INTRODUCCIN

En la siguiente practica se determinara las diferentes clases de enzimas, el

cual en dependencia de sus reacciones qumicas catalizadas se dividen en seis
clases : oxidoreductasas, tranferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas, ligasas.
Estas reacciones de identificacin de cada material biolgico tiene sus
particularidades ( sus condiciones).
Estas reacciones cualitativas de las enzimas se utilizan en las clnicas para la
determinacin de enzimas en las pruebas de sangre, y tambin en la prctica
higienica en la disposicin de las muestras sobre la presencia de enzimas en
los productos alimenticios ( leche, papa, etc.).
En las reacciones, catalizadas por las xidos reductasas, el substrato que se
oxida se considera como donador de hidrogeno o electrones, y aceptor pueden
ser sustancias naturales
(coenzimas- NAD, NADP, FMN, CoQ,
oxigeno, compuestos orgnicos, citocromos, etc.) y xenobioticos.

Parte teorica
Succinato deshidrogenasa
La enzima succinato deshidrogenasa (SDH), succinato coenzima Q reductasa o
complejo II mitocondrial (nmero EC 1.3.5.1) es un complejo proteico ligado a
la membrana interna mitocondrial que interviene en el ciclo de Krebs y en la
cadena de transporte de electrones, y que contiene FAD (flavn-adenndinucletido) unido covalentemente. Cataliza la reaccin:
Succinato + ubiquinona \rightleftharpoons fumarato + ubiquinol
Esta protena puede degradarse a la enzima nmero EC 1.3.99.1 que ya no
reacciona con la ubiquinona necesitando otros aceptores de electrones.
Succinato + aceptor \rightleftharpoons fumarato + aceptor reducido. La enzima
est compuesta de cuatro subunidades, dos hidroflicas y dos hidrofbicas:
Succinato deshidrogenasa subunidad A (SDHA). Es una flavoprotena (Fp)
hidroflica que tiene unida covalentemente como cofactor una molcula de
FAD. Tambin contiene el sitio de unin del succinato.
Succinato deshidrogenasa subunidad B (SDHB). Tambin hidroflica,
contiene tres clsters de hierro-azufre: 2Fe-2S, 4Fe-4S y 3Fe-4S.
Succinato deshidrogenasa subunidad C (SDHC). Hidrofbica. Une el
complejo proteico a la membrana de la mitocondria.
Succinato deshidrogenasa subunidad D (SDHD). Hidrofbica. Une el
complejo proteico a la membrana de la mitocondria. Succinato deshidrogenasa
factor de montaje 1 (SDAHF1). Participa en la biosntesis mitocondrial de los
clsters de hierro-azufre. Succinato deshidrogenasa factor de montaje 2
(SDHAF2). Es necesaria para la insercin del FAD en la SDHA. No est claro si
participa con actividad enzimtica en la unin covalente del FAD a la SDHA, o
manteniendo a la SDHA en una conformacin adecuada para que el FAD se una
a la SDHA.
Mecanismo
El FADH2 de la succinato deshidrogenasa, al no poder desprenderse del
enzima, debe oxidarse nuevamente in situ. El FADH2 cede sus dos hidrgenos a
la ubiquinona (coenzima Q) que se reduce a ubiquinol (QH2) y abandona el
enzima, difundiendo en la bicapa lipdica hasta alcanzar en siguiente complejo
enzimtico de la cadena respiratoria. La molcula de FAD del enzima es el
aceptor de electrones de la reaccin. En general la funcin bioqumica del FAD
es oxidar los alcanos a alquenos, mientras que el NAD+ oxida los alcoholes a
aldehdos o cetonas. Esto es debido a que la oxidacin de un alcano (como el

succinato) a un alqueno (como el fumarato) es suficientemente exergnica

como para reducir el FAD a FADH2, pero no para reducir el NAD+ a NADH. Es
poco usual hallar una unin covalente entre el FAD y una protena; en la
mayora de los casos, el FAD se encuentra unido a su enzima asociado de
forma no covalente (unin dbil y transitoria). por lo que en este caso el FAD
acta como grupo prosttico y no como un coenzima mvil, como lo hace
normalmente. La succinato deshidrogenasa acta separando los tomos de
hidrgeno que se hallan en posicin trans de los tomos de carbono
metilnicos del succinato. Este enzima posee algunas caractersticas de un
enzima alostrica: es activada por el succinato, el fosfato, el ATP y el coenzima
Q reducido, y es inhibido por el malonato, un anlogo estructural del
succinato.Por otro lado, esta enzima se constituye como unos de los blancos
moleculares en la intoxicacin por cianuro, de esta manera es inhibida su
accin y as se bloquea la produccin de ATP, induciendo a hipoxia celular.

