Caracterização, Extração e Purificação Urucum PDF

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO TECNOLGICO
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS
CARACTERIZAO, EXTRAO E PURIFICAO POR

CROMATOGRAFIA DE COMPOSTOS DE URUCUM (Bixa orellana L.)
Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica do Centro

Tecnolgico da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito obteno
do ttulo de Doutor em Engenharia Qumica.
Orientador: Prof. Dr.Antnio Augusto Ulson de Souza

Co-orientadora: Profa. Dra.Selene Maria Arruda Guelli Ulson de Souza
Juarez Souza de Oliveira
Florianpolis SC, 23 de fevereiro de 2005.
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO TECNOLGICO
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica do Centro

Tecnolgico da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito obteno
do ttulo de Doutor em Engenharia Qumica.
Orientador: Prof. Dr. Antnio Augusto Ulson de Souza

Co-orientadora: Profa. Dra. Selene Maria Arruda Guelli Ulson de Souza
Florianpolis SC, 23 de fevereiro de 2005.
iii

Por
Submetida como parte dos requisitos necessrios para obteno do ttulo de
Doutor em Engenharia
Especialidade: Engenharia Qumica
_________________________________
____________________________________
Prof. Dr.Antnio Augusto U. de Souza.
Profa. Dra. Selene M. A. Guelli U. de Souza
Orientador
Co-orientadora
____________________________
Prof. Dr. Agenor Furigo Junior
Coordenador do Curso
BANCA EXAMINADOR
___________________________________
Prof. Dr. Antnio Augusto U. de Souza
____________________________________
Profa. Dra. Selene M. A. Guelli U. de Souza
___________________________
Profa.Dra. Vera Lcia Garcia Rehder
_______________________
Prof. Dr. Joo A. F. R. Pereira
___________________________
Prof. Dr. Agenor Furigo Junior
_________________________
Prof. Dr. Ayres Ferreira Morgado
Florianpolis, 23 de fevereiro de 2005.
iv
A pacincia irm do tempo; ela vive e confia nele,

e este a recompensa constantemente.
Do livro Introduo ao Conhecimento Logosfico
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo dom da vida e pela ddiva do saber, instrumento que nos impulsiona no
caminho para desvendar os frutos de sua criao. A quem nos momentos difceis recorri e
sempre me iluminou.
Aos meus orientadores Prof. Dr. Antnio Augusto Ulson de Souza e Profa Dra Selene M.
A. Guelli U. de Souza, pela oportunidade para realizao deste trabalho e banca
examinadora pelo tempo dedicado anlise deste trabalho.
minha esposa Jocina, pelo incentivo e pacincia, sempre do meu lado dando-me fora
para concluir esta jornada. Aos meus filhos Guilherme e Raquel agradeo pelo carinho
dedicado e compreenso.
Em especial aos grandes amigos, Ricardo e Jaime que sem medir esforos sempre me
apoiaram e tambm pela valiosa ajuda prestada na elaborao de experimentos agradeo a
Milena, Fabiana, Thais, Junior, Felipe, Adriana e a Talita. A Clarice e ao Anderson pela
ateno dispensada no incio dos trabalhos. A Emilly, ao Ronald, a Heloisa e a Cristiane,
que sempre me incentivaram.
Tambm ao Bruno e a Elaine que muito me auxiliaram na verso final.
Ao secretrio da coordenadoria do CPGENQ, Edevilson da Silva, pela sua ateno e
auxlio.
Ao amigo ngelo do Departamento de Qumica da UFSC pela valiosa ajuda como tambm
ao professor Dr. Madureira e ainda ao professor Dr. Luciano da Univali.
vi
Aos professores da UFPR em particular aos amigos, professores Drs. Moacir Kamisnki,
Regina Weinschutz e Carlos Yamamoto, que sempre me apoiaram para a realizao deste
trabalho, como tambm ao professor Dr.Obdlio pelas valiosas informaes tcnicas.
A Capes pelo auxlio financeiro e Universidade Federal de Santa Catarina pelo uso de suas
instalaes.
A todos os amigos que, embora no citados nominalmente, foram importantes para
realizao deste trabalho.
vii
Dedico esta conquista a voc Jocinea,

Minha querida esposa e aos nossos filhos Guilherme e Raquel,
Pela pacincia, incentivo e especialmente
Pelo carinho ao longo desta jornada
Amo vocs
viii
SUMRIO
LISTA DE TABELAS.................................................................................................
xv
LISTA DE FIGURAS..................................................................................................
xvii
SIMBOLOGIA .............................................................................................................
xix
RESUMO ......................................................................................................................
xxii
ABSTRACT ..................................................................................................................
xxiii
01
CAPTULO 1 INTRODUO
OBJETIVO
06
OBJETIVO GERAL
06
OBJETIVO ESPECFICO
06
08
CAPTULO 2 - REVISO BIBLIOGRFICA
08
2.1 ADITIVOS NATURAIS E SUAS APLICAES

2.1.1 PESQUISAS NA REA DA INDSTRIA DE ALIMENTOS
08
2.1.2 PESQUISAS NA REA DA SADE (MDICO-FARMACUTICA)
10
2.2 ESTABILIDADE DOS CORANTES NATURAIS
14
2.3 CAROTENIDES
15
2.3.1 BIOSNTESE DOS CAROTENIDES

2.3.2 OCORRNCIA
DOS
CAROTENIDES-DISTRIBUIO
16
NA
17
NATUREZA
2.3.3 FUNO DOS CAROTENIDES
17
ix
2.3.4 APOCAROTENIDES
19
2.3.5 ISOMERIZAO
22
2.4 BIXINA
23
2.5 ALTERNATIVA BIOTECNOLGICA PARA PRODUO
25
DE CORANTES
2.6 DERIVADOS SINTTICOS DE CAROTENIDES
27
2.7 URUCUM
30
2.7.1 PRINCIPAIS APLICAES PARA O PIGMENTO
34
2.7.2 COMPOSIO DA SEMENTE
35
2.7.3 TOXIDEZ
40
2.7.4 MTODOS DE PRODUO DO PIGMENTO
40
2.7.5 AVALIAO DA ESTABILIDADE/DEGRADAO
45
2.7.6 ESTABILIZAO/CONSERVAO
48
2.8 PROCESSOS DE SEPARAO POR ADSORO
49
2.9 CROMATOGRAFIA
50
2.9.1 CROMATOGRAFIA PREPARATIVA
52
2.9.2 VARIVEIS E PARMETROS OPERACIONAIS NA
55
CROMATOGRAFIA
2.9.3 RELAES DE EQUILBRIO DE ADSORO
22.9.4 DESLOCAMENTO DO SOLUTO ATRAVS DE UM LEITO
64
66
EMPACOTADO
2.9.5 MEDIDAS DE EFICINCIA NA CROMATOGRAFIA
68
x
2.9.6 OTIMIZAO
DE
UMA
COLUNA
CONTROLE
DA
71
RESOLUO
2.9.7 PERMEABILIDADE EM UMA COLUNA CROMATOGRFICA
73
2.9.8 DESEMPENHO DE UMA COLUNA
74
2.10 ADSORVENTES
2.10.1 CARACTERSTICAS DO ADSORVENTE
2.11 POROSIDADE DE UM LEITO
CAPTULO 3 - MATERIAL E MTODOS
74
75
77
79
3.1 SEMENTE DE URUCUM
79
3.2 EQUIPAMENTOS
79
3.3 REAGENTES
80
3.4 OTIMIZAO DO PROCESSO DE EXTRAO
80
3.4.1 PR-PURIFICAO DO EXTRATO SLIDO DE URUCUM
83
(PIGMENTO)
3.5 PADRO DE BIXINA
83
3.6 DETERMINAO DA SOLUBILIDADE DA BIXINA E
83
NORBIXINA
3.7 MONITORAMENTO DO TEOR DE BIXINA NO EXTRATO
BRUTO EM MEIO ALCOLICO
83
xi
3.8 AVALIAO DAS CONDIES DE ESTOCAGEM DE
84
PADRO DE BIXINA
85
3.9 METODOLOGIA ANALTICA

3.9.1 ANLISE ESPECTROFOTOMTRICA
85
3.9.2 DETERMINAO DA MASSA DO EXTRATO SECO
88
89
3.10 ACOMPANHAMENTO ESPECTROFOTOMTRICO NO

CURSO DA
HIDRLISE ALCALINA
3.11 CRISTALIZAO DA BIXINA
90
3.12 CROMATOGRAFIA PREPARATIVA
91
3.12.1 PREPARAO DA COLUNA
92
97
3.13 OBTENO DE DERIVADOS DE BIXINA
99
CAPTULO 4 RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 SOLUBILIDADE
DIFERENTES
DA
BIXINA
NORBIXINA
EM
99
SOLVENTES
4.1.1 SOLUBILIDADE EM SOLUES ALCALINAS
101
105
4.2.1 TEORES DE BIXINA DO EXTRATO SOLVEL DURANTE OS
107
CICLOS DE EXTRAO
4.2.2 COMPARAO DA EFICINCIA E OUTRO SOLVENTE NA
MISTURA
112
xii
4.2.3 EXTRAO
DE
BIXINA
COM
SOLUO
ALCOLICA
114
AMONIACAL
115
4.3 DERIVADOS DA BIXINA

4.3.1 DERIVADO AMONIACAL
115
4.3.2 DERIVADO CLCICO
117
4.4
OBTENO DE BIXINA CRISTALIZADA
120
4.5
RECRISTALIZAO DA BIXINA
121
4.6
SOLUBILIDADE
DA
BIXINA
DERIVADOS
123
(METODOLOGIA II)
4.7
ESCOLHA
DO
SOLVENTE
PARA
123
ESPECTROFOTOMETRIA
4.7.1 EMPREGO DO CLOROFRMIO
123
4.7.2 EMPREGO DO ETANOL
124
4.8 ESPECTROS DE ABSORO EM CLOROFRMIO
128
4.9 ESPECTROS DE ABSORO EM SOLUO ALCALINA
129
4.10 ACOMPANHAMENTO DA ESTABILIDADE DA BIXINA
132
EM ETANOL
4.11 MONITORAMENTO DE PADRES EM DIFERENTES
CONDIES DE ARMAZENAMENTO
133
xiii
4.12 MONITORAMENTO ESPECTROMTRICO NO CURSO DA
136
HIDRLISE
4.13 SEPARAO CROMATOGRFICA
4.13.1 VELOCIDADE DOS PICOS CIS E TRANS COMO FUNO DA
140
146
POLARIDADE
13.2 VOLUME DE COLUNAS EM FUNO DA COMPOSIO DA
149
FASE MVEL
4.13.3 NMERO DE PRATOS
CAPTULO 5 - CONCLUSES E SUGESTES PARA
150
152
TRABALHOS FUTUROS
5.1 PRINCIPAIS CONCLUSES OBTIDAS DO TRABALHO
152
5.2 SUGESTES PARA FUTUROS TRABALHOS
154
CAPTULO 6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
155
Anexo A BALANO DE MASSA - EXTRAO ALCOLICA AMONIACAL
169
Anexo B MICROFOTOGRAFIAS DE BIXINA E DERIVADOS
171
Anexo C ESPECTRO DE RMN DA CIS BIXINA
174
Anexo D ESPECTRO DE RMN DA TRANS BIXINA
176
Anexo E COEFICIENTE DE ABSORTIVIDADE DE BIXINA EM SOLUO
180
ALCOLICA
xiv
Anexo F - VALORES DE ABSORBNCIA DURANTE MONITORAMENTO DE
182
HIDRLISE
Anexo GRESUMO DE DADOS OBTIDOS DE COLUNAS PREPARATIVAS
185
Anexo H - CROMATOGRAMAS DE DUAS COLUNAS COM DIFERENTES SECES
186
Anexo I CROMATOGRAMA PICO 2 DEFORMADO
188
Anexo J - PLANLHA DE DADOS CROMATOGRFICOS (CROMATOGRAFIA

FLASH)
189
xv
LISTA DE TABELAS
Tabela
Dados e propriedades da bixina e norbixina.
25
Tabela
Solubilidade da bixina em CO2 supercrtico
43
Tabela
Solubilidade do pigmento de urucum em CO2 supercrtico
44
Tabela
4.
Solubilidade do leo de urucum em CO2 supercrtico
44
Tabela
Determinao da Taxa de Decomposio da bixina
47
Tabela
Fatores responsveis pela m definio de um pico cromatogrfico
67
Tabela
Relao da presso de equilbrio do mercrio com o dimetro dos

poros de um adsorvente.
76
Tabela
Relao das informaes contidas nos experimentos de extrao
82
Tabela
Plano de ensaio para monitoramento da hidrlise da bixina
90
Tabela
10
Composio das fases mveis e suas polaridades
97
Tabela
11
Solubilidade da bixina/norbixina em solventes orgnicos
100
Tabela
12
Solubilidade da bixina em soluo aquosa de NaOH
101
Tabela
13
Solubilidade da bixina em soluo aquosa de NH4OH
102
Tabela
14
Percentual de bixina no extrato hidro-alcolico amoniacal
103
Tabela
15
Percentual de bixina no extrato seco hidro-alcolico
104
Tabela
16
Teores de bixina e extrato seco por ciclos de extrao -Experimento 1 109
Tabela
17
Teores de bixina e extrato seco por ciclos de extrao Experimento2 110
Tabela
18
Teores de bixina e extrato seco por ciclos de extrao-Experimento 3
111
Tabela
19
Teores de bixina e extrato seco por ciclos de extrao-Experimento 4
112
Tabela
20
Teores de bixina no extrato alcolico e etreo Experimento 5
113
xvi
Tabela
21
Solubilidade da bixina e derivados (metodologia II)
123
Tabela
22
Anlise do teor de bixina recristalizada em acetona
124
Tabela
23
Coeficiente de absortividade da bixina em etanol
125
Tabela
24
Valores de absorbncia das amostras provenientes dos ciclos de
127
extrao do experimento 3
Tabela
25
Valores de absorbncia das solues empregadas para determinao 127

do coeficiente de absortividade
Tabela
26
Bandas de absoro e valores de absorbncia de amostras 131

acompanhadas sob efeito de aerao.
Tabela
27
Acompanhamento da absorbncia das solues com tempo de 132

estocagem
Tabela
28
Concentrao dos padres em funo do tempo de estocagem
134
Tabela
29
Valores mximos de absorbncia apresentados pelas amostras sob
139
monitoramento de hidrlise
Tabela
30
Comparao dos Volumes de coluna entre colunas de diferentes 142

sees
Tabela
31
Velocidade dos picos cis e trans em funo da polaridade
146
Tabela
32
Fator de retardo e fator de capacidade
147
Tabela
33
Volumes de coluna e valores de Rf para a trans-bixina em funo de 149

diferentes polaridades
Tabela
34
Nmero de pratos tericos
150
xvii
LISTA DE FIGURAS
Figura
Estrutura bsica dos carotenides.
15
Figura
ltimos estgios da biosntese de carotenides e suas possveis

transformaes.
17
Figura
Degradao oxidativa do caroteno (ciso oxidativa)
20
Figura
Provvel rota deformao da crocina via ciso oxidativa da molcula
21
da zeaxantina
Figura
Rota de biosntese do licopeno - enzima carotene7,8-desnaturase.
22
Figura
Estrutura dos carotenides bixina e norbixina, cis e trans e do
24
principal produto de degradao.

Figura
Rota proposta da biosntese da bixina a partir do licopeno.
27
Figura
Fotos de urucum: A: fruto verde; B: cachopa com frutos maduros; C:
31
em florao; D: fruto aberto com sementes expostas.

Figura
Degradao trmica da 9cis-bixina.
46
Figura
10
Isotermas: (a) Langmuir, (b) anti-langmuir e (c) e (d) os
66
cromatogramas relacionados.
Figura
11
Pico cromatogrfico tpico.
69
Figura
12
Cromatograma com banda adjacente
69
Figura
13
Pico cromatogrfico assimtrico
69
Figura
14
Esquema representativo de um poro
76
Figura
15
Conjunto para coleta de amostra voltil
89
Figura
16
Conjunto para filtrao sob presso.
91
Figura
17
Disposio esquemtica do conjunto para cromatografia preparativa
92
flash
Figura
18
Vlvula de restrio
92
Figura
19
Solubilidade da bixina e norbixina em diferentes solventes orgnicos 100
Figura
20
Curva de solubilidade da bixina em soluo aquosa de hidrxido de 101

sdio.
xviii
Figura
21
Solubilidade da bixina em soluo aquosa de NH4OH.
102
Figura
22
Percentual de bixina no extrato hidro-alcolico
103
Figura
23
Percentual de bixina no extrato seco hidro-alcolico
104
Figura
24
Evoluo da concentrao de bixina e extrato slido
109
por ciclo de extrao - Experimento 1

Figura
25
110
por ciclo de extrao - experimento 2.

Figura
26
111
por ciclo de extrao - Experimento 3.

Figura
27
Evoluo das concentraes de bixina e extrato slido
112

Figura
28
Reaes da bixina e provvel estrutura do sal amoniacal
116
Figura
29
Espectro no bixina no infravermelho
118
Figura
30
Espectro do derivado clcico no infravermelho
118
Figura
31
Espectro do derivado amoniacal no infravermelho
119
Figura
32
Fluxograma de extrao, pr-purificao e cristalizao de bixina 122

obtida de urucum
Figura
33
Espectros de absoro de bixina em clorofrmio
128
Figura
34
Espectro de absoro da bixina em soluo de hidrxido de sdio
129
Figura
35
Evoluo da hidrlise da bixina em soluo de NaOH 0,02N
136
Figura
36
137
Figura
37
137
Figura
38
Reteno da bixina em placa de TLC em funo da polaridade da 141

fase mvel.
Figura
39
Perfil de deslocamento de um pico de elevada reteno
145
Figura
40
Velocidade do pico em funo da polaridade do eluente
148
Figura
41
Volumes de coluna x ndice de polaridade da fase mvel para eluio 150

da trans bixina
xix
SIMBOLOGIA
Letras latinas
A
rea do pico cromatogrfico (cm2)
angstron (cm-8)
As
rea superficial do adsorvente (m2.g-1)
Cs
concentrao do soluto na fase slida
Cm
concentrao do soluto na fase mvel (mol.cm-3)
CV
volume de coluna (adimensional)
concentrao na fase mvel (mol.cm-3)
grau Celsius
cP
centipoise (kg/m.s)
dp
dimetro mdio de partculas (cm)
Dm
coeficiente de difuso do soluto na fase mvel (cm2.s-1)
dc
dimetro da coluna (cm)
Eo
potencial de reduo (v)
Fc
fluxo em uma coluna cromatogrfica (g/cm-3.s)
fator de forma das partculas no empacotamento
Gy
(gray) 1gy = 100 rad J/kg
altura do prato reduzido (cm)
altura equivalente do prato terico (cm)
Entalpia de adsoro (kcal.mol-1)
grau Kelvin
KA
constante de equilbrio de adsoro
Kd
frao de volume de poros em um empacotamento
ki
constante de equilbrio entre fases
comprimento da coluna cromatogrfica (cm)
mmol
milemol
nmero de pratos tericos
xx
ns
frao molecular na fase estacionria
nm
frao molecular na fase mvel
permeabilidade na coluna cromatogrfica
pr
presso reduzida
Pi
ndice de polaridade
parmetro de polaridade do solvente
pH
potencial hidrogeninico
quantidade de adsorbato na fase adsorvida (mol.cm-3)
reteno cromatogrfica
raio (cm)
marca registrada
Rf
fator de reteno cromatogrfico
Temperatura (oC)
tempo (s)
ui
componente de velocidade (cm.s-1)
Vs
volume da fase slida (mL)
Vm
volume da fase mvel (mL)
Ve
volume de eluio em um empacotamento (mL)
velocidade reduzida (cm.s-1)
volts
xi
frao molar na fase slida
yi
frao molar na fase lquida
Wi
largura da banda cromatogrfica (cm)
Letras gregas
i
frao volumtrica
comprimento de onda (cm)
prefixo (micro)
Prefixo (fempto)
xxi
Abreviaes
ATP
Adenosin Triphosphate
BDDT
Brunauer- Deming-Deming-Teller
BET
Brunauer-Emmett-Teller
BHA
Butil hidroxianisol
CAS
Chemical Abstract Service
CI
Color Index
CACEX
Carteira de Comercio Exterior
DNA
Desoxiribonucleic acid
EEC
Economic European Community
EC
Electrochemical array detection
FAO
Food and Agriculture Organization
GC- MS
Gas Chromatography mass spectrometry
FDA
Food and Drug Administration
HDL
High Density Lipoprotein
LDL
Low Density Lipoprotein
LSERs
Linear Solvatation Relationship
NIST
National Institute of Standard and Technology
OMS
Organizao Mundial de Sade
SST
Triangle Solubility Solvent
CCD
Cromatografia em Camada Delgada
TLS
Thermal lens spectroscopy
WHO
World Health Organization
xxii
RESUMO
Tcnicas cromatogrficas so freqentemente empregadas em processos de

separao de misturas complexas, sendo por isso essenciais em qumica fina e tambm para
o isolamento e identificao de compostos naturais, em particular quando as substncias de
interesse apresentam reduzida estabilidade. O perfeito domnio dos fenmenos de adsoro
envolvidos, associado s condies no agressivas do processo, permite isolar e purificar
compostos de elevado valor agregado, sendo por isso, de grande aplicao na indstria
farmacutica como tambm em processos biotecnolgicos. Neste trabalho foi estudado o
isolamento da bixina proveniente de sementes de urucum empregando-se coluna
preparativa flash com fase normal. Pela variao de parmetros de polaridade da fase
mvel, a tcnica de separao por cromatografia preparativa flash mostrou-se eficaz,
possibilitando inclusive a separao das duas formas ismeras da bixina. O
desenvolvimento desta pesquisa compreendeu tambm a determinao da solubilidade da
bixina em diferentes solventes, assim como a avaliao das melhores condies de
armazenamento para conservao de um padro de bixina, tendo em vista a reduzida
estabilidade apresentada por esta substncia. O estudo envolveu ainda o desenvolvimento e
otimizao de um processo de extrao, separao e purificao da bixina obtida. O
processo desenvolvido resultou em uma nova rota para produo de concentrado de bixina,
vivel, comparada s tradicionais formas de extrao, por permitir a obteno de maiores
quantidades de extrato com menor consumo de solvente. Procedimentos analticos
existentes foram reavaliados e modificados, com base na identificao dos principais
problemas detectados. Neste sentido, verificou-se tambm a tcnica que melhor atendia os
requisitos de confiabilidade.
xxiii
ABSTRACT
Chromatographic techniques are frequently applied to complex mixture separation

process, this way are essential at fine chemical and also to natural compound identification
and isolation, mainly when the target substance presents reduced stability. The perfect
knowledge of adsorption phenomena involved in the process, associated to non aggressive
conditions usually applied, allow to isolate and purify valuable compounds, therefore with
wide application in the pharmaceutical industry as well as biotechnological process. In this
work, it was studied the bixin isolation from annatto seeds using a preparative flash column
with normal phase. The technique using flash preparative chromatography has shown to be
efficient by changing the parameters of polarity in the mobile phase, making possible to
separate the two isomers form of bixin. The development of this work also comprised the
solubility determination of bixin in different solvents as well as the evaluation of the best
storage conditions for a bixin standard, due to the bixin reduced stability. This work also
involved the development and optimization of an extraction separation and purification
process for bixin. The developed process resulted in a viable new route for the production
of a bixin concentrate, compared to the traditional extraction processes because the new
process yields bigger amounts of extracts with less use of solvents Actual analytical
procedures were evaluated and modified based on the identification of the main problems
that were detected. This way, it was also verified the technique that best suit confiability
requirements.
CAPTULO 1 INTRODUO
CAPTULO 1 INTRODUO
A facilidade de padronizao dos corantes sintticos, associada ainda sua grande

disponibilidade muito contribuiu para sua expanso. No entanto, na dcada de 70 foi
constatado que estes se apresentavam como potenciais causadores de doenas degenerativas
como cncer, deformaes teratognicas e males associados ao corao entre outros.
A crescente divulgao quanto aos efeitos nocivos dos corantes sintticos tem
contribudo para a sua substituio por produtos naturais. Em 1990, a Food and Drugs
Administration (FDA) proibiu a utilizao de alguns corantes sintticos nos Estados Unidos.
Tambm na Europa houve restrio ao uso de corantes artificiais.
Os constantes avanos da cincia tm trazido benefcios diretos ao aumento da
expectativa de vida do ser humano. Dentro deste contexto o desenvolvimento de
equipamentos que permitem diagnsticos mais precisos como tambm o surgimento de novos
frmacos tem colaborado de forma decisiva para esta conquista. Nos procedimentos
empregados pela medicina, sejam preventivos, profilticos ou cirrgicos, freqentemente
esto presentes frmacos, e um grande nmero destes tem origem em uma matriz vegetal.
A diversidade vegetal brasileira desperta interesse da comunidade internacional, face
s perspectivas econmicas que representam. Segundo Garcia et al. (1994), mais de 365 000
espcies de plantas j foram catalogadas em todo o mundo e isto corresponde a 60 % das
existentes. Destas, apenas 1100 espcies foram estudadas em termos de compostos bioativos e
identificadas propriedades medicinais. Estima-se que o Brasil possui cerca de 60000 espcies
de plantas. Segundo os autores supe-se que mais de 70 % dos medicamentos derivados de
plantas foram desenvolvidos com base no conhecimento popular. Dados etnobotnicos de
plantas medicinais da Amaznia, por exemplo, revelam mais de 300 espcies de plantas
catalogadas.
So muitas as espcies vegetais que apresentam propriedades antibiticas, antitumorais, anestsicas e antioxidantes exploradas pelas indstrias farmacuticas.
CAPTULO 1 INTRODUO
O comrcio mundial de medicamentos atinge cifras bilionrias (prximo de meio

trilho de dlares/ano). Em 2002, segundo Neves et al. (2003) foram 406 bilhes de dlares
assim distribudos: 42 % na Amrica do Norte, 27 % na Europa, 11 % no Japo, 3 % na
frica, sia e Oriente Mdio e 7 % na Amrica Latina. Naquele ano, o faturamento do setor
no Brasil foi de 4,1 bilho de dlares.
Segundo Garcia et al. (1994) estimativas da Organizao Mundial de Sade, apontam
que mais de 25 000 espcies de plantas so conhecidas no mundo das quais so extrados
remdios fitoterpicos. Ainda, de todos os medicamentos existentes no mercado mundial
quase 40 % provm de fontes biolgicas, deste percentual 60 % obtido de plantas.
Segundo Cughlin (1993), um quarto de todos os produtos farmacuticos
comercializados nos Estados Unidos provm de plantas, tendo sido os produtos naturais as
principais matrias primas empregadas na produo de medicamentos usados at a metade do
sculo. Segundo Veash (2000), de 150 drogas prescritas nos Estados Unidos 118 so
derivados de plantas e animais e, em mdia para cada 125 espcies de plantas pesquisadas,
uma nova droga tem sido produzida. Por outro lado, quando a busca se faz por compostos
qumicos sintticos a proporo passa de 10000 para uma.
Conservantes e corantes esto cada vez mais presentes nos alimentos que consumimos.
Os produtos naturais tm apresentado uma demanda crescente no s na conservao de
alimentos como tambm na indstria de cosmticos. Muitos so os corantes, antioxidantes e
leos essenciais hoje consumidos nesse nicho de mercado.
O emprego de corantes naturais em substituio aos artificiais por diversos setores da
indstria tem gerado um crescente interesse pelos produtos provenientes do urucum. Os
mtodos rudimentares freqentemente aplicados para obteno destes produtos tendem a ser
substitudos por processos mais elaborados visando, no s a reduzir os custos de
processamento, mas tambm para agregar valor ao pigmento. Estes corantes apresentam
problemas de instabilidade resultante da prpria estrutura dos carotenides, (Mc Keown,
1962), exigindo cuidados especiais durante as fases de processamento.
A indstria alimentcia pelo seu elevado volume de produo responsvel por grande
parte desta demanda. Por outro lado, a indstria de cosmticos, com seus distintos segmentos:
perfumes, produtos para cabelo; maquiagem; cosmticos dermatolgicos; corporais e faciais
um outro grande mercado consumidor de produtos naturais.
CAPTULO 1 INTRODUO
O urucum figura como uma das principais fontes de corantes naturais utilizados
mundialmente. Na indstria de alimentos aplicado como corante em derivados lcteos,
embutidos, doces, licores, sorvetes e margarinas. Os corantes obtidos do urucum apresentam
versatilidade, estando disponveis tanto na forma lipossolvel quanto hidrossolvel. Sendo
assim, tm um amplo espectro de aplicao. Outros ramos industriais que tambm fazem uso
de suas propriedades tintoriais so: a indstria txtil e a de tintas e vernizes.
O Brasil situa-se como o segundo produtor de urucum, seguido pelo Qunia, sendo o
Peru, o maior produtor e exportador.
A bixina, um carotenide de cor vermelha, o pigmento presente em maior
concentrao no arilo da semente do urucum, sendo a principal substncia responsvel pelas
caractersticas tintoriais dos corantes obtidos daquela semente. Na semente bruta sua
concentrao pode chegar at 5,0%. Contudo diferentes variedades de sementes apresentam
teores s vezes inferiores a 2,0 %. O valor comercial da semente baseado no percentual de
bixina. Teores mnimos de 2,5% so normalmente exigidos para exportao.
Os compostos de urucum sofrem grande interferncia das condies de processo
estando susceptveis decomposio provocada pelo calor, luz e oxidao, como tambm
potencializada por determinados solventes. Uma vez isolada da semente, a bixina torna-se
muito vulnervel degradao.
As tcnicas de extrao em sua maioria visam produo de um concentrado bruto, no
qual a bixina, maior responsvel pela cor, encontra-se em baixa concentrao. A otimizao
de um processo de extrao de fundamental importncia e visa no s aumentar o
rendimento como tambm minimizar a contaminao com subprodutos de decomposio.
Pesquisas da cintica de oxidao da bixina e seus ismeros, a otimizao das condies de
processamento do pigmento do urucum em diferentes temperaturas e concentrao de lcali,
como tambm a influncia do teor de gua na reduo da estabilidade tm sido realizadas.
Os processos atuais em uso no Brasil destinados ao processamento da semente de
urucum baseiam-se na extrao mecnica e/ou empregando solventes como: leos vegetais,
para a produo de extratos lipossolveis; soluo alcalina, para o extrato hidrossolvel ou
ainda os solventes orgnicos como: acetona, etanol, hexano, propilenoglicol ou clorofrmio.
Alguns dos extratos obtidos com estes solventes so normalmente processados na forma de
pasta ou em p, aps a eliminao do solvente. Em todos os casos trata-se de produto onde a
CAPTULO 1 INTRODUO
bixina encontra-se misturada a outros componentes extrados da semente, resultando em um

produto de baixo valor agregado.
O desenvolvimento de tecnologia que conduza no s a extrao do pigmento bruto,
mas principalmente que leve obteno de bixina de elevada pureza, conjugada a sua
estabilizao de fundamental importncia para agregar valor ao produto. Disponibilizar no
mercado bixina de elevada pureza significa maior competitividade, e certeza de expanso
comercial ao atender aos segmentos de maior tecnologia, como as indstrias farmacuticas.
A comprovada ao antioxidante de alguns carotenides tem intensificado o nmero
de pesquisas no sentido, no s de obter produtos derivados que possam ter suas propriedades
potencializadas, mas tambm a busca de alternativas para ampliar sua produo.
Experimentos efetuados com a associao por simples mistura de cido ascrbico e outros
compostos antioxidantes, tocoferol, por exemplo, tm sido realizados, indicando efeito
potencializado na inibio dos processos de auto-oxidao lipdica.
A sntese de derivados semi-sintticos da bixina vem sendo pesquisada, com vistas a
oferecer ao mercado uma nova gerao de antioxidantes mais eficazes, como tambm
frmacos, destinados a aplicaes especficas, como por exemplo, na composio de drogas
antitumorais, fotoprotetoras entre outras.
A busca por compostos naturais para aplicao no tratamento de doenas
degenerativas como o cncer tem despertado a ateno de muitos pesquisadores. Alguns
fitoterpicos tm sido empregados como agente fotoprotetores em tratamentos radioterpicos
devido as suas propriedades antioxidantes. A bixina figura em algumas pesquisas relacionadas
a aplicaes farmacolgicas por apresentar um grande potencial antioxidante.
Atravs do desenvolvimento do presente projeto sero determinados parmetros de
solubilidade da bixina e norbixina em diferentes solventes, assim como as fases do processo
que permitiro a melhor separao da bixina via cromatografia. Estes resultados permitiro
embasamento de novas tecnologias. A importncia do desenvolvimento tecnolgico neste
setor possibilitaria para o Brasil um aumento de divisas, visto que a semente exportada como
produto agrcola tem um valor comercial muito baixo e a bixina purificada tem elevada
cotao no mercado internacional. Considerando ainda que o pas o terceiro exportador
mundial da semente in natura, a oferta de produto tecnologicamente processado poderia
aumentar sua competitividade comercial.
CAPTULO 1 INTRODUO
A tcnica de separao a ser adotada, separao por cromatografia flash, envolver

ajustes dos parmetros operacionais, trazendo em conseqncia melhor entendimento dos
fenmenos nela envolvidos.
CAPTULO 1 INTRODUO
OBJETIVO
OBJETIVO GERAL
O presente trabalho teve como objetivo principal o estudo e desenvolvimento de um
processo para a obteno de bixina com elevada pureza, a partir de semente de urucum, como
tambm determinar as melhores condies de controle para sua otimizao.
OBJETIVOS ESPECFICOS
Para que o Objetivo Geral fosse atingido, os seguintes objetivos especficos foram
definidos:
Avaliar a influncia do leo presente na semente sobre o processo de purificao da
bixina;
Determinar um processo de pr-tratamento da semente com o objetivo de otimizar a
extrao do pigmento, e que favorecesse a obteno de concentrado adequado aos processos
posteriores de purificao e emprego da bixina;
Avaliar a solubilidade da bixina em diferentes solventes;
Adequar o processo analtico para determinao de pequenas quantidades de bixina;
Preparar um padro de bixina para referncia nos procedimentos analticos;
Obter por recristalizao bixina purificada para ser usada como referncia no
monitoramento das fraes obtidas nos processos de separao;
Avaliar os parmetros de eluio na coluna preparativa para isolamento e purificao
de bixina proveniente de um concentrado enriquecido de bixina;
O presente trabalho est dividido em mais seis captulos, alm deste conforme descrito
a seguir:
CAPTULO 1 INTRODUO
Captulo 2- Reviso Bibliogrfica.

Neste captulo so abordados aspectos relacionados aos corantes, suas principais
aplicaes, caracterizao dos principais compostos do urucum, tcnicas de extrao e
separao da bixina contida no pigmento, assim como aspectos analticos e tambm, aqueles
voltados adsoro e cromatografia, como conceitos e fundamentos pertinentes a esta tcnica.
Captulo 3- Material e Mtodos
So descritos neste captulo os procedimentos operacionais, a metodologia analtica
empregada para o monitoramento dos experimentos, como tambm aqueles constantes na
literatura. Consideraes iniciais antecedem a descrio de algumas metodologias, no sentido
de mostrar os motivos que levaram a elaborao de alguns ensaios realizados.
Captulo 4 - Resultados e Discusso.
Aqui sero relatados os resultados obtidos e que serviro de base para dar
continuidade a futuros trabalhos. Ao final dos ensaios individuais, ou conjunto de resultados
so discutidos aspectos relacionados s observaes obtidas dos experimentos.
Captulo 5 - Concluses e Sugestes para Trabalhos Futuros
Neste captulo sero apresentadas as concluses e sugestes para trabalhos futuros.
Captulo 6 - Bibliografia
CAPTULO 2 REVISO BIBLIOGRFICA
CAPTULO 2 - REVISO BIBLIOGRFICA
2.1 ADITIVOS NATURAIS E SUAS APLICAES.
A incorporao de substncias como aromatizantes, antiespumantes, antioxidantes,

flavorizantes e espessantes na composio de formulaes industriais freqente em muitos
processos produtivos. Existe atualmente nas indstrias de alimentos uma forte tendncia pela
substituio de corantes e aditivos sintticos por produtos naturais, por serem estes
considerados seguros e menos susceptveis a efeitos adversos como alergias e ocorrncia de
danos sade. Os corantes obtidos do urucum destacam-se neste cenrio por apresentarem
um amplo espectro de aplicao. Neste trabalho, a reviso da literatura enfocou
particularmente duas grandes frentes, pela sua importncia e especificidade. Na primeira, as
aplicaes na rea da indstria de alimentos, principalmente como corantes e mais
recentemente pelo seu potencial como antioxidantes. Na segunda, as aplicaes mdicofarmacuticas da bixina fazendo uso do seu poder antioxidante no tratamento de enfermidades
causadas pela ao de substncias oxidantes prprias do metabolismo ou externas a este. A
seguir apresentada uma breve reviso bibliogrfica nestas duas frentes.
2.1.1
PESQUISAS NA REA DA INDSTRIA DE ALIMENTOS.

A fabricao e o preparo de alimentos tm se modificado muito ao longo dos anos,
particularmente nas ltimas trs dcadas. No passado, os alimentos provinham da regio onde
eram produzidos ou de regies muito prximas. Atualmente muitos alimentos produzidos em
regies longnquas necessitam freqentemente de aditivos para manter a sua qualidade. Alm
disso, a variedade e a apresentao dos alimentos so preocupaes constantes das indstrias
alimentcias. Estes fatores tm motivado as indstrias de alimentos a utilizarem quase que
exclusivamente agentes qumicos para conservar, colorir ou aromatizar os alimentos, com
objetivo de atrair cada vez mais os consumidores (Antunes e Arajo, 2000).
Depois da segunda guerra mundial, com o surgimento dos derivados sintticos, um
grande nmero de corantes obtidos de fontes naturais foi substitudo. Da mesma forma, o
emprego de conservantes e aromatizantes sintticos apresentou um grande crescimento.

