officiels de contrle ou par des entreprises. Elles ncessitent
lapplication des mthodes normalises (ISO,AFNOR, CODINORM ... ) et, permettent de vrifier la
conformit du produit des critres.
2/ - Analyse du produit en cours de fabrication, il sagit dun contrle de bonnes pratiques
de fabrication ou hyginique. Elle a un but prventif o lutilisation de nombreux guides sont plus svres
que les critres rglementaires. Quel que soit le type danalyse, lanalyse microbiologique peut tre complte
ou partielle en fonction de la demande du client ou du contenu des cahiers des charges.

III/ - ANALYSE MICROBIOLOGIQUE COMPLETE DES PRODUITS FINIS

Quatre groupes de microorganismes sont habituellement recherchs : les germes daltration de la qualit
marchande, les pathognes, les germes tmoins de contamination fcale et les indicateurs technologiques.
1/ - les germes capables daltration de la qualit marchande de laliment
* Exemple N1 : Les Produits acides, pour les laits et yaourts, lon a les microorganismes 30C,
les Levures et Moisissures, les Lactobacillus et les Bactries lactiques tels les Leuconostocs
* Ex N 2 : Les Conserves, lon a plutt les Clostridium (bombage des botes) et les Bacillus
2/ - les germes potentiellement pathognes pour le consommateur
Ce sont principalement : * Salmonella spp.
* Staphylococcus aureus
* Shigella
* Anarobie sulfitorducteurs ( Clostridium perfringens/ botulinium ) * Bacillus cereus
* E. coli * Yersinia enterolitica
* Listeria monocytogenes
* Campylobacter jejuni ect ...
3/ - les germes tmoins de contamination fcale :
* E. coli * Coliformes ( Klebsiella, Citrobacter, Enterbacter ) * Enterecoques ( eaux coquillages )
4/ - les germes indicateurs technologiques : * Coliformes * Entrobactries
NB : Les germes tmoins sont des marqueurs dont la recherche ou le dnombrement permet de supposer
la prsence dun germe cible. Deux situations peuvent se prsenter : celle de lindex et de lindicateur.
Mais avant denvisager la recherche ou le dnombrement des germes, il est indispensable
dchantillonner, de prlever et de transporter convenablement laliment analyser.

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ETUDE DES MILIEUX DE CULTURE, TECHNIQUES

DENSEMENCEMENT ET CULTURE DES BACTERIES
A/ - ETUDE DES MILIEUX DE CULTURE
Les milieux de culture sont des produits solides ou liquides permettant ltude des
micro-organismes en dehors de leur milieu naturel. Les milieux aident lisolement,
lidentification, la numration, la conservation des bactries. Le choix dun milieu doit tre
adapt la bactrie que lon recherche.
1/ - Conditions optimales selon les espces bactriennes
- pH optimum : 7, 4
- Isotonicit : 9 g/l de NaCl - Humidit : prsence de leau
- Potentiel doxydorduction ( Rh ), selon le type respiratoire
- Temprature
2/ - Classification
- Composition : * Naturels ( dorigine animale et vgtale )
* Synthtiques ( corps chimiques )
* Semi-synthtiques ( naturels et chimiques )
- Mode de prparation : * M. strilisables (sans albumine ) * M. non strilisables ( albumine )
- Utilisation des milieux : * Milieu de base * Isolement * Identification * Conservation
3/ - Diffrentes sortes de milieux existants
- Milieu prt lemploi conditionn (bote et tube ) - Ingrdients de milieu
- Milieu prt lemploi non conditionn (flacon ) - Milieu dshydrat ( flacon de 500 g )
4/ - Technique de prparation
4.a. / - Prparation dun milieu partir de la base dshydrate
Il faut toujours suivre les recommandations du fabricant
* Pese (40 grammes de milieu dshydrat )
* Dissolution ( Ex : 40 gr. de milieu dshydrat dans 1 litre deau distille )
* Porter bullition jusqu' dissolution complte
* Ajustage de pH
* Conditionnement : Rpartition en tube ou flacons
* Bouchage
* Strilisation (autoclaver 120 C pendant 15 minutes)
* Conditionnement final : tube (culot, pente), bote de rpartition
* Etiquetage et stockage 3C en chambre froide ou au rfrigrateur
4. b. / - Prparation dun milieu de culture partir dingrdients
* Pese de chaque ingrdient pour 1000 ml ( 1 l ) deau distille strile
* Dissolution complte par bullition
* Rpartition en tubes ou flacons
* Strilisation : autoclaver 120 C pendant 15 mn.
* Coulage en bote de Ptri et conservation 3C en chambre froide ou au rfrigrateur
5/ - Procdure de strilisation lautoclave
- Remplir les rcipients striliser au et les disposer les ouvertures tournes vers le haut
- Vrifier le niveau deau dans lautoclave - Placer lintrieur le panier charg de milieux
- Fermer le couvercle de lautoclave et serrer 2 2, les boulons diamtralement opposs ainsi
que le robinet dchappement
- Mettre lappareil en marche et laisser la pression monter
- Faire la purge 3 reprises et, fermer le robinet de purge
- Laisser la pression monter la valeur requise et, dclencher le chronomtre
- Arrter la strilisation au terme du temps et, laisser descendre la pression zro
- Ouvrir lautoclave et, sortir les milieux
6/ - Consignes gnrales
- Vrifier la date limite dutilisation
- Conserver les milieux dshydrats labri de la lumire et de lhumidit, dans le
flacon dorigine, avec le bouchon hermtiquement ferm
-Striliser selon le mode indiqu dans la fiche technique

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B/ - LES TECHNIQUES DENSEMENCEMENT
I/ - DEFINITIONS
- Ensemencement : Opration qui consiste dposer des bactries sur un milieu de culture ou,
dans un milieu, et galement raliser le transfert de microorganismes dun milieu un autre.
- Repiquage : Transplantation dune culture pure de microorganisme sur un milieu neuf
- Isolement : Ensemencement effectu dans un but de sparation de faon obtenir partir des
bactries prsentes des colonies nettement distinctes. On isole une bactrie pour lobtenir en
culture pure.
Au niveau des rgles gnrales, ces techniques doivent : - tre pratiques dans des
conditions dasepsie parfaite
- tre effectues sur des milieux favorables aux tudes
envisages et, dans les conditions adaptes aux souches recherches.
II/ - TRANSFERT STERILE
II. 1. / - Techniques de base de la ralisation du transfert strile
Le transfert strile est ralis soit laide : dune pipette pasteur strile, dun
ensemenceur automatis, dune se ou anse de platine.
- Striliser lextrmit la flamme du bec Bnsen - Laisser refroidir quelques minutes
- Prlever : une se de produit liquidien, un aliquote (morceau) du produit alimentaire
analyser, ou une colonie isole sur glose.
NB : La zone strile autour du bec Bnsen est de 15 cm environ, manipuler donc dans cette zone.
II. 2 / - Produit tudier
- Produits naturels : eau de boissons, lait, fruits et lgumes, viandes, conserves, plats cuisins
- Souches bactriennes : en milieu liquide, en milieu solide
- Certains produits pathologiques dorigine humaine et animale
III/ - TECHNIQUES DE DISSEMINATION
Plusieurs techniques densemencement sont utilises en pratique courante mais, selon le type
dexamen, certaines sont plus employes que dautres. Nous pouvons citer les techniques suivantes :
- lensemencement par stries dpuisement
- lensemencement par incorporation en milieu solide en simple ou double couche, en
milieu semi-solide et en milieu liquide.
- lensemencement par talement, par inondation, par touche
La mthode dite par puisement est la plus utilise : cest la technique de base.
Les gloses sont coules soit en tube (glose incline), soit en bote de Ptri.
1/ - Technique par puisement : Isolement en botes, mthode des quadrants
- Tenir la bote de Ptri dans la main gauche, ouverte vers la flamme du bec Bunsen, dans
la zone strile
- Linoculum est dpos en point priphrique de la surface du milieu, la glose doit tre sche
- Linoculum est dissmin en stries parallles trs rapproches dans la moiti de la boite
- Faire des stries perpendiculaires aux premires dans le 3me quadrant
- Faire encore des tries obliques ( 45 ) dans le 4me quadrant, mais en espaant plus les stries
- Refermer la bote avec le couvercle
- La bote ensemence doit toujours reposer couvercle vers le bas dans ltuve ou sur la paillasse
- Existence de beaucoup dautres variantes de la technique