DETALLES EXPERIMENTALES
1. Materiales de laboratorio
Tubos de ensayo
Gradilla
Vasos de precipitado
Baguetas
Pipetas
Probetas
Termmetro
2. Reactivos
Solucin de Formaldehido al 0,4%
Azul de Metileno al 0, 1%
NaOH al 10%
cido succnico al 3% neutralizado con NaOH al 10% hasta pH 7,4
Fenol al 90%
Aceite vegetal
3. Material
Jugo de papa, rbano y pimiento con pednculo
Leche fresca de vaca
Hgado de rata
Pepas de Sanda, harina de soya.
4. Procedimiento Experimental
a) Revelacin de aldehidoxidasa en la leche
En dos tubos de ensayo se colocaron 5 mL de leche fresca, agregndole a
ambos 1mL de solucin de azul de metileno. Luego al primer tubo se le agrego
1mL de agua (para que sirviera como patrn de referencia) y al segundo 1mL
de formaldehido, tapndolos inmediatamente para evitar el contacto con el
aire.
Los tubos se colocaron en un bao de agua a 37C durante 10 min. Pasados los
10 min se observ la decoloracin del azul de metileno en el segundo tubo,
confirmndose asi la presencia de aldehidoxidasa en la leche

Formaldehido

b) determinacin de la actividad de la enzima succinato deshidrogenasa

se pes 1 g de hgado de res fresco luego se coloco en el mortero y se agrego
3 a 4 ml de cido succnico hasta obtener una masa rojiza luego se transfiri a
dos tubos de ensayo y se procedi de la siguiente manera

reactivos
Fenol al 90 %
Azul de metileno
Aceite mineral

Numero de tubos
1
1.0 ml
2 gotas
Mezclar cada tubo
0.5 ml

2 gotas
0. 5 ml

Luego se calent los tubos durante 10 minutos en el bao mara a 50 c

b) Revelacin de la peroxidasa en la papa y rbano

En dos tubos de ensayo se agreg, en uno jugo de papa. Lugo a los tres
tubos se aade una 5 gotas de solucin alcohlica de bencidina y una gota de
perxido de hidrogeno

I. RESULTADOS
Los resultados se muestran en la siguiente tabla
Material

Enzima
Revelado

Sustrato
(donador)

Aceptor

Leche
Fresca

Aldehdoxidas
a

Formaldehid
o

Papa
Rbano
Hgado
de res

Peroxidasa
Peroxidasa
Succinato
deshidrogena
sa

H2O2
H2O2
cido
Succnico

Flavn
Adenn
Dinucletid
o
Bencidina
Bencidina
Flavn
Adenn
Dinucletid
o

Indicador
de
la
reaccin
Azul
de
Metileno
Oxidado
Bencidina
Bencidina
Azul
de
metileno
Oxidado

Resultado

Positivo

Positivo

DISCUSION DE RESULTADOS
Para la revelacin de la aldehidoxidasa, el mtodo si bien esta est basado
sobre la decoloracin del azul de metileno, Para lo cual se hace una
comparacin entre el negativo que es el agua y la solucin de formaldehido
donde se pretende comprobar la accin de la enzima, en base a los resultados
donde muestran que para la reaccin con el agua presenta una coloracin azul
intensa propio del azul de metileno-, pero para el aldehdo la solucin se
muestra color turquesa tenue, indicando as que hubo decoloracin del azul de
metileno y que la reaccin fue llevada con xito.

Para la determinacin de la enzima succinato deshidrogenasa la reaccin de

identificacin es similar a la anterior por lo que la determinacin

RECOMENDACIONES:
El hgado Debe ser preparado en el instante que se va a realizar la prctica.
Debido que en l se encuentra las enzimas. Y si se deja a exposicin, la enzima
puede perder su capacidad cataltica.
No olvidar rotular los envases de las diversas soluciones preparadas para evitar
errores.
Las cantidades de reactivo se aaden gota a gota ara poder asi apreciar los
cambios continuos que se producen.

Conclusin
Las sustancias como el FAD son aceptores de hidrogeno, y esos hidrgenos son
tomados por el azul de metileno, esto se vio en el cambio de coloracin.

REACCIN DE LA DETERMINACIN DE OXIDO-REDUCTASA EN MATERIAL

BIOLGICO
HC

H2O

aldehidooxidasa
FAD

FAD .H2

OH

H
aldehidooxidasa
FAD .H2

HC

O2

FAD

AM.H2
Forma leico

FAD

H2 O 2

FAD.H2

AM
Coloracin azul

CUESTIONARIO
1. Cules son los colores del azul de metileno en sus estados oxidado y
reducido?

PREGUNTA 2
Cul es la funcin del fenol en la reaccin?
Esta sustancia tiene la funcin de inhibir la actividad enzimtica porque tiende
a desnaturalizar las protenas.

PREGUNTA 3
EN QUE VIAS METABOLICAS ESTA INVOLUCRADA LA ENZIMA SUCCINATO
DESHIDROGENASA?
La molcula de FAD del enzima es el aceptor de electrones de la reaccin. En
general la funcin bioqumica del FAD es oxidar los alcanos a alquenos,
mientras que el NAD+oxida los alcoholes a aldehdos o cetonas. Esto es debido
a que la oxidacin de un alcano (como el succinato) a un alqueno (como el
fumarato) es suficientementeexergnica como para reducir el FAD a FADH2,
pero no para reducir el NAD+ a NADH. Es poco usual hallar una unin
covalente entre el FAD y una protena; en la mayora de los casos, el FAD se
encuentra unido a su enzima asociado de forma no covalente (unin dbil y
transitoria). por lo que en este caso el FAD acta como grupo prosttico y no
como un coenzima mvil, como lo hace normalmente.

Anexo
HOJAS DE SEGURIDAD: AZUL DE METILENO

HOJA DE SEGURIDAD PARA ACIDO SUCCINICO