Diferente dos corantes naturais, seus sucedneos sintticos possibilitam fcil padronizao,
associado ainda a uma maior disponibilidade. Entretanto, a utilizao de corantes artificiais
nos alimentos tem sido questionada, especialmente pelo uso de compostos derivados de
petrleo (Da Silva et al., 1987; Rosalen et al., 1991). Na dcada de 70 pesquisas constataram
que muitos dos corantes sintticos empregados na indstria apresentavam-se como potenciais
causadores de doenas degenerativas como cncer (Sandi et al., 2003).
A crescente divulgao quanto aos efeitos nocivos destes corantes tem contribudo
para a substituio por produtos naturais. Em 1990, o FDA proibiu o emprego de alguns
daqueles corantes nos Estados Unidos, por exemplo, o corante Red Dye no 3. Restries
similares tambm foram impostas na Europa, proibindo-se o uso para o consumo humano
(Sandi et al., 2003; Robbins, 1995). Esta mudana por parte de rgos governamentais muito
tem contribudo para o retorno e conseqente aumento da demanda dos produtos naturais.
Os produtos naturais por serem constitudos de uma mistura de numerosos compostos
de estrutura complexa so freqentemente mais caros, isto porque requerem etapas de
concentrao e purificao normalmente mais elaboradas,. Outro aspecto que tambm
contribui para seu elevado valor deve-se a reduzida concentrao normalmente presente na
sua matriz de origem, o que acarreta seu elevado preo.
Uso como corante.
Os principais corantes naturais de aplicao na indstria de alimentos so: os
carotenides, as antocianinas, a clorofila, a riboflavina, as betalanas e os caramelos. Outro
grande grupo de corantes que tem se destacado devido aos benefcios que trazem a sade, face
comprovada ao antioxidante que apresentam so os flavonides. Deste grupo, as
antocianinas existem em uma ampla variedade de cores, seja; em tons de azul, magenta e
prpura, ou ainda tonalidades que vo do vermelho ao amarelo. J foram, identificadas mais
de 250 diferentes antocianinas. Contudo, apenas um pequeno nmero delas so usadas como
aditivos em alimentos. So normalmente corantes cuja cor bastante influenciada pelo pH.
Diferentemente das antocianinas, nas betacianinas e betaxantinas a cor estvel numa
faixa de pH de 4,0 a 7,0. As primeiras so vermelhas enquanto as ltimas amarelas. A
betalana extrada da beterraba, por outro lado apresenta-se como uma outra classe de corante
natural, a qual sensvel ao oxignio e a luz (Kuntz, 1998).
10
Emprego como conservante.

A associao de carotenides com outros compostos antioxidantes tem-se mostrado
eficaz na conservao de leos ou emulses. Haila et al.(1996); Gordon e Sotirios (2003)
pesquisaram o efeito de diversas associaes de tocoferis e carotenos concluindo que a
combinao de lutena e gama tocotrienol foi mais eficaz que o emprego isolado de gama
tocoferol na inibio da formao de hidroperxido no processo de auto-oxidao de
triglicrideos. Da mesma forma a associao da bixina com o referido tocol mostrou-se
igualmente eficaz.
Gordon e Sotirios (2003) pesquisaram as propriedades antioxidantes de alguns
carotenides e o sinergismo destes compostos com outros antioxidantes na conservao de
leos comestveis e suas emulses. Observaram que a norbixina associada ao e tocoferol
aumentou a ao antioxidante destes tocis na conservao do leo de oliva. Sugerem ainda,
que a presena do grupo carboxlico na molcula da norbixina pode contribuir para retardar a
auto-oxidao ao complexar ons metlicos pr-oxidantes ou outras espcies de iniciadores
polares. Tambm, que os carotenides que contm oxignio como grupo polar so melhores
antioxidantes que aqueles hidrofbicos.
2.1.2
PESQUISAS NA REA DA SADE (MDICO-FARMACUTICA)

Oxidao e o metabolismo celular.
Os organismos aerbios empregam o oxignio para gerao de energia em seus
diversos metabolismos. O processo bioqumico de produo de energia no interior da clula

ocorre via oxi-reduo. Cerca de 95 a 98 % do oxignio absorvido pelo processo de
respirao usado para produzir energia (ATP), porm 2 a 5% tornam-se radicais livres como
os superxidos ou perxidos, decorrente da reduo incompleta do oxignio.
Em condies saudveis a natureza dotou o organismo humano com um enorme
potencial antioxidante por meio de vrias enzimas e vitaminas. Um desequilbrio a favor dos
oxidantes em relao aos antioxidantes conduz ao stress oxidativo.
Entre os antioxidantes presentes no plasma sanguneo, a bilirrubina, os cidos rico e
ascrbico so considerados os principais, alm da ao de protenas como a albumina. A
bilirrubina, antioxidante muito eficaz especialmente na membrana celular, consome dois
11
radicais hidroperxidos sendo oxidada a biliverdina que posteriormente reduzida

regenerando bilirrubina. Contudo, quando ligada albumina, a bilirrubina cerca de dez
vezes menos eficiente que a vitamina C, esta, muito eficaz no bloqueio de perxidos
hidrossolveis. A albumina se destaca pela sua capacidade de ligar-se aos ons do cobre
prevenindo a peroxidao lipdica como tambm protege importantes estruturas como os
grupos sulfdricos de membranas das clulas endoteliais e eritrcitos.
O cido rico produzido no catabolismo das purinas elimina os radicais superxidos
como tambm intermedirios oxigenados do hemo com alto estado de valncia do ferro e
adicionalmente prevenindo a oxidao do cido ascrbico. Segundo Aguilar Silva et al.
(2002), diferentes mecanismos de defesa esto presentes nos distintos organismos vivos,
Antioxidantes no combate ao stress oxidativo.
Vrios estudos tm sido realizados no sentido de avaliar o potencial protetor de
compostos antioxidantes relacionados aos efeitos nocivos da oxidao. Durante os processos
bioqumicos, espcies reativas de oxignio e outros radicais com alta energia so s vezes
formados. Estes, uma vez presentes, podem interagir com vrios constituintes das clulas,
incluindo lipdios, carboidratos, protenas e DNA, causando a perda de suas funes
especficas na clula.
Fontes externas de radicais livres e fatores ambientais podem tambm iniciar um
processo de stress oxidativo sobre as clulas e tecidos humanos. Dentre estes fatores podem
ser citados; exposio a produtos qumicos, radiaes, esforo e poluentes. As clulas
possuem seus prprios sistemas naturais de defesa efetuados por enzimas como a superoxiredutase, glutationa-peroxidase e a catalase, as quais neutralizam e destroem estes erros de
alta energia provenientes do metabolismo oxidativo. Segundo Bast et al. (1998), os
antioxidantes, entre os quais alguns carotenos, atuariam de forma a combater os referidos
radicais livres.
Produtos naturais como fontes de antioxidantes.
Diversos produtos naturais so reconhecidos por possurem caractersticas
antioxidantes, razo pela qual, tm sido bastante empregados seja na conservao de
alimentos ou na formulao de frmacos. J h mais de 50 anos, substncias antioxidantes
tm despertado interesse pelo seu potencial em reduzir os danos celulares causados por
12
radiao ionizante. Tradicionalmente os radioprotetores so definidos como agentes

administrados antes da exposio, enquanto os agentes teraputicos so administrados aps a
exposio (Weiss et al., 2003).
Segundo os autores a aplicao com esta finalidade, para varias situaes de exposio
humana no tm sido muito explorada. Estes pesquisadores fizeram um levantamento da
eficincia de diversos antioxidantes endgenos, especificamente nutrientes antioxidantes e
fitoqumicos, avaliando a especificidade de cada grupo seja, no tratamento profiltico durante
radioterapia de cncer, ou mesmo como preventivo.
Muitos so os compostos naturais com potencial oxidante, entre eles destacam-se:
polifenis, tocotrienis e tocoferis (vitamina E); alguns aminocidos, com destaque para a
cistena, primeiro antioxidante estudado em vivo como protetor contra radiao ionizante; a
vitamina C, como tambm os flavonides e os fitoqumicos. Ainda, dentre estes se incluem os
carotenides, do qual fazem parte a bixina, o licopeno, a astaxantina e a vitamina A, aos quais
se tm dado grande enfoque nos dias atuais.
Weiss et al. (2003) fizeram um levantamento de inmeras substncias potencialmente
antioxidantes, dentre elas encontra-se a bixina. Outras aplicaes farmacolgicas so citadas
como, por exemplo, o emprego destas substncias como agentes foto protetores utilizadas em
tratamentos radioterpicos.
Carotenides como antioxidantes.
Pesquisas mdicas tm mostrado que a grande ingesto de vegetais est associada com
a reduo dos riscos de doenas degenerativas, como cncer e doenas cardiovasculares.
Sendo os vegetais a maior fonte de carotenides e devido ao seu potencial antioxidante, os
benefcios que estes compostos trazem dieta alimentar tm sido temas de estudo de muitos
pesquisadores.
consistente a hiptese dos benefcios associados ao consumo de vegetais e a reduo
dos riscos de enfermidades crnicas relacionadas ingesto de uma dieta de carotenides,
reportam Qing et al. (2002), aps examinarem diversas pesquisas.
13
Embora nem todos os estudos tenham mostrado evidncias, muitas destas pesquisas
observaram uma indireta relao entre a concentrao de carotenos no plasma sangneo e os
riscos de doenas cardiovasculares e mortalidade pelo cncer. Alm disso, os autores
reportam que o efeito protetor contra cncer de pulmo foi observado para um elevado
consumo de tomates, alface, cenoura, margarinas e queijo.
Segundo Lima et al. (2003), o efeito antioxidante da bixina e norbixina tem
importncia na preveno de aterosclerose. Uma vez que as leses aterosclerticas iniciam-se
aps algum tipo de leso no endotlio, cujo dano causado principalmente pela lipoprotena
LDL oxidada, a inibio da oxidao, resulta na proteo do endotlio.
Lima et al. (2001) induziram hiperlipidemia em coelhos, com uma dieta contendo
colesterol. Acrescida a esta rao, foram testados os carotenides bixina, norbixina e o
flavonide quercetina, todos provenientes de urucum. Aps 28 dias de tratamento, foi
determinada dosagem sorolgica para determinao do colesterol de alta densidade o High
density lipoprotein (HDL) e triglicerdeos. Concluram os autores que a bixina, apresentou a
maior reduo de colesterol (40 %), em relao ao padro, superior reduo obtida com a
norbixina (25,35 %) e quercetina (35,07 %). Observaram ainda que a bixina apresentou a
menor reduo do HDL, sendo isto uma vantagem, visto que o HDL transporta o colesterol da
circulao sangnea para o fgado, onde metabolizado.
A administrao oral de bixina (200 mmol / Kg de peso) a ratos submetidos a uma
radiao (1,5 a 3,0 Gy) mostrou eficcia na inibio dos efeitos causados pela radiao, no
acarretando aberraes cromossmicas nas cobaias estudadas, desempenho comparvel ao
alfa-tocoferol j consagrado para esta finalidade. Tambm foram testados a curcuma e o cido
elgico (Threziamma et al., 1998).
Zhang et al. (1991) estudaram o efeito de inibio da peroxidao, avaliando alguns
carotenos, entre estes, o beta-caroteno, a castaxantina, a lutena, o alfa-tocoferol, o licopeno e
a bixina, constatando a eficcia na inibio dos conseqentes efeitos de transformaes
neoplsticas induzidas quimicamente. De todos os carotenides testados, o alfa tocoferol foi o
mais ativo inibidor da peroxidao lipdica, seguido pela bixina.
Albanes e Hartman (1999) reportam que recentes revises de dados epidemiolgicos
mostraram a existncia de uma estreita relao inversa entre o consumo de frutas e vegetais
14
ricos em carotenides e a incidncia de casos especficos de cncer de pulmo, esfago,

estmago, colo-retal, cervical e de garganta.
2.2 ESTABILIDADE DOS CORANTES NATURAIS
Diferentemente dos corantes sintticos, alguns corantes naturais so oxidados

facilmente, potencializando assim sua ao antioxidante na mistura. Dentro deste grupo os
carotenides so extremamente reativos e conseqentemente instveis devido a sua longa
cadeia de duplas ligaes conjugadas QING et al., (2002). Fatores como luz, calor e oxignio
potencializam processos de degradao (Najar et al.,1988).
O pH tambm afeta a estabilidade de muitos corantes naturais, da mesma forma que a
presena de determinados ons metlicos com reconhecidas caractersticas catalticas, como
ferro, alumnio, cobre ou mesmo magnsio, cuja ao cataltica menor. Estes catalisadores
podem aumentar a taxa de decomposio de alguns pigmentos, acarretando em conseqncia
a perda de colorao. Os carotenides particularmente so extremamente susceptveis a estes
efeitos (Kuntz, 1998).
A reduzida estabilidade dos produtos naturais se deve em parte funo que
desempenham no metabolismo do organismo vegetal ou animal onde esto presentes. Desta
forma, muitos compostos esto em constante transformao, em resposta a fatores externos
como luz, calor oxignio entre outros.
Speranza et al. (1990) estudaram a interao entre o oxignio singleto e
apocarotenides, entre eles a bixina, norbixina e seus ismeros. Reporta a autora que este
estudo de fundamental relevncia para entender os mecanismos de ao que desempenham
estes compostos na fotossntese dos carotenides, como tambm no seu efeito foto-dinmico.
Este estudo foi realizado pelo monitoramento espectrofotomtrico da soluo de diferentes
apocarotenides, mantida a uma temperatura constante de 35o C, na presena do 3,4-(4-metil1-naftil) cido propinico 1,4 endoperxido, empregado como gerador de oxignio singleto,
alternativo ao fotoqumica. Esta escolha foi tomada no sentido de evitar reao
fotoqumica paralela, como a trans-isomerizao.
15
2.3 CAROTENIDES
Os carotenides so uma extensa classe estrutural de compostos caracterizados pela

presena de uma cadeia polinica conjugada. As variaes estruturais encontram-se na
extremidade da cadeia podendo apresentar anis ou terminao polinica. Na Figura 1
apresentada a estrutura central polinica, a seqncia de unidades terpenides e algumas das
mais comuns terminaes de cadeia encontradas nos diversos carotenides, Schwartz , 2003.
Figura 1- Estrutura bsica dos carotenides. Fonte: Schwartz ,2003.

Os carotenides so usualmente tetraterpenides C40 constitudos de oito unidades
isoprenides, C5, unidas. A estrutura linear bsica simtrica e pode apresentar-se com uma
ou ambas as extremidades cclicas. Nestes compostos, as unidades de isopreno, apresentam no
meio da molcula, nas posies 1:6, dois grupamentos metlicos, enquanto todos os outros
16
grupos metlicos da cadeia lateral ocupam a posio 1:5. Ciclisao e outras modificaes,
tais como: hidrogenao, desidrogenao, migrao da dupla, reduo ou extenso da cadeia,
rearranjo, isomerizao, introduo de funo oxigenada ou combinao destes processos do
origem a um extenso nmero de estruturas. Suas distintas caractersticas devem-se a presena
das ligaes duplas conjugadas na cadeia, que servem como absorvedores cromforos de luz e
que, atribuem a estes compostos cores que variam do amarelo ao vermelho (RodriguezAmaya, 2001).
2.3.1 BIOSNTESE DOS CAROTENIDES

As unidades isoprenides formam a estrutura bsica de todos os terpenides, dos quais
fazem parte os carotenides. A associao desta matriz monmero leva formao de
compostos C10, C15, C20. A dimerizao do composto C20 leva ao fitoeno (C40), o primeiro
composto da famlia dos carotenos. As transformaes sucessivas, como tambm as provveis
rotas de formao dos inmeros carotenos encontram-se esquematicamente representadas na
Figura 2, onde a reao (1) corresponde (1) desaturao, (2) ciclisao, (3) hidroxilao, (4)
epoxidao, (5) rearranjo epxido-furanxido.
17
Figura 2 - ltimos estgios da biosntese de carotenides e suas possveis

transformaes. Fonte: Rodriguez Amaya, 2001.
2.3.2
OCORRNCIA DOS CAROTENIDES-DISTRIBUIO NA NATUREZA

Mais de 700 carotenides j foram identificados e esto amplamente distribudos no
reino vegetal e animal. Podem conter somente carbono e hidrognio como os carotenos e o
licopeno, ou ainda oxignio como as xantofilas, a exemplo da capsantina na pprica; a
zeaxantina e a lutena do milho. Os carotenides representam uma extensa famlia de produtos
naturais. So encontrados nos cloroplastos das plantas fotossintticas, nos cromoplastos das
flores, frutos e folhas, como tambm em bactrias, fungos, algas e insetos, Chaudhry, 2003.
Como as plantas sintetizam continuamente os carotenides, estes esto normalmente
acompanhados de pequenas quantidades de alguns dos seus precursores biosintticos, os quais
ocorrem freqentemente associados aos derivados do componente principal. A fucoxantina
o mais abundante carotenide encontrado na natureza, pelo fato de estar presente em algas
fotossintticas encontradas em grande quantidade nos oceanos.
Embora os animais sejam incapazes de sintetizar os carotenides, estes so
normalmente encontrados em algumas espcies, como resultado de sua dieta, podendo
18
encontrar-se seletivamente absorvido e acumulado de forma inalterada ou levemente

modificado. A astaxantina o principal carotenide responsvel pela cor de alguns peixes
como o salmo e a truta, estando presente tambm em crustceos como o camaro, a lagosta e
o caranguejo. Por outro lado a tunaxantina o carotenide que se encontra em maior
quantidade nos outros peixes. Os carotenos, ecnenone e castaxantina, encontrados em menor
quantidade, so provenientes de transformaes intermedirias na dieta destes animais,
Rodrigues-Amaya, 2001.
2.3.3
FUNO DOS CAROTENIDES

Os carotenides so fundamentais na dieta dos animais. Em vrios mamferos eles
participam dos processos bioqumicos a exemplo da converso do beta caroteno em vitamina

A, Fontana et al., 1997.
A presena de carotenides nas plantas sempre despertou a ateno de pesquisadores.
Karrer e Jucker, (1950) destacaram a existncia de muitos estudos, entre estes a possvel
associao dos carotenides com os mecanismos de respirao das plantas. As pesquisas
mostravam uma constante proporo entre os carotenides (caroteno e xantofila) e a clorofila
nas folhas das plantas, suspeitando-se da que estes atuavam como filtro para a clorofila.
Nenhum resultado, entretanto, foi conclusivo neste sentido.
A atuao dos carotenos como sendo transportadores de oxignio, tambm foi
explorada, visto a existncia de um grande nmero de carotenides epxidos presente nos
tecidos celulares. Contudo, poucos resultados foram conclusivos na ocasio. Hoje sabido
que, nas plantas, os carotenides funcionam como pigmentos absorvedores de luz,
transferindo esta energia para a clorofila no mecanismo da fotossntese. Os carotenides
tambm agem como filtros de radiao ultravioleta, protegendo as plantas da foto-oxidao,
prevenindo as clulas de danos provocados pelo oxignio singleto. Ainda, em situaes de
stress ou ferimentos, ou sujeitos a severa exposio luz, estes compostos protegem as
plantas de futuras infeces ou dano oxidativo (Chaudhry ,2003).
Segundo Rodrigues-Amaya (2001), a caratogenesis que ocorre nos frutos e vegetais,
durante o processo de maturao acompanhada pela decomposio da clorofila enquanto os
cloroplastos so transformados em cromoplastos. A simples transformao de um cloroplasto
d lugar a um aumento expressivo na quantidade e nmero de carotenides. Nas folhas verdes
19
ocorrem muitos carotenides hidroxilados livres e nos frutos maduros os carotenides

encontram-se normalmente esterificados com cidos graxos. No entanto no Kiwi, o carotenol
permanece livre mesmo aps a maturao do fruto (Rodrigues-Amaya, 2001).
Uma extensa relao de fontes naturais; plantas, animais, vertebrados e invertebrados
e alguns carotenides neles identificados so apresentadas por (Karrer e Jucker, 1950).
No ser humano reportado existir uma relao inversa ao risco de cncer associado
presena na dieta, de determinados carotenos como o licopeno e -carotenos, identificado
com freqncia em tecidos e rgos como: tireide, fgados, rins, corao, testculos, tecido
adiposo e pncreas, e que a lutena e a zeaxantina acumuladas na retina atuam
fundamentalmente como fotoprotetores das clulas contra radicais originados do oxignio
pela ao da luz (Qing, 2002).
2.3.4 APOCAROTENIDES
Um grupo derivado dos carotenides, os apocarotenides, oriundo da clivagem
oxidativa dos carotenos. Algum destes carotenides tem elevado valor econmico como
pigmentos ou por incorporar sabor ou aroma aos alimentos. Segundo Schwartz et al. (2001) as
plantas produzem um grande nmero destes compostos que tem entre outras provveis
funes atrair insetos. A formao dos apocarotenides deve resultar de mecanismos no
especficos tais como: co-oxidao, lipoxigenase ou foto-oxidao. Enzimas capazes de
romper os carotenides em pontos especficos da molcula esto provavelmente envolvidas na
sntese de um grande nmero destes compostos.
Cada dupla ligao em um carotenide suscetvel oxidao. A cada ruptura e
conseqente oxidao de uma ligao dupla, dois novos carotenos (apocarotenides) so
gerados. A Figura 3 exemplifica a oxidao de um caroteno simtrico como o -caroteno.
Neste caso, existem nove possveis produtos formados, como resultado do rompimento e
conseqente oxidao de uma nica ligao dupla.
20
Figura 3- Degradao oxidativa do caroteno (ciso oxidativa), Fonte: Schwartz (2003).

Outro exemplo da ruptura oxidativa citada anteriormente apresentado na figura 4 que
mostra a produo do pigmento crocina a partir da degradao da zeaxantina. A cor vermelha
alaranjada caracterstica do aafro devida ao apocarotenides, crocina. Os produtos de
clivagem derivados das extremidades so convertidos a picrocrocina e ao safranal (C10) que
so componentes importantes do sabor e do aroma do aafro.
21
H3C
H3C
CH3
CH3
HO
CH3
Zeaxantina
CH3
OH
CH3
H3C
CH3
CH3
Reao
de
clivagem,
carbonos 7,8-7,8
H3C
CH3
O O
CH3
CH3
Safranal
CH3
H3C
H3C
OH
CH3
O
O
OH
H3C
CH3
CH3
CH3
Picrocrocina
H3C
CH3
Crocetina
HO
H3C
Gli-Gli
Gli-Gli
Crocina
CH3
Figura 4 - Provvel rota de formao da crocina via ciso oxidativa da molcula da

zeaxantina, Fonte: Bouvier (2003).
Na Figura 5 mostrada a rota de biosntese do locopeno, precursor na biosntese da
bixina.
22
Difosfato de farnesila
H 3C
CH3
H 3C
CH3
fitoeno
H 3C
CH3
H3 C
CH3
H3 C
CH3
CH3
CH3
CH3
Fitoflueno
CH3
CH3
H 3C
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
-caroteno
CH3
H 3C
CH3
CH3
CH3
CH3
Caroteno 7,8- desnaturase
CH3
CH3
CH3
Neurosporeno
CH3
CH3
H 3C
CH3
CH3
CH3
CH3
Caroteno7,8'-desnaturase
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
H 3C
Licopeno
CH3
CH3
CH3
CH3
Figura 5 - Rota de biosntese do licopeno - enzima carotene7, 8-desnaturase.

Fonte: Schawartz (2003).
2.3.5 ISOMERIZAO
Os carotenides devido intensa insaturao esto sujeitos no s a oxidao, mas
tambm isomerizao. Calor, luz, cidos ou adsoro em superfcies ativas promovem a
isomerizao da forma cis, para a configurao mais estvel, a forma trans. Segundo Karrer e
Jucker (1950), a isomerizao pode ocorrer pelo refluxo com um solvente, fuso dos cristais,
23
tratamento com iodo ou com cidos ou ainda pela ao da luz. Alguns efeitos normalmente
observados em decorrncia da isomerizao so relacionados abaixo:
Reduo da intensidade da cor;
Aumento da solubilidade;
Aumento do ponto de fuso (compostos cis apresentam menores pontos de

fuso que os correspondentes trans);
Menor coeficiente de absortividade (os coeficientes de extino molar dos

compostos cis so menores que dos seus correspondentes trans);
Os produtos de isomerizao so freqentemente caracterizados pelo

aparecimento de um novo pico na regio do UV;
Deslocamento da banda de absoro (o ismero trans absorve em um

comprimento de onda maior que seu precursor). Obs. Estes ensaios so citados
para uma srie de 18 carotenos, entre eles a Bixina em CS2, (Karrer & Jucker,
1950). Por exemplo, a soluo de bixina no referido solvente absorve nas
respectivas regies espectrais: (Trans-em 526,5 nm, e Cis-em 523,5 nm).
2.4 BIXINA
A cis-bixina (monometilster do dicido carboxlico (norbixina) o constituinte que

ocorre em maior concentrao no arilo da semente do urucum (Bixa orellana L.),
representando cerca de 80% da bixina presente. Alm do ismero cis (metil-hidrognio 9-cis6,6diapocaroteno 6,6dioato), tambm est presente a forma trans, sendo este mais estvel
que o ismero cis. A trans isomerizao acontece parcialmente quando o pigmento
submetido a processo de aquecimento (Galindo-Cuspinera, 2002).
Quando submetida hidrlise em meio alcalino, a bixina perde uma molcula de
metanol produzindo a norbixina, pigmento de cor vermelho intensa.
A bixina foi citada pela primeira vez em 1825 por BOUSSINGAULT, sua cristalizao
foi obtida com sucesso em 1878 por ETTI, a anlise elementar e determinao de sua frmula
emprica foram realizadas em 1917 por HEIDUSCHKA
PANZER e em 19281933 KUHN e
colaboradores prepuseram a frmula estrutural a qual foi confirmada posteriormente por

KARRER e colaboradores atravs da sntese total da per-hidronorbixina (Karrer e Jucker,
1950).
24
So poucos os carotenides carboxlicos conhecidos. Alm da bixina, foram

identificados a crocetina, nas flores (estames) do aafro (Crocus sativus L.), uma iridceae e
a azafranina na raiz do aafro da terra (curcuma longa) uma zingeberceae (Karrer e Jucker,
1950; Jaramilo, 2003). Os pigmentos extrados destas espcies, da mesma forma como
aqueles do urucum tm grande aplicao na indstria de alimentos.
Segundo Jondiko e Patteenden (1989), a bixina foi o primeiro cis carotenide isolado a
partir de fontes naturais. Fazem parte ainda da famlia relativamente pequena dos
apocarotenides naturais cuja formao se d via degradao oxidativa dos carotenides C40: a
crocetina, o -apo-10-carotenal, a - citraurina e o cido abscssico.
Na Figura 6 so apresentadas as estruturas moleculares da cis e trans bixina, cis e trans
norbixina e o principal produto corado de decomposio (monometil ster do cido 4, 8,
dimetil tetradecahexaenediico) freqentemente designado por C17.
CH3
CH3
HO
Ismero trans
CH3
CH3
CH3
CH3
HO
CH3
Ismero cis
CH3
R
CH3
CH3
CH3
O
OH
Bixina
Produto de degradao (C17)

R = COOCH3
Norbixina
R = COOH
Figura 6 - Estrutura dos carotenides bixina e norbixina, cis e trans e do principal produto de
degradao. Fonte Scotter (1995).
A bixina indexada no Color index como CI No 75120, e pela Comunidade
Econmica Europia como EEC no E160b e CI Natural Color 4. (Marmion , 1991).
Na Tabela 1 so apresentados alguns dados referentes bixina e norbixina.
25
Tabela 1 - Dados e propriedades da bixina e norbixina.

No CAS
Cis Bixina
6983-79-5
Trans bixina
39937-23-0
Cis norbixina
626-76-6
Trans norbixina 542-40-5
Urucum
1393-63-1
PM
Frmula emprica
394,5 C25H30O4
380,5 C24H28O4
-------
Ponto de Fuso (oC)

198 (e); 189-190,5 (c); 196.8 (b); 217 (a)
204.0-206.6 (c); 216-217(d)
240 (c) decompe.
250 (c) decompe
(Lewis,1993); (b) ( McKeown., 1961); (c) (Reith & Gielen, 1971); (d) (Karrer & Junker,
1950); (e) (Lide, 1995); CAS Chemical Abstract Service.
2.5 ALTERNATIVA BIOTECNOLGICA PARA PRODUO DE

CORANTES
A biotecnologia pode ser um eficiente caminho para produo de corantes em grande

quantidade. A cultura de tecidos e plantas, fermentao e manipulao gentica tm sido
pesquisadas com freqncia com vistas produo de pigmentos. No entanto, extensivos
testes de segurana devem ser realizados antes que possam ser considerados seguros para uso
em alimentos. Os tecidos de plantas tm sido muito freqentemente estudados como
alternativa para a produo de pigmentos.
Carotenides, antocianinas e betalanas j tm sido produzidos em cultura de clulas de
plantas, entretanto, a produo contnua aplicando-se as tcnicas disponveis atualmente
parece impossvel de ser colocada em prtica, pois muitos dos pigmentos no so excretados
pela clula, mas estocados dentro dela. At o momento nenhum pigmento grau alimentcio foi
produzido em grande escala por processos envolvendo cultura de clulas.
Algas celulares simples e fungos so as melhores opes para novos corantes
biotecnologicamente produzidos. Desenvolvimentos recentes tm sido realizados com treze
carotenos via fermentao em reator, pelo fungo Blakeslea trispora Collins e Downham
(2000). Outro exemplo desta nova vertente so os corantes monascus, vermelho e amarelo,
estveis ao calor, obtidos da fermentao de arroz pelo fungo Manascus purpureus e
Monascus anka. Contudo estes corantes no so permitidos nos Estados Unidos e na Europa,
pois podem conter compostos potencialmente txicos a exemplo da cumarina, produzida
durante o processo de fermentao.
26
A bixina, devido ao seu crescente consumo, tem despertado interesse de

pesquisadores, no sentido da busca por uma fonte alternativa para a sua produo. Embora o
mecanismo de biosntese desta substncia ainda no tenha sido elucidado. sustentado que o
carotenide C40, mais provavelmente o licopeno, seja o precursor da bixina. Com base na
estrutura similar entre a bixina e a crocetina, pigmento do aafro, a reao poderia envolver a
metil transferase e a dehidrogenase em uma srie de reaes precedidas seqencialmente pelo
licopeno. A suposta rota sustentada pela anlise de derivados de decomposio do licopeno
que se encontram acumulados em traos na semente do urucum.
A recente caracterizao de dioxigenases de plantas que atuam na ruptura de
cromforos carotenides tem reforado a hiptese da referida biosntese. J existem pesquisas
bem avanadas que conduzem produo de bixina via manipulao gentica. Cmara et al.
(2003) identificaram no vegetal trs genes responsveis pela produo de bixina. Devido
maior facilidade de manipulao gentica em organismos inferiores, foi testada a insero
simultnea dos trs genes em uma bactria (E. coli), geneticamente modificada, para produzir
licopeno. O xito alcanado determinou o passo seguinte, conseguir reproduzir esta rota de
biosntese em outro organismo. Sendo o tomate uma fonte rica em licopeno, a rota proposta
considera a insero de cada um daqueles genes em distintos tomateiros. Posteriormente,
atravs do cruzamento destas plantas poder-se-ia gerar novos tomateiros produtores de bixina.
CH3
CH3
27
CH3
CH3
CH3
H3C
Licopeno
CH3
Dioxigenase
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
H3C
CH3
CH3
Dioxigenase
CH3
CH3
CH3
CH3
H3C
O
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CHCH
3 4
Aldedo Oxidade/Dehidroxigenase
CH3
CH3
CH3
Aldedo Oxidade/Dehidroxigenase
CH3
CH3
CH3
CH3
HO
O
Norbixina
CH3
Carboxil Metiltransferase
HO
CH3
CH3
CH3
HO
Bixina
CH3
CH3
Figura 7 - Rota proposta da biosntese da bixina a partir do licopeno.

Fonte: (JAKO et al, 2002).
2.6 DERIVADOS SINTTICOS DE CAROTENIDES
Nas aplicaes farmacuticas a eficcia de atuao de uma droga pode ser

potencializada pelos seguintes fatores: aumento da transferncia de massa na membrana
celular, reatividade do princpio ativo e o potencial de reduo este, de fundamental
28
importncia na peroxidao lipdica, particularmente em relao aos danos causados s

clulas e tecidos pela foto-sensitizao provocada por radiao ionizante.
Alm do tocoferol (E = + 0,48V), os carotenides e polifenis se destacam como
importantes bloqueadores fisiolgicos de radicais livres. Os ascorbatos atuam com menor
potencial de reduo (E = + 0,23V) sendo, portanto mais eficientes na desativao do
oxignio singleto do que o tocoferol.
Experimentos mostram que a atividade antioxidante do cido ascrbico envolve
transferncia de hidrognio melhor que de eltron. Tanto os tocoferis quanto o cido
ascrbico apresentam atuaes similares como antioxidantes.
A natureza lipoflica dos tocoferis propicia fcil acesso s regies lipdicas das
membranas celulares e das lipoprotenas, condio no atendida pelo cido. Isto porque a
vitamina C muito solvel em gua, mas praticamente insolvel em hidrocarbonetos e
gorduras. Por outro lado, seus derivados anfiflicos podem ser facilmente dissolvidos tanto em
gua quanto em fases orgnicas. Considerando que a atividade como antioxidante, tanto do
cido ascrbico quanto dos seus derivados so praticamente as mesmas, fica evidente a
importncia de se produzir derivados lipoflicos (hidrfobos) do cido ascrbico (Lo Nostro,
1997).
Ainda, segundo a autora, estes compostos tm grande relevncia quando se destinam
s aplicaes como: reduzir os danos causados por radicais livres, conservao de alimentos,
drogas ou cosmticos. observado que: a especificidade e eficincia de atuao como
tambm a velocidade de absoro atravs da parede celular, so dependentes, entre outros
fatores, das caractersticas estruturais, assim como do tamanho da cadeia lipdica.
Neste sentido, a busca por compostos naturais destinados rea farmacutica e
aplicao como conservantes de alimentos tem merecido especial. A obteno de um ster,
derivado de bixina com o cido ascrbico, citado por Girardin et al. (2000), que conduziram
a. sntese, via catlise enzimtica, pelo emprego da lpase Cndida Antartica. Os autores
visualizam sua utilizao como potencial agente antioxidante, na mesma linha dos steres
graxos insaturados do cido ascrbico ou mesmo como os derivados do tocoferol, cujo
sinergismo de suas combinaes tem sido exaustivamente estudado.
29
Citam os autores que converso de 25% na reao de esterificao foi obtida quando
realizada presso atmosfrica e 50 % quando a presso do sistema foi reduzida para
200mbar. Os experimentos foram conduzidos 65o C por 144 h. A substituio da bixina pela
norbixina reduziu a converso de 50% para apenas 8%. A reao foi monitorada por Thin
Layer Chromatography (CCD) empregando placa de slica gel MERCK e fase eluente
composta de uma mistura de clorofrmio/ metanol /cido actico/gua 80: 10: 8: 2, tendo
apresentado os seguintes valores para o fator de reteno (Rf): 0,00 para o cido L-ascrbico,
0,36 para o ster de bixina, 0,8 para a norbixina e 0,94 para a bixina.
A obteno destes derivados tem sido conduzida no sentido de melhorar suas
caractersticas de solubilidade, estabilidade ou mesmo com vistas a potencializar seu carter
antioxidante de forma a melhor adequar sua aplicao para fins especficos. Tanto a bixina
quanto a norbixina apresentam baixa solubilidade na maioria dos solventes. A bixina
normalmente empregada para produtos com base lipdica, enquanto que em produtos com
base aquosa emprega-se freqentemente a norbixina.
Associao de substncias antioxidantes tm sido exploradas no sentido de otimizar a
ao do coquetel no tratamento de vrias enfermidades. Blot et al. (1993) verificaram a
eficincia da associao da vitamina E com o beta-caroteno e o selnio, atestando os
benefcios na reduo aos riscos de cncer. Atualmente existe no mercado uma associao
destes antioxidantes (POLYANTOX), comercializada como suplemento alimentar.
O emprego de mono e diteres de glicerina, tendo como radicais, compostos
antioxidantes tais como derivados do cido ascrbico ou derivados deste cido com cidos
graxos, a exemplo de palmitatos, tem sido empregado como conservante em leos, cosmticos
entre outros. Trine et al. (2001) sintetizaram um triglicerdeo contendo trs importantes
antioxidantes (atravs da reao do cido beta-apo-8-carotenico, cido selenocaprlico, um
derivado cido do tocoferol (Trolox) e a glicerina). A ligao covalente destes trs
antioxidantes, a um transportador fisiologicamente ativo como a glicerina poderia
potencializar a atividade deste novo antioxidante.
Fuhrhop et al. (1997) desenvolveram uma membrana polinica rgida fazendo reagir
um derivado de bixina, seu cloreto de cido com um derivado porfirnico, o meso-tetrakis (oaminofenol) porfirina. O monmero produzido foi ento polimerizado em soluo hidrometanlica atravs da irradiao por um perodo de 5 a 240 minutos, com uma lmpada de
30
tungstnio de 300 W. Reportam os autores que a membrana polimrica apresentava-se como

vesculas singulares, de espessura molecular e configurao esfrica, apresentando ainda
propriedades nicas. Sugerem os pesquisadores, que as vesculas aninicas, contendo quatro
cadeias laterais rgidas, compostas por cidos carotenicos, ligadas posio central,
diferentes derivados sensveis de base porfirnica, poderiam ser empregados em processos de
separao de cargas por induo pela luz, como receptor de eltrons externo. Segundo o autor
foram testados derivados de bixina e norbixina, com derivao no ncleo da porfirina, esta
derivada com zinco. Derivados de porfirina entre eles: a ciclo-guanidinporfirina; a
diaminoetil, tetrametil, bisdietilporfirina e a-aminofenilporfirina foram tambm avaliados.
Para tornar a bixina reativa, efetuou-se a converso no seu derivado, cloreto de acila, pela
reao prvia com cloreto de tionila em meio de tetrahidrofurano (THF).
2.7 URUCUM
Quando os conquistadores espanhis chegaram ao Novo Mundo conheceram muitas