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2/ - Technique densemencement par incorporation
- A partir dune suspension microbienne ou de colonies sur gloses, lon ensemence
par incorporation un milieu de culture solide, liquide ou rendu liquide.
- A partir de la source microbienne, lon ralise dans la masse une incorporation par piqre
centrale ou une strie longitudinale dans un milieu en culot Ex : Glose Mannitol mobilit
- A partir de la suspension microbienne, un inoculum de 1 ml va tre dpos dans une
bote de Ptri vide dans laquelle la glose en surfusion 47 C sera coule (12 15 ml) et
homognise ralisant ainsi lensemencement dans la masse. Aprs solidification de la glose,
lincubation est ralise.
3/ - Technique densemencement par talement
A partie dune suspension microbienne, lon dpose 0,1 ml dinoculum la surface
dune glose que lon tale laide dun taleur strile. Lon laisse scher et on met incuber.
4/ - Autres techniques densemencement
a/ - Par inondation
Lon inonde la surface dune glose avec une suspension bactrienne, attendre environ une
minute dimprgnation et liminer le surplus. Lon laisse scher et on met incuber
b/ - Par touches : partir dune colonie, toucher un point dune glose
c/ - Par strie transversale : Milieu coul en pente
d/ - Par toile ou par strie radiaire
IV/ - INCUBATION
Les botes de glose ou les tubes ensemencs sont places ltuve 37 C pendant
18 24 heures. La dure dincubation varie en fonction des bactries : 24 h, 48 h, 72 heures
ou plus pour certains germes anarobies stricts.
Latmosphre dincubation peut tre diffrente :
* en arobiose * anarobiose * en microarophilie * en atmosphre enrichie en CO2
Elle dpend de lespce bactrienne recherche. Exemples : - Entrobactrie ===> Arobiose
- Campylobacter === > Microarophilie
- Pneumocoque === > CO2
C. / - DESCRIPTION DES COLONIES ET BOUILLONS
Aprs incubation pendant un temps dtermin, temprature constante favorable au
dveloppement des colonies bactriennes, les milieux gloss et liquides sont examins.
1/ - Instruments de lecture
- A lil nu le plus souvent - A la loupe main - Au stro microscope (loupe binoculaire )
2/ - La forme : - ronde - ovale
- asymtrique - irrgulire
3/ - La surface : - brillante lisse (humide, grasse)
- mate (sche, rugueuse) mais aussi ride, plisse
- crbriforme (chou-fleur)
4/ - La taille : - petite (< 1 mm ) - moyenne ( 1,5 3 mm ) - grande ( > 3 mm )
5/ - Le contour : - net - chancr - lob - dentel- filamenteux - arborescent
6/ - Le relief
- bomb - plat - globulaire - mamelonn - ombiliqu - acumin
- cratriforme
7/ - La consistance : - pteuse (molle)
- solide ( cohrente ) dtachable en
bloc ou non dtachable - lastique - filante ou visqueuse avec les colonies ne pouvant se diviser.

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8/ - La couleur : observable que sur les gloses nutritives, sans sucre et sans inhibiteur
- verte ( Pseudomonas aeroginosa ) - jaune ( Staph aureus ) - rouge ( Serratia ) - noir ( Bacterodes )
Le pigment produit peut tre diffusible ce qui donne des colonies et le milieu de culture pigments
ou, non diffusible ce qui donne des colonies pigmentes mais, le milieu de culture inchang.
9/ - L odeur
- Vgtal (terre ) == > Nocardia / Serratia odorifera
- Aromatique == > P. aeroginosa
- Ammoniaque == > Proteus
- Mtallique == > Clostridium perfringens

- Fruit ==== > Alcaligenes

- Laiterie == > Lactobacillus
- Putrfaction == > Anarobies

10/ - Le type de colonie

a/ - Colonie S
( Smooth = lisse )
- Bords irrguliers, souvent bombes, surface lisse, consistance crmeuse, suspension homogne
dans leau
b/ - Colonie R
(Rough = rugueux )
- Bords rguliers, souvent plates, surface rugueuse, consistance sche, suspension htrogne
c/ - Colonie M
(Muqueuse)
- Bords lisse et rguliers, bombes, surface lisse, brillante, consistance filante, suspension htrogne
d/ - Colonie naine : Taille < 1 mm
e/ - Colonie envahissante Proteus
- DESCRIPTION DES BOUILLONS
On peut constater au niveau des bouillons : un trouble, un aspect en mie de pain, un
dpt visqueux ou un voile
1/ - Trouble : homogne ou htrogne
2/ - Aspect en mie de pain
3/ - Dpt visqueux : lagitation torsade le dpt
4/ - Voile : * en haut du tube * adhrant plus ou moins aux parois * flottant ou immerg

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LES METHODES DE DENOMBREMENT EN MILIEU

SOLIDE EN MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE
I/- GENERALITES
Lanalyse microbiologique des aliments a pour objectif de contrler : la qualit
marchande des denres alimentaires et la qualit hyginique.
Le but du dnombrement est de dterminer le nombre de microorganismes appartenant
a un ensemble donn dans un volume donne soit en milieu liquide, soit en milieu solide.
Les mthodes bactriologiques vont permettre de dnombrer certes, mais aussi de
rechercher et identifier tous les microorganismes. Pour cela une tude quantitative de la flore
est ncessaire : -soit par un dnombrement de la flore totale (arobie revivifiable)
-soit par un dnombrement dun groupe bactrien correspondant a une contamination
dtermine. Il en est de mme dune recherche oriente comme les bactries pathognes.
II/- MATERIEL
-Boites de Ptri (90 mm de diamtre)
- Pipettes gradues striles (1 ml, 2 ml. 10 ml)
-Etuves (30. C, 37 C, 44 C, 46 C et 55 C) -Broyeur Stomacher (Homognisateur)
-Bain-marie (100 C pour lbullition des milieux gloss et 45 C pour leur surfusion)
-Balance de prcision
- Compteur de colonies
-Microscope -Autres .
III/- PREPARATION DES DILUTIONS DECIMALES
Ce sont des dilutions successives a partir dun produit brut (liquide) ou dune
suspension mre (produit solide et dilue). Le but est de rduire progressivement la charge
microbienne du produit brut ou de la solution mre afin de rendre les colonies dnombrables.
Il sagit de sries logarithmiques caractrises par une progression gomtrique.
Les liquide de dilution utilises sont : leau peptonnee tamponne, la tryptone sel, la
solution de Ringer au
IV/- DENOMBREMENT EN MILIEU SOLIDE
1/ -PRINCIPE
Toute bactrie vivante introduite dans la masse dun milieu glos favorable et, une
temprature convenable, donne naissance une colonie reprable macroscopiquement.
Le nombre total des colonies en surface et dans la profondeur du milieu correspond au
nombre des bactries prsentes dans linoculum. Toutefois, les bactries arobies strictes se
dveloppent mal dans la masse de la glos, par contre les bactries anarobies strictes ne se
dveloppent pas en surface et, certaines bactries vivantes peuvent tre incapable de se
multiplier.
2/- METHODES
2.1./- Dnombrement par incorporation
A laide dune pipette strile, transfrer 1ml du produit brut ou de la suspension
mre et, chaque dilution (10-1 10-4) dans une boite de Ptri. Ensemencer deux (2) boites
par dilution. Couler dans chaque boite 15 ml dune glose fondue et refroidie 45 C
Mlanger soigneusement linoculum au milieu et, laisser se solidifier sur un plan
horizontal. Apres solidification complte, on peut couler la surface du milieu ensemenc
4 ml de glose et cela en fonction du microorganisme recherch : cest
lensemencement en double couche .
Exemples : * Glose blanche pour le germes arobies msophiles (GAM)
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*VRBL pour les coliformes *MRS pour les Lactobacillus
Les boites ensemences sont mise ltuve, retournes. La temprature et, le temps
dincubation sont fonction du microorganisme.
Exemples : * 30 C pendant 72 h pour les GAM
* 30 C et 44 C pendant 24 48 h pour les coliformes.
Expression des rsultats
Prendre en compte les boites contenant 15 150 colonies caractristiques pour les
coliformes et 30 300 colonies pour les germes arobies msophiles (GAM)
Exprimer le rsultat dfinitif en fonction de la dilution.
Dilutions