plantas cujos extratos eram empregados pelos Maias e Aztecas. Uma destas plantas, o
urucum, existente ao longo da Amrica tropical era usado como extrato para tingir tecidos e
pintar o corpo, alm de ser utilizada junto vanilina na formulao de uma bebida a base de
cacau. O nome cientfico do urucum, Bixa orellana foi dado por Francisco Orellana, aps uma
expedio na regio na Amaznica Setentrional (Giuliano, 2003; Sandi et al., 2003).
A planta, (Bixa orellana L.) da famlia das Bixaceae recebe diferentes denominaes
populares ao redor do mundo: Urucu, urucum e aafroa (Brasil), atole, achiote e bija (Peru,
Colmbia e Cuba), achiote, bija, onoto (Venezuela), uruk (Paraguai), rocou e rocoyer
(Repblica Dominicana e Guiana francesa), rocuyer (Frana), changuaric, pumacu e Kuzub, (Mxico). Outras denominaes encontradas na literatura so: ua, eroy, chagerica,
orelana, ranota, annatto e lipstick (USA) (Sandi et. al., 2003; CATLOGO Rural, 2003).
um arbusto com altura entre 2,0 a 4,0 m, podendo atingir at 6,0 m dependendo das
condies de clima e idade da planta. Cresce em altitudes de at 1000m, contudo, desenvolvese melhor em zonas relativamente baixas, de 100 a 500m., suportando temperaturas de 24 a
35o C. Seus frutos so cpsulas ovides cachopas, cobertas por espinhos flexveis, em cujo
interior encontram-se de 30 a 50 sementes. Oriundo da Amrica Tropical acredita-se que
tenha sido uma das primeiras plantas domesticada pelos ndios da regio, provavelmente
31
para fins cerimoniais, a partir da Bixa excelsa, rvore silvestre da famlia das (Bixceae),
(Sandi et al., 2003; Vazquez-Yanes, 1999). A Figura 8 mostra flores, frutos e sementes de
urucum,
Figura 8: Fotos de urucum: A: fruto verde; B: cachopa com frutos maduros; C: em florao;
D: fruto aberto com sementes expostas.
Almeida et al. (1995) estudaram a micropopagao do urucuzeiro submetendo gemas
adventcias a diferentes concentraes de auxina. Segundo os autores, por serem as plantas
geralmente formadas a partir de sementes, no apresentam grande uniformidade nos plantios,
com variaes em relao ao teor de bixina, resistncia s pragas e produtividade. Devido
a isto, a micropropagao vegetativa aparece como mtodo vivel para obteno de lavouras
produtivas e uniformes uma vez que, constitudas de clones, herdam as mesmas caractersticas
genticas da planta matriz fornecedora do material propagativo. Apresenta ainda como
vantagem a gerao de milhares de plantas clonais, isentas de problemas fito-sanitrios,
podendo ainda ser multiplicado em qualquer poca do ano.
O urucum empregado com freqncia como condimento na culinria asitica,
africana e europia. Foram os espanhis os responsveis pela expanso do consumo deste
produto ao redor do mundo, o que levou a um aumento de sua produo j no sculo XIX.
Sua maior aplicao est concentrada na indstria de alimentos, onde empregado como
corante (Sandi et al., 2003).
Nos ltimos anos o potencial do mercado internacional do urucum teve um grande
impulso. Como o produto natural substituto para corantes sintticos, considerados
32
cancergenos, a proibio ao uso destes aditivos nos Estados Unidos, Japo e alguns pases da
Europa, fez com que o urucuzeiro ganhasse importncia nas regies produtoras, Almeida et
al. (1995). Atualmente, o urucum uma das maiores fontes naturais de corantes e pigmentos
vermelhos.
Entre os corantes naturais, o urucum figura como o segundo em importncia
econmica depois do caramelo (Mercadante et al., 1998). O cultivo do urucum destina-se
exclusivamente a comercializao do corante presente na semente, podendo chegar no
mximo a 4,5 % em massa, nas sementes de boa procedncia. A produo de pigmento,
contudo, deixa a semente como subproduto. Esta semente foi avaliada no sentido de tornar o
cultivo daquela espcie mais lucrativo, procurando, por exemplo, explorar a sua possvel
aplicao como rao animal.
Bressani et. al. (1983) conduziram estudos nesse sentido, efetuando anlises das
sementes com enfoque especial para seu valor nutricional. Os resultados revelaram: elevado
teor de fibras totais (16%); alto de teor de fsforo e baixo de clcio e elevada quantidade de
protena, (13 a 17 %), das quais, lisina e tripitofano em quantidades majoritrias e, em menor
quantidade: metionina, isoleucina, leucina fenilamina e treonina. O contedo total de protena
corresponde a cerca de 65 % daquele encontrado na casena, usada como referncia.
Reportam os autores, que a deficincia de aminocidos, particularmente metionina faz desta
farinha um produto de baixo valor biolgico. Tambm foi constatada a baixa digestibilidade
da protena, 57% comparada a 94 % para a casena. Sugerem os Autores que mais de 50% das
fibras podem ser eliminadas por peneiramento da farinha trazendo conseqentemente um
aumento da digestibilidade.
A colorao vermelha da semente est diretamente relacionada ao percentual de
bixina. Quanto maior a concentrao de norbixina, maior a tendncia para o amarelo. Tanto as
sementes, quanto os extratos processados so comercializados com base no teor de bixina ou
norbixina. As sementes da Jamaica, por exemplo, apresentam teores normalmente mais
elevados de bixina, 3% em mdia, contra menos de 2% daquelas produzidas na ndia. Por
outro lado, sementes provenientes do Caribe so intensamente vermelhas, o que eleva o seu
valor no mercado. A composio do extrato varia segundo o mtodo empregado no processo
de extrao e concentrao, visto que a bixina isomeriza com o calor, aumentando o
percentual de trans-bixina, como tambm, hidrolisa em meio alcalino dando lugar a norbixina,
(Robbins, 1995; REVISTA de Fitoterapia, 2003).
33
O consumo de urucum tem aumentado muito nas ltimas dcadas. Excludas as

demandas internas, o comrcio internacional mdio anual de urucum estimado em cerca de
10000 toneladas, sendo dois teros desta produo na forma de semente bruta e o restante
como extrato. A Amrica Latina produz 60 % de todo o urucum consumido no mundo,
seguido pela frica com 27% e a sia 12%. Os preos da semente dependendo da produo e
da variedade oscilaram de US$ 2000 a US$660 por tonelada entre 1985 a 1995. Estes preos
tambm so proporcionais ao contedo de bixina, o qual em alguns casos deve ser maior que
2,7 % (Giuliano, 2003). S o Peru, maior produtor mundial, exportou em 1990, cerca 2000
toneladas, equivalente demanda mundial em 1970. Sua produo em 2000 subiu para 4482
toneladas. Outros grandes exportadores so a Bolvia, Brasil, Equador, Mxico, Repblica
Dominicana, Colmbia, Kenia, Sri Lanka, Senegal, Costa do Marfim e ndia. Em menores
quantidades tambm produzido: na Nicargua, Jamaica, Paquisto, Malsia, Filipinas,
Tanznia e Angola (Sandi et. al., 2003; PROCESSOS de Comercializao e Mercados, 2003;
May, 1997).
Segundo Mello e Lima (1989), existe uma expectativa para o Brasil destacar-se no
cenrio mundial como maior exportador de urucum. Cultivado por muitos anos, encontrado
nos estados do Acre, Amazonas, Par e tambm nos estados da Bahia, Cear, Paraba e Piau.
Atualmente, outros estados, como Rio de Janeiro e So Paulo tm se dedicado no cultivo
deste vegetal. Contudo, apesar da expectativa, o produto brasileiro apresenta em sua maioria
teores reduzidos de bixina. Entretanto, sua maior produo destinada ao mercado interno.
Em 1991 e 1994 a produo situou-se na ordem de 8000 e 9000 toneladas respectivamente.
Neste perodo, apenas 2504 toneladas foram exportadas (Carteira de Comercio Exterior
(CACEX)). Apesar de ser amplamente cultivado existem poucas pesquisas, particularmente,
referentes ao melhoramento gentico, que levem ao aumento da produtividade por rea de
cultivo ou que conduza a maior produo de sementes por fruto, como tambm a um aumento
no teor de bixina das sementes.
O urucum importado em grande quantidade pelos Estados Unidos, maior importador
mundial, seguido pela Inglaterra, maior importador europeu, como tambm pela China,
Frana, Alemanha, Japo e Argentina. Destaca-se a Dinamarca no cenrio mundial como o
maior processador do pigmento, (PROCESSOS de Comercializao e Mercados, 2003;
Robbins, 1995; May 1997).
34
2.7.1 PRINCIPAIS APLICAES PARA O PIGMENTO

O pigmento extrado do urucum um corante com ampla aplicao em diversos ramos
industriais. A Organizao Mundial da Sade reconhece sua nula toxidade tanto para o
consumo humano como para sua aplicao na pele. O produto registrado pela Unio
Europia sob a denominao de E160 b.
O maior segmento consumidor destes corantes a indstria de derivados lcteos,
sendo empregado para colorir queijos, manteigas, iogurtes e margarinas. Tem aplicao
tambm em produtos derivados de carne como: salsichas, salames e defumados; derivados de
pescados; molhos de salada; cereais matinais, caramelos, sorvetes, como tambm em
achocolatados, refrigerante, e licores (SANDI et. at,. 2003).
A norbixina o nico pigmento natural que reage com a casena. Esta caracterstica
torna este corante exclusivo no segmento de queijo e produtos lcteos (Collins, 1992).
Em cosmtica, o pigmento encontra aplicao como: na formulao de bronzeadores,
na forma de extrato oleoso; produtos de maquilagem como: batons e ps-faciais; produtos
para cabelos como: tintura e xampus, como tambm em sabonetes. Na indstria txtil
empregado para tingir algodo, l e especialmente a seda, conferindo a esta um efeito especial
difuso, amarelo-laranja. Tambm tem sido empregado como pigmento na indstria de couro
bem como na fabricao de tintas e vernizes, graxas para sapato e ceras para pisos (Sandi et
al., 2003; REVISTA de fitoterapia, 2003).
Encontra-se na literatura informaes relacionadas ao emprego na medicina, como
composto adstringente, bactericida, como poderoso agente antioxidante, eficaz no combate
aos radicais livres, ou ainda para controle de taxas de colesterol e reduo dos nveis de
triglicrides no sangue.
Estudos homeopticos indicam seu uso para o tratamento de cardite e endocardite.
Outras qualidades medicinais atribudas referem-se ao emprego no tratamento de
hemorragias, dispepsias e queimaduras da pele (CATLOGO Rural, 2003; Newman, 2002).
Em Newman (2002) encontra-se a relao de um grande nmero de aplicaes medicinais do
urucum, includas as referncias.
Alm do emprego da semente devido ao seu pigmento, faz-se tambm uso das folhas e
raiz, explorando suas propriedades teraputicas. O extrato etanlico das folhas citado como
35
antdoto eficaz em caso de envenenamento por mandioca, como tambm um potente

antiofdico. (Sandi et. al., 2003).
Vrias so as propriedades atribudas planta e que so exploradas pela medicina
tradicional das quais so mencionadas: ser efetivo contra diarria, amidalite, no tratamento de
doenas peitorais, tambm como estimulante, diurtico, febrfugo, expectorante, cicatrizante,
afrodisaco e laxante (CATLOGO rural, 2003; Sandi et al., 2003;Giuliano, 2003).
2.7.2 COMPOSIO DA SEMENTE

Frega et al. (1998) identificaram na frao lipdica, extrada com hexano, a presena
de tocotrienis, destacando-se elevada concentrao do delta tocotrienol, 140-147 mg/100g de
extrato seco, maior do que aquelas normalmente encontradas em qualquer outra espcie
vegetal. Reportam ainda no ter sido encontrado nenhum tocoferol.
Mercadante et al. (1997), isolaram 5 cinco apocarotenides e identificaram a estrutura
de trs outros at ento desconhecidos, presentes no arilo da semente de urucum. O metil (7Z,
9Z, 9Z)-apo-6-licopenoato, o metil (9Z,)-apo-8-licopenoato, e o metil 1(all-E)-apo-8licopenoato, foram os trs novos carotenides encontrados. Os compostos; metil (all-E)-8apo-betacaroten-8-oate e o metil (all-E)-apo-6-licopenoate, no tinham antes sido
encontrados no urucum.
Mercadante et. al. (1999) isolaram trs outros apo carotenides do urucum (Bixa
orellana L.): o 6-geranilgeranil-8-metil-6,8diapocaroten-6-8dioato; o 6-geranilgeranil-6metil-(9Z)-6,6-diapocaroten-6-6-dioato e o 6-geranilgeranil-6-metil-6-6-diapocarotem-66-dioato. Reportam os autores ter sido esta, a primeira vez que foi encontrado o
geranilgeraniol esterificado com um cido carboxlico carotenico.
Muitas outras informaes referentes composio qumica da semente, raiz e folhas
do urucum, so encontradas na literatura. Contudo, talvez pelas diferentes procedncias das
plantas, mtodos analticos empregados, ou ainda a custa da prpria instabilidade apresentada
por alguns de seus componentes, os percentuais variam bastante.
A anlise da semente inteira apresenta 17,5% de lipdeos sendo; cido linolnico,
linolico e olico. Possui ainda 10,6% de aminocidos, 6 dos 8 aminocidos essenciais
36
contemplados no padro ideal da OMS. As cinzas (5,4%) apresentaram alto contedo de

fsforo, ferro e zinco, com reduzido teor de clcio. Alm da bixina e norbixina outros
carotenos so encontrados em menores quantidades no arilo da semente do urucum entre eles;
isobixina, beta caroteno, criptoxantina, lutena, zeaxantina e a orellina, de cor amarela. Das
folhas foram isolados os compostos apigenina, luteolina, hipoaletina e isoscutelarena, como
tambm seus heterosdeos cosmosina, alm dos derivados bisulfatados apigenina e luteolina7-bisulfato e hipoaletina-8-bisulfato. Foram tambm isolados os diterpenos; farnesilacetona,
geranilgenaniol e geranil formato. No leo essencial foi detectada a presena de dois
sesquiterpenos o ishwarano e bixageneno, alm de cido glico e pirogalol (REVISTA de
fitoterapia, 2003).
Segundo Amsar (2002) alm da bixina encontram-se tambm nas sementes de
urucum; bixeina, bixol, crocetina, iswarane, cido elgico, cido saliclico, treonina, cido
tomentsico, triptofano e fenilalanina. A semente bruta apresenta como composio tpica; 40
a 45 % de celulose, 3,5 a 5,5 % de acares, 0,3 a 0,9% de leo essencial, 3% de leo fixo,
1,0 a 4,5% de pigmento, 13 a 16 % de protena como tambm alfa e beta caroteno alm de
taninos e saponinas, (Taylor, 2002; Amsar, 2002).
Galindo-Cuspinera et al. (2002) empregando tcnica de head space e Cromatografia
gasosa com espectrometria de massas (CG-MS) determinaram a presena de inmeros
compostos volteis em extratos aquosos e lipossolveis de urucum. A identificao foi
realizada por comparao com dados de biblioteca NIST e ndice de Kovats como tambm
pelo tempo de reteno com padres conhecidos. Mais de 100 compostos foram detectados e
cerca de 50 identificados, entre eles: acetato de bornila, -cariofileno, copaene, -cubebene,
(+)ciclosativene, geranilfenilacetato, 1-heptanetiol, 3-metil piridina, 4-metil piridina elemene, -humuleno, isoledene, -pineno, selina-6-em-4-ol, -selinene,(-) espatulenol, e o
(+) ylangene.
Separao, anlise e identificao dos constituintes.
Vrios trabalhos enfocam a separao e identificao dos compostos presentes no
extrato de urucum. Entretanto, a maior parte deles exploram particularmente aspectos
analticos, e no a otimizao de um processo exclusivo para produo da bixina, o
componente de maior valor econmico.
37
Arima e Angelucci (1980) testaram dois mtodos de separao de carotenides por

cromatografia preparativa. Reith e Gielen (1971) determinaram algumas propriedades fsicas
da bixina, norbixina e seus ismeros, tais como: ponto de fuso e coeficientes de extino
molar em diferentes solventes. Pesquisas referentes separao e identificao ainda
empregam com certa freqncia a CCD. Entretanto, devido a uma srie de vantagens
apresentadas, o emprego da cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC), vem sendo a
tcnica mais explorada nos dias atuais para a separao e identificao de componentes do
extrato do urucum. (Rousseff, 1988).
Mercadante et al. (1999) reportam o isolamento e elucidao da estrutura de trs novos
diapocarotenides, alm dos outros 4 apo carotenides e 5 diapocarotenides j identificados
pelo mesmo grupo de pesquisa em 1997.
A cromatografia em coluna e a CCD foram mtodos historicamente empregados para
isolamento e anlises de muitos carotenides. Contudo, os avanos das tcnicas de
espectroscopia, ressonncia magntica nuclear e espectroscopia de massa tm contribudo
muito para a elucidao da estrutura destes compostos. Por outro lado, os constantes avanos
na HPLC e da espectrofotometria tm contribudo de maneira significativa para o isolamento
e quantificao destes carotenos (Qing, 2002). Desta forma, a determinao do teor de bixina
se faz normalmente por tcnicas espectrofotomtricas ou por cromatogrfica lquida de alta
eficincia HPLC. No obstante, ambos os processos analticos dependem de um padro de
referncia de alta pureza.
Particularmente no caso da bixina ou norbixina, devido reduzida estabilidade
estocagem no se dispe de um padro analtico no mercado. Sendo assim, recorre-se a
extrao e purificao, com posterior caracterizao e determinao da pureza do padro
obtido. Um aspecto determinante neste procedimento refere-se tcnica escolhida,
normalmente a espectrofotomtrica. Segundo Carvalho (1993), as tcnicas empregadas so
adaptaes de procedimentos aplicados anlise dos extratos (FAO/WHO, 1982; Lara, 1984;
Yabiru & Takahashi, 1991).
Observa-se nesta metodologia que o conhecimento do coeficiente de absortividade
determinante, para fidelidade dos valores de concentrao que sero calculados com base
neste coeficiente. A anlise conduzida em soluo alcalina de hidrxido de sdio ou potssio
apresenta uma srie de inconvenientes visto que, o processo envolve a reao de hidrlise da
38
bixina. Por ser funo da cintica, a cor desenvolvida pela soluo, correspondente a
norbixina formada, depende de diversos fatores tais como: tempo decorrido entre a leitura e
preparao da soluo, concentraes do lcali e da prpria amostra como tambm da
temperatura. A interdependncia daqueles fatores acarreta uma srie de incertezas quanto aos
valores de absorbncia medidos. Outro aspecto que deve ser considerado, refere-se prpria
instabilidade da soluo, bastante significativa em solues diludas, e que leva rpida
degradao do produto no decorrer da anlise.
A determinao da concentrao da bixina em um solvente orgnico mais adequada,
visto que pode ser realizada imediatamente aps a solubilizao da amostra, apresentando
tambm, leituras de absorbncia mais estveis. Com relao aos valores do coeficiente de
absortividade empregado tambm ocorrem controvrsias. Segundo Carvalho (1993), o valor
do coeficiente de absortividade publicado pela FAO (1975), para extratos em solues de
NaOH de E
1%
1cm
utiliza para clculo E
=2850 40 a 453 nm. Todavia, em outra publicao da FAO (1982),

1%
1cm
= 3473 a 453 nm. (Tambm o valor do referido coeficiente para
extrato em clorofrmio foi alterado, de 3230 80 em 470nm (FAO, 1975) para 2826 80 em
1982).
Simpson et al. (1993) realizaram o isolamento e purificao da bixina em coluna
preparativa empregando fase reversa C-18. Aps uma prvia purificao em coluna
preparativa empacotada com slica hypersupercel e empregando como fase mvel uma
mistura contendo 25 % de acetona e 75% de hexano foi possvel eliminar os componentes
minoritrios. Posteriormente para isolamento da bixina, uma primeira eluio, com uma
soluo de acetonitrila/gua 50%, permitiu a reteno da bixina e remoo da norbixina. Por
fim, percolando a coluna com uma soluo 40:60, a bixina retida foi removida do adsorvente
e isolada.
A cromatografia em camada delgada foi por muito tempo um instrumento empregado
na investigao de compostos extrados de uma matriz vegetal. Mc Keown (1961)
empregando cromatografia em papel, impregnado com N, N-dimetilformamida, e utilizando
como fase mvel uma mistura de ciclohexano, clorofrmio, dimetilformamida e cido actico
isolou e identificou seis principais componentes presentes na semente de urucum: as duas
formas ismeras da bixina (cis (lbil) e trans.); ambas norbixina e metilbixina (formas lbeis)
como tambm seus correspondentes ismeros estveis, os compostos de forma trans.
39
Reith e Gielen (1971) determinaram algumas propriedades da e norbixina e e

bixina, tais como: coeficientes de extino molar (em clorofrmio), como tambm ponto de
fuso, confrontando com valores disponveis na literatura. Para realizao desta pesquisa
empregaram cromatografia em camada delgada (celulose sem prvio tratamento), para
isolamento e purificao das amostras ensaiadas.
A cromatografia lquida de alta eficincia HPLC apresenta-se como soluo para
aquelas anlises que envolvem riscos de decomposio fotoqumica e por oxidao a que
esto sujeitos muitos compostos naturais. Isto particularmente observado na separao de
bixina. Rousseff (1988) desenvolveu e otimizou um processo analtico para determinao de
pigmentos de urucum e tumrico presentes em corantes alimentcios. Destaca que esta tcnica
analtica reduz os efeitos de decomposio, visto que o tempo decorrido para a separao
reduzido e tambm o processo se desenvolve no interior da coluna, na ausncia de luz e em
um solvente degaseificado. A cromatografia lquida, pelas caractersticas mencionadas tem
sido a tcnica mais indicada para anlise destes produtos.
O crescente interesse despertado pelos carotenides, e a necessidade do seu
monitoramento em pequenas concentraes no plasma sanguneo tm conduzido a constante
procura por tcnicas analticas capazes de determinar com preciso quantidades muito
reduzidas destes carotenides. Segundo Qing (2002), tcnicas modernas de deteco
associadas HPLC tem contribudo para aumentar a sensibilidade das determinaes. O
detector por varredura eletroqumica (Eletrochemical array detection (EC)) empregado na
determinao de carotenos, (hidrocarbonetos e oxigenados) tem viabilizado analisar microquantidades provenientes de plasmas, clulas da mucosa bucal, tecido cervical ou da prstata,
a um limite de deteco que chega a ordem de 50 fmol. O mtodo que emprega deteco foto
trmica a laser (Thermal lens spectroscopy (TLS)) tem provado ser ultra-sensvel, sendo
aplicado por isto com sucesso em pesquisas biomdicas apresentando limite de
detectabilidade de at 70 pg/ml para criptoxantina, sensibilidade esta, cerca de 100 vezes
superior deteco por ultravioleta. A espectrometria de massa apresenta limite em torno de
500fmol para um caroteno individual. Tcnica mais recente como a ionizao por desoro a
laser tem sido empregada para limites de deteco na ordem de fmol e a ressonncia
magntica nuclear (RNM) possibilita anlise com amostras na ordem de at nanograma. Esta
tcnica, entretanto, requer amostra muito pura, diferente da requerida nas tcnicas de deteco
por UV visvel ou espectrometria de massa (Qing, 2002).
2.7.3
40
TOXIDEZ
Na aplicao como corante, normalmente se faz uso de um extrato bruto do urucum.
Diante de uma mistura de substncias, cuja composio est sujeita as mudanas decorrentes
das condies do processo empregado para sua extrao ou mesmo durante a fase de
concentrao, a avaliao, da estabilidade estocagem ou a anlise dos efeitos deste
pigmento, relacionando sua ao teraputica, pode levar a concluses imprecisas.
Sempre que se faz meno ao pigmento do urucum, maior ateno dada bixina; por
ser este o componente que ocorre em maior concentrao, como tambm por ser o principal
responsvel pela sua cor vermelha. No entanto, muitos compostos presentes nas sementes, j
foram identificados Desta forma, controvrsias quanto toxidez podem estar relacionadas a
alguns daqueles compostos que ocorrem em menor quantidade no pigmento.
Aranez e Bayot (1998), relataram que o extrato do urucum genotxico. Contudo, os
ensaios foram realizados com extratos brutos, obtidos com clorofrmio e ter de petrleo, o
que pode ter comprometido os resultados.
Nish et al. (1991) estudaram as implicaes dos efeitos causados pelo pigmento de
urucum tais como urticria e angiodema desenvolvido por alguns pacientes. Concluram,
entretanto que este efeito estava provavelmente relacionado a duas protenas presente na
semente as quais foram encontradas em pequenas concentraes nos extratos. Estas protenas
mostraram-se txicas queles pacientes estudados.
Scotter (2000) pesquisou os produtos de degradao trmica proveniente da semente
de urucum encontrando tolueno e m-xileno e um produto de decomposio, de cor amarela, o
qual tratado na literatura pertinente como C17, como algumas das substncias produzidas
neste processo.
Em publicao do National Toxicology Program (NPT), Instituio americana que
conduz estudos toxicolgicos encontra-se um levantamento de diversas pesquisas publicadas,
referentes estudos toxicolgicos, relacionados ao urucum, bixina e norbixina tendo como
objetivo, verificar possveis atividades carcinognicas, genotxica e mutagnicas envolvendo
ratos, camundongos e cachorro. A pesquisa realizada com ratos empregou extrato
lipossolvel, e hidrossolvel. Os valores para dose letal (LD) oral encontrados foram
respectivamente LD>50g/kg para o primeiro extrato e LD>35g/kg.para o segundo. Tambm
41
so reportados resultados de experimentos realizados com seres humanos nos quais foram
avaliados o efeito da ingesto destes compostos e a associao a sintomas como alergias,
urticria e angiodema. Foram identificadas reaes alrgicas positivas para alguns indivduos
aps ingesto do extrato de urucum. Alguns destes pacientes apresentaram urticria ou
angiodema, porm, nenhuma das pesquisas foi realizada com placebo, o que torna imprecisa
qualquer afirmao.
Segundo Preston e Rickard (1980), em 1970, a ingesto diria permitida pela
FAO/OMS era de 1,25 mg/kg de massa corprea. Uma dcada depois, segundo Paumgartten
et al. (2002), um Comit de especialistas da FAO/WHO, (Joint Expert Commmitee on Food
Additives (JECFA)) (1982), considerando os dados toxicolgicos disponveis sobre o extrato
de urucum, estabeleceu valores mais baixos para a ingesto diria aceitvel (IDA) fixada em
(0,065 mg/kg/dia).
Ainda, Segundo Preston e Rickard (1980), estudos metablicos mostraram que os
pigmentos do urucum so facilmente metabolizados. Os nveis de pigmento no plasma
reduzem em menos de 24 h. Estudos in vitro sugerem ainda que o fgado seja responsvel por
esta funo. Atualmente diversos estudos tm sido conduzidos no sentido de comprovar
outras propriedades atribudas ao urucum tais como sua atividade hipoglicmica.
Levy et al. (1997) pesquisaram o tempo de reteno no plasma, tanto da bixina (cis e
trans), quanto da norbixina (cis e trans). Sete voluntrios ingeriram uma nica dose de 16mg
de corante alimentcio. Foi observado que a bixina totalmente eliminada, no mximo, aps
oito horas, contra 24 h para norbixina.
Segundo Thresiamma et al. (1998) a bixina apresentou ao anti-mutagnica inibindo
significativamente a freqncia de microncleos e de aberraes cromossmicas, induzidas
pela radiao gama, nas clulas da medula ssea de camundongos e de linfcitos de ratos em
cultura. As cobaias em estudo foram expostas radiao gama de intensidade 1,5-30 Gy e
receberam via oral, dose de 200mmol de bixina /kg de peso. Foram tambm estudados outros
antioxidantes como o cido elgico (200mmol/Kg) e a curcuma (400mmol/kg). Os resultados
obtidos foram comparveis com a administrao de alfa-tocoferol (200mmol/kg.).
42
2.7.4 MTODOS DE PRODUO DO PIGMENTO

As caractersticas finais do pigmento dependem no s das condies de conservao
dos produtos, mas principalmente do processo de extrao, o que reflete na qualidade final do
produto. Desta forma muitos pases importam as sementes in natura. Tendo em vista que o
mercado importador exige um percentual mnimo de 2,5 % de bixina, a existncia de
variedades cultivadas com somente 1,6 a 2.1 % de bixina tem levado muitos pases a
mudarem sua estratgia de mercado (May et al., 1997). A ndia, por exemplo, tm ampliado a
exportao de pigmento processado de forma a aumentar o valor agregado (Robbins, 1995).
Os corantes de urucum podem ser encontrados no mercado em diferentes formas: em
soluo aquosa, solvel em leo ou ainda, na forma de emulso ou em suspenso (Sandi et. al.
, 2003). Vrios so os processos adotados para obteno do pigmento. O mtodo tradicional
de extrao dos corantes do urucum consiste na enrgica agitao das sementes em gua fria.
Uma vez separada a semente e decantada a suspenso, seca-se a pasta. Esta pasta
comercializada in natura ou misturada a um leo comestvel. O referido processo acarreta
baixo rendimento no teor de bixina, devido ao prolongado tempo de secagem (Sandi et al.,
2003).
Preston e Rickard (1980) descrevem os principais mtodos de extrao; a extrao em
leo, a extrao em solventes orgnicos e a extrao em meio aquoso alcalino, como tambm
variantes destes processos. Em um dos processos as sementes so tratadas com soluo
alcalina, a frio ou a sob leve aquecimento. A soluo alcalina obtida, contendo o corante
solvel, acidificada o que leva a precipitao de um pigmento rico em norbixina. Desta
forma obtido um concentrado vermelho com elevado teor daquele componente. A extrao
com solventes orgnicos tm sido tambm uma alternativa para a obteno de produto com
elevada concentrao bixina. Destacam-se entre os solventes empregados: a acetona, o lcool
etlico, o propilenoglicol e tambm o clorofrmio. Este processo, no entanto apesar de
conduzir a um produto com elevado rendimento, apresenta alguns problemas, devido ao
elevado custo para recuperao dos solventes, ou a possibilidade de deixar resduos txicos
que pode inviabilizar seu emprego como corantes para alimentos. Outra forma tambm
empregada pela indstria faz uso de leos vegetais como solventes, produzindo extratos
lipossolveis.
43
Extraes com fluido supercrtico, particularmente empregando dixido de carbono

so reportadas na literatura, contudo esta tcnica extrativa continua restrita a escala
laboratorial, Chao et al. (1991) conduziram extraes de sementes de urucum com CO2 a
diferentes presses e temperatura, (207 bar/50o C, 310o bar/ 60o C e 345 bar/50o C).
Analisaram posteriormente os extratos, empregando tcnicas de CCD, Ressonncia magntica
nuclear (RNM) e cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas CGMS.
Obtiveram maior concentrao de pigmentos totais a 345 bar/50o C (19 mg/g de extrato). Em
outro ensaio amostras de bixina e norbixina puras submetidas s mesmas condies de
extrao no acusaram a presena na anlise por CG-MS, evidenciando baixa solubilidade,
quando o leo estava ausente.
A presena de grupamentos carboxlicos cidos nestes compostos foi apontada como
provvel razo da inexistncia de espectro de massa, uma vez que sua elevada polaridade
poderia ter favorecido forte reteno daqueles compostos na coluna empregada. A
espectrometria de massa mostrou, contudo a presena de muitos compostos terpnicos entre
eles, em maior concentrao o diterpeno geranilgeraniol.
Degnan et al. (1991) determinaram a solubilidade em CO2 supercrtico dos compostos
puros; bixina, norbixina e metilbixina como tambm de pigmento bruto, obtido de sementes
inteiras de urucum. Observaram que a concentrao de bixina solvel em CO2, proveniente do
extrato de semente era cerca de 10 vezes superior em massa quando comparada ao ensaio de
solubilidade de bixina com 97 % de pureza. Por outro lado, a concentrao do leo de urucum
era cerca de 100 vezes aquela da concentrao de bixina. Nas Tabelas 2, 3 e 4, so
apresentados os dados de solubilidade em CO2 supercrtico: da bixina, do pigmento de
urucum e do leo de urucum respectivamente.
Tabela 2 Solubilidade da bixina em CO2 supercrtico.
Solubilidade da bixina 97% (mg bixina/g de CO2 )
3000 psi, 40C
7000 psi, 55C
0.0010 0,0001mg
0,0033 0,0002
44
Tabela 3 Solubilidade do pigmento de urucum em CO2 supercrtico.
Solubilidade do pigmento na semente inteira (mg de bixina /g de CO2)

3000 psi, (40C)
7000 psi, (55C)
0,013 0,001mg
0,027 0,002
Tabela 4- Solubilidade do leo de urucum em CO2 supercrtico.

Solubilidade do leo de urucum ( mg/g de CO2)
Presso (psi)
40C
50C
3000
0,3
0,5
3850
1,3
1,7
4500
1,5
1,9
7000
1,7
2,1
55C
0,6
2,0
2,3
2,5
Processos alternativos, como operaes mecnicas envolvendo moinhos de bolas ou

ento em leito de jorro, onde as sementes de urucum sofrem atrio e impacto umas com as
outras conduzem a um pigmento em forma de p ultrafino. Os produtos resultantes de
operaes puramente mecnicas apresentam baixos teores de bixina, visto que a camada que
envolve a semente de urucum represente cerca de 6% do peso da semente, e pouco mais de
2% da semente devido bixina (Carvalho, 1989).
Alves (2002) estudou a extrao de bixina das sementes de urucum empregando
moinho de bolas. Observou que o aumento de duas para quatro horas no tempo de processo,
aumentou o rendimento de extrao de 4,86 % para 14,83 % e que a frao granulomtrica de
100 a 250 mesh apresentava os maiores teores de bixina.
Apesar da elevada sensibilidade degradao em presena de ar e calor, algumas
tcnicas empregam a concentrao de extratos atravs da secagem com fluxo de ar quente.
Tavares et al. (1999) estudaram a influncia dos parmetros; vazo de ar e carga de semente
de urucum no processo de extrao mecnica em um leito de jorro monitorando a
produtividade do processo e os teores de bixina do concentrado. Massarani et al. (1992)
conduziram experimentos de extrao de pigmentos de urucum simultneo secagem, em um
equipamento de leito de jorro de configurao cnica, avaliando a eficincia desta operao
conjunta. Passos et al. (1997) estudaram a secagem do extrato de urucum em leito de jorro, a
45
50o C avaliando a degradao trmica ocorrida durante o processo. Constataram ser pouco
significativa a perda quando comparadas operao conduzida a 105o C.
Deve-se ainda destacar uma alternativa de extrao mecnica muito comum que
emprega a farinha de milho (fub). Este agitado com a semente, de forma que, por abraso o
pigmento removido, ficando incorporado farinha de milho. O produto assim obtido tem
emprego na culinria e popularmente conhecido como colorau.
2.7.5 AVALIAO DA ESTABILIDADE/DEGRADAO

A estrutura polinica dos carotenides torna estes compostos extremamente sensveis
oxidao. Vrios trabalhos tm sido realizados no sentido de avaliar no s a influncia dos
parmetros que favorecem ou catalisam estes efeitos, como tambm determinar a cintica de
decomposio ou ainda identificar os produtos provenientes da decomposio. Efeitos do
calor, oxignio, luz, presena de gua tm servido de base para muitas pesquisas. Desta
forma, as condies de armazenamento do produto so fatores determinantes na conservao
deste corante.
Kanjilal et al. (1996) monitoraram a concentrao do produto em diferentes condies
de estocagem, observando que as sementes conservadas temperatura ambiente apresentavam
reduo na concentrao de bixina de at 50 % contra 25 %, quando estocada em freezer.
Observaram tambm que a bixina purificada (90%), tornava-se muito vulnervel a
decomposio. Por outro lado, as perdas de bixina foram reduzidas quando dispersa em leo
vegetal, tanto quando estocada em freezer ou mesmo mantida a temperatura ambiente.
Glria et al. (1995) avaliaram a atividade da gua sobre a estabilidade da bixina,
associando parmetros como luz e ar. Foi observado neste ensaio, que a bixina mais estvel
em condies de mdia a elevada atividade de gua.
Carvalho et al. (1993), avaliaram a estabilidade a estocagem de um corante slido de
urucum armazenado em embalagens plsticas co-extrusadas, aluminizadas e no
aluminizadas, constitudas de distintos polmeros, as quais apresentavam diferentes nveis de
permeabilidade ao oxignio. As amostras foram mantidas em temperatura e umidades
constantes. Concluram neste trabalho que embalagens com taxas de permeabilidade ao
oxignio de at 42 cm3 (CNTP) /m3/dia a 25o C conferem adequada proteo ao produto
durante um ano a 30o C a 90 % de umidade relativa e na ausncia de luz.
46
O principal produto de decomposio da cis-bixina, isolado inicialmente por Mc

Keonw (1962) foi mais tarde identificado pelo mesmo pesquisador em 1963 como sendo o
ster monometlico do cido 4,8- dimetil-tetradecahexanenediico, o qual foi denominado
C17. A Figura 9 mostra o esquema da provvel rota de degradao da 9-cis-bixina (I)
acompanhada dos produtos de decomposio formados, o m-xileno (II) e o composto corado
C17 (III). Segundo Scotter et al. (1994) o tolueno tambm ocorre junto como produto de
degradao.
12
H3C
CH3
19
13
11
14
10
20
9
8
20
CH3
11
10
13
12
15
14
15
9
8
OH
CH3
19
O
CH3
II
19
9
14
13
10
H3C
11
12
H3C
20
III
CH3
CH3
19
9
8
20
11
10
13
12
15
14
8
15
CH3
7
OH
Figura 9- Degradao trmica da 9cis-bixina. Fonte: SCOTTER et al. (1995).

Scotter et al. (2000) conduziram anlises em varias amostras comercias de pigmentos,
com o objetivo de monitorar a concentrao de produtos de degradao (tolueno e m-xileno)
provenientes da bixina e norbixina. Concluram os autores que a presena de C17 um forte
indicativo do emprego de elevada temperatura de extrao. As amostras foram analisadas por
cromatografia gasosa, usando a tcnica do head space. Em outra pesquisa Scotter et al. (2001)
avaliaram a cintica de degradao trmica da 9-cis-bixina, monitorando os produtos de
degradao. Reportam que a degradao complicada pela ocorrncia de muitas reaes
competitivas de isomerizao, as quais se desenvolvem a diferentes taxas ao longo do
equilbrio. Isto posteriormente agravado pela simultnea e irreversvel formao do
composto C17, (com produo associada do m-xileno), o qual pode sofrer posterior
degradao produzindo mais m-xileno e tambm tolueno. Ainda, observaram os autores que a
formao de m-xileno ocorre mais facilmente e em menor extenso o tolueno.
47
Com objetivo de dispor de padro analtico, no disponvel comercialmente, Scotter et

al. (1994) isolaram e purificaram a cis e trans bixina assim como seus compostos de hidrolise,
os ismeros da norbixina. As amostras foram analisadas, identificadas e caracterizadas
empregando-se HPLC por fase reversa com deteco por feixe de fotodiodo. A espectrometria
de massa, RNM H, infravermelho e espectrofotometria no UV, tambm foram empregadas
como tcnicas analticas.
Najar et al. (1988) monitoraram a degradao da bixina, proveniente de um extrato
bruto, sob efeito da luz. Amostras com massas idnticas de bixina, solubilizadas em
clorofrmio foram submetidas a diferentes intensidades de radiao, na presena de oxidantes
e/ou (ar ou perxido de benzola) e/ou antioxidante (palmitato de ascorbila). Aps 12 dias de
ensaio, a 24o C, os dados obtidos foram confrontados com amostras, no submetidas queles
fatores. Concluram os autores, que a ao luz afeta muito mais a degradao que o oxignio.
Na Tabela 5 so reportados os dados obtidos pelo Autor na qual so apresentados as
condies experimentais empregadas e os valores encontrados para a taxa de decomposio, o
perodo de meia vida e o percentual de bixina de cada experimento aps o dcimo segundo
dia de avaliao.
Tabela 5 Determinao da Taxa de Decomposio da bixina

Experimento Condio experimental
K x 10-2 t1/2
(dias 1) (dias)
Bixina aps 12
dias (%)
Ar, iluminao a 100W, 1380 lux

17,4
4
73,1
Ar, escuro
0,9
75
98,2
12,0
6
76,2
N2 ,100W iluminaoa, 1380 lux
N2, escuro
_
_
100,0
Ar, iluminao 40 W , 430 lux,
2,4
28
83,9
Ar, iluminao 100 W , 1380 lux, 10%
5,7
12
85,9
palmitato de ascorbila
7
Ar, iluminao 40 W, 430 lux, 10%
1,4
49
94,7
palmitato de ascorbila
8
Ar, 40W iluminao, 430 lux, 20%
1,2
58
96,0
palmitato de ascorbila.
9
Ar, escuro 10% palmitato de ascorbila
0,9
77
88,5
10
Ar, escuro 2,5 % palmitato de ascorbila 8,0
9
81,0
(a) Lmpada de tungstnio (Osran Catlogo, 1985). Os tubos foram expostos fonte de luz
distncia de 17,5 cm, ( b) % em w/v., (d) (Scooter,et al., 2001).
1
2
3
4
5
6
48
A preocupao quanto possibilidade dos corantes apresentarem contaminao com

microorganismos incorporados durante as fases de processamento e embalagem levou Odake
et al. (1993) a avaliar o emprego de irradiao como forma de esterilizao de uma amostra de
urucum. Submeteu a amostra, previamente contaminada com Bacillus subtilis a um feixe de
eltrons (2,5 KGy a 40 KGy). Conclui que o emprego de radiao levou a uma reduo na cor
do pigmento muito inferior provocada pelo emprego de esterilizao trmica. Concluindo
assim ser uma alternativa vivel.
2.7.6 ESTABILIZAO/CONSERVAO
Ainda que no se consiga total estabilizao de compostos carotenicos, cuidados
especiais, tomados para inibir sua degradao e conseqentemente assegurar maior tempo de
conservao destas substncias so aconselhados para a preservao de suas caractersticas
originais. Portanto fundamental o acondicionamento em temperaturas reduzidas como as de
um freezer, alm da total proteo contra radiao luminosa.
Uma atmosfera de nitrognio recomendada durante as fases de isolamento,
processamento e embalagem do produto, no sentido de evitar o efeito nocivo do oxignio
sobre a cadeia polinica de muitos carotenides. A incorporao de antioxidantes como
palmitato de ascorbila, butil-hidroxitolueno (BHT) ou pirogalol, outra pratica por vezes
adotada, quando da formulao de alimentos ou frmacos contendo estes compostos (Fontana
et al., 1997).
O encapsulamento tem sido uma medida adotada para proteger substncias de reduzida
estabilidade. As ciclodextrinas; hexa, hepta e octa-maltosacardeos cclicos derivados do
amido, tambm conhecidos como: , e cilodextrinas, com sua conformao tubular tronco
cnica, tm sido exploradas com o propsito de encapsular molculas lipossolveis. A
superfcie externa, circundada por grupamentos hidroxlicos torna esta molcula solvel,
particularmente em gua. Na cavidade apolar, formada no interior de uma molcula de
ciclodextrina, compostos lipossolveis so facilmente ocludos. Uma vez alojados, ficam mais
protegidos de agentes nocivos como calor, oxignio, radiao como tambm da interao com
outras substncias. Alquilao, carboxilao ou hidroxialquilao so tambm efetuadas como
forma de modificar as ciclodextrinas, no sentido de aumentar suas propriedades de
hidrossolubilidade e capacidade de incorporao de substncias lipoflicas.
49
Outra vantagem associada a esta ocluso molecular refere-se possibilidade de

controle de liberao de um princpio ativo, que pode ser conseguido de forma lenta e
progressiva, dentro do organismo consumidor. Segundo Fontana et al. (1997), a estratgia de
encapsulamento, alm da liberao modulada do princpio ativo retido na cavidade funcional
da ciclodextrina, propicia mecanismo protetor de alta eficincia justamente contra os fatores
ambientais que so altamente destrutveis estrutura nativa e livre dos carotenos: vapores
cidos ou oxidantes, luz, calor e oxignio. A combinao destes fatores leva,
indubitavelmente, gerao de alteraes estruturais, as quais, no obstante a manuteno da
cor, ainda que alterada, podem no mais responder pela propriedade biolgica otimizada
desejada.
2.8 PROCESSOS DE SEPARAO POR ADSORO

A adsoro aplicada em processos de separao no qual certos componentes de uma
fase gasosa ou lquida so seletivamente transferidos para a superfcie slida de um
adsorvente. Este processo permite conduzir separaes por vezes muito difceis ou mesmo
impossveis de serem conseguidas por tcnicas mais convencionais como a destilao ou
sistemas baseados em membranas (Knaebel, 1995).
Distintas so as interaes presentes em um processo adsortivo. A adsoro fsica
causada principalmente por foras de van der Waals e foras eletrostticas entre molculas do
adsorbato e tomos que compem a superfcie do adsorvente. Sendo assim, um adsorvente
primeiramente caracterizado pelas propriedades de sua superfcie tais como rea superficial e
polaridade (Suzuki, 1990). Da mesma forma diferentes foras de interao esto presentes
entre as molculas do soluto e a fase solvente. So quatro as mais importantes formas de
interao entre molculas do solvente e soluto, as quais tm grande contribuio na
cromatografia lquida: disperso, dipolo, pontes de hidrognio e interaes dieltricas (Snyder
et al., 1979).
Os processos cromatogrficos esto embasados em fenmenos de adsoro. A
cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao e est fundamentada na migrao
diferencial dos componentes de uma mistura, decorrente de diferentes interaes de duas fases
imiscveis, a fase mvel e a fase estacionria (Cass et al., 2001).
50
Segundo Qing et al. (2002), o isolamento de carotenides usualmente emprega

cromatografia em coluna ou CCD, enquanto a etapa de purificao final conduzida
posteriormente por HPLC. De um modo geral, pode-se dizer que, a cromatografia lquida e a
CCD so as tcnicas mais aplicadas, quando os compostos em estudo so molculas
complexas e susceptveis a degradao por outros procedimentos que envolvam processos de
aquecimento. Quando, entretanto, a substncia isolada est sujeita a oxidao, alguns
cuidados so normalmente tomados, evitando sempre que possvel sua exposio ao ar. Neste
aspecto a CCD est mais sujeita aos referidos danos, por expor o composto a uma grande
superfcie. A incorporao de antioxidantes soluo contendo os compostos de interesse
uma soluo por vezes adotada, para minimizar os efeitos nocivos da oxidao tanto durante
as fases de extrao quanto na etapa final de anlise (Fontana et al., 1997).
2.9 CROMATOGRAFIA
A cromatografia em coluna foi primeiramente empregada em 1906 pelo botnico russo
M.S.TSWETT para isolar pigmentos de plantas. Outra configurao, a forma aberta
denominada cromatografia em camada delgada, Thin-Layer Chromatography (CCD), foi
introduzida no incio da dcada de 50 por KIRCHNER e posteriormente popularizada por
STAHL, (Snyder et al., 1979).
Citam Cass et al. (2001), que o primeiro tratamento matemtico da teoria da
cromatografia foi desenvolvido em 1952 por Martin e Synge, rendendo a estes pesquisadores
o premio Nobel.
Trs tipos de fluidos com amplas diferenas de propriedades fsico-qumicas; lquidos
e gases, de baixa e alta densidade (includos aqui os gases no estado supercrtico) podem ser
empregados como fase mvel (Guiochon, 1993). A Cromatografia lquido-slido, ou
cromatografia por adsoro o mais antigo mtodo cromatogrfico empregado. Sua clssica
forma concebida por Tsweet, tambm conhecida por cromatografia em coluna ainda hoje
amplamente empregada. So quatro os mecanismos de separao ou processos responsveis
pela reteno do soluto pela fase estacionria. Estes em conseqncia conduzem a quatro
mtodos bsicos: alm do lquido-slido tm-se: lquido-lquido (partio), a troca inica e a
excluso por tamanho.
51
No primeiro grupo, a interao do soluto com a fase estacionria ocorre diretamente

nos stios do adsorvente slido. Na segunda modalidade a superfcie ativa da fase estacionria
compe-se de um lquido. Este lquido pode estar simplesmente adsorvido a superfcie do
suporte slido ou imobilizado, ligado quimicamente ao suporte. Na troca inica, a fase
estacionria contm grupos inicos, catinicos e aninicos ligados ao suporte. Por fim na
ltima modalidade, tambm denominada de cromatografia em gel, a fase estacionria
compe-se de partculas com poros de distintas dimenses que impedem determinados solutos
de permearem atravs destes poros, fazendo com que percolem mais rpido a coluna (Snyder
et al., 1979).
Outra modalidade, distinta das anteriores, a cromatografia por afinidade conduz a um
processo de separao muito mais seletivo. A presena de um composto ou terminal reativo
ligado fase estacionria permite uma ligao diferenciada, selecionando de forma especfica
um composto. Desta forma, por exemplo, a ligao de um anticorpo fase estacionria
possibilita a reteno de um antgeno especifico ao ser percolado atravs da coluna. A
remoo do adsorbato conseguida aps a eluio da coluna com uma soluo que possua
condies de diminuir a interao antgeno/anticorpo, tais como; maior fora inica, pH, a
presena de um tenso ativo ou um solvente com diferente polaridade.
Quando na cromatografia lquida a fase estacionria mais polar que a fase mvel,
recebe a denominao de cromatografia por fase normal. Na cromatografia por fase reversa a
fase estacionria apresenta polaridade menor que o solvente. Os adsorventes mais empregados
na cromatografia por fase normal so a slica e a alumina, enquanto para a fase reversa so
empregadas fases polares quimicamente ligadas, tendo como grupos ativos terminaes do
tipo ciano, diol, fenil , amino ou apolares, contendo terminaes hidrocarbonetos, dentre estes
os mais comuns so C8 e o C18.
A cromatografia por fase reversa tipicamente mais eficiente e apresenta maior
versatilidade e reprodutibilidade. Embora muitos compostos orgnicos apresentem limitada
solubilidade em gua, isto no problema quando se trata de processo analtico, visto que as
massas normalmente necessrias para a anlise so muito pequenas. Por outro lado, quando a
solubilidade excepcionalmente baixa ou ainda, quando o analito apresenta instabilidade
frente gua, podese optar pelo uso de solventes polares no aquosos ou alternativamente
usar-se a cromatografia em fase normal (Snyder et al., 1997).
52
Na cromatografia por fase normal, os eluentes freqentemente empregados so

solventes orgnicos. Alm da slica, ou ocasionalmente alumina, empregada como fase
estacionria, fases quimicamente ligadas, com elevada polaridade, como ciano, diis ou
amino, suportados em slica so por vezes empregadas. Este mtodo de separao tem sido
normalmente realizado para separar compostos neutros ou, em menos freqentemente,
compostos ionizveis. Para otimizar a separao de compostos orgnicos, cidos ou bsicos, a
mudana da polaridade pode ser conseguida com a incorporao de: gua, um cido ou uma
base orgnica na composio do solvente. A separao por fase normal tambm conveniente
nas seguintes situaes: e quando maiores quantidades de amostra so requeridas, quando
necessrio melhorar a sensibilidade deteco, e quando do isolamento de uma banda
cromatogrfica, para posterior identificao.
Neste aspecto so mais baratas que as fases reversas, e comportam tambm maior
carga de amostra, sendo inclusive mais estveis frente a extremos de pH. Por estas qualidades
so preferidas em processos de cromatografia preparativa, Outras vantagens devem ser
destacadas na cromatografia por fase normal: Boa seletividade para compostos com diferentes
nmeros de grupos funcionais, e tima diferenciao entre misturas ismeras. Contudo, no
que se refere seletividade para homlogos mostra-se ineficaz frente fase reversa (Snyder et
al., 1979; 1993; 1997).
2.9.1
CROMATOGRAFIA PREPARATIVA
A tcnica cromatografia tem sido com freqncia empregada para separar substncias
contidas em misturas complexas. Processos contnuos em contracorrente so normalmente

empregados para separar compostos obtidos de processos biotecnolgicos. Encontra-se
tambm presente em processos separao e purificao da indstria petroqumica,
farmacutica e qumica fina. Alguns parmetros so de fundamental importncia na
cromatografia preparativa so eles: seletividade, eficincia, capacidade de carga da fase
estacionria e velocidade mxima do processo. Determinados aspectos econmicos devem
tambm ser considerado: produtividade (quantidade de produto por unidade de tempo e por
quantidade de fase estacionria); consumo de eluente; custo tanto do eluente quanto da fase
estacionria; diluio do produto, alm do custo de recuperao do solvente na etapa posterior
de isolamento do extrato.
53
Quando a eficincia de uma corrida cromatogrfica no suficientemente para

conduzir a uma boa separao, tem-se como opo aumentar o dimetro da coluna ou
empregar dimetro menor das partculas. Contudo, esta prtica leva a um aumento da presso.
Uma soluo alternativa conduzir o extrato pr-purificado a um posterior reciclo.
A cromatografia preparativa pode servir para o isolamento na ordem de miligramas,
para elucidao de estrutura ou, para o isolamento de amostra na ordem de gramas a
quilogramas que podero ser destinadas pesquisas sistemticas ou para sntese. No primeiro
caso importante a eficincia de separao. No segundo, de fundamental interesse a
quantidade isolada por tempo de operao (Snyder et al., 1993).
Quantidades maiores de material purificado usualmente requerem condies de
operao diferentes daquelas aplicadas em processos analticos (Snyder et al., 1979). Num
processo de separao cromatogrfica, os parmetros; resoluo, velocidade de separao,
carga de amostra e capacidade do adsorvente esto inter-relacionados. Ao se fazer a
otimizao de um dos parmetros, normalmente comprometemos os outros. Enquanto na
cromatografia analtica, velocidade e resoluo so imprescindveis e, a quantidade de
amostra desprezada, na cromatografia preparativa o foco voltado para a massa purificada, de
forma que deve ser enfatizada a capacidade da coluna. Este requisito, para ser alcanado
usualmente, compromete a velocidade e/ou a resoluo. O fator de reteno k ' na
cromatografia analtica experimenta insignificante alterao em funo da massa de amostra,
uma vez que esta se apresenta muito diluda (<1mg/g). Para otimizar a separao de massas
maiores o processo conduzido em colunas com dimetros maiores onde se emprega
sobrecarga de amostra, maior que 1mg / g de fase estacionria. Nesta condio, os valores de
k ' so reduzidos na ordem de 10% ou mais, comparados quele obtido no processo analtico.
Isto em conseqncia leva reduo da eficincia da coluna. Ainda assim, prefervel a
sobrecarga de concentrao (em massa) quela de volume. Ainda, na operao em sobrecarga
pode-se aumentar a eficincia aumentando-se o comprimento da coluna. Contudo, a mais
eficaz alternativa para melhorar a eficincia repousa no ajuste da seletividade. Segundo
Snyder et al. (1979), embora e k' reduzam com o aumento da quantidade de amostra, a
resoluo nestas condies pouco afetada pelo aumento da velocidade da fase mvel. Desta
forma, pode-se processar uma maior massa por unidade de tempo com adequada resoluo,
operando-se com uma maior vazo atravs da coluna.
54
A purificao em escala piloto de um determinado princpio ativo contido em um

extrato, freqentemente obtida por cristalizao. Este processo, entretanto ainda que leve a
obteno de um produto de elevada pureza, pode demandar muito tempo. A cromatografia
preparativa flash traz como vantagem a supresso da lenta fase de cristalizao acima citada.
Desta forma esta tcnica tem sido extensivamente empregada em processos de sntese, onde
pureza e rendimento so crticos. Nestes processos como tambm no isolamento de um
princpio ativo contido em uma matriz complexa, a tcnica de purificao via cristalizao
normalmente no conduz a bons resultados. Por outro lado, a cromatografia flash leva a
resultados consistentes possibilitando a obteno de produtos com elevada pureza, os quais
em muitos casos so facilmente cristalizados em uma etapa posterior.
A cromatografia flash, tambm conhecida como cromatografia mdia presso foi
introduzida por W.C.STILL em 1978 e caracteriza-se pela aplicao do eluente a uma coluna
cromatogrfica preparativa, normalmente operada pressurizada. uma forma rpida e
eficiente de separao cromatogrfica e de custo relativamente baixo. Com o emprego desta
tcnica possvel purificar desde pequenas massas de substncia at cerca de 10 gramas em
menos de 15 minutos, sendo ideal para preparao de padres de elevada pureza ou mesmo
para a purificao de maiores quantidades de produtos, de elevado valor, provenientes de um
meio reacional. Esta tcnica est correlacionada diretamente aos resultados da cromatografia
de placa (CCD). Sendo assim, para otimizar as condies de separao, um adequado ajuste
da composio da fase eluente conduz a melhor condio de operao da coluna. Para uma
eficaz separao desejvel que o componente que se deseja isolar apresente um fator de
reteno (Rf) de 0,35 e uma diferena entre os componentes adjacentes maior que 0,15.
Na cromatografia flash utiliza-se normalmente slica de 40 a 60 microns de dimetro,
o que permite elevadas taxas de fluxo e eficiente separao, operando em presses de 40 a
100 psi. Estas condies permitem um fcil scaleup de uma planta de pesquisa para uma
planta piloto ou mesmo industrial. Adsorvente de maior dimetro de partcula (63-200
microns) tambm so empregados, apresentando, contudo baixa resoluo. Por outro lado
partculas de dimetro menores que 40 microns no apresentam grandes ganhos na resoluo.
O fator de reteno (Rf) obtido na CCD correlaciona-se diretamente separao na coluna,
sendo o primeiro inversamente proporcional ao fator de reteno na coluna flash, medido em
unidade de volume de coluna.
55
Uma variante operacional da cromatografia em coluna que tem se destacando

atualmente o leito mvel simulado. A principal vantagem apresentada por este processo de
separao refere-se obteno de fraes puras, com baixa diluio. No entanto, apresenta
como desvantagem a impossibilidade de separar misturas complexas, separando-se apenas
duas correntes. Existe ainda uma restrio isocrtica de diluio por constante permuta de
solvente. Nesta tecnologia de separao. O adsorvente encontra-se em colunas separadas (de 6
a 12) as quais so conectadas em srie formando um circuito. Na parte superior de cada
coluna esto presentes 4 vlvulas de trs vias, atravs da qual se permuta a alimentao do
extrato bruto, o eluente, o rafinado (composto menos retido) e o extrato purificado obtido (o
mais retido). A cada ciclo, s uma vlvula est ativa em cada coluna. A seqencial troca das
correntes no circuito simula o movimento da fase estacionria.
2.9.2 VARIVEIS E PARMETROS OPERACIONAIS NA CROMATOGRAFIA

O conhecimento e adequado controle de determinados parmetros relacionados aos
processos de separao cromatogrficos so de extrema relevncia na conduo de um
processo de separao cromatogrfica. Alguns destes parmetros sero tratados abaixo.
Fora do solvente e polaridade.
A fora do solvente bem como a polaridade deste so parmetros de fundamental
importncia em um processo de separao cromatogrfica. Segundo Sewell et al. (1994), as
trs mais comuns medidas de polaridade so o parmetro de fora de solvente de SNYDER o ,
o parmetro de solubilidade de HILDEBRAND e o parmetro de polaridade de solvente P " .
As interaes das molculas do soluto com as molculas do solvente resultam de
quatro tipos de foras: disperso, dipolo, pontes de hidrognio e interaes dieltricas. Quanto
maior estas foras atuando em conjunto, maior a atrao entre solvente e soluto. A polaridade
de um solvente ou de um soluto caracterizada pela presena das referidas interaes. De
forma que, quanto mais polar mais intensas sero as interaes resultantes, sendo, portanto a
fora do solvente definida por o ,diretamente relacionada sua polaridade. Solventes polares
preferencialmente atraem e dissolvem solutos polares. Na cromatografia por fase normal ou
adsoro, a fora do solvente aumenta com a polaridade deste, ocorrendo o inverso na fase
reversa. No apndice so mostrados os valores de polaridade para diferentes solventes.
56
Polaridade de uma mistura de solventes.

A polaridade P ' de uma mistura de solventes a mdia ponderada dos valores de
polaridades dos solventes puros Pa e Pb relacionada s suas fraes volumtricas na mistura
a e b :
P ' = a Pa + b Pb
(1)
O incremento em 10 % na frao volumtrica de um dos solventes acarretar, por

exemplo, uma mudana na polaridade anterior m 0,1 (Pb Pa ) , (Snyder et al., 1979).
Seletividade do solvente.
Uma vez selecionada a fase mvel, e sua composio volumtrica resultou em um
valor de k ' adequado separao, pode ocorrer que duas ou mais bandas ainda estejam se
sobrepondo. Diante disto, uma mudana na seletividade deve ser pesquisada, de forma a
otimizar a separao.
De acordo com Snyder et al. (1979), isto facilmente alcanado, pela mudana da
seletividade da fase mvel, porm com a manuteno da fora do solvente, o que se consegue,
procedendo variao na composio da fase mvel. Se por exemplo, tivermos uma mistura
de solventes: A (hexano), no polar,
Pa 1
e B (clorofrmio) polar, tal que a proporo
empregada na mistura tenha conduzido a um valor de polaridade P ' e conseqente k '

adequados a um determinado perfil de separao, pode-se mudar a seletividade do solvente,
pela substituio de um dos componentes da mistura, por exemplo, B por C (ter etlico). A
fora do solvente ser a mesma se mantivermos constante o produto ( b Pb ), parcela a ser
substituda na equao (1).
A concentrao volumtrica do solvente C na nova mistura dever ser:
Pb
Pc
c = b
(2)
O emprego de misturas solvente que possua maior polaridade em relao a outro

permite um adequado ajuste de polaridade da fase eluente. A escolha dos solventes
componentes da mistura, quanto o percentual destes na composio determina a polaridade da
57
fase mvel que, em conseqncia interferem diretamente na taxa de eluio dos compostos a
serem separados. Na cromatografia lquida por fase normal, quanto maior a polaridade do
sistema solvente mais rpida a eluio dos compostos polares, ocorrendo o inverso na
cromatografia por fase reversa.
Quando se processa a troca de um solvente da mistura com objetivo de alterar a
seletividade conveniente ajustar o percentual do novo solvente mantendo, porm a mesma
fora da mistura anterior. Encontra-se na literatura, nomogramas que facilitam este
procedimento. Entretanto, na cromatografia por fase normal, quando se misturam fases
mveis de mesma fora, a fora da mistura resultante freqentemente muda para um valor
mais elevado, de forma que, so requeridos mais experimentos para se obter a mistura
adequada. Grandes mudanas de seletividade podem ser obtidas pela apropriada troca de um
dos solventes da mistura. Por exemplo, a substituio em uma mistura de um solvente polar B
(ex. metanol), por outro homlogo C (propanol) pode no alterar muito a seletividade, pois
ambos so solventes doadores de prtons. Por outro lado, a troca por um solvente receptor de
prton como o ter etlico, favoreceria a interao com solutos doadores os quais teriam forte
interao com a nova fase mvel. No caso de um solvente que tenha um grande momento de
dipolo como o diclorometano, molculas com fortes grupos de dipolos passariam a fase
mvel.
Rohrschneider (1973) classificou os solventes segundo propriedades que afetam a
seletividade como; a acidez, basicidade e polaridade. Estes parmetros foram empregados
para a elaborao de um diagrama triangular, conhecido como solvent-selectivity triangle
(SST) em cujos vrtices situa-se cada uma das trs propriedades puras. De forma que, uma
determinada regio interna ou delimitada pelo diagrama corresponde a uma mistura solvente
que associa propriedades, proporcional ao percentual de cada um dos componentes da
mistura. Os solventes mais empregados foram enquadrados em oito classes, sendo que cada
classe, ocupa uma regio especfica dentro do diagrama de acordo com a sua propriedade
como solvente associada s trs caractersticas citadas. Sendo assim, tm-se os seguintes
grupos: I- receptores puros (ter e amina); II.doadores-receptores (lcool) e VIII doadores
puros (clorofrmio). Os outros grupos so solventes que apresentam propriedades
intermedirias.
Segundo Snyder et al. (1993), vrios processos tm sido propostos para a classificao
da seletividade de solventes. Estes trabalhos e outros esquemas para escolha da seletividade
58
do solvente, assumem a possibilidade de separar fora e seletividade de um solvente. Muitos

destes esquemas relacionam as foras de atrao entre solvente e molculas do soluto, com
nfase nas interaes de dipolares e ligaes de hidrognio. Assim a classificao de um
determinado solvente como possuidor de uma caracterstica pura pode conduzir as distores.
Isto em conseqncia conduz a distino de diferentes solventes em termos de sua relativa
acidez por pontes de hidrognio, basicidade e momento de dipolo.
A classificao do lcool como acdico, da dioxana como bsica e o nitrometano como
dipolar, desconsiderando que na verdade eles so capazes de experimentar mais de um tipo de
interao pode conduzir a misturas com propriedades um pouco diferentes da esperada. O
lcool, por exemplo, certamente, dipolar, prtico e um bom receptor de prtons.
Na classificao da seletividade de um solvente por aproximao (modelo
solvatocrmico) os valores da dipolaridade de um solvente, pontes de hidrognio e basicidade
foram obtidos por metodologia espectroscpica e outras tcnicas especficas, processadas no
sentido de medir cada forma isolada de interao, diferente daqueles obtidos pela interao do
solvente com um composto tomado como referncia.
Os valores dos parmetros: - que representa a capacidade do solvente de interagir
como doador de hidrognio frente a um soluto bsico, - representando a capacidade do
solvente de agir como receptor de hidrognio diante de um soluto prtico e * a capacidade do
solvente de interagir com um soluto por fatores de polarizao e dipolo,foram desenvolvidos
dentro do contexto de relaes de energia de solvatao (LSERs), Linear Solvation Energy
Relationships.
log k ' = SP0 + m H + S * d KT + a + b

onde:
k ' = um fator de capacidade cromatogrfica;

SP 0 = fator do soluto (interceptao do);
H = parmetro de solubilidade de Hildebrand;

d KT = fator de correo de polarizabilidade (capacidade de polarizao);
(3)
59
m, s, a e b esto relacionados aos testes de dimenso do soluto, basicidade, acidez e

dipolaridade/polarizabilidade respectivamente.
Somados os valores de , e * , para cada solvente, as frao dos coeficientes de
interao, , e * expressam os coeficientes de (acidez), (basicidade) e
(dipolaridade) respectivamente. Organizados em um diagrama triangular, permitem ajuste de
seletividade de uma determinada mistura solvente nos mesmos moldes propostos por outros
diagramas triangulares empregados para este fim.
Encontra-se em Snyder, et. al (1979;1997) exemplo destes diagramas.
Fator de separao.
O fator de separao 12 entre duas substncias 1 e 2 mede a seletividade para duas

bandas adjacentes em um cromatograma, e representa a facilidade com que estas substncias
podem ser separadas, estando relacionado ao equilbrio entre o soluto nas fases adsorvidas e
aquele presente na soluo. Tem analogia a volatilidade relativa numa coluna de destilao e
representado por:
12 =
k1
k2
sendo,
k1 =
y1
x1
k2 =
y2
,
x2
(4)
onde: yi e xi so as fraes molares na fase lquida e na fase slida respectivamente e

ki a constante de equilbrio entre as duas fases, similar ao coeficiente de partio no equilbrio
(Wankat, 1986).
Reteno na cromatografia.
O adequado controle na reteno de um composto em relao a outro, em um processo

cromatogrfico a chave para o sucesso de separao. Na cromatografia em coluna a reteno
uma medida quantitativa da migrao, sendo definida pela razo entre a velocidade da
amostra e a velocidade da fase mvel,
R=
ux
,
uo
(5)
60
podendo ser tambm expresso em funo do tempo de reteno da amostra em relao ao

solvente por,
R=
to
,
tr
(6)
em que t t o intervalo de tempo entre a injeo da amostra e o pico mximo e t o o tempo

de eluio de um soluto no retido (Cass et al., 2001).
Na cromatografia em camada delgada a reteno, designada como Rf , o quociente
da distncia de migrao do soluto desde a linha de base, pela distncia percorrida pela fase
eluente, no mesmo intervalo de tempo (Stahl, 1969).
Quando uma amostra, transportada pela fase lquida, entra em contato com a fase
estacionria ocorrer a distribuio entre as duas fases de acordo com o valor do coeficiente
de distribuio. Tanto maior a afinidade do soluto com a fase estacionria, mais retida a
amostra e, de acordo com a equao (4), k1 =
y1
, maior o valor de x1 . Conseqentemente
x1
menor ser o valor do coeficiente k1 . Desta forma a amostra permanecer mais tempo no
interior da coluna. O soluto adsorvido, ao ser percolado por um solvente puro, restabelece
novamente o equilbrio de distribuio, desorvendo e difundindo-se neste novo solvente,
sendo ento transportado por ele at encontrar um adsorvente com superfcie livre sobre a
qual readsorver. O processo se repete at o soluto sair da coluna. As diferentes taxas de
migrao so, portanto devidas ao tempo ( t s ) que as diferentes espcies permanecem na fase
estacionria. Sendo assim, um soluto com baixo coeficiente de distribuio, ter um menor
nmero de molculas na fase estacionria, num mesmo intervalo de tempo, que um outro
soluto que apresente maior afinidade com aquela fase. Desta forma, este ltimo migrar mais
rpido da coluna. Temos ento que, o tempo de reteno inversamente proporcional ao
coeficiente de distribuio (Sewell et al., 1994).
Rm
1
k
(7)
O tempo total de reteno a soma do tempo que o soluto permaneceu na fase

estacionria mais aquele em que esteve na fase mvel.
61
t R = tm + ts
(8)
Volume de reteno.
A reteno numa coluna est relacionada frao de molculas presentes na fase

mvel e aquele presente na fase estacionaria. O quociente entre a velocidade de deslocamento
da banda de soluto e a velocidade da fase mvel, definido como fator de retardo R:
(u )
(u )
(9)
u x = Ru m
(10)
R=
onde,
Desde que as molculas do soluto s migram quando esto na fase mvel, a

velocidade com que o soluto se desloca atravs da coluna depende diretamente do nmero de
molculas presentes na fase mvel. Sendo assim R tambm pode ser definido como:
R=
ns
n s + nm
(11)
onde n s corresponde frao de molculas na fase estacionria e nm a frao na fase

mvel. A relao
ns
definida como fator de capacidade k ' (Snyder et al., 1997). Logo
nm
fazendo-se as substituies podemos ter R expresso em funo do fator de capacidade.

R=
1
1+ k`
(12)
Podemos tambm relacionar os parmetros; velocidades da banda e da fase mvel ao

fator de capacidade tal que:
um = u x (1 + k '
(13)
Ainda, como a velocidade de deslocamento da banda e da fase mvel, est relacionada

ao comprimento da coluna atravs dos respectivos tempos de reteno, tem-se que:
ux =
L
tR
(14)
um =
62
L
tm
(15)
Substituindo-se as equaes. 14 e 15 na equao.13 teremos:
t R = t m 1 + k' .
Por definio, a concentrao de soluto nas fases slidas
(16)
C S , e na fase mvel C m
obtida pelo quociente da frao de molculas do soluto nas fases slida e mvel
respectivamente em relao ao volumes das correspondentes fases V S e Vm , assim:
CS =
nS
VS
(17)
Cm =
nm
Vm
(18)
n S = C SV S
(19)
n m = C mV m
(20)
nS
nm
(21)
C SV S
C mV m
(22)
k =
k' =
Ainda, como o coeficiente ou constante de distribuio definido por:

K=
CS
Cm
(23)
, ao se efetuar a substituio na equao 22 teremos:

k' = K
Substituindo-se (23 ) em (16) tem-se:
VS
Vm
(24)
63
V
t R = t m 1 + K S
Vm
(25)
Como o volume retido pode ser expresso pelo produto da vazo de percolao pelo
tempo de reteno V R = Ft R . Dividindo-se a equao25 por F, teremos:
V R = Vm + KV S
(26)
De acordo com Sewell et al. (1994), em cromatografia por adsoro, o volume da fase
estacionria V S , no um parmetro de fcil determinao, visto que a adsoro um
fenmeno de superfcie a equao (26) no caso da cromatografia por adsoro pode ser escrita
como:
V R = V m + K A AS ,
(27)
onde K A e AS so coeficiente de adsoro e rea superficial respectivamente.