Nombre de colonies

Moyenne

Nombre de bactries
/ ml de produit pur

Produit pur
Trop nombreuses
Rsultat non
Rsultat non
Dilution 10-0
Non dnombrables
interprtable
interprtable
Dilution 10-1
1re Boite
308
301
301 X 10 = 3010
2me Boite
293
Dilution 10-2
1re Boite
35
34
34 X 100 = 3400
2me Boite
33
Dilution 10-3
1re Boite
07
Rsultat non
Rsultat non
2me Boite
01
interprtable
interprtable
NB : - Si le rapport nexcde pas 2 , faire la moyenne des valeurs provenant des
diverses dilutions
- - Si le rapport excde 2 , prendre le nombre le plus faible
2.2/- Dnombrement par talement en surface
Il consiste faire un ensemencement en surface dun milieu slectif solide, coule en
boite de Ptri, avec une quantit dtermine de lchantillon : 0,1 ml ou de la suspension
mre et autant pour les autres dilutions.
Ex : * Baird-parker pour S. aureus * OGA pour les levures et moisissures
Les boites ensemences sont retournes, mise a ltuve a une temprature et un temps
fonction du germe recherch.
Expression des rsultats
Prendre en compte les boites contenant 15 150 colonies caractristiques pour les
Staphylocoques . Exprimer le rsultat dfinitif en fonction de la dilution.
2.3./- Dnombrement sur membrane filtrante
Il consiste faire passer un certain volume dchantillon (liquide) a travers une
membrane filtrante (millipore de diamtre connu) sur laquelle se trouvent donc retenues les
bactries recherches. Le filtre est ensuite pos sur le milieu de culture glos pr-coul
spcifique pour le microorganisme. Apres incubation la temprature et, au temps
convenable : lon va dnombrer les colonies sur le filtre.
Cette mthode a plusieurs avantages : - utilisation dun volume plus important
dchantillon do, une plus grande prcision - une meilleure numration des bactries
-une identification plus facile des diffrentes espces mais, le cout de cette mthode est lev.

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Technique de dnombrement des principaux microorganismes

(GAM, Coliformes, ASR, Staphylocoques, Salmonelles).

On va prendre ou, prlever 10 g daliment mlang dans 90 ml deau et broy dans

un broyeur stomacher. On obtient une solution homogne reprsentant la solution.
Cela peut se raliser avec 25 g daliment et 250 ml dEPT : deau peptone tamponne
Dilution dcimale
On utilisera comme diluant leau peptonne on prlve 1 ml du broyat (solution mre)
dans 9 ml de typtone sel , ce qui correspond la dilution 10-2
A laide dune pipette de 1ml
Prlever 1 ml du tube marqu 10-2 et lintroduire dans le tube deau peptone tamponne
marqu 10-1 et homogniser. On obtient ainsi la dilution 10-.3
Reprendre la mme opration du 10- 3 au tube 10 4 et, ainsi de suite jusqu' la valeur de
dilution souhaite en changeant de pipette aprs chaque dilution.
Jeter chaque fois la pipette utilise dans le bac deau de javel
1 ml

Solution Mre
(SM) 10-1

1 ml

10 - 2

1 ml

10 - 3

1 ml

10 - 4

10 -5

SCHEMA DENSEMBLE
TEMPERATURE
ET DUREE
DINCUBATION
30 C
pendant 72 h +/-3 h
43,5C+/- 0,5
pendant 24 h

GERMES

MILIEU

GAM : Germes
Arobies Msophiles
Coliformes

PCA
VRBL

Staphylocoques

Baird -parker

37 C
pendant 24 h et 48 h

ASR

TSN /TSC

46C pendant 24 h

ASPECT
Toutes les colonies
Colonies roses ou
rouges de diamtre
> 0,5
Colonies noires avec
halo clair et
zone opaque
Colonies noires

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RECHERCHE DES PRINCIPAUX

MICROORGANISMES PATHOGENES DES ALIMENTS
Les critres tablis pour la microbiologie alimentaire comportent de rares exceptions prs
toujours les mmes microorganismes. Ainsi a ton choisi de prsenter, lensemble des bactries
retenus et non retenues dintrt, leur signification et les mthodes danalyses recommandes.

I/ - LES GERMES AEROBIES MESOPHILES

I/ - CARACTERISTIQUES
Le terme de germes arobies msophiles (GAM) regroupe les bactries, les levures, les
moisissures se dveloppant en arobiose une temprature caractristique, il sagit de la flore
totale msophile et spychrophile. Ces microorganismes sont des germes qui contaminent souvent
les aliments et qui peuvent tre nfastes pour la qualit des produits alimentaires.
Ces GAM sont des indicateurs dhygine. Ils sont tolrs dans la limite dune certaine
quantit au del de laquelle, ils constituent un problme hyginique.
Le dnombrement des GAM est couramment utilis dans le domaine alimentaire en
matire de contrle qualit. Il permet une valuation relative de la salubrit des procds lusine
et / ou de la prparation des aliments dans les tablissements alimentaires. Il nous renseigne
galement sur lefficacit des contrles de temprature lors de la manipulation des produits, leur
transport et leur entreposage.
Les GAM prsentent les caractres communs aux levures, moisissures et bactries. Ils se
dveloppent en arobiose cest dire en prsence doxygne. Ils se dveloppent entre 30 - 37 C.
Tous ces germes sont cultivs sur milieux ordinaire.
II/ - DENOMBREMENT ET IDENTIFICATION DES GAM (ISO 4833)
1/ - Prise dessais : on prend 25 grammes daliment
2/ - Pr - enrichissement : il permet de revivifier les germes prsents
Les 25 g. daliment sont mis dans 225 ml ou 250 ml deau peptonne tamponne ( EPT )
3/ - Dilution dcimale et ensemencement
A partir de la suspension mre ( 225 ml EPT/25 g daliment ), des dilutions dcimales
sont ralises et, 1 ml de chaque dilution est utilis pour un ensemencement en boite de Ptri
par incorporation en double couche avec le milieu PCA. (Palt Count Agar ): agar la peptone
de caseine au glucose et lextrait de levure. La gelose blanche est utilise par lea 2eme couche
4 / - Incubation (Cf: Photo No 1)
Aprs cet ensemencement, les boites sont incubes: mise ltuve 30 C pendant 72
heures,aprs ces trois jours , on va dnombrer toutes les colonies (on compte entre 30 et 300).
5/ - Expression des rsultats
Ce sont des critres microbiologiques dapprciation , seuil limite ICSMF ( International
Commission Microbiological Specification Foods ) et le Codex Alimentarius.
Si lon utilise ces deux critres , on distingue deux types de limite : une valeur m
correspondant au seuil dacceptabilit en dessous duquel le produit est de qualit
microbiologique satisfaisante , et un seuil limite M suprieur m correspondant au rejet du
produit. Ce seuil M tant un multiple du seuil m, la qualit du produit est inacceptable.
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PHOTO No 1 : ISOLEMENT ET DENOMBREMENT

DES GERMES AEROBIES MESOPHILES (G.A.M) SUR MILIEU P.C.A.

PHOTO No 2 : ISOLEMENT ET DENOMBREMENT

DES COLIFORMES SUR MILIEU DESOXYCHOLATE LACTOSE DCL

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II/ - LES COLIFORMES TOTAUX,

COLIFORMES FECAUX, ESHERICHIA COLI (E. coli )
I/ - CARACTERISTIQUES
Les coliformes constituent un groupe bactrien sans signification taxonomique. Il regroupe
en thorie, les coliformes totaux et les coliformes fcaux prsents dans les matires fcales.
Pratiquement, on retrouve dans ce groupe des Escherichia coli dont le dnombrement est
ralisable sans difficult technique reflte sans ambigut la contamination fcale. Cest une espce
bactrienne dont certains types srologiques sont pathognes. Bactrie considre dans le cadre de
la microbiologie alimentaire comme un indicateur de contamination fcale et donc indicateur de
bactrie pathognes.
Escherichia coli est toujours dnombr en faible quantit ; elle est mme souvent absente
dans les aliments de qualit microbiologique correcte. La prsence de cette bactrie hors critre
indique que les rgles dhygine nont pas t respectes (souillures par les fces) ou au cours des
manipulations. Le dnombrement est ralis selon la norme AFNOR NF V08 017 par comptage
des colonies ou par toute autre mthode donnant des rsultats quivalents.
Les Coliformes sont en fait des Entrobactries. Ce sont des bacilles Gram(-), mobiles
pritriche ou immobiles, acapsuls, asporuls, pas de cytochrome oxydase, possdent une catalase,
rduisent les nitrates en nitrites, et rduisent le glucose.
Les Coliformes selon les normes ISO sont des bacilles Gram(-), aro-anarobie facultatifs
(AAF), capables de se multiplier en prsence de sels biliaires et, capables de fermenter le lactose
avec production dacide et de gaz en 48 heures 35 37 C.
Lon classe ces bactries entriques en trois (3) groupes : les Coliformes Totaux ( C.T.)
qui se dveloppent entre 30-35C , les Coliformes Thermotolrants (C. Th.) ou Coliformes
Fcaux (C.F) qui ont la facult de se dvelopper des tempratures leves entre 44-45C et, les
bactries Escherichia coli ( E. coli) excluant tous les pathovars.
Ces germes sont lorigine dinfections alimentaires sous formes de gastroentrites et des
diarrhes aprs une incubation allant de 5 24 heures. Les aliments impliqus sont : les fromages,
buf hach saignant, viandes et volailles, eau, crudits
II/ - DENOMBREMENT ET IDENTIFICATION
- Prlvement et prise dessai : chez lhomme,, on peut prlever E. coli dans les selles dans
lenvironnement, leau de boisson et certains aliments. Lon prend 25 gramme daliment
-Pr-enrichissement : pour donner du tonus la bactrie, on utilise leau peptonne
tamponne(EPT), ;cette tape peut toute fois tre saute chez les E. coli
- Enrichissement : importante chez les E. coli car, elle se dvelopperait de faon anormale
Les bouillons denrichissement slectifs sont : * bouillon Lactos au Bromocresol Pourpre
* bouillon Lactos Bili au vert brillant * bouillon Mac Conkey * bouillon au glutamate
- Isolement : ralis sur les milieux de culture, en gnral en double couche sur les gloses
suivantes : * au Desoxycholate Lactose 1% * EMB (Eosine au bleu de mthylne)
* milieu SS * VRBL (violet-cristal rouge neutre bili lactos) * glose lactose de Driglaski
- Incubation: 30C pour les coliformes totaux et, 44C pour les thermotolrants pendant 24 48 h
-Denombrement : Les coliformes apparaissent rouges foncs , seules les colonies de diametre
superieur 0,5 mm sont denombres (Cf : photo No 2)
- Identification : elle se fait sur 5 colonies avec le portoir rduit de Leminor