A seleo do solvente, com relao seletividade e fora, fator determinante no
desempenho da separao cromatogrfica, possibilitando melhor controle no parmetro de
reteno. A otimizao da mistura solvente pode ser facilmente conduzida inicialmente pela
tcnica da cromatografia em camada delgada CCD, visto que so os mesmos os mecanismos
de reteno envolvidos. Desta forma, os valores de Rf encontrados na CCD podem ser
usados para predizer os valores de k ' para a cromatografia lquida, empregando-se na coluna a
mesma fase estacionria (Snyder et al., 1979). A equao abaixo (28) relaciona ambos os
parmetros:
k' =
(1 R )
f
Rf
(28)
Ainda, uma vez que na cromatografia flash o fator de reteno o recproco do

volume de coluna, (CV), interessante que o composto de interesse tenha baixo RF na CCD.
Desta forma, o composto apresentar na coluna preparativa, maior tempo de contato em
relao queles compostos com maior RF, o que conduzir maior resoluo. Da mesma
forma para dois compostos adjacentes, uma grande diferena nos CV desejvel. Ainda,
quanto maior a diferena no CV, maior a capacidade de carga da coluna.
64
Por exemplo, se temos na CCD, um Rf=0,2 para um determinado composto teremos

que passar pela coluna um volume cinco vezes maior que volume do solvente contido na
coluna, de forma a deslocar este componente da coluna (Still, 1978).
2.9.3
RELAES DE EQUILBRIO DE ADSORO

As relaes de equilbrio entre o soluto adsorvido na fase estacionria e fase mvel
apresentam especial importncia no estudo da capacidade de um adsorvente, o que

normalmente feito na forma de grficos. A quantidade de um determinado soluto adsorvido na
fase estacionria depende da concentrao presente na fase mvel. A relao entre a
quantidade adsorvida, q e a concentrao na fase mvel C a temperatura constante
denominado isoterma de adsoro a temperatura T . (Suzuki, 1990).
q = q(C )
aT.
(29)
Outras formas de expressar estar relaes de equilbrio tambm so empregadas. As

isosteres apresentam curvas para um grau especfico de carga, em funo da presso parcial
ou ponto de orvalho, contra o recproco da temperatura absoluta. Enquanto os grficos
denominados Isobares relacionam as cargas adsorvidas, como funo da temperatura, para
uma dada presso parcial ou outra forma de medida de concentrao. Estes dois tipos de
grficos oferecem vantagem de linearidade em certos sistemas possibilitando facilidade de
extrapolao, (Knaebel, 1995).
Isotermas de adsoro.
Segundo Ruthven (1984), Brunauer e colaboradores classificaram as isotermas para

adsoro fsica em cinco classes. O modelo terico mais simples para adsoro, as isotermas
de Langmuir, originalmente desenvolvidas para representar quimiosoro em monocamada,
assume as seguintes restries:
as molculas so adsorvidas e fixadas a um nmero bem definido de stios

ativos,
cada stio pode fixar uma nica molcula de adsorbato,
todos os stios so energicamente equivalentes,
interaes entre molculas adsorvidas no esto presentes.
65
Diferente da adsoro em fase gasosa, na adsoro em fase lquida, ambos, soluto e

solvente competem pelos stios ativos do adsorvente (Wankart, 1986). Para solues diludas,
o efeito do solvente pode freqentemente ser ignorado e a equao de equilbrio para uma
soluo mono-componente tem a forma:
q=
q max . K A c
,
1 + K Ac
(30)
onde; q representa a quantidade adsorvida, q max . a capacidade de saturao da

monocamada, K A a constante de equilbrio de adsoro e c a concentrao da fase mvel.
(Wankart, 1986).
Um outro tipo de isoterma freqentemente empregada do tipo Freundlich.
q = KC
(31)
Segundo Suzuki (1990), por no impor limite de capacidade de adsoro, esta equao
somente aplicada em solues abaixo da concentrao de saturao, pois em condies de
saturao ocorrem fenmenos de condensao ou cristalizao, no sendo mais significativos
os fenmenos de adsoro.
Outras isotermas como as de (Brunauer-Emmett-Teller) BET e tambm as isotermas
de (Brunauer-Deming-Deming-Teller), (BDDT) so mais aplicadas quelas situaes onde a
adsoro se d com total preenchimento dos poros atravs de mltiplas camadas (Knaebel,
1995).
Quando a isoterma linear, K constante, isto , independe da concentrao. Neste
sentido, durante o deslocamento da banda atravs da coluna, devido ao homogneo gradiente
de concentrao atravs do leito resulta uma mxima concentrao no centro do pico,
conduzindo a um pico simtrico (gaussiano). Isto significa que o pico desloca-se
integralmente na mesma velocidade. O alargamento da banda e formao de cauda se d
quando diferentes fenmenos de difuso esto presentes. O pico cromatogrfico produzido
quando o sistema apresenta isoterma do tipo Langmuir (perfil cncavo em relao abscissa)
conduz normalmente a picos com cauda posterior ao deslocamento do pico. Enquanto para
isotermas anti-Langmuir, a cauda situa-se frente do pico. No primeiro caso, quanto maior a
interao do soluto com a fase estacionria e mais fraca com a fase mvel, mais intenso ser
este comportamento. Na Figura 10 so apresentados exemplos de picos caractersticos e as
correspondentes isotermas.
66
Figura10- Isotermas: (a) Langmuir, (b) anti-langmuir e (c) e (d) os cromatogramas
relacionados
Como a taxa de deslocamento dada pela equao 12, inversamente proporcional
equao 23, para a isoterma Langmuir o valor da constante K diminui com o aumento da
concentrao de adsorbato na fase slida. Em conseqncia, a migrao atravs da coluna no
homognea. Onde a concentrao mais baixa, teremos um maior valor de K . Desta forma,
como o centro da banda est mais concentrado mover mais rapidamente, alcanando a frente
da banda e deixando uma cauda atrs desta. Situao inversa ocorre com um sistema que
apresente uma isoterma anti-Langmuir (Sewell et al., 1994).
2.9.4 DESLOCAMENTO DO SOLUTO ATRAVS DE UM LEITO EMPACOTADO
O fluido contendo o soluto percola atravs dos espaos interpartculas (macro-poros)

difundindo pelo filme externo s partculas. Neste ponto, pode ocorrer adsoro na superfcie
externa ou difuso para o interior dos poros contendo fluido estagnado. As partculas de
dimenses inferiores ao dimetro dos poros interagem com os stios ativos disponveis atravs
de mecanismos fsicos, foras eltricas ou reaes qumicas. Enquanto adsorvido, o soluto
pode difundir-se sobre a superfcie. O processo inverso conduz o soluto ao filme externo e
posteriormente ao fluido em movimento na coluna. Neste processo, uma dada molcula pode
adsorver e dessorver muitas vezes no interior e superfcie de uma mesma partcula.
67
Retornando ao fluido em movimento, o soluto difunde para outra partcula e todo o processo
se repete. Desta forma, ao longo do processo, o soluto apresenta desde a velocidade do fluido
em movimento na coluna at a velocidade zero, quando se encontra adsorvido. A separao
ocorre devido ao movimento diferencial dos solutos ao longo da coluna (Wankat, 1986).
A migrao diferencial ou o movimento de um composto individual atravs da coluna
depende do equilbrio de distribuio de cada composto entre as fases mvel e estacionria.
Vrios fatores contribuem na cromatografia, para a migrao diferencial como tambm
para o alargamento da banda, so eles: a difuso de eddy ou mltiplas trajetrias; a
transferncia de massa nas fases mvel, estagnada e estacionria, e a difuso longitudinal,
esta, apresentando efeito significativo apenas em condio de reduzida velocidade do fluido
na coluna (Snyder et al., 1979). Contudo, na cromatografia lquida a grande diferena nas
propriedades fsicas tais como, coeficiente de difuso e viscosidade determinam efeitos
marcantes na transferncia de massa nas fases mvel e estacionria (Sewell, 1994).
Durante o processo de deslocamento da banda, alguma frao de soluto permanece por
mais tempo retida que outras. Desta forma, para um simples componente, nem todas as
molculas de soluto eluem em um mesmo tempo. Algumas molculas eluem numa frao de
tempo menor enquanto outras demandam um pouco mais de tempo (Sewell, 1994). Isto
observado na forma Gaussiana apresentada por um cromatograma. A assimetria na forma do
pico tambm conhecida como cauda, decorre do atraso (tailing) ou adiantamento (fronting) da
frente de soluto ao se deslocar na coluna.
Segundo Snyder et al. (1997), a formao de cauda em um cromatograma pode ter
origem de diversas fontes, a Tabela abaixo relaciona algumas possveis fontes.
Tabela 6 - Fatores responsveis pela m definio de um pico cromatogrfico.
Causa de assimetria de picos

Coluna danificada; frita bloqueada ou com vazios.
Alargamento ou sujidade na entrada da coluna
Sobrecarga de amostra
Solvente inadequado
Efeito de extra-coluna
Efeito de reteno secundria (silanol) ou qumica
Tamponamento inadequado ou inapropriado
Contaminao com metais pesados
68
O efeito de sujidades (soluto fortemente retido) pode ser eliminado procedendo-se

uma prvia purga, com um solvente que possua elevada interao com a fase estacionria. O
alargamento de banda aumenta normalmente com o tempo de reteno.
2.9.5 MEDIDAS DE EFICINCIA NA CROMATOGRAFIA

Resoluo.
Para a determinao da resoluo de bandas adjacentes, consideram-se as larguras das

bandas W i na linha de base como mostra a Figura 11, como tambm seus respectivos tempos
de reteno t i de acordo coma equao abaixo:
RS =
2(t 2 t1 )
,.
(W1 W 2 )
(32)
Esta equao se aplica sempre que as bandas estiverem bem resolvidas (separadas). A
determinao manual da largura da banda na linha de base envolve a construo de tangentes
de cada lado da banda, sendo a largura desta a distncia entre a interseco daquelas tangentes
com a linha de base. Uma forma mais prtica e que leva a resultados mais precisos faz uso da
largura da banda a meia altura da linha de base. Esta alternativa faz uso da equao 33 mais
conveniente no exigindo extrapolao das linhas tangentes aos pontos de inflexo, sendo
tambm mais exata.
RS =
1.18(t 2 t1 )
(W0 ,51 W0 ,5 2 )
(33)
Contudo clculos de R S aplicando-se estas equaes no so confiveis quando

apresentam valores menores que 1 (Snyder et al., 1997). Na prtica, um valor de R S = 1
corresponde a uma separao na ordem de 94 %, isto 94% do pico puro e os outros 6%
restantes estariam contaminados com o componente de banda adjacente sobreposta (Sewell et
al., 1994).
Na Figura 11 apresentado um pico cromatogrfico tpico onde so mostrados: a
largura a meia altura (B), a largura na base (C), o tempo de reteno e a altura do pico (D).
69
Figura 11 Pico cromatogrfico tpico.
A presena de bandas adjacentes, parcialmente sobrepostas em um cromatograma,

ilustrada na Figura 12, onde T1 e T2 correspondem aos tempos de reteno dos picos 1 e 2, W1
e W2 s larguras dos picos e W1/2 , largura dos picos a meia altura.
Figura 12 Cromatograma com banda adjacentes.
Assimetria de pico.
A assimetria de um pico a medida do quociente
CB
conforme mostra a Figura (13).
AC
Figura 13Pico cromatogrfico assimtrico.

Nmero de pratos tericos.
A eficincia de uma separao cromatogrfica est relacionada forma e boa

definio dos picos. Quanto mais estreito, simtrico e alongado o pico, mais eficaz a coluna.
O alargamento da banda cromatogrfica est normalmente relacionado ao aumento do tempo
70
de reteno, implicando na reduo da eficincia. A eficincia de uma coluna

freqentemente expressa pelo nmero de pratos tericos (N), ou pela altura equivalente de
um prato terico (HETP) ou simplesmente H (Sewell et al.,1994). Cada prato corresponde a
estgio de equilbrio do soluto entre as duas fases. Na cromatografia em coluna, o nmero de
pratos tericos calculado a partir do cromatograma. Vrios so os mtodos disponveis para
a determinao de N. O mtodo absoluto, mais indicado para picos assimtricos faz uso da
varincia do segundo momento central t2 sendo expresso pela equao:
2
(
tR )
,
N=
( t )2
(34)
onde: t R a medida do tempo de reteno do pico. Quando os picos so simtricos pode-se

empregar uma das trs equaes abaixo:
t
N = 16 R
tW
N = 5 ,54 R
t1
2
ou
h" t R
N = 2
A
(35)
onde: t W a distncia na linha de base entre a interseo das tangentes anteriores e

posteriores do pico. t 1 a largura do pico a meia altura e, h' e A so respectivamente a
2
altura e rea do pico.

Segundo Snyder (1979), estas formas de clculo so empregadas com picos com
assimetria de at 1,2. Acima deste valor os erros so significativos.
Altura equivalente de um prato terico.
Relaciona o nmero de pratos e o comprimento da coluna. Este parmetro serve para

comparar a eficincia entre colunas de diferentes comprimentos. Por definio:
H=
L
N
(36)
Altura do prato reduzido.
Correlaciona a altura de um prato terico com o dimetro de partculas e serve para

comparar a eficincia entre colunas de diferentes comprimentos empacotadas com partculas
de diferentes dimetros.
h=
71
H
dP
(37)
Este parmetro permite estimar o desempenho de uma coluna em funo de condies

experimentais.
Como a velocidade da fase mvel atravs da coluna pode tambm afetar seu
desempenho, outra correlao reduzida pode ser empregada como ferramenta de avaliao,
sendo definida como velocidade reduzida:
v=
ud P
Dm
(38)
Sendo u a velocidade da fase mvel e Dm o coeficiente de difuso do soluto na fase mvel

(Snyder et al., 1979).
2.9.6 OTIMIZAO DE UMA COLUNA-CONTROLE DA RESOLUO

A equao:
( )(
k'
,
R S = 1 1) N
'
4
(1 + k
(39)
relaciona parmetros cromatogrficos resoluo. Os parmetros presentes na equao

podem ser alterados para melhorar a resoluo de uma coluna. O aumento no fator de
separao resulta no deslocamento de uma banda em relao a outra, no alterando de forma
significativa as alturas dos picos para moderadas mudanas no valor de . Por outro lado, um
incremento no valor de N , conduz a um estreitamento das bandas e tambm um aumento na
altura dos picos, enquanto o tempo de separao no sofre grande alterao pela variao
tanto de quanto de N . Em contrapartida, variao no parmetro k ' produz significativo
efeito na resoluo, contribuindo para grandes mudanas na separao. Um decrscimo no
valor de k ' acarreta deficincia na separao, enquanto um incremento conduz a um
significativo aumento na resoluo. Quando o valor de k ' baixo para uma condio inicial
de separao, deve-se aument-lo numa faixa ideal de 1 k ' 10 . Nenhuma outra mudana
nas condies de separao conduz a um aumento na resoluo com to reduzido esforo
(Snyder et al., 1979). A forma de controle de k ' se faz pela mudana da fora do solvente, a
72
qual interfere diretamente na reteno do soluto fase estacionria. Em conseqncia, um

aumento na reteno corresponde a um aumento da resoluo.
Num processo de separao cromatogrfica o fator de reteno no deve ser muito
reduzido. Isto , a interao do soluto com a fase estacionria no deve ser muito pequena.
Por outro lado, se esta interao for demasiadamente grande acarretar alargamento de picos.
Na cromatografia por fase normal, o aumento do fator de reteno conseguido pela reduo
da polaridade da fase mvel (Snyder et al., 1997).
Sobreposio de pico com sobrecarga de amostra.
Quando se aumenta a sobrecarga da coluna ocorre o alargamento de pico, e

dependendo da extenso desta sobrecarga, ocorrer a sobreposio de bandas. Esta
sobreposio de bandas pode comprometer a eficincia de separao no que se refere pureza
do soluto a ser recuperado. Segundo Sewell et al. (1994), a sobrecarga excessiva tambm
conduz ao afastamento das bandas.
Porm, quando maior quantidade de material purificado requerido, conveniente
proceder-se a sobrecarga de amostra. Ainda que ocorra a sobreposio de bandas um
adequado corte da frao de interesse possibilita obter um produto altamente purificado alm
de maior produo por unidade de tempo, quela que seria possvel se operada a coluna no
limite ideal de carga.
Valores baixos de resoluo acarretam picos mais altos e mais largos acarretando erro
na determinao da pureza quando se procede ao clculo de rea. Na cromatografia
preparativa, segundo Sewell et al. (1994), um valor de resoluo R = 1 permite uma separao
na ordem de 94 % de pureza, os restantes 6% correspondem contaminao pelo componente
do pico adjacente. O aumento da resoluo leva conseqentemente a um aumento da pureza
do produto a ser isolado.
Forma do pico - Cauda ou sobreposio?
Quando dois solutos apresentam baixa reteno relativa, deve-se otimizar a resoluo
pela adequao do solvente, no sentido de melhorar a seletividade e conseqentemente a
resoluo. A eficincia na separao ser notada pela formao de um vale entre os dois
picos. Dependendo porm da concentrao relativa entre ambos os solutos e da insuficiente
seletividade do solvente, o no aparecimento de um vale mais sim o surgimento de um ombro
73
no cromatograma pode sugerir erroneamente se tratar de assimetria. Nestas condies

conveniente melhorar a resoluo para se certificar do fato. Se finalmente, o aumento da
resoluo levar ao aparecimento de um vale, trata-se de um componente em menor
concentrao, encoberto pela banda do soluto que se encontra em maior concentrao,
exigindo, portanto otimizar a mistura solvente para melhorar a separao. Entretanto se a
forma da banda no se modifica com o aumento da resoluo tem-se a comprovao de
assimetria (Sewell et al., 1994). Ainda, segundo o Autor, no caso de picos sobrepostos, a
posio dos verdadeiros centros das bandas de dois componentes no corresponde posio
aparente para os picos combinados. Quando se reduz a sobreposio dos picos, com aumento
da resoluo, no s os centros das bandas convergem para as posies reais como tambm as
alturas dos picos convergem para seus valores verdadeiros, inferiores aqueles que se
destacavam quando sobrepostas estavam as bandas.
2.9.7 PERMEABILIDADE EM UMA COLUNA CROMATOGRFICA

A avaliao da permeabilidade de uma coluna importante no sentido de reproduzir
colunas com as mesmas caractersticas de separao quando mantidos todos os parmetros de
dimenso de coluna e material de empacotamento. Reproduzir a mesma condio de
empacotamento conduzindo a colunas que apresentaro similares desempenhos de separao.
A equao abaixo,
to =
15000 L2
Pd 2p f
(40)
relaciona o tempo morto t o aos parmetros: comprimento da coluna L , viscosidade da fase

mvel , dimetro de partcula d p e a perda de carga atravs do leito. O valor atribudo a f ,
ser de 1, 2 ou 4 se as partculas apresentarem poros irregulares, esfricos ou empacotamento
pelicular respectivamente. Segundo Snyder et al. (1979), a reduo na permeabilidade da
coluna efetivamente reduz o desempenho da coluna em algumas aplicaes, resultando em
tempos maiores para uma dada separao.
2.9.8
74
DESEMPENHO DE UMA COLUNA

Segundo Snyder et al. (1979), o desempenho de uma coluna, tem sido
tradicionalmente definido pelo nmero de pratos. Embora til, este parmetro por si s no
fornece informaes suficientes para avaliar de forma apropriada a sua utilidade. Vrios
fatores contribuem para o desempenho de uma coluna, devendo portanto ser avaliados, so
eles: resistncia ao fluxo ,
0 ,1Pt o d p2
10 9 L2
(41)
onde d p igual ao dimetro das partculas ( m ), P , a perda de carga (bar), L , o

comprimento (m), t o o tempo de reteno para o soluto no retido (em segundo), a
viscosidade da fase mvel (cP).
2.10 ADSORVENTES
Quase todas as aplicaes atuais da cromatografia lquida preparativa esto limitadas
ao emprego de slica ou a alumina. Estes adsorventes apresentam similares propriedades de
reteno, sendo preferencialmente retidos os compostos mais polares. Por um nmero de
razes prticas, muitas separaes so hoje conduzidas mais freqentemente com slica. Esta
apresenta maior capacidade de carga, menos sujeita a catalisar reaes indesejveis durante
a separao e existe disponvel em uma ampla variedade de forma e caractersticas de
superfcie. Apresentam pequena diferena, normalmente para menos, na reteno relativa
quando comparada alumina. Em alguns casos so similares, em outros a diferena no chega
a 30 % do valor desta ltima. Compostos cidos so mais intensamente retidos em alumina, s
vezes de forma irreversvel, como tambm aromticos de anis maiores apresentam elevada
reteno. Outro fator que leva ao emprego da slica a sua baixa acidez, diferente da alumina
(normalmente bsica). Deve-se evitar a exposio alumina daquelas amostras sujeitas a
catlise cida ou bsica, pois reaes indesejveis podem ser catalisadas. Neste sentido, a
slica, apesar de apresentar acidez, pH 5,0, tem reduzido efeito catalisador comparado
alumina bsica cujo pH 12 (Snyder et al., 1979).
75
A superfcie especfica da slica pode variar de 300 a 900m2/g dependendo da

densidade. Os produtos mais densos tm poros mais finos e maior rea superficial (Knaebel,
1995).
A slica apresenta polaridade mxima quando, aps ter sido exposta a gua, aquecida
at 170o C. Isto se deve ao fato de que a gua fisicamente adsorvida geralmente presente na
superfcie removida deixando ativo um grande nmero de grupos silanol. O tratamento
trmico da slica resulta conseqentemente em mudana nas propriedades adsortivas.
Contudo, o aquecimento acima de 200o C leva a perda total da habilidade de separar
compostos polares (Sewell et al., 1994).
2.10.1 CARACTERSTICAS DO ADSORVENTE

Atributos como capacidade, seletividade, regenerabilidade, compatibilidade, alm de
custo, so importantes na seleo de um adsorvente, Entretanto, raramente um adsorvente
rene todas estas caractersticas (Knaebel, 1995).
Seletividade.
Um adsorvente altamente seletivo requisito primrio para um processo de separao

econmico, mas tambm, a elevada capacidade de carga e vida til so aspectos de grande
importncia.
Porosidade do adsorvente.
Uma elevada superfcie especfica de uma partcula favorece a uma grande capacidade
de adsoro. A criao de uma elevada superfcie interna, pela presena de poros proporciona
um excepcional aumento da rea superficial de um adsorvente. O tamanho dos micro-poros
determina a acessibilidade das molculas do soluto superfcie de adsoro, de forma que a
curva de distribuio de poros uma outra importante propriedade para caracterizao da
adsortividade de um adsorvente. Alguns adsorventes possuem alm dos micro-poros, macroporos de grande dimenso, resultado do processo de granulao de ps ou cristais finos dentro
dos pelets ou de origem da textura da matria prima (Suzuki, 1990).
Uma variedade de mtodos para produo de slica gel tm sido descritos. No processo
de hidrlise do silicato alcalino com um cido, o cido silcico liberado polimeriza,
76
condensando em aglomerados aproximadamente esfricos formados por uma rede de SiO4

o
tetradricos ligados entre si, apresentando dimetro de 20 a 200 A . Aps a secagem, os

aglomerados formam uma estrutura micro-porosa, cuja dimenso dos poros determinada
principalmente pela dimenso original das micro-partculas. A ligao entre as partculas
ocorre com a eliminao de hidroxilas vizinhas s partculas. A presena de grupos hidroxilas
no eliminados atribui slica diferentes graus de polaridade (Ruthven, 1984).
Determinao da porosidade de uma partcula.
Porosmetro de mercrio.
Uma forma prtica para determinao da porosidade realizada com freqncia com
porosmetro de mercrio (Ruthven, 1984). A partcula porosa imersa no mercrio. Este
penetrar nos poros at que a presso aplicada ao fluido atinja o valor de equilbrio da fora
de tenso necessria para vencer a fora de tenso capilar, tanto maior quanto menor o
dimetro do poro. Segundo a equao abaixo possvel verificar o princpio de
funcionamento. A Tabela 7 relaciona a presso necessria penetrao, de acordo com o
dimetro de poros.
Pr 2 = 2rCos
Figura 14 - Esquema representativo de um poro.
Tabela 7 - Relao da presso de equilbrio do mercrio
com o dimetro dos poros de um adsorvente.

Presso (atm) 10
100
o
2.2 x 104 2200
Raio ( A )
103
220
104
22
77
Mtodo de adsoro de nitrognio BET.
Quando a adsoro do nitrognio efetuada na temperatura do nitrognio lquido

(77,34 K), ocorre a adsoro na superfcie dos poros e posterior condensao no seu interior.
A espessura da camada adsorvida ( t ) e o tamanho dos poros onde ocorre a condensao
dependem da presso parcial do nitrognio na superfcie. Da isoterma de adsoro, obtida
pelo mtodo gravimtrico ou pelo mtodo a volume constante pode-se determinar a
distribuio cumulativa do tamanho dos poros. Segundo Suzuki (1990), varias equaes so
propostas relacionando a espessura da camada adsorvida e a presso. Entre elas, a relao de
HALSEY uma das mais importantes:
1
3
p
t A = 4 ,35 / ln S ,
p
(42)
onde p S a presso de saturao.

Ainda, segundo Suzuki (1990), quando a adsoro ocorre em multicamadas na
superfcie do adsorvente, as molculas sobrepostas quelas diretamente ligadas superfcie
apresentam diferentes foras de interao. A adsoro por monocamada formada pelo
mesmo conceito de adsoro do tipo Langmuir, enquanto aquelas acima das monocamadas
so equivalentes condensao de molculas do adsorvato, dando lugar equao de BET
(Brunauer, Emmett and Teller, 1938).
q
qm
= K B p r / (1 p r )(1 p + K B p r ) ,
(43)
onde: p r a presso relativa, K B a constante de equilbrio e q m a quantidade adsorvida na

superfcie (monocamada). O valor de q m obtido da isoterma pode ser convertido para rea
superficial, multiplicando-se pela rea superficial do nitrognio, igual a 3480m2/g.
2.11 POROSIDADE DE UM LEITO

O espao disponvel em um leito empacotado corresponde soma dos espaos interpartculas (porosidade do leito) e aqueles presentes no interior das partculas (intrapartcula) , que correspondem frao de espaos vazios no interior da partcula. Estes,
pelas suas dimenses podem ser micro ou macro-poros. Em mdia, apenas 2% da superfcie
disponvel encontra-se externa as partculas, estando a maior capacidade no interior dos poros.
78
A frao de volume de poros que uma partcula pode penetrar denominada K d . Se a

molcula pequena e tem acesso a todos os poros o valor de K d igual a 1. O volume de
eluio Ve acessvel molculas de reduzida dimenso ser ento:
Ve = Vo + Vi = Vcol . + (1 ) Vcol .
(44)
Para molculas de grandes dimenses que no tm acesso aos poros internos da

partcula, seu volume de eluio ser:
Ve = Vo = Vcol .
(45)
As equaes (42 ) e ( 43 permitem determinar Vo , , V i , atravs de experimentos

com grandes molculas e um experimento com molculas pequenas. Molculas de dimenses
intermedirias podem penetrar alguns dos poros interpartculas, de forma que, para estas
molculas K d pode ser determinado de:
Kd =
(Ve Vo )
Vi
(46)
Cromatografia por gel permeao ou excluso so baseadas exclusivamente nas

diferenas de K d (Wankart ,1986).
Segundo Snyder et al. (1979), a porosidade total de um leito cromatogrfico pode
tambm ser expressa por:
tot =
4 Fc t o
,
d c2 L
(47)
onde Fc o fluxo (cm3/seg) e d c o dimetro da coluna.

Atravs da anlise da literatura, verificou-se a existncia de uma lacuna de publicaes
voltadas obteno de bixina com elevada pureza, que o objeto deste trabalho.
A seguir sero apresentados os equipamentos, reagentes e metodologia empregados no
desenvolvimento do presente trabalho.
CAPTULO 3 MATERIAL E MTODOS
79
CAPTULO 3 - MATERIAL E MTODOS

Neste captulo so apresentados os reagentes, equipamentos e a metodologia
empregada para a execuo dos experimentos. Os trabalhos foram desenvolvidos no
Laboratrio de Transferncia de Massa (LABMASSA) da Universidade Federal de Santa
Catarina, UFSC.
3.1 SEMENTE DE URUCUM
Foram empregadas neste trabalho sementes de urucum, cedidas pela empresa CHR
Hansen Indstria e Comercio LTDA Valinhos SP.
Teor de bixina.
As sementes foram analisadas pelo mtodo da hidrlise, segundo Kato et al. (1992).
Armazenamento.
Aps seu recebimento, pores de cerca de 250g de sementes, foram transferidas para
embalagens plsticas aluminizadas, as quais foram seladas a vcuo e conservadas na
geladeira, temperatura de 5 C.
3.2 EQUIPAMENTOS
Os seguintes equipamentos e acessrios foram empregados para a conduo dos

trabalhos:
Espectrofotmetro - Marca Shimadzu - Modelo UV mini 1240;
Coletor de fraes - marca Gilson modelo FC 204;
Sistema de aquisio de dados: Espectrofotomtricos software UV Data Aquisition

Shimadzu, conectado a um microcomputador Celeron MMX (266 MHz);
Centrfuga - marca, Jouan B4i, velocidade mxima 17000 rpm., rotor monobloco com
capacidade para 10 tubos de 6ml;
Pipetas de preciso - marca Ependorf, de 100, 1000 e 5000 l;
Unidade pressurizada para filtrao;
80
Constitui-se de um dispositivo empregado para filtrao com membrana, confeccionado

em ao inoxidvel, com capacidade para 120ml de soluo. Como elementos filtrantes
foram empregados papis de filtro grau qualitativo de porosidades mdia e alta.
Coluna para cromatografia preparativa flash.

O sistema para cromatografia empregado dispe de um vaso para pressurizao da
soluo confeccionado em ao inoxidvel com capacidade para 250ml. Duas colunas
foram construdas: uma com tubo de 10,85 x 298,40 mm e a outra de 6,08 x 262,10mm
com extremidades adaptadas, usinadas em Teflon.
3.3 REAGENTES
Nos processos de extrao, preparao das amostras e na cromatografia preparativa

foram empregados reagentes e solventes PA, das marcas Nuclear, Synth, Biotec e Vetec;
Fase estacionria As colunas cromatogrficas foram empacotadas com Slica gel 60 marca
Vetec, malha 40 60 (230-400 mesh) com densidade aparente 0,4 g/cm3;
Cromatografia em camada delgada - lminas revestidas com slica gel 60 espessura 0,2mm
marca Merck, artigo n 105554.
Na descrio dos processos de extrao foram empregados os seguintes termos:
Extrato slido ou extrato bruto: sempre se referindo ao produto bruto (pigmento)

removido da semente, por operao mecnica ou com a participao de um solvente, que
no necessariamente solubiliza a bixina, mas que facilita a remoo dos componentes que
mantm a camada de pigmento aderida semente.
Extrato solvel (Es): soluo contendo os componentes solveis do extrato bruto.
Extrato seco (ES): material slido obtido do extrato solvel aps eliminao do solvente.
81
3.4.1 PR-PURIFICAO DO EXTRATO SLIDO DE URUCUM (PIGMENTO)
Dois diferentes procedimentos foram adotados para pr-purificao do extrato slido:
i) Extrao em vaso aberto Procedimento I.

Sobre uma massa de 250 g de sementes, contida em um becker de 1000mL,
adicionava-se 150 mL de hexano e igual volume de etanol. Aps enrgica agitao por 45
minutos, procedia-se remoo das sementes com o auxlio de uma peneira de nylon de
malha 1,0 mm. Na seqncia, para remover sujidades como tambm materiais particulados
removidos dos gros por atrio, passava-se o pigmento atravs de uma malha fina de
serigrafia (mono-filamento com 120 fios/cm2). Depois de drenado o solvente, o pigmento era
conduzido ao subseqente ciclo de extrao.
A cada ciclo, aps decantao e posterior centrifugao, alquotas da soluo eram
coletadas, para determinao da massa de extrato seco e do teor de bixina segundo
metodologias (3.9.2) e (3.9.1).
Com a prvia remoo das sementes, a reduzida quantidade extrato bruto resultante
permitia que os ciclos subseqentes ao primeiro fossem tratados com menor volume de
mistura solvente, de forma a minimizar as perdas de bixina solubilizada. Para tanto, o volume
de mistura empregado era reduzido de 250 para 50mL.
No curso dos ciclos de lavagem com hexano/etanol, aps verificar predominncia de
bixina na composio do extrato seco, empregava-se somente hexano como solvente. O
extrato assim obtido era conduzido ao processo de extrao da bixina e posteriormente
cristalizao.
O procedimento acima descrito foi adotado para preparao de material necessrio a
obteno de extrato bruto, e matria-prima para bixina recristalizada, enquanto experimentos
destinados otimizao do processo de extrao a exemplo dos experimentos 1, 2, 3 e 4,
descrito na Tabela 8, foram realizados em vaso aberto, porm empregando-se menores massas
de semente e diferentes relaes de solvente.
ii) Extrao em tubo fechado Procedimento II.

Em dois tubos de ensaio de 15 mL, providos de tampa, foram colocados 2,5 g de
semente de urucum e em outros dois 0,18g de extrato bruto (pigmento removido da semente
aps um ciclo com hexano/lcool 1/1). Etanol absoluto e ter etlico foram testados como
82
solventes em seis ciclos consecutivos de extrao. Decorridos 30 min. de contato e agitao

constante, o contedo era centrifugado, retirando-se ento 5mL para determinao de massa
de extrato seco e 0,5 mL para espectrofotometria. Esta alquota, depois de eliminado o
solvente por passagem de nitrognio, era diluda a 100mL com soluo de NaOH 0,5 N para,
a seguir, proceder leitura espectrofotomtrica. Ao final de cada ciclo, os tubos eram vertidos
sobre um papel absorvente para drenar ao mximo o solvente do ciclo anterior. Acrescentavase a seguir solvente PA dando continuidade ao prximo ciclo. Os resultados deste
experimento so detalhados na Tabela 20, designados como experimento 5.
Na Tabela 8 so apresentadas informaes relativas aos experimentos cujos resultados
so mostrados no Captulo seguinte - Resultados e Discusses.
Tabela 8 Relao das informaes contidas nos experimentos de extrao.

no ciclos
Relao
Expto
Massa (g) sub/solv.
Exp-1
Sem. 42
1/1
Exp-2
Sem 42
1/1
Exp-3
Sem 20
Exp-4
Ensaios
% bix mtodo
ST
obs.
2 Hex
Sim
Kato
Sim
a, b
2 Hex
Sim
Kato
Sim
1/5
Sim
Kato
Sim
c, d
Sem 50
1/1
2 Hex
Sim
Clorof.
Sim
Exp- 5-1
Sem 2,5
1/1
6 EE
Sim
Kato
Sim
Exp- 5-2
Sem 2,5
1/1
6 Alc
Sim
Kato
Sim
Exp- 5-3
Ext
0,18
1/5
6 EE
Sim
Kato
Sim
Exp- 5-4
Ext
0,18
1/5
6 Alc
sim
Kato
Sim
Hex/Alc Outro
Legenda: Sem = semente; Ext = extrato; Sub = substrato submetido extrao; Solv = solvente; Hex =
hexano; Alc = etanol; EE = ter etlico; Bix = bixina; ST = slidos totais.
a - slido posteriormente submetido extrao com acetona;
b - slido posteriormente submetido extrao amoniacal;
c - curva de calibrao processada com os extratos provenientes de cada ciclo;
d - amostras de cada ciclo acompanhadas para avaliao da estabilidade a estocagem;
e - curvas espectrofotomtricas disponveis;
f amostra submetida coleta especial.
83
3.5 PADRO DE BIXINA
A inexistncia no mercado de um padro de bixina como tambm de norbixina,

somado reduzida estabilidade destes compostos a estocagem, levou necessidade de
preparao de padres, os quais foram empregados para o monitoramento das amostras
coletadas no curso deste trabalho. Os padres de bixina foram obtidos via recristalizaes
sucessivas em acetona conforme descrito na Seo (3.11). Os padres, na forma de cristal,
foram mantidos em frasco mbar, no compartimento superior do refrigerador (-8oC) e
envolvidos em folha de alumnio. Ainda, sempre que possvel, mantidos sob vcuo ou em
atmosfera de nitrognio. Empregou-se tambm uma amostra de procedncia da empresa CHR
Hansen A/S de Hrsholm Dinamarca, lote BX-124-99.
3.6 DETERMINAO DA SOLUBILIDADE DA BIXINA E NORBIXINA
Em tubos de ensaio, foram colocados cerca de 25 mg de padro de bixina

acrescentando-se a seguir aproximadamente 4,0 mL do solvente em estudo. Devido ao
pequeno volume de solvente empregado, a massa empregada garantia condio de saturao.
Os tubos foram submetidos temperatura 30 C. Aps repouso, os tubos foram levados
centrfuga, para em seguida retirar-se uma alquota precisa, para anlise espectrofotomtrica,
adotando-se o procedimento analtico descrito em 3.9.1 (variante para pequeno volume).
A solubilidade foi determinada nos seguintes solventes: acetona, acetato de etila,
etanol, clorofrmio, ter etlico, metanol, hexano, solues aquosa de hidrxido de sdio e
solues; aquosa e hidro-alcolica de hidrxido de amnio.
3.7
MONITORAMENTO DO TEOR DE BIXINA DE EXTRATO BRUTO EM

MEIO ALCOLICO
Amostras provenientes de diferentes ciclos de extrao com mistura etanol /hexano 1/1
foram separadas para acompanhamento segundo o procedimento abaixo:
De cada ciclo de extrao foram separados 10 mL de soluo, eliminando-se o hexano
com nitrognio. Na seqncia, foram diludas a 50 mL com etanol. Oito pores de 5mL, de
cada uma destas solues, foram transferidas para pequenos frascos, seladas e mantidas na
geladeira (5 C) para posterior leitura espectrofotomtrica no comprimento de onda de 486
nm, regio de mxima absoro da bixina em soluo alcolica. Durante sete meses estas
84
solues foram monitoradas. Periodicamente, fazia-se a leitura espectrofotomtrica de oito

amostras, uma de cada ciclo, que em seguida eram descartadas. Os resultados deste
acompanhamento so apresentados na Tabela 27.
3.8
AVALIAO DAS CONDIES DE ESTOCAGEM DE PADRO
Amostras de bixina e de derivado amoniacal, na forma slida (cristais) e em solues,

foram monitoradas periodicamente durante 90 dias. Os padres slidos, todos provenientes de
um mesmo lote foram estocados em fraes individuais e lacrados, sendo descartados a cada
anlise. Os recipientes contendo as amostras em soluo eram retirados do freezer e depois de
atingida a temperatura ambiente uma alquota era coletada para anlise. Logo aps, o frasco
retornava ao freezer.
As amostras slidas foram estocadas nas seguintes condies:
a) Em gs liquefeito de petrleo (GLP);
b) Sob vcuo;
c) Em atmosfera de nitrognio.
Os solventes empregados para estocagem foram respectivamente:
a) Etanol absoluto;
b) Etanol com 2% de BHA (butil hidroxianisol);
c) Etanol com 2% de vitamina E (-tocoferol);
d) Soluo 50/50 de acetonitrila e dimetilformamida.
Todas as amostras foram mantidas no freezer a 8 C e isoladas da luz. As anlises foram
realizadas no dia de preparao da amostra e posteriormente com 8, 15, 30, 60 e 90 dias de
estocagem.
Procedimento para preparao e estocagem das amostras.
Bixina recristalizada e derivado amoniacal, recm produzidos, foram analisados e
divididos em pequenas pores, as quais foram transferidas para frascos de 8 mL e
imediatamente fechados com lacres de alumnio. Introduzindo-se uma agulha, perfurava-se a
tampa de borracha fazendo-se vcuo. A seguir injetava-se GLP, nitrognio ou mantinha-se
sob vcuo. Aps a remoo da agulha, colocava-se uma pequena poro de cola de silicone na
regio do orifcio feito pela agulha. As amostras eram ento mantidas no freezer at o dia da
anlise. As amostras em soluo foram preparadas pela pesagem de uma massa dos padres e
diludas no solvente de interesse. Os padres acrescidos de antioxidante foram preparados
85
com prvia dissoluo do aditivo no solvente, a seguir esta soluo era empregada para
dissolver uma massa precisa do padro. Depois de aferido o balo. a soluo era analisada,
transferida para frascos mbar e colocadas no freezer.
Anlise das amostras

-Amostras slidas (cristais)
Nas amostras mantidas em GLP, eliminava-se previamente o gs, pela introduo de
uma agulha atravs da borracha, permitindo a vaporizao do contedo lquido. A seguir
inseria-se outra agulha e passava-se uma corrente de nitrognio para permitir a remoo do
gs residual do interior do tubo. Abria-se ento o frasco e atravs de um funil, transferia-se
uma alquota, para um balo volumtrico colocado sobre o prato da balana analtica. Depois
de dissolvidos os cristais, procedia-se a anlise segundo metodologia descrita na Seo 3.9.1,
Metodologia II.
As amostras mantidas sob vcuo foram tratadas de forma semelhante aquela com GLP,
injetando-se primeiro a agulha que alimenta o nitrognio e imediatamente aps perfura-se
com outra agulha para permitir a corrente de gs atravs do tubo.
- Amostras em soluo
Das amostras em soluo, depois de atingida a temperatura ambiente, retirava-se uma
alquota e eliminava-se o solvente atravs de vcuo. Em seguida, o soluto deixado pelo
solvente era redissolvido em clorofrmio. Aps aferir o balo fazia-se a leitura
espectrofotomtrica segundo metodologia 3.9.1.
3.9
METODOLOGIA ANALTICA
3.9.1 ANLISE ESPECTROFOTOMTRICA
As anlises espectrofotomtricas foram realizadas com base em dois mtodos:

O mtodo da hidrlise alcalina, com base no mtodo segundo Kato et al., (1992) e o
outro embasado em Yabiru e Takahashi, (1992), que emprega clorofrmio como solvente.
Estas metodologias sero aqui referenciadas como metodologia I e metodologia II,
respectivamente.
86
- Metodologia I - via hidrlise alcalina

Para determinao do teor de bixina foi feita uma adaptao do mtodo descrito por
KATO et al. (1992), pois, neste trabalho, as quantidades de bixina presentes em soluo eram
freqentemente reduzidas, dificultando a determinao das massas com preciso. Sendo
assim, volumes de amostras que podiam variar de 5 a 50 mL foram coletados para
determinao da massa de extrato slido. Paralelamente, alquotas de 20 a 500L das
solues foram coletadas com micropipeta e transferidas para bales de 100mL. Depois de
eliminado o solvente, sob vcuo e/ou pela passagem de nitrognio, adicionava-se ao balo
soluo de NaOH 0,5N com posterior aquecimento em banho-maria (40o C) e sob agitao
por 30 min, em cuba de ultra-som, de forma a facilitar a hidrolise da bixina. Resfriado
temperatura ambiente completava-se o contedo do balo com a mesma soluo alcalina,
procedendo-se em seguida leitura espectrofotomtrica, no comprimento de onda de 482 nm.
Com os dados de massa de extrato seco e o valor de absorbncia determinava-se a
concentrao da amostra pela aplicao da Equao: (1) que tem base na lei de Beer.
X=
A V
1 Vi
1%
E1 m d c d i
(48)
onde:
X = % de bixina (g/ 100g de amostra);
m = massa da amostra (g);
V = volume inicial de extrao (mL);
Vi = volume de diluio (mL);
di = volume da alquota para a diluio; (mL);
A = absorbncia lida no comprimento de onda de 482 nm;
%
E11cm
= coeficiente de absortividade (2870);
dc = caminho tico da clula (1,0 cm).
Para converter o resultado obtido em percentual de bixina, multiplica-se pelo fator

1,076.
- Metodologia II - via clorofrmio
As anlises espectrofotomtricas das amostras e padro solubilizados em clorofrmio

foram adotadas no presente trabalho como metodologia para anlise de controle do teor de
bixina, em substituio ao mtodo (Kato et al, 1992). As leituras foram determinadas a 501
87
nm e 471 nm, regio do espectro onde apresentavam picos de mxima absoro. Foi utilizado
%
para anlise da bixina, o valor 11cm
3230 (471nm), citado por Reith e Gielen, (1971), sendo
assumido deste modo como estando o composto na forma de cis-bixina.