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III/ - LES STREPTOCOQUES FECAUX

I/ - CARACTERISTIQUES
Les Streptocoques fcaux sont des bactries ubiquitaires, commensales du tube digestif de
lhomme et des animaux, saprophytes de lenvironnement (eau use, eau douce, eau de mer, dans le
sol, sur les vgtaux). Ce sont des indicateurs de contamination fcale. En effet, la prsence des
streptocoques fcaux (S. feacalis ) dans les eaux de boissons est considre comme un signe de
contamination fcale.
Les entrocoques sont susceptibles de contaminer les aliments comme le lait et les produits
laitiers, les viandes et produits de pche. Notons quEnterococcus feacalis participe la
maturation du fromage, et est considr comme un ferment darme.
Certaines souches dEnterococcus sont utilises comme levain ou ferment
II - DENOMBREMENT DES STREPTOCOQUES D
II. A/ - MILIEUX DE CULTURE
1/ - Glose BEA ( Bile Esculine Azide ) ou Glose D- Coccosel
Sa composition est : la bile comme inhibiteur des bactries Gram (+) sauf les Streptocoques D,
lazide de sodium comme inhibiteur des bactries Gram (-), lesculine comme compos glucidique,
cest un htroside dont lhydrolyse libre le glucose et le di hydroxyde dammonium qui donne une
coloration noire. La prsence de colonie noire met en vidence la caractre esculine positif
2/ - Milieu liquide de Rothe : Cest un milieu slectif utilis en gnral pour le dnombrement
des Streptocoques des eaux dalimentation, lon recherche laspect trouble
3/ - Autres milieux : * Milieu solide de Slanetz Bartlez * Milieu de Litsky * Milieu OAA
( Oxalinique,Acide,Azide ) * Glose Esculine Azide Canomycine
*Milieu solide de Slanetz-Bartlez : utilis pour le snombrement des Enterococcus dans
les eaux Il contient lazide de Na, du glucose, du triphenyl tetrazolium de chlorure (TTC) qui est
indicateur depotentiel redox pouvant etre rduit par les bactries avec formation dlments violet ou
rouge brique. Lon a donc des colonies caractristiques rouge, marron ou rose.
*Milieu OAA qui contient : lacide oxalique, lazide de Na, lesculine, le citrate de fer
ammoniacal, le glucose et lextrait de levure. Il fournit des colonies noires entoures dhalo noir.
II. B/ - METHODOLOGIE
En gnral, les Streptocoques fcaux seront recherchs dans les eaux
- Prise dessai : dans le cas de leau on prend 1 10 litres. Cette quantit est filtre sur
membrane, cest un filtrat qui va servir faire lensemencement.
- Dilution dcimale, ensemencement et rsultats
Des dilutions dcimales sont ralises avec de lEPT et on ensemence sur milieu Rothe.
Ce milieu est un test prsomptif :
1/ - si on a un Rothe positif (+) cest dire daspect trouble, on peut aussi ensemencer sur
milieu BEA pour dnombrer les colonies
2/ - sil y a des colonies noires , on suspecte des streptocoques D. A partir des colonies
sur BEA, on peut faire lidentification partir des critres morphologiques, biochimiques et dautres
tests biochimiques
- A partir de BEA ( + ) ==== > Tellurite de K+ (+ ) : Enterococcus feacalis
- A partir de BEA ( + ) === > Bouillon Hypersal (+) : Strep. du groupe D (Enterocoque )

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IV/ - LES STAPHYLOCOCCUS AUREUS

I/ - CARACTERISTIQUES
Cest une espce bactrienne, une bactrie pathogne pouvant tre prsent sur le cuir et
dans les mamelles et dans le tractus digestif et gnital des animaux vivants. Elle peut provenir
aussi de pollutions dorigine humaine (manipulation, rhume, etc.).
Staphylococcus aureus est toujours dnombr en faible quantit ; il est mme souvent
absent sur les produits de qualit microbiologique correcte. La prsence de cette bactrie des taux
suprieurs aux critres proposs indique que les rgles dhygine nont pas t respectes.
II/ - DENOMBREMENT ET IDENTIFICATION
Le dnombrement est ralis selon la norme AFNOR V08 014 modifi : ensemencement de
0,1 ml de suspension mre ou de dilution la surface du milieu Baird Parker. Incubation 37 C.
Lecture des boites aprs 24 28 heures dincubation. Toute autre mthode donnant des rsultats
quivalents peut tre utilise.
- Prise dessai : on prend 25 grammes daliment ou dchantillon
- Enrichissement :il permet de revivifier les germes prsents les 25g daliment sont mis dans
225ml deau peptonne tamponne (EPT) pour une suspension mre qui est dilue au 1/10
- Dilution dcimale et ensemencement : partir de la suspension mre (225 EPT/25g
daliment), des dilution dcimale sont raliss. Ensuite 0,1ml de chaque dilution est utilis
pour un ensemencement par talement sur milieu Baird Parker coul en boite de Ptri. Le
milieu Baird Parker est le milieu slectif avec trois agents slectifs : la glycine, le tellurite de
potassium et le chlorure de lithium. Lon va assister au mtabolisme lipidique des germes
avec la production de lcithine.
-Identification : aprs cet ensemencement, les boites sont incubes mises ltuve 37C pendant
45 48heures. Aprs ces deux jours, on va dnombrer les colonies de Staphylocoque aureus qui
se prsentent sous forme de colonies noires brillantes, bombes. Leur diametre est compris
entre 0,5 et 2mm entour dun halo clair ou, une aurole transparente stendant dans le milieu
opaque et, traduisant la digestion des lipoprotines. Lexamen microscopique confirme lexistence
de Staphylococcus regroup en grappe de raisin.
En gnral, on choisit les gloses contenant les boites ayant entre 20 200 colonies
suspectes.
Quant la pathognicit de Staphylococcus, le test de la thermonulase est effectu :
Lon homogise quelques colinies suspectes du milieu Baird-Parker dans le boillon cur cervelle
puis lon chauffe 100C pendant 15 mn. Lon introduit ensuite quelques gouttes dans des puits
faits dans la glose lADN au bleu de toluidine et, lon incube la boite sans la retouner pendant
quatre (4) heures. La presence dune aureole rose autour des puits traduit la prsence dune
thermonuclase.
Les Staphylococcus prsums pathognes toxinognes sont galement thermonuclases
positives

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V/ - LES ANAEROBIES SULFITO REDUCTEURS (ASR)