A metodologia aqui empregada, usando clorofrmio como solvente foi adaptada da
tcnica descrita por Yabiku e Takahashi (1992). Na metodologia original, as sementes so
trituradas. Contudo, por se tratar de extrato, o procedimento adotado neste trabalho emprega a
massa de extrato slido, ou alquota da soluo da qual o solvente previamente eliminado.
Para determinao da massa de extrato seco foi aplicado o procedimento descrito na seo
(3.9.2). As alquotas contendo baixa concentrao e reduzido volume de amostra foram
analisadas por comparao a uma curva de calibrao, esta elaborada com clorofrmio como
solvente ou hidrxido de sdio, neste caso quando da adoo da metodologia por hidrlise.
Este procedimento analtico foi denominado-Variante.
O procedimento de clculo para determinao do percentual de bixina fez uso da
equao (1) da seo anterior, procedendo leitura espectrofotomtrica no comprimento de
onda de 471nm, e substituindo-se o valor do coeficiente de absortividade por 3230.
Na determinao espectrofotomtrica de amostras (slidas), estas eram pesadas
diretamente no balo volumtrico; acrescentava-se o clorofrmio e aps agitao em banho
ultra-snico, aguardava-se o resfriamento para, s ento, aferir o balo. Para proceder
diluio, colocava-se em outro balo volumtrico, um pouco de solvente, sobre o qual a
alquota era transferia com o auxlio de uma micropipeta. Depois de drenada a ponteira,
secava-se a parte externa com um papel umedecido no solvente. Na seqncia lavava-se o
interior da ponteira com solvente, transferindo a soluo de limpeza para dentro do balo
completando-se ento o volume com o restante do solvente at a aferio.
Variante para pequenos volumes de amostras
Para amostras com baixa concentrao e volume insuficiente para determinao da

massa de extrato seco, procedia-se leitura espectrofotomtrica e com o valor da absorbncia
obtido, determinava-se a concentrao da amostra pelo confronto com uma curva de
calibrao elaborada com o mesmo solvente diluente da amostra e preparada com um padro
de concentrao conhecida. Esta metodologia foi empregada tanto para amostras procedentes
de solues aquosas quanto para aquelas provenientes de solventes orgnicos. Amostras
contidas em solventes orgnicos eram previamente secas sob vcuo e posteriormente
88
dissolvidas em soluo de NaOH, quando adotada a metodologia I, seo (3.9.1), ou em

clorofrmio no caso da adoo da metodologia II.
3.9.2 DETERMINAO DA MASSA DO EXTRATO SECO
Para determinao da massa do extrato seco (ES), um volume preciso da soluo (10 a
50 mL), coletado com pipeta volumtrica, era transferido para uma placa petri/ou Becker (prtarados) e colocados na estufa a 60o C at total evaporao do solvente. Aps estabilizao da
temperatura, em dessecador, determinava-se a massa de extrato seco. Para volumes acima de
10 mL as secagens foram efetuadas em Becker de 100mL.
Procedimento para coleta de amostra em solvente voltil.
Visto ser crtica a relao volume/massa de amostra na determinao do teor de bixina,

cuidados especiais foram tomados no sentido de aumentar a preciso na coleta. Quando da
coleta de soluo com micropipeta, as ponteiras eram sempre enxaguadas, com a prpria
soluo, no sentido de transferir totalmente o contedo residual retido nas paredes internas da
ponteira.
Naquelas amostras cuja concentrao de bixina era muito reduzida, ou ainda quando se
usava solvente com elevada presso de vapor, o emprego de pipeta volumtrica como tambm
as micropipetas automticas tornava-se impraticvel, pois era impossvel manter o fluido
nestes dispositivos sem que houvesse expulso de gotas de soluo, o que acarretava erro de
medida. Para este propsito foi adaptada uma bureta, cuja extremidade era constituda de uma
coluna graduada com reduzida seco interna, conforme ilustra a Figura 15. Utilizando-se as
duas escalas da bureta foi possvel coletar, por transferncia, volumes precisos, como aqueles
necessrios espectrofotometria, ou mesmo volumes maiores para a determinao do extrato
seco. A extremidade inferior, abaixo da torneira, era enxaguada internamente com o solvente,
antes e aps a transferncia da alquota.
89
Figura 15 Conjunto para coleta de amostra voltil.

3.10
ACOMPANHAMENTO
ESPECTROFOTOMTRICO
NO
CURSO
DA
HIDRLISE ALCALINA
Para avaliar a confiabilidade do mtodo analtico, foram monitoradas solues de

bixina, em trs diferentes concentraes de NaOH; 0,02 N, 0,1N e 0,5N.
Uma soluo padro de bixina contendo 59,2 mg bixina recristalizada (92,53% de
pureza) dissolvida em 50 mL de clorofrmio foi utilizada para preparar as solues de
monitoramento.
Cada soluo de monitoramento foi obtida pela diluio de 2 mL da soluo padro
em 1000mL da correspondente soluo alcalina. Obtendo-se, ao final, solues com 2,19
g/mL de bixina.
A determinao da concentrao do padro de bixina foi realizada atravs da

metodologia II descrita na seo (3.9.1).
Na Tabela 9 mostrado o plano experimental para acompanhamento da evoluo da
hidrlise das solues Cij de bixina.
90
Tabela 9 - Plano de ensaio para monitoramento da hidrlise da bixina.
Soluo de NaOH
Temperatura
(oC)
0,02 N
0,1 N
0,5 N
C11
C12
C13
25
C21
C22
C23
40
C31
C32
C33
Cij: sendo, i, referente temperatura e j a concentrao de hidrxido de sdio.
Dois litros das referidas solues Cij foram colocados em frascos mbar, e
armazenados a diferentes temperaturas (4o C, 25 C, e a 40o C). Alquotas destas solues
foram periodicamente coletadas para acompanhamento espectrofotomtrico. As leituras foram
realizadas no comprimento de onda de 282 nm a partir de cinco minutos da dissoluo e at o
28o dia da preparao.
3.11 CRISTALIZAO DA BIXINA
O extrato slido, pr-concentrado, cerca de 1,0g, foi transferido para um Becker de

1000mL e dissolvido em 500mL de acetona PA, sob aquecimento at incio de ebulio.
Ainda quente, a soluo foi transferida para o filtro, previamente aquecido, ilustrado na
Figura 16. A seguir, o sistema foi pressurizado com nitrognio e o filtrado recolhido em um
frasco de vidro mbar. Fechou-se o frasco deixando a soluo esfriar lentamente. Atingida a
temperatura ambiente transferiu-se para a geladeira e aps alguns minutos para o freezer.
Lavado o dispositivo de filtrao, trocou-se o elemento filtrante (papel de filtro de filtrao
lenta) procedendo nova filtrao com o conjunto previamente resfriado. Os cristais obtidos
foram ento secos sob vcuo e estocados.
91
Figura 16 - Conjunto para filtrao sob presso.
Para preparao de padro de maior pureza, os cristais obtidos eram conduzidos a

sucessivos ciclos de cristalizao (recristalizao), por repetio do procedimento anterior.
Atingida a pureza que atendia ao propsito analtico, os cristais eram transferidos para um
frasco de vidro mbar, fechado sob vcuo e estocado em freezer.
3.12 CROMATOGRAFIA PREPARATIVA
Os experimentos em cromatografia preparativa foram efetuados em colunas de vidro

com dimetros internos de 10,85 mm e 6,08mm e comprimento til de 298,4 mm e 262,1mm,
respectivamente. Foi empregado como adsorvente slica gel 60 marca Vetec, malha 40 60
(230-400 mesh), com densidade aparente 0,4 g/cm3. A fase mvel, colocada no interior do
recipiente de alimentao, era transferida para a coluna pela pressurizao com nitrognio.
Para possibilitar a reproduo da vazo, a perda de carga atravs da coluna era monitorada
com o auxlio de um manmetro de mercrio, possibilitando medir com preciso a presso
aplicada ao sistema. Nas Figuras 17 e 18 so apresentadas, respectivamente, de forma
esquemtica a montagem experimental do sistema empregado e a vlvula de restrio.
a - coluna preparativa flash, b-coluna de mercrio, c-vaso pressurizado

com fase eluente, d-dreno, e-cilindro de nitrognio, f-vlvula de restrio,
g coletor de fraes, 1, 2, 3 e 4 - vlvulas.
Figura 17 Disposio esquemtica do conjunto para cromatografia preparativa flash.
Figura 18 - Vlvula de restrio
3.12.1 PREPARAO DA COLUNA
Trs diferentes formas de preenchimento foram testadas:
92
93
a) Disperso da slica em hexano e agitao no ultra-som, com posterior transferncia da

suspenso para a coluna parcialmente preenchida com solvente;
b) Preenchimento da coluna com a slica, remoo do ar contido nos poros, submetendo

vcuo a extremidade superior e posterior alimentao do solvente, pela mesma
extremidade. Este procedimento conduz a uma classificao natural do adsorvente
favorecendo a distribuio das partculas menores na regio superior da coluna,
promovida pelo fluxo ascendente do ar durante o processo para sua remoo. Isto, em
conseqncia, tende a criar um empacotamento com diferente adensamento;
c) Procedimento semelhante ao segundo, porm efetuando vcuo pela parte inferior e

alimentao do solvente pelo topo da coluna. Este procedimento levou a obteno de
empacotamento mais homogneo e de maior densidade, particularmente quando
comparado ao primeiro.
Preenchimento com fase estacionria
Com a finalidade de reter e suportar o adsorvente coloca-se uma fina tela de nylon e
um papel de filtro na base da coluna. Fechada esta extremidade transfere-se 2,75g (coluna de
menor dimetro) ou 10,00g (coluna de maior dimetro) de adsorvente atravs de um funil
colocado em sua extremidade superior. Esta operao efetuada com alimentao em
pequenas pores, de forma contnua e sob vibrao, conseguida por batimentos com um
basto de vidro tendo em sua extremidade uma rolha de borracha. Aps total transferncia da
slica, introduz-se um basto de vidro de dimetro externo prximo ao dimetro da coluna.
Batendo-se no topo do basto por cerca de 5 minutos, para auxiliar no processo de
compactao. Retira-se o basto e mede-se a altura resultante da coluna.
Empregando duas pinas, fecham-se as extremidades da coluna com mangueira de
silicone. Submete-se vcuo a coluna, atravs da extremidade inferior. A seguir, fecha-se esta
extremidade com a pina de Hoffman e desconecta-se da bomba de vcuo. Atravs da
mangueira de silicone, conecta-se uma bureta extremidade superior que mantida fechada
com outra pina. Na seqncia, abre-se a torneira da bureta e a seguir a pina, transferindo-se
cerca de 4,5 mL (coluna de menor dimetro) ou 20 mL de hexano (coluna de maior dimetro)
para o interior da coluna. A presso reduzida no interior desta permite que o solvente
preencha os poros do leito. Desconecta-se a bureta, removendo o tubo de silicone.
94
Quando a coluna lquida atravs do leito alcana a proximidade da base da coluna,

acopla-se ao tubo de silicone conectado a parte inferior, uma seringa e s ento se abre a
pina nele acoplado. Empregando-se a seringa, aplica-se uma suave suco para permitir total
preenchimento do leito, o que se observa pelo aparecimento de solvente no tubo de silicone,
situado imediatamente abaixo do duto de conexo da coluna. Mede-se ento o nvel final de
solvente acima do topo do leito de slica, deduzindo este volume do total transferido para a
coluna. Conhecido o volume dos poros como tambm o volume do duto de conexo da coluna
vlvula do coletor de fraes possvel determinar o correspondente volume de coluna
(VC).
Aps o procedimento anterior, remove-se o conector ligado a parte inferior da coluna,
colocando em seu lugar a vlvula de restrio (f) esquematizada em corte na Figura 18. Esta
permite controlar o fluxo atravs da coluna. A seguir, conecta-se a outra extremidade da
vlvula ao coletor de fraes.
Pr-ajuste de vazo da coluna
Aps o preenchimento da coluna com massa de adsorvente equivalente quela que

estar associada amostra, alimenta-se a coluna com a soluo eluente em estudo. Em
seguida ajusta-se a presso do nitrognio monitorando a altura manomtrica da coluna de
mercrio, at ser conseguida uma vazo de eluente, prximo de 2mL/min. Havendo
impossibilidade de atendimento da vazo requerida, aumenta-se ou diminua-se a restrio na
vlvula (f) situada na sada da coluna, pelo ajuste da compresso da mola interna, de forma a
aumentar ou diminuir a perda de carga. Uma vez atingida esta vazo, registrava-se o valor de
presso manomtrica, de forma a reproduzir esta vazo nos experimentos posteriores,
elaborados com a amostra a ser processada.
Preparao da amostra
Considerando a reduzida solubilidade da bixina e tambm no sentido de evitar

alargamento das bandas, como conseqncia de sobrecarga de amostra na coluna, utilizou-se
massa reduzida de amostra, na ordem de 0,2 mg. Ainda, para permitir melhor
homogeneizao e perfeita distribuio da amostra sobre a coluna, determinou-se previamente
a capacidade mxima de saturao da slica pela bixina proveniente de uma soluo em
clorofrmio. Neste sentido, evitava-se adicionar bixina alm do limite de (1,4mg de bixina)/(g
de slica), valor de saturao determinado.
95
Aps a anlise do teor de bixina da soluo, determinada segundo a metodologia II,

Seo (3.9.1), transfere-se um volume preciso para um frasco de vidro, contendo 38,5 mg
(coluna de menor dimetro) ou 140 mg (para coluna de maior dimetro) de slica dispersa em
1,0 mL de clorofrmio. Fecha-se o frasco com uma rolha de borracha, sendo introduzido
previamente atravs desta uma agulha, em cuja extremidade foi colocada uma pequena poro
de algodo. Efetua-se vcuo at total eliminao do solvente. Terminada a operao observase o algodo para constatar a ausncia de partculas arrastadas. Se positivo, transfere-se esta
slica para a coluna j preparada, cujo solvente situa-se um pouco acima do leito da coluna.
Sobre a amostra depositada, coloca-se uma pequena poro de slica, (tambm mantida
inundada no solvente presente na coluna). Depois de removido o excedente de solvente acima
da slica, fecha-se a extremidade superior da coluna, acoplando-se a esta a tubulao de
alimentao de fase eluente.
Fraes coletadas da coluna flash
Para cada fase eluente de diferente polaridade elaborou-se uma curva de calibrao.
Volumes precisos de uma soluo recm analisada de bixina foram transferidos para bales
volumtricos e sob vcuo, o solvente era eliminado. Posteriormente re-dissolvia-se com o
solvente correspondente a nova fase e fazia-se a varredura espectrofotomtrica da soluo.
Identificado o pico da bixina, efetuava-se neste comprimento de onda a leitura das solues
que compunham a curva.
Percolao da coluna
Com o coletor de fraes conectado ao conjunto e programado para coleta de 180

gotas por tubo, coloca-se a fase eluente no vaso de presso e injeta-se nitrognio no sistema.
Com a vlvula de restrio previamente ajustada, manipulaes consecutivas na vlvula do
cilindro de nitrognio permitem que a vazo atravs da coluna rapidamente entre em regime.
Este ajuste se faz necessrio devido acomodao da coluna sob efeito da presso aplicada ao
leito. Para evitar erros nas variaes da vazo durante a corrida, mede-se o volume de cada
frao, empregando-se para tal um calibrador.
Realimentao do vaso de presso
Havendo necessidade de realimentar a fase eluente fecha-se primeiro a vlvula (4)

situada logo abaixo da vlvula de restrio (f), depois aquela imediatamente anterior entrada
coluna. Assim procedendo preserva-se a compactao do leito evitando despressurizao da
96
coluna (a). Reduz-se a presso do vaso (c), aliviando primeiro a vlvula (1) reguladora de
presso do cilindro de nitrognio (h). Faz-se o abastecimento com fase eluente. Pressuriza-se
novamente o vaso (c) com a mesma presso antes aplicada. Abre-se a vlvula (3) de
alimentao da coluna. Verifica-se se a presso na coluna de mercrio fora mantida
inalterada. S ento se abre a vlvula (4 ) de sada da coluna. Se a presso da coluna sofrer um
leve incremento abre-se levemente a vlvula de dreno (2) e reajusta-se a presso do cilindro.
Na situao inversa aplica-se pequeno incremento na presso do sistema.
Anlise das fraes
Para cada frao corada coletada, mede-se outra vez o volume no ato da anlise
corrigindo-se assim o efeito de evaporao ocorrida no intervalo de tempo entre a coleta e a
anlise. Quando h necessidade de diluio, esta feita com o mesmo solvente empregado na
eluio. Com a leitura da absorbncia, determina-se a concentrao contra a curva de
calibrao.
Para cada corrida foram elaborados os grficos do volume percolado contra a
concentrao de bixina das correspondentes fraes. Aps integrar a massa de todas as
fraes associadas aos correspondentes volumes percolados, obtiveram-se os cromatogramas.
Comparava-se ainda, a massa integrada quela massa inicialmente colocada na coluna,
procurando assim fechar um balano de massa atravs da coluna.
Avaliao das fraes por cromatografia em camada delgada TLC
Fraes coletadas na cromatografia flash obtidas de fases mveis de diferentes

relaes de solventes foram reservadas para anlise dos tempos de reteno pela tcnica de
TLC. A Tabela 10 apresenta as composies e os respectivos valores de polaridade das fases
mveis empregadas na cromatografia flash e em camada delgada (TLC).
97
Tabela 10 - composio das fases mveis e suas polaridades
Solventes ( % )
ndice de polaridade P
Acetato de etila
hexano
mistura
90
10
3,87
80
20
3,45
70
30
3,03
60
40
2,06
50
50
2,18
40
60
1,75
30
70
1,33
ndice de polaridade: hexano 0,06; acetato de etila, 4,3.

Ref. Snyder, Kirkland, J. J., (1979).
3.13 OBTENO DE DERIVADOS DE BIXINA
A obteno de derivados de bixina teve como objetivo avaliar as caractersticas de

novos compostos de forma a flexibilizar suas futuras aplicaes. Estes compostos podem ter
aplicao como matria prima de partida para outros derivados funcionais, como steres de
bixina ou norbixina ou ainda como padro de referncia. A substituio do hidrognio do
grupamento carboxlico pelo anion amnio tem por finalidade obter um derivado de maior
solubilidade em solventes polares trazendo em conseqncia maior versatilidade na utilizao
do produto.
Produo do derivado amoniacal a partir de semente.
Preparar uma soluo de etanol com 3 % hidrxido de amnio, acrescentando-se

sulfato de sdio suficiente para remover a gua transportada pela base. Depois de filtrada, esta
soluo empregada para extrao das sementes. Aps agitao e aquecimento por 5 min. a
50 C filtra-se soluo obtida. A seguir adiciona-se cido actico, at no mais ser
observado formao de nvoa de acetato de amnio. Filtra-se o precipitado, lavando-o uma
vez com ter etlico e depois com hexano at quase total descolorao da soluo. A seguir
lava-se com gua gelada para remoo de algum residual de acetato de amnio e aps, com
acetona para eliminao da umidade e finalmente seca-se sob vcuo.
O precipitado obtido novamente solubilizado com soluo amoniacal. Esta soluo
transferida para um rota-evaporador onde, sob aquecimento suave e reduo da presso
98
elimina-se a amnia residual e parte do etanol. Uma vez eliminado a amnia eleva-se a
temperatura para reduo do volume de etanol. Com a reduo do teor de amnia e parcial
reduo do volume de solvente, tem incio o processo de cristalizao do composto. A
conduo do resfriamento de forma lenta permite obter precipitado enriquecido em composto
amoniacal. O produto slido obtido, depois de filtrado lavado com acetona, e posteriormente
seco a vcuo.
Repetindo-se a operao de solubilizao com soluo amoniacal e controlando-se o
processo de eliminao da amnia e resfriamento possvel obter produto de grande pureza.
Produo de derivado de clcio
Prepara-se uma suspenso de hidrxido de clcio pela disperso de 50 g de xido de

clcio em um litro de gua destilada. A seguir procede-se filtrao sob vcuo, adicionandose sobre o filtrado soluo alcolica do derivado amoniacal de bixina. O precipitado formado
depois de filtrado lavado com gua destilada para remover o excedente de hidrxido,
seguido por uma lavagem com acetona. O precipitado obtido depois da secagem sob vcuo
conservado em frasco selado, e estocado no freezer.
99
CAPTULO 4 - RESULTADOS E DISCUSSO.
Neste captulo so apresentados os resultados obtidos no presente trabalho e a

discusso dos principais avanos e restries encontradas no seu desenvolvimento.
4.1
SOLUBILIDADE
DA
BIXINA
NORBIXINA
EM
DIFERENTES
SOLVENTES.
Seleo de solvente.
A determinao da solubilidade da bixina e da norbixina, em diferentes solventes
permitiu escolher a melhor rota de processamento, visando purificao do corante de
urucum, desde a fase inicial de remoo dos principais compostos contidos no arilo da
semente. Estes dados possibilitaram minimizar as perdas de bixina decorrentes de
solubilizao, durante as consecutivas etapas de lavagem nos procedimentos de extrao,
como tambm contriburam na otimizao do processo de cristalizao.
Nos processo de purificao da bixina, tanto atravs de recristalizaes sucessivas
quanto via cromatografia preparativa, foi empregado como matria prima de partida o extrato
solvel obtido diretamente das sementes, empregando-se solventes orgnicos. Observou-se
que a solubilidade tanto da bixina quanto da norbixina era extremamente baixa na maioria dos
solventes. Desta forma um grande volume de solvente era consumido para a obteno de
pequena massa de produto isolado. A inexistncia na literatura de nmeros referentes
solubilidade da bixina e da norbixina, motivou a determinao destes dados.
Neste conjunto de experimentos para a determinao dos dados de solubilidade,
devido indisponibilidade de padro com alta pureza, empregou-se um concentrado cujo teor
de bixina foi determinado aplicando a metodologia I descrita na seo (3.9.1). Amostras
provenientes da empresa CHR Hansen, (produzidas em 1999) indicando teores de 90% e 70%
de bixina e norbixina respectivamente, foram empregados como padro. Estes concentrados,
na poca dos experimentos apresentavam teores de, 24,64% e 27,88% de bixina e norbixina
respectivamente. Com os concentrados tomados como padro elaborou-se curva de calibrao
em soluo de NaOH. O,5 N. A utilizao desta curva fez-se necessria, tendo em vista a
100
reduzida massa de padro empregada nos ensaios de solubilidade, mas tambm devido a baixa
concentrao de material solvel, o que tornaria impraticvel a determinao da massa de
extrato seco.
As solues de bixina e norbixina em diferentes solventes orgnicos foram preparadas
segundo o procedimento descrito na seo (3.6). Os resultados obtidos so apresentados na
Tabela 11, e Figura17, respectivamente.
Tabela 11 - Solubilidade da bixina/norbixina em solventes orgnicos.

Solvente
Bixina
mg/mL
1 Clorofrmio
3,75
2 Acetona
1,5
3 Acetato de etila
0,89
4 Metanol
0,38
5 ter etlico
0,37
6 Etanol anidro
0,18
7 n-hexano
-*
8 ter de petrleo
-*
*no detectado por espectrofotometria.
Norbixina
mg/mL
0,29
1,96
0,76
0,68
0,12
1,82
-*
-*
Na Figura 19 representada a solubilidade da bixina e norbixina nos referidos solventes
Figura 19 - Solubilidade da bixina e norbixina em diferentes solventes orgnicos.

4.1.1
101
SOLUBILIDADE EM SOLUES ALCALINAS.
A concentrao da soluo nesta srie de ensaios foi determinada tambm por

comparao do valor de absorbncia com a curva de calibrao. Todos os ensaios foram
realizados a temperatura ambiente.
No procedimento de clculo das massas de extrato seco das amostras dissolvidas em
soluo de hidrxido de sdio, foram deduzidas as massas de lcali, correspondentes s
concentraes presentes nos volumes de solues empregados. Contudo, no foram
considerados os possveis incrementos mssicos decorrentes de carbonatao do hidrxido de
sdio ocorridos no curso da secagem.
Na Tabela 12 apresentada a solubilidade da bixina em soluo aquosa de hidrxido
de sdio, enquanto a Tabela 13 mostra o comportamento da solubilidade de uma soluo
aquosa amoniacal com o incremento desta base. As Figuras: 20 e 21 mostram os grficos das
correspondentes Tabelas.
Tabela 12 - Solubilidade da bixina em soluo aquosa de NaOH.
Solubilidade da bixina (mg/mL)
Soluo de NaOH.
Eq.g/L
0,01
0,1
0,5
1,0
Bixina
mg/mL
0,05
0,37
2,14
4,71
5
4
3
2
1
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,2
Concentrao de NaOH (Eq. g/L)
Figura 20 - Curva de solubilidade da bixina em soluo aquosa de hidrxido de sdio.
Empregando-se
102
a metodologia II descrita na seo 3.91, foram determinados os
seguintes valores de solubilidade da bixina em soluo etanlica com 3 % de NH4OH, 4.30

mg/mL a 0 C e 6.25 a 25 C, respectivamente. A solubilidade a 40C apresentou valores na
ordem de 8,5 mg/mL. A dificuldade de filtrao e coleta de soluo acima da temperatura
ambiente no permitiam uma determinao com maior preciso.
Tabela 13 - Solubilidade da bixina em soluo aquosa de NH4OH.
NH4OH em gua
% v/v
0,1
0,5
1,0
3,0
5,0
10,0
Bixina
mg/mL
0,06
0,24
0,40
2,92
6,14
46,82
Solubilidade da bixina (mg/mL)
50
40
30
20
10
0
0
10
Concentrao da soluo aquosa de hidrxido de amnio (v/v)
Figura 21- Solubilidade da bixina em soluo aquosa de NH4OH

Em soluo de hidrxido de sdio, devido hidrlise, grande parte do material solvel
se encontra na forma de norbixina. Contudo os clculos foram expressos como base em
bixina.
103
Os resultados de solubilidade obtidos para as diferentes solues alcalinas mostraram

haver um crescente aumento da solubilidade com o incremento da concentrao da base
empregada.
Solubilidade da bixina em soluo hidro-alcolica de hidrxido de

amnio.
Os valores apresentados na Tabela 14 expressam a concentrao de bixina em soluo,
enquanto na Tabela 15 os dados referem-se concentrao sobre extrato seco. A solubilidade
foi avaliada para soluo amoniacal hidro-alcolica em diferentes relaes destes
componentes como tambm em concentraes variveis de hidrxido de amnio. As medidas
de solubilidade foram realizadas segundo a metodologia I descrita na seo (3.9.1). e
determinadas temperatura ambiente (25 C 3).
Os dados apresentados nas Tabelas 14 e 15 podem ser vistos na forma grfica nas
Figuras: 22 e 23.
Tabela 14 - Concentrao de bixina no extrato hidro-alcolico amoniacal
Valores de concentrao da Bixina (mg/mL)
Etanol/gua Concentrao do NH4OH
Experimento
%
1%
2%
3%
1
80/20
13,61 14,07
9,77
2
70/30
19,82 14,42 14,71
3
60/40
18,50 17,98 17,87
4
50/50
18,67 19,53 20,74
5
40/60
*
17,23 21,15
6
30/70
*
16,43 17,06
% de bixina(mg/mL)
* As amostras apresentaram-se emulsificadas, impedindo uma anlise precisa da soluo.

E = etanol e A = gua.
23
NH4OH 1%
18
NH4OH 2%
13
8
0
Identificao do experimento
Figura 22 - Percentual de bixina no extrato hidro-alcolico.
104
Tabela 15 concentrao de bixina no extrato seco hidro-alcolico

Concentrao da bixina / Es (%)
Etanol/gua
Concentrao do NH4OH
Experimento
%
1%
2%
3%
1
80/20
47,94 46,91 41,03
2
70/30
48,82 42,16 42,75
3
60/40
45,34 48,34 46,53
4
50/50
2,22
42,65 41,81
5
40/60
*
37,79 46,49
6
30/70
*
34,52 37,09
% de bixina / ES
60
NH4OH 1%
50
40
NH4OH 2%
30
20
10
0
0
Identificao do experimento
Figura 23 - Percentual de bixina no extrato seco hidro-alcolico

A reduo do percentual de gua dificultou o processo de separao devido intensa
emulsificao da soluo. A partir da relao 80:20 todas as amostras apresentaram problemas
de separao, independente da concentrao de hidrxido de amnio empregado.
Pela anlise dos resultados das Tabelas 14 e 15, observa-se que o aumento da
concentrao de hidrxido de amnio contribuiu para um acrscimo na concentrao de
bixina no extrato obtido, para aquelas solues com maior teor de gua. Por outro lado, de um
modo geral, esta contribuio no parece to clara para solues ricas em etanol. A relao
60/40 etanol/gua, contendo 2 % de hidrxido de amnio, apresentou-se como boa opo para
realizar as extraes. Contudo, o aumento da concentrao de amnia para 3% com uma
conseqente reduo do teor de lcool como na relao 40/60, tambm levou a um favorvel
aumento da capacidade de extrao.
Os resultados da relao intermediria 50/50, tambm apontam como opo de
soluo extratora. Considerando-se, entretanto, a maior facilidade de separao das solues
que contm maior teor de lcool, a opo 60/40 confirma-se como sendo a mais indicada.
105
4.2 OTIMIZAO DO PROCESSO DE EXTRAO.

Encontra-se no arilo da semente do urucum a quase totalidade de seus corantes, destes,
a bixina representa at 80 %. Remover o pigmento aderido semente onde se encontra a
bixina apresenta certa dificuldade, visto que esta se encontra envolvida por outros compostos,
dentre os quais um leo denominado olerina. Estes leos acarretam problemas de separao,
particularmente quando o processo de remoo conduzido usando-se gua como veculo.
Outro grande inconveniente a ser destacado deve-se configurao das sementes que
apresentam pequenas cavidades, o que dificulta uma eficaz remoo dos corantes retidos
naquelas depresses.
Os experimentos realizados tiveram como objetivo avaliar as variaes na
concentrao de bixina no extrato slido e no extrato solvel, decorrentes das diferentes
condies a que so submetidas as sementes durante o processo de extrao. Isto porque, no
s a bixina, mas muitos dos compostos presentes no arilo da semente apresentam reduzida
estabilidade qumica, frente a diversos fatores como: luz, calor, mudanas de pH e oxignio.
Esta avaliao de fundamental importncia visto que, as condies de processamento da
semente, alm de afetar o rendimento de extrao, podem acarretar maior grau de dificuldade
nos processos subseqentes de isolamento e purificao da bixina pela incorporao ao
extrato solvel de um grande nmero de componentes indesejveis, presentes naturalmente na
semente, ou aqueles provenientes de degradao.
Solues alcalinas ou solventes orgnicos so empregadas para a extrao do
pigmento. Contudo, um maior tempo de contato das sementes durante o processo de extrao
pode favorecer a degradao parcial de muitos compostos seja pelas severas condies de pH,
calor, ou mesmo pela natureza do reagente empregado.
O volume de semente muito grande em relao quantidade de pigmento presente,
isto requer o emprego de grande quantidade de solvente. Desta forma, quando se deseja o
extrato slido seco, faz-se necessrio recuperar aquele insumo, via destilao, no caso de
solvente orgnico, o que alm de onerar o processo, tambm submete o produto a condies
que favorecem sua degradao.
O emprego de gua nos processos de remoo do pigmento associado agitao
mecnica levava formao de uma emulso. A presena de material particulado, de
106
dimenses reduzidas, removido por atrio e disperso na emulso, inviabilizava a subseqente

operao de filtrao ou decantao. Tambm neste caso a reduzida massa de pigmento
comparado ao volume de semente requeria o emprego de um grande volume de gua para
conduo do processo, agravando ainda mais o problema. Por outro lado, a separao por
centrifugao s foi conseguida elevada velocidade e a filtrao tambm no se mostrou
eficiente, exigindo presses elevadas devido formao de uma pasta viscosa.
Um processo alternativo, de floculao ou precipitao da suspenso, atravs da
adio de agente floculante, com o propsito de eliminar o excessivo volume de fluido de
processo, pode trazer problemas nas fases posteriores de purificao.
A ao de uma soluo de hidrxido de sdio ou potssio sobre a semente conduz a
hidrlise da bixina a norbixina, levando tambm a remoo do pigmento e os compostos a ele
associado. A posterior adio de um cido sobre o extrato alcalino obtido leva precipitao
da norbixina formada, favorecendo a remoo do excedente de gua.
cidos clordrico e actico foram testados como agente de precipitao, como
tambm sais solveis de clcio e brio (cloreto e acetato). Todas as variantes testadas levaram
a bons resultados de precipitao, permitindo fcil filtrao.
Entretanto as condies que propiciam a hidrlise da bixina, tambm podem hidrolisar
outros steres presentes nas sementes, o que pode caracterizar-se como um problema
adicional futuro na tentativa de purificao dos produtos.
Uma rota testada que se mostrou muito promissora foi o uso de uma base com menor
grau de dissociao. Foram empregadas: solues amoniacais, aquosa e alcolica anidra.
Ambas removeram com facilidade os pigmentos da semente, contudo, os problemas
associados emulsificao e dificuldades de eliminao da gua tambm so observados com
o emprego da soluo aquosa. Observa-se, no entanto, que a soluo alcolica amoniacal
anidra alm de possuir maior capacidade de dissoluo da bixina que a soluo aquosa, no
apresenta problemas de emulsificao, permitindo rpida extrao e fcil filtrao.
A adio de cido, sais de clcio ou brio suspenso amoniacal obtida, resultou em
rpida floculao, da mesma forma que a obtida com hidrxido de sdio. Estes ensaios
serviram de base para obteno de derivados de clcio cujos ensaios so discutidos na Seo
4.3.2.
107
A presena de leo na semente no s reduz a concentrao de bixina no extrato slido

obtido, como tambm dificulta o processo de purificao, visto que alm de favorecer a
formao de emulso, quando se tem gua presente, incorpora tambm ao extrato
emulsificado compostos que possuem afinidade por solvncia. Sendo assim, foram efetuadas
extraes previas, no sentido de obter um extrato slido enriquecido em bixina e com baixo
teor em leo. Observou-se que tanto o hexano quanto o ter de petrleo removiam compostos
corados da semente, contudo no solubilizavam a bixina quando pura (isenta de leo).
Experimento preliminar para extrao dos leos das sementes empregando estes
solventes no resultou na total eliminao de cor, ainda que tenham sido feitos muitos ciclos
de extrao em sohxlet (8 horas de extrao, com ciclos de cerca de 12 minutos, repetidos por
5 dias, com interrupo no perodo noturno). O prolongado tempo de contato sob aquecimento
propiciava a degradao da bixina, levando reduo dos teores presentes com conseqente
formao de subprodutos de decomposio, de colorao amarela, solveis no solvente
empregado.
A associao de um solvente polar ao hexano ou ter de petrleo, em um processo de
extrao a frio, mostrou-se eficaz na remoo do leo, mesmo acarretando, na fase inicial do
processo uma pequena remoo de bixina solvel no leo. Alm do etanol, ter etlico e
acetona tambm foram testados como solventes polares associados ao hexano. Todos
apresentaram bons resultados, entretanto, por serem menores as perdas de bixina no etanol,
este solvente foi escolhido para a etapa inicial de remoo da camada de pigmento que
envolve as sementes.
4.2.1 TEORES DE BIXINA DO EXTRATO SOLVEL DURANTE OS CICLOS DE

EXTRAO.
No sentido de otimizar o nmero de ciclos necessrios obteno de um extrato slido
rico em bixina, a cada ciclo de extrao foram monitorados na soluo de lavagem, os teores
de bixina e extrato seco, segundo procedimentos descritos nas Sees (3.9.1) e (3.9.2)
respectivamente. Ainda, para minimizar os riscos de incorporao ao pigmento de
componentes provenientes do interior da semente, estas eram separadas imediatamente aps o
primeiro ciclo, depois de removido o pigmento, reduzindo assim o prolongado tempo de
contato, o que favoreceria processos de difuso. Todos os ciclos foram realizados a
temperatura ambiente.
108
Foram realizados cinco experimentos com o objetivo de otimizar o processo extrativo,

constitudo de sucessivas etapas, aqui denominadas ciclos de extrao. As avaliaes da
massa de extrato seco e percentual de bixina no extrato solvel foram determinadas para todos
os experimentos, porm, diferentes relaes entre; a massa de substrato, semente ou extrato
bruto (pigmento isento da semente) e o volume de solvente foram empregadas nos distintos
ensaios, conforme mostrado na Tabela 8.
Nas Tabelas 16, 17, 18 e 19 so apresentados os dados obtidos dos experimentos de
extrao. Na segunda coluna mostrada a concentrao de bixina, expressa como percentual
mssico sobre o extrato seco, na terceira, a massa de slidos totais (extrato seco) em
mg/100mL de soluo e na quarta coluna apresentada as perdas de bixina [mg de
bixina/100mL] decorrentes das lavagens, a cada ciclo de purificao do extrato slido.
Experimento 1.
O procedimento para execuo deste experimento est descrito na Seo (3.4),
Procedimento I. Para a determinao do extrato seco (ES) empregou-se o procedimento
descrito na Seo (3.9.2) e para anlise da concentrao de bixina o descrito na Seo (3.9.1),
metodologia I. A partir do oitavo ciclo de extrao em diante no mais se detectava bixina,
pois no havia mais concentrao significativa de etanol que resultasse na solubilizao de
bixina o que produzia um extrato visualmente incolor.
Aps o ltimo ciclo de lavagem, o extrato slido foi dividido em duas fraes, as quais
foram submetidas extrao com dois diferentes solventes. A primeira frao, extrada com
acetona, produziu um extrato seco com 56,55 % de bixina e a segunda, com soluo hidroalcolica amoniacal 60/40/3 v/v, produziu um extrato seco com 87 % de bixina. Todas as
anlises foram realizadas segundo a metodologia descrita na Seo (3.9.1) Metodologia I. Os
resultados deste experimento so mostrados na Tabela 16 e Figura 24.
109
Tabela 16 Teores de bixina e extrato seco por ciclos de extrao - Experimento 1.