I/ - CARACTERISTIQUES
Cest une espce bactrienne pathogne. Elle peut tre prsente sous forme de spore, en trs
petite quantit. Cest une bactrie anarobie stricte, msophile ne se dveloppant pas dans les
aliments quand les rgles de bonnes pratiques des oprations de transformation et de conservation
ne sont pas respectes. La dose minimale infectante de Clostridium perfringens ne parat pas
connue. Dautre part on peut toujours craindre une croissance de cette bactrie au cours de
refroidissement mal conduit de produits aprs cuisson (temps de refroidissement trop long des
tempratures entre 50C et 15C).
En thorie, le dnombrement des spores et des cellules vgtatives de Clostridium est
considr comme rvlant la prsence de Clostridium perfringens.
II/ - DENOMBREMENT ET IDENTIFICATION DES A.S.R
Cest en fait le dnombrement des spores des ASR qui peuvent tre isoles en utilisant
des milieux gloss contenant du sulfite reparti dans des tubes.
Le milieu doit contenir environ 0.45% de sulfite. Ex : *milieu TSN (tryptone SulfiteNeomycine) / *milieu TSC (Tryptone Sulfite-Cycloserine).
Ces milieux seront chauffs pendant 10 mn. dans de leau bouillante puis, refroidis 45C.
Un (1) ml de la suspension mere et, des autres dilutions sont portes successivement dans les
tubes rgners et refroidis. Linoculum et le milieu sont melangs en vitant dintroduire de lair.
Apres solidification de la gelose, les tubes sont incubs 46C letuve pendant 24 48
heures. Les bactries anarobies ne possdent pas doxyde disulfitase, pas doxydase, catalase et
de peroxydase. Elles sont identifies par la prsence de colonies noires floconneuses avec un
diametre superieur 1 mm.
On peut raliser la confirmation en repiquant, les colonies noires sur une boite de glose
luf de Willis.
PHOTO N3 : ISOLEMENT ET DENOMBREMENT DES ASR
SUR MILIEU TSN

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VI/ - LES SALMONELLA

I/ - CARACTERISTIQUES
Cest une espre bactrienne, une bactrie pathogne pouvant tre prsent sur le cuir et
dans le tractus digestif de lanimal vivant porteur sain, rarement dcel lintrieur des masses
musculaires. Elle peut se trouver sur les carcasses aprs abattage : lors des oprations dabattage,
elle passe directement ou indirectement du cuir la carcasse pour les bovins, ovins et quins.
Les conditions de ressuage, la conservation des tempratures de rfrigration ou de
conglation nentranent pas la destruction de cette bactrie. Elle est msophile, ne se dveloppant
ni sur le cuir , ni dans la viande au cours des oprations de transformation et de conservation si les
rgles de bonnes pratiques sont respectes.
SALMONELLA peut donner lieu des contaminations croises tout au long de la chane
de fabrication des produits viande et ultrieurement en cuisine.
II/ - RECHERCHE ET IDENTIFICATION
Dtection selon la norme AFNOR NF V08 013 ou toute autre mthode donnant des
rsultats quivalents. La recherche dans 10 gr a t substitu celle dans 25 gr car la mthode
actuellement utilise (milieu Rappaport - Vassiliadis) sest rvle deux fois plus sensible que
lancienne technique (milieu Mller-Kauffmann)
-- Prise dessai ou chantillonnage : la recherche se fait sur 25 grammes daliment en gnral
-- Pr-enrichissement :cest la prparation de la suspension mre qui se fait avec 225 ml deau
peptonne tamponne (EPT) et, lon met ltuve 37C pendant 16 20 heures. Il favorise la
revification des bactries et, leur croissance. Ce milieu nest toutefois pas slectif
- Enrichissement : il est ralis en ensemenant dans les bouillons denrichissement slectifs
pendant 24 48 heures avec :* bouillon de Sltine 37C * bouillon Mueller Kauffman 43C
* bouillon Rappaport Vassiliadis 43C pendant 4 heures
Ces milieux ont la proprit de favoriser la croissance de Salmonella et, de limiter celle des
autres germes de la famille des Entrobacteries.
- Isolement : Ensemencement par quardrant sur gloses slectives notament le milieu SS et
incubation 37C pendant 24 48 heures
- Identification : sur au moins 5 colonies isoles, ensemencer sur portoir rduit de Leminor
A partir des colonies caractristiques sur les gloses SS et Hektoen on ensemence le
portoir rduit de Leminor comprenant les milieux suivant incubs 37C pendant 24 h :
Ure indole de Fergusson, Kligler-Hajna, Lysine de fer ,Clark et Lubs , Mannitol mobilit et,
Citrate de Simons .
*Milieu Ure-Indole : milieu synthetique qui permet de rechercher simultanement :
Lurase, la production dindole et le tryptophane dsaminase (TDA)
*Milieu Kligler Hajna : il est coul en tube inclin avec un culot dau moins 3 cm et
une pente. Il est ensemenc en profondeur par piqure centrale et, sur la pente en strie.
* Milieu Lysine de fer : lensemencement est fait par piqure centrale et en strie sur la
pente. Il permet letude de la dcarboxylation et de la desamination de la lysine.
*Milieu Clark et Lubs, il sert ltude de deux caractres : la reaction au rouge de
methyl (RM) et, la raction de Voges-Proskauer (VP)
*Milieu Mannitol-Mobilit, ensemenc par piqure centrale et utilis pour la
recherche de la mobilit, de la fementation du mannitol et, la nitrate rductase (NR)
*Milieu Citrate de Simmons, ensemencer par strie logitudinale sur la pente du milieu
pour rechercher lutilisation du citrate.
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Les caractres biochimiques des Salmonella sont :*Lactose - *Citrate + * H2S+/1/- Caractres de Famille : * Oxydase (-) *Catalase (+) *Nitrate (+) * AAF * Glucose (+)
2/- Caractres de Genre : * Portoir rduit de Leminor * Plaque API 20 E
Ure - Indole

Kligler - Hajna

Lysine de fer

Mannitol Mobilit

Citrate de
Simmons

Urease (-)

Glucose (+)

LDC (+)

Mobilit (+)

Citrate (+)

Indole (-)

Lactose (-)
Gaz (+/-)

LDA (-)

Mannitol (+)
NR (+) =
Rduction de
Nitrate en Nitrite

TDA (-)

H2S +/-

H2S +

NB * H2S + sauf S. paratyphi A et S. choleraesuis qui sont ngatifs

*GAZ (+) sauf S. typhi et S. gallinarum qui sont ngatifs
La prsence de SALMONELLA dans un aliment doit le faire considrer comme un
aliment corrompu

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VII/ - LES VIBRIO

I/ - CARACTERISTIQUES
Ce sont des bactries retrouves dans lenvironnement principalement dans les eaux, dans
les aliments (poissons, crustacs ) Lhomme est le principal rservoir.
Lagent responsable du cholera est le VIBRIO cholerea O :1 qui est trs dangereux,
entrainant la mort en quelques heures.
Le VIBRIO parahemolyticus (VP+) est frquent dans les crustacs et dans certains
poissons. Tons les VIBRIO ne donnent pas de diarrhes, ils aiment tous le sel soit donc les lagunes
et, les eaux de mer.
II/- RECHERCHE DES VIBRIO DANS LES ALIMENTS
1/- Prlvements :
On peut rechercher VIBRIO dans les eaux et, les aliments tels que les poissons et les
crustacs. Pour le prlvement de leau, lon a la mthode par filtration sur membrane ayant un
diamtre de lordre de 0,2 um. Lon peut galement prendre directement 500 ml deau pour les
mlanger avec de leau peptone alcaline. (EPA)
2/- Enrichissement
Dans leau peptone tamponne contenant du chlorure de sodium (NaCl) qui joue le rle de
slectivit, en inhibant les autres bactries. Cest une bactrie a multiplication rapide (30 mn)
3/- Isolement
Lensemencement permet davoir des colonies isoles, il est ralis la surface par stries.
A partir de leau peptone alcaline (EPA), on ensemence sur le milieu TCBS : Thiosulfate
Citrate Bile Saccharose qui est de couleur verte et galement, sur de la glose alcaline blanchtre.
La bile va inhiber la croissance des bactries Gram (+) et Gram (-). Ces deux milieux sont
mis ltuve a 37 C pendant 18 a 24 heures.
4/- Lecture et Identification
-Sur TCBS , lon aura des colonies jaunes qui fermentent le saccharose. Ce sont de
grosses colonies de 2 mm de diamtre. Les colonies vertes sont dites saccharose ngatif (-) .
Lindicateur colore permet de vrifier lutilisation dun lment dans le milieu de culture :
le bleu de bromothymol de couleur verte.
-Sur la glose nutritive alcaline : lon a de grosses colonies qui sont translucides
bleutes et, dotes de plusieurs caractres spcifiques.
a/- Caractres morphologiques :
* Examen a ltat frais : mobilit polaire * Coloration de Gram : B. Gram (-) incurv en virgule
b/- Caractres biochimiques :* Arobie Anarobie Facultative (AAF) * Oxydase positif (+)
* Catalase (+ ) * Rduction Nitrates *Fermentation du glucose * Lactose (-) *ONPG (+)
c/- Caractres antigniques : * Ag O / * Ag H
Ag O : serotypage avec limmuno-srum anti-VIBRIO cholerea O : 1 qui induit une agglutination

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VIII/ - LES LISTERIA

I/ - CARACTERISTIQUES
On peut les retrouves dans les pays temprs, dans les produits dorigine animale et,
dans tous les aliments. Elle se dveloppe de 25 30 C, on peut les trouver dans le milieu
extrieur, dans le sol, les eaux dgouts, eaux courantes, poussires, les vgtaux en
particulier les ensilages de mais.
Cest une bactrie qui ne donne pas dintoxications alimentaires mais, donne plutt
des septicmies : prsence de bactries dans le sang. Elle est dautant plus grave chez la
femme enceinte.
II/- RECHERCHE DE LISTERIA DANS LES ALIMENTS
1/- Prlvement et prise dessai : La quantit prleve daliment est de 25 g
2/- Pre-enrichissement : avec de leau peptonee tamponne
3/- Enrichissement : il permet davoir une multiplication des bactries sur les bouillons
slectifs pour LISTERIA nous avons : le bouillon Fraser, le LEB (B. denrichissement de Listeria)
4/- Isolement : ralis avec des gloses slectives pour Listeria et, lensemencement se fait
en surface par strie. *Glose Palcam +++ * Glose Oxford
*Glose Mac Bride
5/- Identification
a/- Caractres morphologiques: * Bacille Gram (-), acapsul, mobilit pritriche en pirouette
b/- Caractres biochimiques : *Oxydase ngatif (-) * Catalase positif (+)
Il existe des mthodes rapides avec des techniques dimmuno-enzymatiques bases sur la
recherche dune protine spcifique du genre LISTERIA.
Lon a galement des techniques molculaires qui peuvent tre spcifiques du genre et
dautres qui sont spcifiques de lespce. L. monocytognes qui est pathogne par excellence

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RECHERCHE DES PRINCIPAUX GERMES

FERMENTAIRES DANS LES PRODUITS DE 4eme GAMME
A/- GENERALITES
Les produits de 4me gamme sont dfinis par Jouve (1993), comme tant des produits
vgtaux conditionns en units mnagres ou collectives, crus, frais, prts lemploi la
consommation humaine, ayant fait lobjet dun pluchage, coupage ou toute autre opration
touchant leur lintgrit.
Les micro-organismes fermentaires sont des tres dont les potentialits sont trs
utilises dans lalimentation et lindustrie alimentaire. Dune faon gnrale, nous distinguons
deux (2) types de micro-organismes fermentaires : les Champignons et les Bactries.
Les Champignons sont essentiellement les Levures et les Moisissures, tandis quau
niveau des Bactries nous avons :
les bactries actiques ( Acetomonas , Acetobacter, Gluconobacter ) qui transforment
lalcool thylique en acide actique par oxydation;
les bactries lactiques ( Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus , Streptococcus ) trs
utilises en industrie alimentaire; elles sont les agents de fermentation lactique.
Les bactries propioniques qui correspondent au genre Propionobacterium et, qui
appartiennent au groupe des Actinobactries
Dans les produits sucrs de 4me gamme, les micro-organismes fermentaires
rechercher sont : les Levures, les Moisissures et les Leuconostocs. Bien qualtrant la
qualit marchande des produits, ils ninduisent pas de risque sanitaire pour le consommateur.

B/ - PROTOCOLE MICROBIOLOGIQUE
Les analyses microbiologiques doivent seffectuer dans un milieu aseptique cre par la
flamme du bec Bnsen permettant ainsi dviter la contamination du produit par le
manipulateur ou lenvironnement.
Cinq (5) tapes majeures sont accomplies avant lisolement et le dnombrement des
germes fermentaires ; ce sont :
la prparation des milieux de culture. la prparation de lchantillon et de la
suspension mre. la prparation des dilutions dcimales
Lensemencement des milieux spcifiques et. lincubation aux tempratures
spcifiques. Les deux dernires tapes constituent ltape de la recherche des germes.
I/- PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE
Une certaine quantit de milieu de culture est pese et, dissoute dans un volume prcis
deau. Un chauffage est ralis pour assurer lhomognisation du milieu. Ceux-ci sont rpartis
dans des tubes vis ou dans des flacons. Ils sont autoclavs par la suite.
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II/- PREPARATION DE LECHANTILLON ET DE LA SUSPENSION MERE

Aprs avoir tremp les fruits dans de leau de javel, lon ralise une dissection de
lpicarpe avec un couteau strile. Dix grammes de la pulpe sont pess et mis dans un sachet
Stomacher strile o lon ajoute 90 ml deau peptone tamponne (EPT). Lensemble est
soumis laction dun broyeur Stomacher et, aprs homognisation lon obtient une solution
qui est appele: suspension mre ; cette solution homogne est 101
III/ - PREPARATION DES DILUTIONS DECIMALES
La tryptone sel utilise comme diluant, est repartie aseptiquement dans des tubes
essai en raison de 9 ml. par tube. Lon prlve 1 ml. de la suspension mre, que lon transfre
dans un autre tube contenant 9 ml. de diluant. Aprs homognisation lon obtient une
suspension qui est 102.
Lon prlve ensuite 1 ml. de la suspension 10-2 quon met dans un autre tube essai
contenant 9 ml. diluant. Aprs homognisation, lon obtient une autre suspension qui est
10-3. Par la mme technique on obtient les dilutions 10-4, 10-5, 10-6
IV/ - RECHERCHE DES GERMES FERMENTAIRES
IV. 1./ - Ensemencement des milieux de culture
Lon ralise un ensemencement par inondation la surface des diffrents milieux
spcifiques couls en bote de Ptri avec 0,1 ml. de la suspension mre et de chacune des
dilutions retenues. Ces milieux spcifiques tant :
-le milieu OGA pour la recherche des Levures et Moisissures
-le milieu Hypersaccharos pour la recherche des Leuconostocs
-le milieu MRS pour la recherche des Lactobacillus
IV.2/ - Incubation 48 72 heures aux tempratures spcifiques
Aprs ensemencement, les boites sont incubes ltuve 30C. pendant 48 72 heures.
V/ - IDENTIFICATION DES GERMES
V.1./ - LES LEUCONOSTOCS
Aprs incubation, lon recherche la surface du milieu hypersaccharos de grosses
colonies transparentes muqueuses et coulantes. La coloration de Gram fait apparatre des
Cocci Gram positif (C.G. + ) en diplocoques et en chanettes.
V.2. / - LES LEVURES ET MOISISSURES
Aprs incubation , on observe la surface du milieu glucos loxyttracycline des
colonies crmeuses blanche ou blanchtre qui caractrisent les Levures et, les colonies
duveteuses spcifiques aux Moisissures.
Une vrification de ces rsultats est faite partir des colonies, par une coloration de
Gram pour la mise en vidence, permettant de relever des Cocci Gram positif (C.G. +)
lancols et operculs caractristiques. Pour les Moisissures, ce sont des germes filamenteux
pluri-segments qui sont recherchs.
La dtermination du genre et, de lespce des Levures isoles est ralise laide des
galeries API 20 C AUX.
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PHOTO No 4 : ISOLEMENT ET DENOMBREMENT

DES LEVURES SUR MILIEU O G A

PHOTO No 5 : ISOLEMENT ET DENOMBREMENT DES LEVURES

ET DES MOISISSURES SUR MILIEU O G A

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A partir des colonies isoles de souche pure, lon fait 3 5 suspensions dans de leau distille
( 2 ml. ) contenue dans des tubes hmolyse. Ces suspensions sont utilises pour transfrer
100 l, soit 3 gouttes dune pipette Pasteur dans une ampoule de C Mdium afin
densemencer une galerie 20 C AUX. pour lidentification des levures isoles. Une fois les
galeries ensemences, elles sont incubes pendant 48 72 heures une temprature de 30C.
Une premire lecture des galeries est effectue aprs 24 heures dincubation. Les
cupules plus troubles que le tmoin, indiquent des ractions positives sont notes sur la fiche
de rsultats.Une seconde lecture des galeries est effectue aprs 48 heures dincubation
30C. pour une meilleure analyse des ractions positives et une identification plus prcise des
genres et des espces. Une troisime lecture est enfin ralise aprs 72 heures dincubation
pour dterminer le profil numrique afin didentifier la Levure.
Toutes les ractions positives et ngatives sont notes sur la fiche de rsultats. Grce
cette fiche de rsultats, lon obtient un profil numrique pour lidentification du genre et
de lespce des colonies isoles ce laide du catalogue API 20 C AUX.
Quant aux Moisissures, on ralise une coloration avec une solution de bleu de
mthylne . Un examen ltat frais entre lame et lamelle est ainsi ralis. On note ensuite les
aspects macroscopiques des colonies.
Il existe lheure actuelle environ 50.000 espces connues de Moisissures.
Ces champignons possdent certaines particularits qui fait natre dans le domaine
agroalimentaire des esprances: leur teneur en protine est trs leve, mais aussi des
inquitudes, car elles ont le pouvoir dlaborer des substances toxiques: raison de leur
identification.
V.3. / - LES LACTOBACILLUS
Aprs incubation , lon observe des colonies circulaires, opaques, incolores ou
blanchtres et de 0,5 1 mm de diamtre.
La coloration de Gram rvle des bacilles Gram positif ( B. G. + ) non sporules longs
et flexueux.