Ciclo
Bixina / ES
%
1,72
5,69
20,97
27,31
20,58
36,45
1,26
Nd
1
2
3
4
5
6
7
8
ES
(mg/100 mL)
21,74
5,63
1,07
0,62
0,81
0,54
0,55
0,17
Bixina
(mg/100mL)
37,39
31,97
22,43
16,93
16,66
19.68
0,69
Nd
Solvente empregado: do ciclo 1 ao ciclo 6, mistura hexano / etanol

50/50, stimo e oitavo ciclo, hexano puro.
100
% de bixina / ES
ES (mg/100 mL)"
bixina (mg/100mL)
10
1
1
0,1
Ciclos de extraes
Figura 24 - Evoluo da concentrao de bixina e extrato slido
Experimento 2.
Neste experimento foram adotados os mesmos procedimentos aplicados ao
experimento 1, com o objetivo de reproduzir dados nele obtidos. O tempo de contato do
solvente com a semente favorece a extrao de compostos internos contidos no gro, da
mesma forma que uma inadequada agitao pode acarretar em ineficaz remoo do pigmento
das cavidades da semente. Estes fatores associados tcnica analtica adotada podem ter
contribudo para os diferentes resultados obtidos, assim como os possveis erros na
determinao da massa, visto que ser reduzido o volume de amostra coletado para
determinao do estrato seco. Ainda, alguns compostos presentes no extrato so volteis, de
110
forma que um maior tempo de secagem pode acarretar na eliminao de parte destes
compostos ocasionando, em conseqncia, perda de massa. Os resultados deste experimento
so apresentados na Tabela 17 e Figura 25.
Tabela 17 - Teores de bixina e extrato seco por ciclos de extrao - Experimento 2.
Bixina
Bixina / ES
ES
%
(mg/100mL)
(mg/100mL)
2,91
29,89
86,90
315
5,54
17,40
9,47
2,54
24,00
29,80
0,79
23,50
35,01
0,45
15,70
5,78
0,29
1,60
2,78
0,14
3,80
empregado: do ciclo 1 ao ciclo 6, mistura hexano / etanol
Ciclo
1
2
3
4
5
6
7
Solvente
50/50, stimo e oitavo ciclo hexano puro.

100
% de Bixina / ES
ES (mg/100 mL)
bixina (mg /100mL)
10
1
1
0,1
Ciclos de extraes
Figura 25 - Evoluo da concentrao de bixina e extrato slido

por ciclo de extrao - experimento 2.
Experimento 3.
O experimento 3 difere dos anteriores 1 e 2 na relao de semente/solvente empregada
como tambm pelo emprego de mistura hexano/etanol na proporo de 1/1 utilizado em todos
os ciclos. Os resultados deste experimento so mostrados na Tabela 18 e Figura 26.
111

Ciclo
Bixina / ES
%
5,65
22,24
19,60
18,35
44,86
47,44
38,25
52.43
1
2
3
4
5
6
7
8
ES
(mg/100mL)
5,69
1,13
1,30
092
0,33
0,34
0,38
0,32
Bixina
(mg/100mL)
31,85
25,17
25,44
16,80
14,98
15,93
14,45
16,98
Solvente empregado: Hexano / etanol 50/50 nos oito ciclos.

% Bixina / ES
ES (mg/100 mL)"
Bixina (mg/100ml)
100
10
1
1
0,1
Ciclos de extraes
Figura 26- Evoluo da concentrao de bixina e extrato slido

Experimento 4.
O experimento 4 foi realizado com massa maior de semente em relao mistura
solvente. O teor de bixina no extrato foi determinado segundo descrito na seo (3.9.1)
procedimento Metodologia II usando clorofrmio como solvente para espectrofotometria.
Detalhes deste experimento encontram-se na Tabela 8 e os resultados obtidos so mostrados
na Tabela 19 e Figura 27.
112

Bixina/ES
%
2,90
8,23
17,11
26,53
28,49
34,42
35,76
16,24
0,46
Ciclos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
ES
mg/mL
46,47
6,57
1,55
0,92
0,91
0,57
0,56
0,12
0,07
Bixina
(mg/100mL)
134,67
54,01
26,44
24,40
25,92
19,45
20,02
1,95
0,03
Solvente empregado: do ciclo 1 ao ciclo 6, mistura hexano / etanol

50/50, stimo e oitavo ciclo hexano puro.
% bixina / ES
1000,00
Bixina / ES (mg/100 mL)
100,00
Bixina (mg/100mL)
10,00
1,00
0,10
0,01
Ciclos de extraes
Figura 27 - Evoluo das concentraes de bixina e extrato slido

4.2.2 COMPARAO DA EFICINCIA DO TER EM SUBSTITUIO AO ETANOL

Experimento 5
O experimento 5 teve como objetivo avaliar a troca do etanol, por um solvente de
menor polaridade associado ao hexano e o conseqente benefcio ao processo de purificao
do extrato, no sentido de aumento do teor de bixina. Ainda, verificar a extenso da
113
contaminao do extrato obtido pelos compostos presentes no interior da semente, os quais

so incorporados a bixina durante o processo do seu isolamento. Na Tabela 20 so
apresentados os dados referentes ao experimento de nmero 5 e cujas condies de processo
constam da Tabela 8. A metodologia empregada neste experimento est descrita na Seo
(3.4) Procedimento II.
Tabela 20 - Teores de bixina no extrato alcolico e etreo Experimento 5
Amostras
1S
2S
1E
2E
Ciclos
1
3.05
5.75
38.42
72.83
2
8.37
18.62
52.61
100.61
3
14.38
35.07
66.69
56.94
4
15.89
36.08
-------70.88
5
21.88
35.25
47.69
72.90
6
12.97
39.19
64.70
75.86
Obs.: valores em % (massa de bixina/massa de extrato seco); 1- solvente, etanol; 2

solvente, ter etlico; S - semente; E - pigmento removido do gro.
Observa-se neste ensaio uma superior vantagem da utilizao do ter etlico em
substituio do etanol, como tambm do emprego do pigmento isolado comparado semente.
Contudo, no que se refere aos valores obtidos, percebe-se que os mesmos no apresentaram
uma tendncia de crescimento como se esperava, visto que, os ltimos extratos deveriam
apresentar maiores teores de bixina aps sucessivas remoes do leo, o que no ocorreu. Em
alguns casos nota-se at reduo dos valores. Este problema deve-se, entre outros,
dificuldade de se trabalhar com volumes e massas reduzidas, e que agravado, quando se
trata do emprego de solventes de elevada volatilidade, como se observou particularmente com
o ter etlico, o que em conseqncia pode ter acarretado erros.
Estes ensaios foram realizados tomando-se pequenas amostras, com micropipeta. Com
o ter em especial, muito difcil operar este tipo de dispositivo, pois a elevada presso de
vapor do solvente freqentemente expulsa a amostra das ponteiras podendo nesta situao
acarretar erro de volume. Sendo assim seria conveniente repetir estes ensaios com volumes
maiores ou empregando a bureta com escala expandida, conforme ilustrado na Figura15.
Outra provvel explicao se deve ausncia de seletividade destes solventes. Observa-se
ainda ser reduzida a concentrao de bixina nos extratos obtidos das sementes, para ambos os
solventes empregados, comparados queles obtidos do pigmento extrado dos gros,
independente de ter sido feito para este um ciclo a mais, na fase de separao inicial. Este
114
resultado, em contrapartida, mostra a extrao paralela de componentes do gro, contribuindo

assim com a diluio da bixina no extrato obtido.
4.2.3 EXTRAO DE BIXINA COM SOLUO ALCOLICA AMONIACAL.
O emprego de soluo etanlica anidra de hidrxido de amnio permitiu melhores

resultados de extrao. Esta tcnica mostrou-se mais seletiva, permitindo isolar, pelo emprego
de um volume reduzido de solvente, uma massa de bixina muito superior quela obtida, pela
utilizao de acetona ou mesmo clorofrmio, solvente orgnico no qual a bixina tem a melhor
solubilidade. Os valores de solubilidade em soluo amoniacal (4,30 mg/mL a 0 C a 6, 8
mg/ mL, a 25C) foram superiores aqueles obtidos para os solventes mencionados, cujos
valores so apresentados na Tabela 21.
Dois procedimentos foram adotados nesta rota de extrao:
i)
Extrao amoniacal do pigmento removido da semente com

hexano/etanol
Seguindo o procedimento descrito na Seo (3.4) o pigmento, isolado da semente, foi

lavado duas vezes com pequeno volume de etanol, com o objetivo de remover todo o hexano.
Ao extrato slido resultante foi ento acrescentado 300mL de etanol absoluto, 20g de Na2SO4
anidro e 20 mL de hidrxido de amnio (NH4OH30%). Aquecido prximo ebulio por
5min, filtrou-se a quente. A seguir adicionou-se cido actico glacial gota a gota, at no mais
ser observado a formao de nvoa de acetato de amnio, acima da superfcie da soluo.
Agitado por cerca de 10 min deixou-se repousar no freezer. Filtrando ainda gelado. Os cristais
foram lavados com pequena poro de etanol gelado. O produto final assim obtido apresentou
concentrao de 80,12% de bixina.
ii)
Extrao amoniacal diretamente da semente.
Neste experimento, as sementes foram tratadas diretamente com a soluo alcolica

amoniacal anidra a 45 C durante 15 minutos. A soluo, depois de removida a semente, foi
filtrada sob presso e imediatamente precipitada com cido actico. Aps outra filtrao, o
precipitado foi sucessivamente lavado: com. ter etlico/hexano, uma vez, depois com
hexano/lcool e posteriormente seis vezes com hexano. Seguido por outra dissoluo com
115
soluo alcolica amoniacal e precipitao produziu bixina com 87,03 % de pureza. Aps a
ltima precipitao, conveniente lavar com gua destilada, desaerada, no sentido de eliminar
resduo de acetato de amnio proveniente da neutralizao do hidrxido de amnio pelo cido
actico. Para eliminar o residual de gua de lavagem feito uma ltima lavagem com etanol
ou acetona e posterior secagem sob vcuo. No anexo A apresentado um balano de massa
representativo do processo de extrao amoniacal.
A extrao do pigmento da semente com soluo amoniacal, efetuada no primeiro
estgio do processo, seguida de precipitao e lavagem com solvente orgnico, com posterior
re-dissoluo amoniacal e precipitao, mostra-se mais seletiva do que a extrao previa com
hexano/lcool seguida por um nico ciclo de extrao amoniacal e posterior precipitao. Isto
se deve provavelmente a maior seletividade da soluo amoniacal em extrair
preferencialmente a bixina, na forma de bixato de amnio, mais solvel e deixando insolveis
aqueles compostos solveis no hexano, de forma que estes contaminantes sejam eliminados,
em grande parte, j no incio do processo.
4.3 DERIVADOS DA BIXINA

4. 3.1 DERIVADO AMONIACAL
O processamento do substrato contendo bixina, com soluo alcolica anidra

amoniacal, levou a uma maior solubilidade da bixina, devido formao de um sal mais
solvel (bixato de amnio), do que o correspondente tratamento com soluo aquosa de
hidrxido de sdio ou potssio, que por outro lado, conduz hidrlise produzindo norbixina,
menos solvel. A soluo assim obtida, ao ser tratada com cido mineral ou orgnico levou a
ao isolamento de bixina. Isto ficou evidente ao ser se observado, que o precipitado obtido
apresentava as mesmas caractersticas de solubilidade da bixina nos diferentes solventes
testados, distinto dos valores de solubilidade apresentado pela norbixina, com manuteno de
outras propriedades fsicas. O precipitado apresentou ponto de fuso entre 190-192 C em um
ensaio realizado a uma taxa de aquecimento de 10
C/min. Valor este prximo quele
encontrado por Reith e Gielen (1971) para a cis-bixina, 189,5 190,5 C (1,6 C/min, na
regio de fuso). O ponto de fuso para os ismeros da norbixina determinado pelos mesmos
autores situava-se acima de 240C. A Figura 28 representa a provvel estrutura do sal da cis
116
bixina (bixato de amnio), sua formao da soluo amoniacal, alm da reao de hidrlise e
precipitao da bixina e norbixina.
Figura 28 Reaes da bixina e provvel estrutura do sal amoniacal

a reao de formao do bixato de amnio, b reao de precipitao da bixina de uma
soluo amoniacal de bixato de amnio, c reao de hidrlise da bixina (formao de
norbixina), d reao de precipitao da norbixina.
117
4.3.2 DERIVADO CLCICO

Foi observado que a adio de ons clcio s solues alcalinas: aquosa, alcolica, ou
alcolica amoniacal de bixina levavam formao de precipitado vermelho escuro e
conseqente reduo da cor da soluo. Entretanto as solues neutras do derivado amoniacal,
fossem elas, aquosa ou alcolica no precipitavam com a adio de ons clcio. Ocorre que, a
presena de ons clcio em meio alcalino leva tambm a precipitao de hidrxido de clcio.
Sendo assim, este procedimento quando empregado resulta na precipitao do hidrxido de
clcio com a co-precipitao da bixina.
Para evitar a precipitao de hidrxido de clcio procedeu-se a precipitao de uma
soluo amoniacal de bixina com a adio de uma soluo (filtrado) recm preparada de
hidrxido de clcio, facilmente obtida pela hidratao de xido de clcio. Nesta condio, a
presena de ons clcio aqum do produto de solubilidade do hidrxido, permitiu a
precipitao apenas do derivado de bixina. A adio de uma soluo alcolica de bixina a
uma soluo do hidrxido tambm resultou na precipitao. Contudo, a maior solubilidade em
etanol do derivado amoniacal, comparada a bixina, apresenta vantagens de processo
permitindo obter maiores massas de extrato empregando-se volumes menores de solvente.
No anexo B so apresentadas microfotografias dos cristais de bixina e do derivado

amoniacal obtidos em diferentes solventes. As microfotografia do resduo obtido da
evaporao dos solventes empregados nos ensaios de solubilidade do derivado clcico da
bixina, apresentadas no mesmo anexo no mostram sinais de formao de produto com
caractersticas de slidos cristalinos, o que se observa a presena de um resduo oleoso.
Com amostras dos precipitados obtidos foram tambm determinados espectros de IV

e a solubilidade em diferentes solventes segundo procedimento descrito na Seo (3.6). Na
Tabela 21 so apresentados os resultados de solubilidade.
As anlises espectromtricas de infravermelho so apresentadas nas Figuras 29, 30 e
31.
Figura 29 - Espectro no infravermelho da bixina
Figura 30 - Espectro no infravermelho do derivado clcico da bixina.
118
119
Figura 31 - Espectro no infravermelho do derivado amoniacal

Para o espectro da bixina observam-se sinais em 1715 e 1607 cm-1 correspondente a
banda referente carbonila, e uma banda larga na regio entre 3000 e 3500 cm-1
correspondente ao sinal do grupamento cido.
Para o derivado clcico observa-se uma banda larga e intensa diferenciada na regio
correspondente ao grupamento cido. Observa-se tambm uma sobreposio dos dois sinais
da carbonila na regio de 1630 cm-1.
Pela anlise do espectro no possvel inferir se a outra extremidade da molcula
sofrera hidrlise, neste caso formando no apenas um dister, mas sim uma substncia de
maior peso molecular com as extremidades da cadeia interligadas por tomos de clcio
bivalente. No entanto, a reduzida solubilidade como tambm a ausncia de cristais aps a
evaporao das solues nos diferentes solventes refora a suspeita de formao de um
oligmero.
O espectro para o derivado amoniacal no elucida a formao de um sal ou mesmo de
uma amida, porm, uma vez garantida a total eliminao da amnia, no processo de sua
preparao, fica descartada a hiptese de favorecimento da solubilidade por aquela base. Por
outro lado, os dados de solubilidade mostram a existncia de um composto distinto da bixina,
apresentando maiores valores de solubilidade, particularmente em solventes de maior
polaridade. Caracterstica esperada ao substituir o hidrognio pelo grupamento NH4, mais
120
dissocivel. A anlise complementar por RNM traria subsdios para resoluo do problema.
Contudo, no foi possvel ser realizado no presente trabalho.
4.4
OBTENO DE BIXINA CRISTALIZADA
Cerca de 5,0 g de pigmento, removido das sementes segundo procedimento descrito na

Seo 3.6.1, exceto que neste experimento o etanol foi substitudo pela acetona, foram
submetidas cristalizao em acetona, segundo o procedimento descrito na Seo 3.11. O
filtrado resfriado foi transferido para um Becker com o objetivo de novamente saturar a
soluo com mais bixina no extrada (no solubilizada) no primeiro ciclo. Esta operao foi
repetida por cinco vezes at quase total esgotamento da bixina contida no extrato slido, o que
foi observado pela mudana de cor da frao insolvel, que passou do roxo avermelhado
intenso ao amarelo plido. Durante estes ciclos houve a necessidade de reposio de acetona
para compensar perda por evaporao.
Partindo-se de extrato slido com 55 % de pureza, obtido de extrao com acetona
/hexano e empregando acetona PA, no primeiro dos cinco ciclos de cristalizao efetuados,
foram obtidos cristais com pureza de 81,53 %. Todo o contedo de cristais obtidos nos ciclos
posteriores foi reunido em um nico lote que apresentou, aps homogeneizao, uma
concentrao de 77, 2 % de bixina.
Experimento semelhante, porm empregando-se etanol/hexano na fase inicial de
extrao e que levou a um concentrado slido com 50,79% de pureza, produziu cristais com
72,60 % de bixina no primeiro ciclo de cristalizao em acetona, caindo para 63,6% na
amostra obtida pela homogeneizao dos ciclos consecutivos.
Os resultados mostraram que a reutilizao da soluo me desaconselhvel, visto
que as impurezas mantidas em soluo aps a separao dos cristais so incorporadas aos
novos cristais formados no processo posterior de cristalizao, devendo-se, portanto,
empregar solvente PA a cada novo ciclo de cristalizao.
4.5
121
RECRISTALIZAO DA BIXINA
No curso dos trabalhos, aps otimizao do processo de extrao, foram repetidos por
diversas vezes o procedimento de recristalizao, com o objetivo de obter-se padro de alta
pureza e recm preparado. Experimentos realizados com sucessivas etapas de cristalizao da
bixina usando-se solvente PA, a cada novo ciclo, permitiram obter cristais com pureza que
variaram de 94,03% at 98,27 %. Observa-se que quanto maior a concentrao do extrato
bruto, mais fcil obteno de cristais com maior pureza, inclusive sem a necessidade de um
grande nmero de ciclos de recristalizao. O experimento que conduziu a 98,27 % de pureza
resultou de um extrato obtido de extrao alcolica amoniacal com resfriamento lento
controlado, o que refora a necessidade de boa formao dos cristais relacionada sua pureza.
Este grau de pureza foi conseguido com um nico ciclo de cristalizao.
Tomando-se por base os resultados obtidos dos experimentos de extrao e
determinao da solubilidade da bixina, possvel definir uma rota para extrao e
purificao de pigmento, ou mesmo a conduo de um processo que leve obteno de bixina
com elevada pureza. Na figura 32 apresentado o fluxograma que resultou do conjunto de
observaes obtidas deste estudo.
122
Semente
Etanol
Agitao
mecnica
Na2SO4
NH4OH
Semente
isenta de
Pigmento
Soluo
precipitao
Filtrao
Soluo
cido
actico
filtrao
Precipitao
Lavagem
com gua +
antioxidante
descarte
Filtrao
Lavagem
4 ciclos
hexano/etanol
soluo
Precipitado
Descarte
Precipitado
Lavagem c/ etanol
Lavagem c/ter etlico
Pigmento com
85 a 88% de
bixina
Redissoluo
Recistalizao
em acetona
Etanol
Na2SO4
NH4OH
Retido
Filtrao
Soluo
Cristais de bixina
c/at 98,5 % de
pureza
Figura 32 - Fluxograma de Extrao, pr-purificao e cristalizao de bixina obtida de

semente de urucum.
Neste processo de cristalizao, quanto mais lento era conduzido o resfriamento, mais
puro eram os cristais obtidos. Nesse sentido conveniente re-aquecer a soluo
imediatamente aps a filtrao permitindo assim um resfriamento mais uniforme e sob
repouso. A transferncia para um recipiente isolado termicamente tambm propicia condio
favorvel a um bom desempenho deste processo. Ainda, cuidados quanto ao isolamento da luz
durante o procedimento de filtrao tambm prtica aconselhvel.
123
4.6 SOLUBILIDADE DA BIXINA E DERIVADOS (METODOLOGIA II)

Na Tabela 21 so apresentados os valores de solubilidade da bixina, do derivado
amoniacal, do derivado de clcio e da norbixina, cuja determinao se fez empregando a
metodologia II Seo 3.9.1. A adio de acido actico s solues dos derivados amoniacal e
clcico permitia proceder anlise do equivalente teor de bixina.
Os resultados apresentados na Tabela 21 esto expressos em termos do equivalente
teor de bixina. Quando se comparam os valores encontrados para a solubilidade da bixina
queles determinados usando a metodologia I, observa-se grande diferena. Estes
experimentos estiveram menos sujeitos a erros analticos, pois no estavam envolvidos os
fenmenos de hidrlise, e as amostras aps saturao foram centrifugadas e posteriormente
filtradas em membrana de teflon de 0,22 m de abertura.
Tabela - 21 Solubilidade da bixina e derivados (metodologia II)

Solvente
Bixina
Derivado
Derivado de.
Norbixina **
Amoniacal*
Clcio*
mg/mL
mg/mL
mg/mL
mg/mL
Etanol
0,148
0,360
0,021
0,685
Acetona
0,616
0,709
0,007
0,992
Clorofrmio
2,191
0,830
0,105
0,931
Metanol
0,121
0,276
0,133
1,002
Acetato de etila 0,533
0,471
0,018
0,601
ter etlico
0,328
0,575
0,003
0,812
*Com base no teor em bixina, **Coeficiente de absortividade em clorofrmio, segundo Reith
%
e Gielen (1971), como -norbixina Ecm
(468) = 2470.
4.7
ESCOLHA DO SOLVENTE PARA A ESPECTROFOTOMETRIA
A impreciso das medidas, decorrentes do emprego da tcnica por hidrlise e o risco

de comprometimento das avaliaes foram decisivas para a adoo do clorofrmio como
solvente para as anlises espectrofotomtricas.
4.7.1 EMPREGO DO CLOROFRMIO

Na Tabela 22 so apresentados os valores da pureza de bixina, obtidos atravs de dois
ciclos de recristalizao em acetona. Os resultados referem-se a anlises da mesma amostra,
124
(6 repeties) determinadas em clorofrmio, segundo a metodologia II descrita na

Seo (3.91), empregando-se os dois coeficientes de absortividade citados por Reith e Gielen
(1971).
Tabela 22 - Anlise do teor de bixina recristalizada em acetona

Amostras
Massa
(multiplicata) (mg)
1
7.5
2
13.6
3
26,6
4
5
18,7
6
14,5
Valor mdio
( b)
V. balo
(mL)
50
50
50
50
50
50
Diluio
0,1/10
0,1/10
0,05/10
0.05/10a
0,05/10
0,07/10
Abs
(471nm)
0,372
0,703
0,672
0,701
0,478
0,531
% Bixina
76,78
80,01
78,21
81,59
79,13
80,98
79,44
79,58b
Abs
(501nm)
0.334
0,633
0,602
0,628
0,428
0,474
% Bixina
77,31
80,81
78,58
81,97
79,47
81,07
79.86
79.45b
(a) Amostra 4 = amostra 3 empregando clorofrmio recuperado para diluio, (b) = mdia,
excludo a amostra 4.
4.7.2 EMPREGO DO ETANOL
O emprego de etanol em substituio ao clorofrmio apresenta algumas vantagens

competitivas: no txico e tem menor custo. Alm disto, a bixina mostra-se mais estvel
quando nele dissolvida, sendo, portanto, de grande importncia determinao do coeficiente
de absortividade neste solvente. A soluo de bixina apresenta neste solvente, bandas de
absoro mxima na regio de 458 nm e 486 nm do espectro eletromagntico visvel. Dois
experimentos, identificados respectivamente como A e B foram realizados para a
determinao do coeficiente de absortividade em etanol. Na seqncia sero mostrados os
resultados obtidos; no primeiro foram empregados cristais de bixina preparados por
recristalizao e analisados em clorofrmio, no segundo a bixina empregada correspondia
quela contida nas solues dos ciclos de extrao do experimento 3, cujos teores foram
determinados pela tcnica da hidrlise.
125
Experimento A.
Os valores do coeficiente de absortividade obtidos no primeiro ensaio, mostrados na
Tabela 22, apresentaram os seguintes valores mdios: 3443 28 em 458 nm e 3058 255
em 486nm. Estes valores so oriundos da mdia entre os coeficientes das curvas de
calibrao, obtidas em etanol absoluto e cujos valores de concentrao da bixina empregada
como padro, apresentados na Tabela 21, foram calculados nos dois comprimentos de onda de
absoro em clorofrmio, 471nm e 501nm empregando o mtodo descrito na seo (3.9.1),
Metodologia II.
O procedimento para determinao do coeficiente de extino molar segue a mesma
metodologia de preparao de amostra para leitura espectrofotomtrica em clorofrmio.
Partindo-se de um padro de concentrao conhecida, prepara-se uma soluo estoque no
solvente desejado e desta soluo coletam-se alquotas para elaborao de uma curva de
calibrao. Atravs do grfico, absorbncia versus a concentrao, obtm-se o coeficiente de
absortividade, que corresponde ao coeficiente angular da curva.
Na Tabela 23 pode ser observado o valor do coeficiente de absortividade obtido para a
bixina em soluo alcolica.
Tabela 23 - Coeficiente de absortividade da bixina em etanol.
458 nm
de leitura para o etanol
de leitura para o padro em clorofrmio 471nm 501nm
% de bixina*
79,58 79,45
3472 3415
e tan ol
5 R
0,9992 0,9992
3443.5 28
6 e tan ol ( valor mdio)**
1
2
3
4
486 nm
471nm 501nm
79,58 79,45
3084 3033
0,9991 0,9991
3058 25
(*) valor obtido da Tabela 22. (valor mdio da concentrao do padro).

(**) mdia entre os valores apresentados na linha 4.
As diferenas encontradas estariam relacionadas a erros experimentais e aos limites de
preciso das micropipetas e balana. Os valores maiores de concentrao mostrados na Tabela
23, obtidos com a leitura em 501nm e que foram empregados para a determinao da
concentrao do padro em uma das duas curvas de calibrao da soluo alcolica, no
permitem afirmar que este seria a melhor regio da banda do espectro para determinao do
valor de absorbncia. Visto no ser um padro 100% puro, ou ainda devido a incertezas com
relao aos valores dos coeficientes de absortividade adotados (3230 para 471 nm ou 2880
126
para 501 nm), fica difcil predizer qual valor seria aquele mais correto (adequado) e
conseqentemente qual a melhor banda para leitura, 471nm ou 501nm. Observa-se, por outro
lado, que o uso de clorofrmio recuperado para diluio, aumentou o valor de absoro nas
duas bandas, contudo, mais intensamente em 501nm, o que poderia evidenciar uma maior
contribuio de contaminantes provenientes do pigmento, no eliminados na destilao do
solvente, agora sobrepondo absoro nesta regio do espectro.
Experimento B.
Das solues provenientes do experimento 3, foram separadas amostras de cada ciclo
de extrao, com as quais foram conduzidas diluies para elaborao de curvas de
calibrao. Os valores dos coeficientes obtidos so apresentados no Anexo E. Esta avaliao
teve como objetivo verificar se o valor do coeficiente de extino se mantm constante para
diferentes concentraes de bixina, independentemente se esta contem associada uma maior
quantidade de contaminantes. Este aspecto importante visto que, quando se determina a
concentrao de uma amostra desconhecida, o coeficiente aplicado deve atender a uma faixa
ampla de concentrao, fornecendo valores que correspondam realidade. Caso contrrio, se
a recproca no for verdadeira, os erros analticos sero agravados em funo da maior ou
menor quantidade de contaminantes presente.
Os valores de concentrao das amostras tomadas como padro para a elaborao das
curvas de calibrao foram obtidos de anlise pelo processo da hidrlise. Para cada amostra
foi adotado o maior valor de absorbncia encontrado durante a evoluo da hidrlise,
acompanhada no intervalo de cinco horas. Estes resultados so apresentados na Tabela 24, na
qual mostrada a variao da absorbncia para as solues de cada ciclo de extrao ao longo
do intervalo de observao.
Para curva de calibrao foram coletadas alquotas de 0,02 mL a 0,1mL conforme
Tabela 25, na qual tambm podem ser observados os valores de absorbncia medidos a
486nm. As alquotas aps eliminao do hexano, por arraste com nitrognio, foram diludas a
10 mL com etanol absoluto.
127
Tabela 24 - Valores de absorbncia das amostras provenientes dos ciclos de extrao do

experimento 3
Ciclos
1
2
3
4
5
6
7
8
Valores de absorbncia (evoluo com o tempo)*

0.338
0.356
0.354
0.348
0.369
0.22
0.223
0.231
0.223
0.289
0.232
0.217
0.222
0.231
0.292
0.192
0.186
0.182
0.188
0.193
0.159
0.16
0.155
0.158
0.172
0.165 0.17
0.17
0.167
0.183
0.163
0.16
0.163
0.157
0.166
0.165
0.169
0.169
0.163
0.195
0.362
0.252
0.229
0.179
0.15
0.171
0.153
0.158
0.342
0.214
0.215
0.177
0.149
0.164
0.158
0.156
*Intervalo de observao 5 h.
Tabela 25 - Valores de absorbncia das solues empregadas para determinao do

coeficiente de absortividade
Ciclos
1
2
3
4
5
6
7
8
Volume alquotas por 10 mL

0.02
0.04
0.06
0.162
0.348
0.530
0.104
0.20
0.325
0.095
0.187
0.295
0.062
0.156
0.246
0.067
0.139
0226
0.067
0.141
0.233
0.061
0.130
0.192
0.039
0.106
0.211
0.08
0.655
0.419
0.385
0.339
0.290
0.309
0.278
0.262
0.10
0.781
0.556
0.537
0.437
0.366
0.394
0.345
0.357
Os valores obtidos para o coeficiente de absortividade apresentaram variaes muito

grandes. Os erros decorrentes da metodologia analtica, inerentes hidrlise da bixina
contriburam em grande parte para os resultados obtidos. A reduo do teor de leo do
primeiro para o ltimo ciclo, e o conseqente aumento da concentrao de bixina nos
respectivos extratos no mostrou um comportamento de crescimento ou de reduo dos
coeficientes obtidos, que pudesse justificar contribuio destes contaminantes em participao
aditiva na absorbncia. Ao contrrio os valores encontrado oscilaram aleatoriamente. Erros de
diluio, se presentes, no acarretariam tal comportamento, pois os procedimentos adotados
para coleta de amostra e diluio foram os mesmos empregados para preparao das solues
que levaram aos resultados obtidos com clorofrmio. A grande variao nos valores
encontrados est certamente relacionada confiabilidade da metodologia analtica adotada, ou
seja, o mtodo espectromtrico baseado na hidrlise alcalina.
128
4.8 ESPECTROS DE ABSORO EM CLOROFRMIO

Na Figura 33 so apresentados os espectros de absoro das solues oriundas do
experimento 4, no qual foram realizados sete ciclos de lavagem com hexano/etanol 1/1 (ciclos
de 1 a 7) e dois ciclos finais (8 e 9) empregando-se hexano puro. As varreduras das solues
foram determinadas em clorofrmio depois de ter sido eliminado o solvente original das
amostras. Pode ser observado nos espectros o encobrimento do pico da bixina naquelas
amostras que apresentam um maior teor de leo (amostra 1), tanto mais encoberto quanto
menor a ordem do ciclo.
Como as amostras apresentavam concentraes distintas de bixina, a seqncia dos
grficos no corresponde seqncia numrica (legenda), que corresponde ordem do ciclo.
Nota-se, contudo, a melhor definio (forma) do pico da bixina como tambm a relao de
sua intensidade com a intensidade dos outros picos, na regio de menor comprimento de onda,
na medida em que a amostra se torna enriquecida, ciclos de maior ordem.
Ciclos de extrao
1,0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Absorbncia
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
200
300
400
500
Comprimento de onda (nm)
Figura 33 - Espectros de absoro de bixina em clorofrmio
600
129
4.9 ESPECTROS DE ABSORO EM SOLUO ALCALINA
A anlise de espectros de varredura obtidos de extratos provenientes de diferentes

ciclos de extrao, quando provenientes de hidrlise, possibilitou fazer as seguintes
observaes:
O primeiro extrato, rico em leo apresenta-se com intensa absoro na regio do

visvel de reduzido comprimento de onda, entre 340 nm a 400 nm encobrindo o
espectro at a regio do UV longo;
Nos ciclos de extrao monitorados, observou-se que na medida em que se

evoluam as lavagens, a absoro na regio anterior quela da bixina, perdia
intensidade paralela ao destaque do pico da bixina, demonstrando que estes
extratos estavam sendo enriquecidos em bixina em detrimento dos contaminantes
antes presentes.
A Figura 34 apresenta uma seqncia de espectros obtidos de solues de lavagem de

semente com hexano/etanol.
1,1
Ciclos de extrao
1,0
0,9
1
2
3
4
5
6
7
8
0,8
Absorbncia
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
200
300
400
500
600
Comprimento de onda (nm)
Figura 34 - Espectro de absoro da bixina em soluo de hidrxido de sdio.
130
Instabilidade de leitura.
As solues de amostras contendo bixina apresentam diferentes comportamentos no
que se refere instabilidade de leitura espectrofotomtrica. As amostras submetidas
hidrlise em soluo alcalina, se agitadas antes da determinao espectrofotomtrica
apresentam leitura oscilante. Este comportamento no se observa para a soluo em
clorofrmio. As solues alcalinas, ainda que totalmente cristalinas, quando observadas no
balo, logo aps enrgica agitao, mostram variaes na cor da soluo, aparentando a
presena de um componente de colorao amarela mais intensa difundindo-se atravs da
soluo. Isto porm desaparece, minutos aps a agitao, repetindo contudo a qualquer
momento que se proceda a nova agitao. Suspeitou-se da presena de oxignio incorporado
durante o processo de agitao, favorecendo a formao de um composto intermedirio que
imediatamente era incorporado soluo. Neste sentido, uma srie de ensaios foi realizada
com o propsito de investigar a participao do oxignio neste processo.
Influncia do oxignio.
Esta srie de ensaio teve como objetivo avaliar amostras de mesma origem,
submetidas soluo de hidrxido de sdio 0,5 N, porm tomando-se o cuidado de avaliar a
interferncia do oxignio durante o processo de solubilizao. importante destacar que
nestes ensaios no foram feitas determinaes do percentual de bixina, pois nesta prvia,
apenas a visualizao do espectro poderia acusar presena de outros compostos, o que poderia
caracterizar a esperada interferncia. Empregou-se como amostra o pigmento removido da
semente aps cinco lavagens com etanol/hexano 1/1 e 6 ciclos com hexano. Foram
processadas quatro amostras como segue:
A - Pigmento extrado com soluo de hidrxido de sdio sem aerao;
B-Pigmento extrado com soluo de hidrxido de sdio e efetuando-se aerao da
soluo final por 10 min;
C-Pigmento extrado com soluo de hidrxido de sdio previamente desaerada*;
D - Pigmento extrado com soluo Etanol/gua / amnia 40/57/3.
131
Tabela 26 - Bandas de absoro e valores de absorbncia de amostras acompanhadas sob

efeito de aerao.
(nm)
Amostras
A
B
C
D
Branco
481.0
453
0.476
1.233
0.310
0.958
0.551
1.411
.077
1.089
345
273.5
270.5
238
217.5
0.316
0.371
0.282
0.517
0.241
0.112
0.282
0.077
0.154
0.184
218.5
0.429
0.184
a) * soluo de hidrxido de sdio submetida ao aquecimento e mantida sob vcuo por

30 min.
b) Todas as diluies foram feitas com soluo de hidrxido de sdio desaerada
c) os experimentos foram realizados sem proteo dos efeitos de luz.
Observa-se na Tabela 26 que:
Todas as solues, com exceo da amoniacal apresentam absoro em 217,5 nm,
porm com maior intensidade de absoro que o branco, sugerindo alguma interao com o
solvente;
A intensidade de absoro se acentua, tanto maior quanto maior a concentrao de
bixina (picos de absoro em 481,0 nm e 453 nm);
Observa-se tambm que quanto mais aerada maior o aparecimento de outras bandas de
absoro, sugerindo a formao de outros compostos;
A amostra com soluo de hidrxido de sdio previamente desaerada mostra uma
menor intensidade no pico em 273,5 nm, tambm presente na amostra 1;
O experimento 2 apresenta picos inexistentes nos outros ensaios com soluo de
hidrxido de sdio, provavelmente decorrentes de processos oxidativos.
O comportamento de instabilidade de leitura tambm foi observado, da mesma forma
que o surgimento de regies de difuso de cor na soluo, ainda que com menor intensidade.
A presena na amostra, de alguns compostos lipossolveis que no foram eliminados
adequadamente durante o processo de lavagem com solvente, ainda que em quantidade
reduzida, podem ser responsveis pelo fenmeno observado, se estes apresentarem reduzida
solubilidade na soluo alcalina. Se ao contrrio, os mesmos compostos forem totalmente
solveis no clorofrmio isto explicaria a estabilidade de leitura neste solvente.
132
4.10 ACOMPANHAMENTO DA ESTABILIDADE DA BIXINA EM

ETANOL
Na Tabela 27 so apresentados os valores de leitura espectrofotomtricas de solues
provenientes dos ciclos de extrao do experimento 3, monitoradas ao longo de sete meses de
estocagem.
Tabela 27 - Acompanhamento da absorbncia das solues com tempo de estocagem.
Ciclos
1
2
4
5
6
7
8
Tempo (dias)
1
9
2,713
2,731
2,622
2,635
2,582
2,614
2,546
2,575
2,546
2,575
*
2,575
*
2,594
15
2,715
2,645
2,604
2,585
2,585
2,566
2,566
34
2,712
2,620
2,600
2,488
2,545
2,563
2,563
50
2,712
2,622
2,622
2,582
2,522
2,522
2,552
80
2,734
2,660
2,616
2,590
2,531
2,535
2,556
130
2,707
2,659
2,618
2,596
2,536
2,502
2,546
200
2,645
2,582
2,563
2,527
2,544
2,478
2,563
Obs.: Ausncia do terceiro ciclo devido perda da soluo aps a extrao.