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LES CRITERES MICROBIOLOGIQUES DES ALIMENTS

PRODUITS DE 4me GAMME, PLATS CUISINES, EAU DE BOISSON

I/ - INTRODUCTION
Les microorganismes sont des composants extrmement nombreux et actifs de notre
environnement. Cependant cause de leur petite taille, on a souvent tendance les ignorer ou
les sous estimer. Il existe pourtant deux domaines o ils nous concernent de faon particulire :
celui de la sant et celui de lalimentation. En effet ils sont la cause des altrations des produits
alimentaires et des infections bactriennes et fongiques et mycosiques que nous contractons.
La dtermination des microorganismes savre ncessaire pour permettre une matrise de
la qualit et, une prvention des risques infectieux au niveau des matires vgtales alimentaires.
Ainsi pour protger la sant des consommateurs, lAssociation Franaise de Normalisation
(AFNOR) a dfinie des critres microbiologiques obligatoires pour les diffrents types
daliments depuis les eaux jusquaux plats cuisins en passant par les fruits et lgumes
II/ - CRITERES DE QUALITE DES FRUITS ET LEGUMES
Les Fruits et Lgumes sont des produits vgtaux dits de la 4me gamme. Lanalyse
microbiologique de ces produits est essentiellement dirige vers la recherche des germes
fermentaires qui, un taux lev altrent la qualit marchande et des fois la qualit hyginique
lorsquil y a productions des mycotoxines telles laflatoxine et lochratoxine dans le cacao.
Les microorganismes recherchs sont :
- les Levures ou champignons unicellulaires
- les Moisissures , (champignons pluricellulaires ou, thalles filamenteux)
- les Lactobacillus responsables des gots aigres et piquants
- les Leuconostocs qui sont des bactries htro-fermentaires et muqueuses
Au stade de la production, les critres de qualit des normes AFNOR adopts par le Comit
Ivoirien de Normalisation (CODINORM) pour les Levures et Moisissures sont les suivants :
- valeur limite minimale m = 1. 000 microorganismes / ml.
- valeur limite maximale M = 10. 000 microorganismes / ml
Tableau N1 : Critres microbiologiques lis aux fruits au stade de la production
Micro-organismes
recherchs

Nombre de germes / ml
Nombre de germes / ml
(Valeur limite minimale: m) (Valeur limite maximale: M)

* Levures
* Moisissures
* Leuconostocs
* Lactobacillus
* m = Valeur limite minimale

m = 1. 000
m = 1. 000
Absence
Absence

M = 10. 000
M = 10. 000
Absence
Absence
* M = Valeur limite maximale

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* M = Valeur limite maximale ou, seuil dacceptabilit au-del duquel les rsultats sont
considrs comme non satisfaisants pour la qualit marchande. Sans pour autant que ces
produits soient considrs comme toxiques.
A partir de ces critres noncs, les diffrents commentaires assigns la qualit des
fruits au stade de la production sont les suivants :
1/ - Qualit Microbiologique Satisfaisante : QMS lorsque les rsultats en milieu solide,
sont tous infrieurs ou gaux trois (3) fois m .
2/ - Qualit Microbiologique considre comme Acceptable : QMA lorsque les rsultats
obtenus sont compris entre trois (3) fois m et M , soit dix ( 10 ) fois m
3/ - Qualit Microbiologique Non Satisfaisante : QMNS quand les rsultats sont
suprieurs M
III/ - CRITERES DE QUALITE DES PLATS CUISINES
Tableau N2 : Critres microbiologiques lis aux plats cuisins (AFNOR / CODINORM)

Microorganisme recherch

******

Valeur limite minimale : m

- Germes Arobies Msophiles 30C. ( G.A.M. )

- Coliformes Totaux 30 C. ( C.T. )
- Coliformes Thermotolrants ( C. Fcaux : C.F. )

300.000 germes / g
1.000 germes / g
10 germes / g

- Staphylococcus aureus
( Staph. )
- Anarobies Sulfito-Rducteurs ( A.S.R. )
- Streptocoques Fcaux
( Strep. D )
- Salmonella ( Sal. )

100 germes / g
30 germes / g
Pas de critre
Absence dans 25 g

A partir de ces critres noncs, les diffrents commentaires assigns la qualit des
plats cuisins sont les suivants :
1/ - Qualit Microbiologique Satisfaisante : QMS lorsque tous les dnombrements sont
infrieurs trois (3) fois le critre m avec, absence de Salmonella.
2/ - Qualit Microbiologique considre comme Acceptable : QMA lorsque un des
dnombrements est compris entre trois (3) fois m et M , soit dix (10 ) fois m avec, absence
de Salmonella
3/ - Qualit Microbiologique Non Satisfaisante : QMNS quand plusieurs
dnombrements sont compris entre 3 et 10 fois le critre m avec, absence de Salmonella
4/ - Aliment Corrompu : lorsquil y a prsence de Salmonella et, quand les
dnombrements sont compris entre 500 et 1000 fois le critre m
PS : Index / Indicateur
a/ - Index : cest un germe dont la prsence en nombre suprieur aux valeurs dfinies
indique la prsence possible dun pathogne dcologie similaire.
b/ - Indicateur : cest un germe dont la prsence en nombre suprieur aux valeurs
dfinies indique un dfaut dadhsion aux bonnes pratiques de fabrications reconnues.
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Tableau N 3 : COMMENTAIRE DES CRITERES DES PLATS CUISINES
GERMES

G.A.M.

Q.M.S. *

900.000

Q.M.A. *

Q.M.N.S *

900.000

900.000

3.000.000

3.000.000

3.000 10.000

3.000 10.000

Aliment corrompu

C. Totaux

3.000

C. Fcaux

30

30 - 100

30 - 100

A.S.Rducteurs

90

90 - 100

90 - 100

300 1.000

300 1.000

Absence / 25 g.

Absence / 25 g.

Absence / 25 g.

Prsence dans 25 g.

Tous les

Un des

Plusieurs

Susceptibilit

dnombrements

dnombrements

dnombrements

de toxicit.

Staph. aureus
Salmonella

300

sont infrieurs

est compris entre sont compris entre Egalement lorsque les

dnombrements sont
3 fois le critre 3 et 10 fois le 3 et 10 fois le
compris entre 500 et
avec absence de critre avec
critre avec
1000 fois le critre
Salmonella
absence
absence
de Salmonella

de Salmonella

* 1/ - Q.M.S. : Qualit Microbiologique Satisfaisante

* 2/ - Q.M.A. : Qualit Microbiologique Acceptable
* 3/ - Q.M.N.S. : Qualit Microbiologique Non Satisfaisante
* 4/ - Aliment Corrompu
IV/ - CRITERES DE QUALITE EAUX DE BOISSONS (AFNOR / CODINORM )
Tableau N4 : Critres microbiologiques lis aux eaux de boissons
Valeur limite minimale : m
- Germes Arobies Msophiles (G.A.M.) * 22C 100 germes / ml * 37C 200 g / ml
- Coliformes Totaux 30 C. ( C.T. )
< 1 germe / 100 ml
- Coliformes Thermotolrants ( C. Fcaux : C.F. )
< 1 germe / 100 ml
- Anarobies Sulfito-Rducteurs ( A.S.R. )
1 germe / 20 ml
- Streptocoques Fcaux
( Strep. D )
< 1 germe / 100 ml
- Salmonella ( Sal. )
Absence dans 100 ml
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MICROBIOLOGIE
ALIMENTAIRE
TRAVAUX DIRIGES

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MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE

ANALYSE CONTROLE DE QUALITE DES ALIMENTS

- EXERCICE N 1 : Normes et critres

Donner les normes utilises aprs les analyses :

a/ - dune eau alimentaire
b/ - du lait cru c/ - dun fruit
d/ - dun plat cuisin
Et dites quand un produit alimentaire est de Qualit Microbiologique Non Satisfaisante.

- EXERCICE N 2 : Etude des eaux dalimentation

- Quels sont les germes recherche obligatoire dans lanalyse et le contrle bactriologique
des Eaux, et donner la dfinition de la colimtrie

- EXERCICE N 3 : Contrle de qualit des eaux de boissons et de boissons alcoolises

Une analyse de trois chantillons deau de boissons et dune boisson alcoolise est effectue,
les rsultats sont consigns dans le tableau ci-dessous
*Eau Minrale Cleste *Eau Purifie en sachet
*Eau Potable
* G.A.M.
1. 000
22. 000
4. 500
* Coliformes Totaux
34
7. 200
320
* Coliformes Fcaux
0
200
60
* Streptocoques gpe D
0
800
0
* Boisson alcoolise : Absence totale de germes
1/ - Faites un commentaire de ces rsultats
2/ - Dans quel but la recherche des coliformes et des streptocoques D est ralise
3/ - Lchantillon deau en sachet dit purifie peut-il tre mis en vente ? Pourquoi ?
4/ - Malgr labsence de germes, cette boisson alcoolise ft lorigine dintoxications svres;
de quel type dintoxication pourrait il sagir ?

- EXERCICE N 4 : Contrle de qualit des eaux de boissons

Une analyse de trois (3) chantillons deau est effectue, les rsultats des germes isols
par ml sont consigns dans le tableau ci-dessous
* Eau Awa Dji
a/ - G.A.M.
800
b/ - Coliformes Totaux
26
c/ - Coliformes Thermo-tolrants
0
d/ - Streptocoques Fcaux
0

* Eau Purifie en sachet

32. 000
6, 400
400
2. 200

* Eau Sodeci
8. 000
350
40
0

1/ - Faites un commentaire de ces rsultats en vous rfrant aux normes internationales AFNOR et
nationale CODINORM
2/ - Dans quel but dune part, la recherche des germes arobies msophiles (GAM) est ralise, et
dautre part ceux des coliformes et des Streptocoques D.
3/ - Lchantillon deau en sachet dit purifie peut-il tre mis en vente ? Pourquoi ?

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- EXERCICE N 5 : Contrle dun jus de fruit

Lanalyse microbiologique dun jus de fruit du secteur informel donne les rsultats suivants :
* SM
* 10-1
* 10-2
* Coliformes
48
05
* Clostridium
11
01
1/ - Quels sont les noms des milieux spcifiques utiliss pour la recherche des germes isols
2/ - Quel est le nombre de chaque germe dans 1 ml de jus

- EXERCICE N 6 : Contrle de foutou banane

Lanalyse microbiologique dun foutou de banane donne les rsultats suivants :

* SM
* 10-1
* 10-2
* Milieu Baird Parker
72
08
* Milieu P.C.A.
55
1/ - Quels sont les noms des germes recherchs sur ces milieux spcifiques
2/ - Quel est le nombre de chaque germe dans un (1) gramme de foutou

- EXERCICE N 7 : Contrle microbiologique dun plat cuisin

Lanalyse microbiologique qualitative et quantitative dun plat cuisin issu dun

maquis de la rue princesse dans la commune de yopougon donne les rsultats suivants :
* SM
* 10-2
* 10-3
* G Arobies Msophiles
260
30
02
* Staphylococcus
09
01
* Salmonella
Prsence
1/ - Quel est le nombre de chaque germe isol dans 1 g daliment
2/ - Quelle est la qualit microbiologique de cet aliment en fonction des normes AFNOR et
CODINORM en sachant que les autres germes recherchs sont absents
3/ - Quels sont les principaux conseils que vous pouvez transmettre aux clients de ce maquis

- EXERCICE N 8 : Etude de cas

En Cte dIvoire, dans la rgion de DUOKOUE des signes cliniques affectant un groupe de
population dplace amne un mdecin de la Croix rouge la suspicion dune toxi-infection
alimentaire collective (TIAC) au cours des ftes pascales 2010. Des prlvements de plusieurs plats
de rsistance sont alors raliss et transfrs votre laboratoire Abidjan pour un contrle
microbiologique complet avec des recherches pousses sur les germes Staphylococcus et Salmonella
A/ - 1re partie
1/ - Donner la dfinition dune toxi-infection alimentaire collective
2/ - Prsenter les principales origines des microorganismes dans les aliments
B/ - 2me partie : rsultats danalyse
* SM
* 10-2
* 10-3
* G Arobies Msophiles
105
10
* Staphylococcus
29
03
00
* Coliformes Totaux
84
07
00
1/ - Quel est le nombre de chaque germe isol dans 1 g daliment
2/ - Quelle est la qualit microbiologique de ces aliments en sachant que les autres germes
recherchs sont absents
3/ - Quels sont les principaux conseils que vous pouvez transmettre cette population

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MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE

EXERCICE N 9 : Analyse de deux (2) denres alimentaires

Lanalyse de deux denres alimentaires (produit N 1 et produit N2 ) prleves dans des

grands restaurants de la place a fourni les rsultats consigns dans les tableaux suivants :
MICROORGANISMES

PRODUIT N 1

PRODUIT N 2

CRITERES

Germes A. Msophiles
Coliformes Totaux
Coliformes
Thermotolrants
Staphylococcus aureus
A. S. R.
Salmonella

3,7 10 7
2,5 10 5
2,5 10 3

2, 9 10 5
2 10 3
25

3 10 5
10 3
10

10 5
0
Absence

0
0
Prsence

100
30
Absence

1/ - Interprtez les rsultats du tableau en considrant chaque groupe de

microorganismes pour chacune des denres N 1 et N 2.
2/ - Quelles conclusions tirez-vous quant la qualit microbiologique de ces denres
aprs analyse ?

EXERCICE N 10 : Analyse dun sandwich

Lanalyse dun sandwich vendu proximit de luniversit Flix Houphouet

BOIGNY de Cocody a donne les rsultats suivants :
Solution
mre

10 -1

10 - 2

10 - 3

10 - 4

(-)

Incomptable

573

203

37

9 5. 5. 10 5
g

Incomptable

315

35

13

100 / g

E. coli

(-)

179

63

100 / g

S. aureus

131

29

100 / g

Salmonella

Absence

Abs

Abs

Abs

Abs

Abs

Shigella

Prsence

Abs

Abs

Abs

Abs

Abs

Bacillus
cereus
ASR

134
152

18
32

0
1

0
0

0
0

0
0

GAM
Coliformes
Totaux

10 - 5

Critres

Absence
/ 25 g
Absence
/ 25 g
100/g
10 /g

1/ - Interprter ces rsultats par rapport chaque microorganisme ou groupe de

microorganismes.
2/ - Donnez la qualit microbiologique de ce sandwich

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ANALYSE CONTROLE DE QUALITE

DES PRODUITS DE 4me GAMME (Fruits tropicaux)
EXERCICE N 1

Au cours de lanalyse microbiologique des aliments

1/ - Quappelle ton altration de la qualit marchande dun produit ?
2/ - Quels sont les germes qui permettent sa mise en vidence
3/ - Citer le nom des milieux de cultures spcifiques ltude de ces germes
4/ - En vous referant aux normes AFNOR et CODINORM, quand pourriez vous dire
que ce produit est de qualit microbiologie non satisfaisante

EXERCICE N2

Dans le souci de lamlioration de la qualit des produits fruitiers dune entreprise

exportatrice, des rsultats issus de lanalyse microbiologique de lots de fruits dananas,
de papaye, et de banane vous sont prsents :

Levures
Moisissures
Leuconostocs

Levures
Moisissures
Leuconostocs

Lot Ananas : Ananas comosus : A X 2

SM
10-2
10-3
Indnombrable
520
48
Indnombrable
14
02
06
01
00
Lot Papaye : Carica papaya : P Y 2
SM
10-2
10-3
242
25
02
06
01
00
00
00
00

10-4
05
00
00

10-4
00
00
00

Lot Banane: B Z 3
SM
10-2
10-3
10-4
Levures
24
02
00
00
Moisissures
02
00
00
00
Leuconostocs
00
00
00
00
1/ - Effectuer le dnombrement des germes recherchs : Levures, Moisissures
et Leuconostocs prsents dans les fruits dananas, papaye et ceux de banane analyss.
2/ - Effectuer le commentaire des rsultats obtenus sur ces deux fruits par
rapport aux critres CODINORM lis aux produits de 4me gamme.
3/ - Dterminer la qualit microbiologique des trois lots de fruits analyss et
indiquer lequel des fruits pourra tre exportes

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