*no disponvel no primeiro dia, leitura efetuada no segundo dia de extrao (conseqentemente os tempos
referentes a estas amostras esto defasados de 1 dia).
Os valores de absorbncia apresentados referem-se leitura das amostras em repouso

aps agitao por aproximadamente 5 segundos, visto que sua leitura efetuada aps a
transferncia para cubeta apresentava valores oscilantes e com reduo de 20 a 30 milsimos
de unidades de absorbncia.
O acompanhamento das solues de bixina em etanol, empregando as amostras
provenientes dos ciclos de extrao teve como propsito verificar se os outros componentes
presentes nas sementes trariam alguma contribuio, no sentido de favorecer a estabilizao
da bixina durante o perodo de estocagem. As solues provenientes dos ciclos de extrao
apresentam crescentes concentraes de bixina e decrescente teores de outros componentes,
ver Tabela 19, experimento 3. Enquanto o extrato slido proveniente do primeiro ciclo
apresenta apenas 5,65 % de bixina, aquele obtido do oitavo ciclo apresenta 52,43 %. Contudo,
isto no resultou em mudanas nas absorbncias. Apesar de todos os valores terem
apresentado queda, as leituras determinadas aps 200 dias de avaliao corresponderam a
nmeros que oscilaram de 96,23 % a 99,92 % daqueles iniciais. Contudo, sem nenhuma
133
correspondncia com o maior ou menor teor de bixina ou dos outros compostos presentes no
extrato. Por outro lado, a ausncia de uma soluo preparada com bixina pura, isenta dos
outros componentes, impossibilita fazer qualquer afirmao que relacione alguma possvel
contribuio na conservao da bixina. O percentual dos outros componentes, presentes na
soluo do oitavo ciclo ainda elevado, desta forma pode ter contribudo para os valores
encontrados.
Os elevados valores de absorbncia encontrados e as oscilaes durante a leitura
impedem um monitoramento mais preciso. A avaliao da estabilidade pode ser mais evidente
em condies de maior diluio. Desta forma, seria conveniente diluir
as amostras
anteriormente estocagem. Por outro lado, a diluio da alquota na ocasio da medida no

permitiria uma avaliao acurada, pois teramos um provvel efeito positivo da concentrao
na estabilizao da amostra. Ainda assim, os valores observados sugerem que, a estocagem da
bixina em soluo alcolica mais conveniente do que em clorofrmio. Os padres mantidos
durante uma semana em clorofrmio tinham que ser descartados visto que perdiam
rapidamente seu teor original. Entretanto, a baixa solubilidade da bixina em etanol comparada
ao clorofrmio, traz dificuldades a sua aplicao.
4.11
MONITORAMENTO
DE
PADRES
EM
DIFERENTES
CONDIES DE ARMAZENAMENTO
Observou-se que tanto as amostras de bixina, quanto de bixato de amnio, quando
devidamente secas absorviam umidade imediatamente aps a abertura do frasco mantido sob
vcuo, tornando imprecisa a pesagem. Isto em conseqncia causava srios problemas de
preciso na determinao da massa empregada para determinao do teor destes
componentes. O procedimento de quebra de vcuo com nitrognio ou mesmo com ar
previamente seco, permitiu que as oscilaes apresentadas durante a pesagem fossem
eliminadas.
A Tabela 28 apresenta os valores das concentraes durante o perodo de estocagem.
134
Tabela 28 Concentrao dos padres em funo do tempo de estocagem

Perodo de acompanhamento (dias)
Amostra Concentrao 0
15
30
60
90
% degradao.
A1
92,79 93,36
92,07 84,46 77.13 73,83
20.44
A2
92,79 93,47
92,82 88,41 85,31 80,08
13,7
A3
92,79 86,01
91,27 94,96 89,40 80,09
13,69
A4
mg/100mL
10,11 10,53
10,98 10,27 10,02 11,23
0,00
A5
mg/100mL
9,98
9,95
9,56
8,78
8,42
9,84
1,41
A6
mg/100mL
7,41
8,04
7,44
6,9
6,3
7,22
2,57
A7
mg/100mL
52,36 52,55
51,79 50,7
48,77 51,53
1,59
B1
90,27 85,5
74,69 85,94 80.03 71,24
21,09
B2
90,27 91,02
94,06 86,45 80.25 77,85
13,76
B3
90,27 100,74 95,89 81,7
88,3
82,17
8,58
B4
mg/100mL
10,63 7,02
7,23
7.04
7,12
7,01
34,06
B5
mg/100mL
8,64
7,26
8,18
8,02
7,18
5,76
33,34
B6
mg/100mL
8,64
7,44
6,66
6,5
6,1
6,06
29,87
B7
mg/100mL
56,38 58,19
56,9
57,89
0,00
57,06 56,5
Legenda: A, bixina; B, derivado amoniacal.

ndices; 1, gs liquefeito de petrleo (GLP); 2, vcuo; 3,atmosfera de nitrognio; 4, etanol absoluto; 5, Etanol
com 2% de BHA; 6, etanol com 2% de vitamina E (-tocoferol); 7, soluo 50/50
Acetonitrila/dimetilformamida.
Todas as amostras foram estocadas mantidas em freezer a 18C e isoladas da luz.
Dos resultados mostrados na Tabela 28 pode-se verificar que as amostras de bixina

apresentaram maior estabilidade em soluo. O etanol absoluto puro mostrou-se melhor
solvente para conservao da bixina representado pela amostra A4. Durante o perodo de
acompanhamento no se observou reduo na concentrao. A adio de vitamina E ou BHA
no trouxe a contribuio esperada, ainda que a degradao tenha sido reduzida.
No caso dos derivados amoniacais a maior estabilidade foi conseguida para a mistura
acetonitrila /dimetilformamida. Em etanol foram observadas degradaes da ordem de 30 %.
Ainda que se tenha tomado cuidado especial para minimizar erros de pesagem
observou-se que para as amostras slidas os resultados obtidos oscilaram ao longo do
monitoramento, como pode ser visto na Tabela 29. Por outro lado, para estas amostras, no foi
possvel garantir que todas as fraes, colocadas nos frascos tivessem a mesma concentrao.
Isto porque estas fraes foram transferidas e lacradas em diferentes intervalos de tempos.
135
No d para desprezar os efeitos de incorporao de umidade, enquanto expostas, aguardando

o processamento de embalagem. Este fato marcante, visto que duas solues preparadas
com pequeno intervalo de tempo apresentaram variaes na concentrao, acarretadas por
erro de massa. Estas variaes chegaram em determinados casos em at 5 %. Os erros de
pipeta tambm devem ser considerados apesar da sua contribuio ter um menor peso.
No caso de erros causados pela pipeta, ainda que se proceda lavagem da parte interna
aps a drenagem, o emprego de solventes orgnicos agrava mais os problemas inerentes
medida de volume, tanto maior quanto maior a presso de vapor apresentado por este.
A ttulo de informao solues em triplicata elaboradas com uma mesma soluo
estoque, em que o solvente era clorofrmio, foram preparadas com alquotas de 100L e
diludas a 10 mL. Estas solues apresentaram absorbncia de: 0,245, 0,247 e 0,235. Como a
concentrao tem uma relao direta com a absorbncia, estes valores acarretariam erros na
ordem de at 3,0%.
As amostras mantidas em GLP, apresentaram aps um ms de estocagem aspecto
aglomerado, diferente de sua caracterstica anterior, material solto e de fcil fluidez. No foi
possvel concluir se houve degradao, contudo, a tampa de borracha, apresentou ntidos
sinais de desagregao acarretada pelo GLP, fato verificado em um ensaio em branco. Desta
forma, o teste com este solvente ficou inviabilizado, devido contaminao de material
proveniente da tampa de borracha.
Comparando conservao de amostras no estado slido, sob vcuo ou em atmosfera
de nitrognio aos melhores resultados apresentados pelas amostras estocadas em soluo,
sugere ser satisfatrio o armazenamento de cristais imersos em soluo. Sendo a solubilidade
da bixina muito baixa, esta alternativa permite estocar quantidades maiores e com elevada
pureza mantidas em pequeno volume de
solvente. Neste sentido, duas amostras, uma
estocada em etanol e outra em acetona foram avaliadas pelo perodo de dois meses. Durante
este tempo, no foi observado reduo nas concentraes destes padres. Esta forma de
interesse, visto a facilidade de se disponibilizar maior quantidade de padro no momento das
anlises. Para isso, basta retirar quantidade de padro necessrio, e eliminar o solvente sob
vcuo. No caso particular da acetona isto se torna ainda mais fcil custa da sua elevada
presso de vapor deste solvente.
136
4.12 MONITORAMENTO ESPECTROFOTOMTRICO NO CURSO DA

HIDRLISE
A anlise da bixina via hidrlise, segundo o mtodo (Kato et al., 1992) apresenta uma
srie de inconvenientes. A dependncia com relao a parmetros cinticos faz com que
ocorra um grande desvio nos resultados, dificultando a reprodutibilidade.
Este monitoramento teve como objetivo acompanhar a evoluo da hidrlise alcalina
da bixina em funo do tempo, temperatura e concentrao do lcali, com o objetivo de
verificar a estabilidade do composto frente s condies que podem estar presentes no s nas
metodologias analticas como tambm em processos de extrao.
No Anexo F esto reunidos os valores de absorbncia das solues de bixina obtidos
durante o perodo de monitoramento. A evoluo da hidrlise pode ser visualizada melhor nas
Figuras 35, 36 e 37.
Figura 35 Evoluo da hidrlise da bixina em soluo de NaOH 0,02N.
Figura 36 - Evoluo da hidrlise da bixina em soluo de NaOH 0,1N.
Figura 37 - Evoluo da hidrlise da bixina em soluo de NaOH 0,5N.
137
138
Os resultados obtidos, mostram que a utilizao da metodologia que explora o

fenmeno da hidrlise no permite obter valores precisos para a determinao da
concentrao da amostra.
As solues preparadas com padro de bixina continham 2,19g/mL de bixina. Com
esta concentrao a soluo deveria apresentar um valor de absorbncia de 0,630,
correspondente s diluies a que foi submetido o padro, conforme descrito abaixo.
54,7mg de bixina, proveniente de uma massa de 59,2mg com 92,53 % de pureza,
diluda, inicialmente a 50 mL e a seguir 2/50 desta soluo diluda a 1000mL. Este valor
aplicado ao coeficiente de extino 2870 (para a soluo de NaOH), resultaria em uma
absorbncia de 0,630.
Ou, ainda, com base na equao (48) para clculo da concentrao, onde podemos
assumir como 54,7 mg sendo bixina 100% pura, teremos:
100%= (Abs. x 50 x 1000 x 100) / (0,0547 x 287 x 2 x 1000) =
Resolvendo-se a equao obtem-se o valor de absorbncia (Abs) = 0,630.
Das Tabelas apresentadas no Anexo F foram retirados alguns valores de absorbncia,
mostrados aqui na Tabela 30 na qual podemos observar que:
A soluo mantida na geladeira a 5 C apresentou absorbncia mxima de 0,621 aps
14124 min (9,8 dias), mesmo assim este valor corresponderia a 0,621/0,630, ou seja 98,57 %
da bixina presente. A mesma avaliao pode ser feita para as outras solues. Observa-se
ainda que aquelas solues submetidas maior temperatura no atingiram a absorbncia
mxima e, inclusive mostraram maior degradao. Da mesma forma a degradao foi tanto
maior quanto maior a concentrao da soluo de hidrxido de sdio.
139
Tabela 29 Valores mximos de absorbncia apresentados pelas amostras sob

monitoramento de hidrlise
Temperatura Conc. NaOH Abs.
Concentrao Tempo
Eq.g/L
Mxima
Mxima %
horas
0.02
0.621
98.57
588
25
0.02
0.561
89.04
22.81
40
0.02
0.528
83.81
15.58
0.1
0.614
97.46
309.75
25
0.1
0.570
90.47
143.25
40
0.1
0.537
85.23
46.36
0.5
0.406
64.44
670.72
25
0.5
0.401
63.65
671.08
40
0.5
0.458
72.69
64.33
A indicaes ( e ) que aparecem na terceira coluna tm como propsito indicar a

evoluo da absorbncia (), significando que o valor de absorbncia j atingiu sua maior
intensidade e (), que os valores de absorbncia apresentam-se em curso de queda,
mostrando que a absorbncia evoluir para valores inferiores.
Pode-se da concluir que o aumento da temperatura e/ou concentrao da base, ainda
que tenham efeito cataltico sobre a cintica, tambm catalisam outras reaes secundrias, de
forma que a reduzida estabilidade da bixina como tambm do seu produto de hidrlise, a
norbixina, impe limitaes ao controle destes parmetros. Portanto, a informao da
concentrao de bixina obtida pelo emprego desta tcnica imprecisa pois, reaes paralelas
de isomerizao, oxidao e decomposio ocorrem no curso da anlise, observado aqui pela
mudana constante da leitura espectrofotomtrica. Sendo assim, os percentuais de bixina
encontrados nas analises efetuadas pelo uso desta tcnica levam a valores de concentrao
inferiores a real concentrao presente.
140
4.13 SEPARAO CROMATOGRFICA
A purificao e separao da bixina por processo adsortivo, objetivos principais deste

trabalho foram conduzidas em coluna preparativa flash. Amostras parcialmente concentradas
contendo uma massa conhecida de bixina foram aplicadas coluna. Feita a varredura das
fraes, aquelas identificadas como bixina eram analisadas, computando-se a massa presente.
No anexo J apresentado uma planilha dos dados completos coletados de um dos
experimentos.
Nas separaes realizadas na coluna preparativa flash, mesmo empregando padro
recristalizado, observou-se a presena de dois picos de bixina. Nos experimentos iniciais, em
que a polaridade era mais elevada, uma banda bem resolvida, de maior intensidade,
identificada como bixina, apresentava reduzido tempo de reteno. Distante deste pico e com
menor concentrao tambm se detectava outro pico de bixina.
Em experimentos subseqentes, onde a polaridade foi progressivamente reduzida,
notou-se que, alm da elevao do tempo de reteno do primeiro pico, tambm ocorria a
inverso da posio destes. Esta inverso ocorre na regio entre a relao 50/50 e 40/60
acetato de etila /hexano. Ainda, na medida em que se afastava dos extremos de polaridade
ocorria um alargamento da banda, particularmente naquela de maior tempo de reteno,
acarretando um conseqente maior volume de colunas, tambm caracterizado por fraes que
apresentavam lenta e gradual variao na concentrao.
No dispondo de um forma imediata de caracterizao dos ismeros, submeteu-se uma
amostra recristalizada de bixina a aquecimento com gua, em tubo fechado por um perodo de
24 horas, que segundo Surmatis (1976) isomeriza a forma cis trans. Tambm no sentido de
favorecer a isomerizao, uma segunda amostra foi exposta luz ambiente por um perodo de
20 h. Com estas amostras foram realizadas corridas na coluna flash. Como resultado, para a
mesma relao polar anteriormente empregada, o pico de maior intensidade mantinha-se na
mesma posio relativa em relao ao segundo, Foi tambm observado reduo na
intensidade do segundo pico, porm sem total eliminao. Este experimento permitiu concluir
que dispnhamos de amostra contendo baixo teor de bixina na forma cis.
141
Para verificar a pureza das fraes de bixina obtida, foram realizados testes com
cromatografia em camada delgada (CCD) e determinados os valores de Rf. Apesar de terem
apresentado tempos de reteno distintos na coluna, na CCD no se observou diferenas. Os
resultados confirmaram a pureza das fraes correspondentes ao primeiro pico proveniente
daquelas corridas com maior relao de acetato de etila (maior polaridade), visto que apenas
uma nica mancha era deslocada. Entretanto, a frao correspondente ao segundo pico
revelava um composto na mesma posio do primeiro pico e apresentando ainda sinais de
composto retido na linha de base. Na Figura 38 so mostradas placas cromatogrficas nas
quais se empregou fase mvel acetato de etila/hexano com polaridade decrescente. Usou-se
neste conjunto de placas as amostras provenientes dos dois picos eludos em uma corrida
contendo 80 % de acetato e 20 % de hexano.
Figura 38 Reteno da bixina em placas de CCD em funo da polaridade da fase mvel .

Fase mvel acetato de etila/hexano; A 90/10; B 80/20; C 70/30 ......H 20/80 e I 10/90. Em
cada placa, amostra a esquerda - cis-bixina, amostra a direita - ismero trans.
Com o objetivo de avaliar o desempenho do processo de separao, vrios outros

dados foram obtidos da coluna flash, tais como: velocidades da fase mvel e dos picos
cromatogrficos, densidade e volume do leito e correspondente volume de coluna para eluio
dos picos. Tambm foi verificada a eficincia no empacotamento pelo monitoramento atravs
da massa especfica encontrada para a slica. Os dados mais relevantes esto reunidos no
anexo G. Ainda, foram realizados para efeito comparativo, experimentos com uma coluna de
menor seo. No anexo H so apresentados dois destes experimentos, realizados com as duas
colunas, empregando-se fase mvel de idntica composio.
142
Na Tabela 30 so apresentados parmetros comparativos entre colunas de diferentes

dimetros.
Tabela 30 - Comparao do Volume de coluna entre colunas de diferentes sees

seo slica VC
Vazo original
Vel.original
Vel. corrigida.*
Cis P2 TransP1 P1
P2
P1
P2
P1
P2
2
3
cm
g/cm
mL/min mL/min cm/min cm/min cm/min cm/min
0,292 3,55
45,66 2,005
1,364
1,364
2,739 0,120 4.016 0.176
0,931 2,18
42,31 1,88
2,416
1,855
1,802 0,062 1.49
0,067
P1- pico 1; P2 pico 2; VC volume de coluna; - massa especfica. Fase mvel - acetato de
etila/hexano 80/20.,* velocidade corrigida para deslocamento do eluente obtido na vazo de
2,0 mL/min.Volume de fase lquida no empacotamento (VC (poros)); coluna de dimetro
reduzido, 4,44 mL, coluna de maior dimetro, 14,89 mL.
Dos resultados apresentados na Tabela 30 possvel observar diferenas na
compactao das colunas. Deficincia no empacotamento da coluna de menor seo pode ser
notada pelo valor obtido para a massa especfica da slica, cujo valor real de 2,2 g/cm3. Isto
significa existncia de poros no preenchidos, resultado do inadequado empacotamento, o que
interfere de forma significativa na separao, favorecendo efeitos de parede, como tambm
fluxos preferenciais em regies de maior porosidade. Conseqncia direta nas falhas de
empacotamento refletem na maior deformao dos picos alm de alargamento da banda. Estes
problemas acarretam dificuldades na reproduo de experimentos. Tambm pode ser
observado que a melhor maneira de comparao se faz com o emprego de volumes de coluna,
que independe da vazo.
A dificuldade de reproduzir corridas com a mesma vazo traz dificuldades
comparao de duas corridas cromatogrficas. Como o deslocamento dos picos est
relacionado velocidade de transporte da fase mvel, e esta dependente da vazo, a
aplicao de um fator de correo, quociente da vazo obtida para a fase mvel por um valor
fixo (2,0 mL/min), possibilita comparar as velocidades encontradas quelas que seriam
esperadas se a fase mvel se deslocasse na velocidade tomada como referncia.
Uma vez identificada a existncia das duas formas isomricas na composio da
amostra e julgando que o padro que se dispunha pudesse apresentar baixa concentrao da
forma cis, a mais instvel, suspeitou-se da qualidade deste, que mesmo estocado em freezer,
havia transcorrido duas semanas da sua preparao. Preparou-se ento novo padro
empregando o processo da extrao alcolica amoniacal. Trs corridas flash, 80/20, 40/60 e
novamente 80/20 foram realizadas em intervalos de um dia. Estas corridas tinham como
143
propsito verificar se ocorria a isomerizao entre o primeiro e o ltimo ensaio. Os

cromatogramas confirmaram a inverso na posio dos picos, porm a maior concentrao
continuava ocorrendo para o mesmo pico. Diante destes resultados suspeitou-se da qualidade
das sementes, usadas para preparao do padro, estocadas h mais de um ano. Contudo,
sabendo-se da baixa estabilidade da forma cis em relao trans, novo padro foi elaborado,
desta vez desenvolvendo todo processo a temperatura ambiente. A amostra, sem passar pelo
processo de purificao e recristalizao, apenas lavada com gua depois de um ciclo de
precipitao e apresentando teor de 26.21 % de bixina foi utilizada como matriz para
preparao de soluo. Empregando-se como fase mvel acetato/hexano 30/70, condio em
que a suposta forma cis apresenta menor tempo de reteno, procedeu-se uma corrida
cromatogrfica, com adio coluna de 0,060 mg de bixina, (169 L de uma soluo recm
preparada contendo 0,359 mg/mL de bixina) proveniente da nova matriz.
Agrupadas as fraes de cada um dos picos, resultaram respectivamente em 0.039 mg
(primeiro pico) e 0,019 mg ( segundo pico) de bixina, portanto 65% do suposto ismero cis.
Visto que as separaes anteriores apresentavam teores reduzidos do referido
ismero
concluiu-se que as condies de processo, ainda que empregando aquecimento brando tanto
na extrao quanto na cristalizao, poderiam estar contribuindo para a isomerizao da
amostra, porm, observa-se que a sua eventual exposio luz durante o processo muito
mais crtica.
As fraes integradas obtidas das amostras, submetida a aquecimento e aquela exposta
luz apresentaram respectivamente, 15,9 % e 2,8 % de cis-bixina. Isto poderia tambm
explicar a dificuldade de se obter valores do Rf do ismero cis. Durante o processo de eluio
na coluna, esta, foi mantida freqentemente coberta com uma folha de alumnio. Qualquer
pequeno perodo de exposio afetaria somente aquela bixina prxima parede da coluna. Em
contrapartida, uma vez nos tubos do coletor, agravado ainda mais pela pequena concentrao,
ainda que tomados os cuidados de evitar incidncia direta de luz, sua exposio inevitvel.
Mantida nos tubos da bandeja ao longo da coleta, ou ainda durante a fase de preparao da
placa CCD, o perodo de ao da luz poderia ser suficiente para promover total isomerizao.
Outro aspecto a ser considerado, trata da posio relativa deste ismero na linha de base da
placa.
O espectro de 13C RMN(500 MHz, DMSO) para o trans-derivado (Anexo D), isolado
na coluna flash apresentou sinais em 167,9 e 166,9 ppm referentes aos dois carbonos de
carbonila. Em 71,23 ppm aparece sinal referente a carbono metlico de grupamento ster. Na
regio entre 120 e 145 ppm observa-se uma multiplicidade de sinais correspondentes aos
144
carbonos sp2 da cadeia vinlica Na regio entre 10 e 30 ppm observa-se sinais dos carbonos
das metlas ligadas ao carbono vinlicos.
O espectro de 1H RMN(400 MHz, DMSO) para o cis-derivado (anexo C) apresentou
em 1.89 e 1,94 ppm dois singletos correspondente aos prtons das metilas ligadas aos
carbonos vinlicos. Em 3,67 ppm um singlete de prtons da metila do grupamento ster
(OCH3). Entre 5,78 e 5,92 um dublete de integrao quatro de prtons da cadeia polinica e
ainda um duplete na regio de 7,22 e 7,26 ppm de prtons visinhos da cadeia polinica como
tambm um multipleto na regio entre 6,42 a 6,85 ppm.
Ainda que as anlises de RMN apontem para a presena de bixina, no foi possvel
estabelecer a identidade dos dois ismeros. Muitos sinais estavam presentes particularmente
no espectro de 1H RMN, correspondente a amostra supostamente do ismero cis. Tambm
foram encontrados sinais de hidrognio e aos grupos carboxlicos do cido livre e do ster
entre 7,83 e 7,87 ppm e singlete caracterstico de um radical metila ligado ao anel aromtico
a 2,48 ppm. A presena de aromtico pode indicar a ocorrncia de produto de degradao,
que de acordo com Scotter, (2001) alm da formao do composto C17, reportado pelo autor
tambm ocorre a formao de tolueno.
Como o objetivo do trabalho era obter bixina pura e no necessariamente separar os
dois ismeros, a utilizao de solvente grau PA atendeu ao propsito. Contudo, a anlise de
ressonncia magntica nuclear requer o emprego de solventes de elevada pureza. Desta forma,
seria conveniente, em trabalho futuro, reproduzir os experimentos, em HPLC, empregando a
mesma fase estacionria. Fraes obtidas, em solvente grau HPLC poderiam ento ser
encaminhadas para a RMN.
Como o recproco do RF obtido em CCD possibilita estimar o nmero correspondente
ao volume de colunas aproximado em uma coluna preparativa, um volume de colunas na
ordem de 30 corresponderia a um Rf em torno de 0,033mm em uma placa se 60 mm. Este
valor relacionado mancha na placa cromatogrfica estaria situado a aproximadamente 2 mm
da linha de base. Sendo assim, para compostos com elevada reteno fica difcil mensurar
com preciso o correspondente Rf.
Nos experimentos realizados observou-se tambm variaes para os valores de
volumes de coluna entre cromatogramas de mesma relao de solventes. Estas variaes eram
particularmente maiores para aqueles picos com elevada reteno. Desta forma, ainda que a
separao entre as bandas tenha ocorrido, a correlao entre os dados relacionados queles
picos fica prejudicada.
145
Estes desvios so conseqncia da dificuldade de reproduzir colunas com o mesmo

empacotamento. Alm da ampliao da banda, as imperfeies do leito podem levar a falsa
interpretao de separao para aquelas picos com maior reteno. Isto se revela pela forma
deformada no pico cromatogrfico, apresentado no anexo I, correspondente a um pico de
elevada reteno na coluna. O duplo ombro, observado no cromatograma pode sugerir
ineficincia de separao e sobreposio de dois componentes. Contudo, as fraes
correspondentes banda cromatogrfica referente ao pico citado, aps analisada testemunhou
bixina como nico componente. O exemplo mostrado na Figura 39 refere-se coluna que
gerou o cromatograma apresentado no Anexo I. Isto comprova o desenvolvimento dinmico
dos fenmenos de adsoro/desoro ao longo da coluna, somado aos efeitos das imperfeies
no empacotamento. Variaes na densidade e tamanho das partculas acarretam variaes no
tamanho dos poros conduzindo a fluxos preferenciais, em determinadas regies ao longo da
coluna, levando a diferenas no coeficiente de difuso convectivo com conseqente oscilao
na velocidade de arraste do adsorbato, em equilbrio com a fase mvel, em pontos diferentes
da seo transversal da coluna. Estas variaes de fluxo, ocorrendo ao longo da coluna e em
diferentes pontos das sees responsvel pela forma deformada apresentada pelo pico. As
amostras coletadas ao longo da banda correspondem rea transversal e possuem densidade
varivel do composto, distribudas em diferentes regies na superfcie. O perfil da banda, a
semelhana de uma superfcie em forma de sela a conseqncia dos fenmenos acima
destacados.
Figura 39 - Perfil de deslocamento de um pico de elevada reteno

A: amostra integral, antes do incio da corrida. B e C: segundo pico
(composto de elevada reteno), no curso da eluio, fotografado
no mesmo instante, vista sob dois ngulos, deslocadas em 90.
146
4.13.1 VELOCIDADE DOS PICOS CIS E TRANS COMO FUNO DA POLARIDADE

O perfeito ajuste da polaridade de fundamental importncia e define condies
timas de separao. O quociente entre a velocidade de deslocamento da banda de soluto e a
velocidade da fase mvel, definido como fator de retardo R est relacionado ao fator de
capacidade katravs da equao (12), pagina 68..
R = 1/(1+k).
Ainda, a equao (13) pagina 68, relaciona as velocidades, da banda e da fase mvel
ao fator de capacidade:
um= ux (1+k),
onde um representa a velocidade da fase mvel e ux a velocidade do soluto.
Com os dados de velocidades apresentados na Tabela 31, obtidos dos cromatogramas,
foram calculados os parmetros R e k.
Tabela 31- velocidade dos picos cis e trans em funo da polaridade.

fase ndice de Polaridade
(v/v)
3,87
90/10
3,45
80/20
3,03
70/30
2,18
50/50
1,75
40/60
Vel. P1
cm/min
1,183
0,832
0,616
0,031
0,26
Vel. P2
cm/min
0,067
0,078
0,121
0,322
1,295
Fases Acetato de etila /hexano; P1 velocidade do pico 1

P2 velocidade do pico 2
Velocidades corrigidas para vazo equivalente 2,0 cm/min.
A Tabela 32 mostra os valores de ke R calculados a partir dos dados de velocidade

acima reportados.
fases
90/10
80/20
70/30
50/50
40/60
147
Tabela 32 Fator de retardo e fator de capacidade

Fator de capacidade k
Fator de retardo R
Trans-bixina
Cis-bixina
Trans-bixina
Cis-bixina
0,69
1,40
2,25
0,16
0,65
28,63
24,41
15,48
0,01
0,13
0,59
0,42
0,31
5,21
0,54
0,03
0,04
0,06
61,84
6,67
A mudana na fora do solvente, uma forma de controle de k, foi obtida pela variao
na composio da fase mvel. A conseqente mudana na polaridade acarreta modificaes
na reteno de um pico em relao ao outro permitindo, deste modo, um aumento na
resoluo. Outro aspecto de grande importncia relacionado ao fator de capacidade refere-se
possibilidade do aumento da carga de coluna, para aquele componente que apresenta maior
valor. A necessidade de um nmero maior de volumes de coluna para sua eluio, devido a
sua maior reteno permite operar maiores massas na separao cromatogrfica. Exemplo
disto pode ser observado para a bixina cis em condio de maior polaridade, que apresentou
na relao 90/10, k igual a 28,63, em conseqncia do reduzido fator de retardo 0,03
representado. Este aspecto favorece separaes com maior quantidade daquele composto com
menor reteno.
A ocorrncia da inverso dos picos com a variao da polaridade observada nos
experimentos sugere que a partir de uma determinada faixa de composio as bandas cis e
trans deslocam-se com a mesma velocidade, tornando impossvel sua separao. Nota-se que
a trans-bixina apresenta baixa reteno em polaridade elevada, aumentando, contudo, com a
reduo da polaridade. Com a cis-bixina o fenmeno manifesta-se de forma inversa. Contudo,
mesmo em polaridade baixa sua reteno apresenta valores elevados. Desta forma, a melhores
condies de separao so alcanadas nas proximidades dos extremos de polaridade.
Diante do comportamento de inverso observado e tambm, pelo fato de que tempos
de reteno longos acarretam alargamento de bandas, trazendo em conseqncia riscos de
sobreposio de outros picos, alm de produzir fraes muito diludas, pode-se concluir que;
se o pico de interesse for o trans, deve-se percolar a coluna com fase de maior polaridade. Ao
contrrio, se o ismero de interesse for o cis, a opo pela fase de menor polaridade mais
aconselhvel, ainda que a capacidade de carga fique reduzida.
Na Figura 40 apresentada a interseco entre as linhas de tendncia
Velocidade (cm/min)
148
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
trans- bixina
cis-bixina
ndice de polaridade
Figura 40 - Velocidade do pico em funo da polaridade do eluente

O desvio de alguns pontos afastados da linha de tendncia resultado de
empacotamento desuniforme. As imperfeies no leito podem acarretar fluxos preferenciais
como tambm as diferentes vazes apresentadas pelas diferentes colunas, somado a oscilao
da vazo durante as corridas cromatogrficas teriam conduzido s flutuaes no
comportamento das curvas. Ainda assim possvel visualizar a citada inverso na posio dos
picos.
Foram realizadas varias corridas visando uma melhor definio dos pontos na regio
prximo interseco das linhas de tendncia. O espalhamento e deformao da banda
acarretava com freqncia variaes na concentrao ao longo do pico, distinta de uma
distribuio gaussiana caracterstica de um pico cromatogrfico. Um fator contribuinte, alm
das caractersticas de empacotamento, pode estar relacionado isomerizao da cis- bixina
durante a eluio na coluna. Uma vez ocorrendo a formao do ismero este se desloca com
velocidade diferente do composto que o gerou. Nas condies de polaridade intermediria,
prxima linha de tendncia, ambos os picos apresentam reteno elevada, fazendo com que
o efeito se torne mais pronunciado. No caso da mistura eluente tendendo para a menor
polaridade, onde o composto cis desloca-se na frente, deve ocorrer um atraso, com formao
de uma cauda atrs do pico, fazendo com que se aproxime do pico trans que se desloca um
pouco acima. Na situao inversa, deve ocorrer um alargamento particularmente no segundo
pico. Como a trans bixina do primeiro pico desloca-se com velocidade tambm reduzida, a
trans-bixina produzida pela isomerizao do segundo pico,
mais retido,
adianta-se,
aproximando-se do primeiro pico.

Observou-se tambm nos experimentos que o balano de massas efetuado com a
integrao dos valores da concentrao das varias fraes, analisadas individualmente,
apresentava diferenas, que em determinados experimentos afastava-se bastante do valor da
149
massa inicial empregada. Isto se deve a erros cumulativos na determinao do volume das
correspondentes fraes, somados a erros de diluio, evaporao, entre outros. Contudo em
uma corrida, onde as fraes foram agrupadas e analisadas na sua integralidade, obteve-se
95,08 % de recuperao da massa aplicada coluna, correspondente a 0,019 mg (no primeiro
pico) ismero trans e 0,039 (mg no segundo pico) ismero cis, de um total de 0,061 mg de
bixina empregada na separao.
4.13.2 VOLUME DE COLUNAS EM FUNO DA COMPOSIO DA FASE MVEL
Diferente da comparao com base na velocidade do pico, a relao com volumes de

coluna permite melhor avaliao.
Na Tabela 33 so mostrados os valores de Rf dos picos correspondentes forma trans
determinados por CCD, para diferentes polaridades e os respectivos volumes de colunas, com
base neles calculados. Na ltima coluna possvel observar os dados de volumes de coluna
calculados dos cromatogramas realizados com o emprego da coluna flash.
Tabela 33 - Volumes de colunas e valores de Rf para a trans-bixina em funo de diferentes

polaridadesFase
Distancia da base (mm) H placa (mm) Valor do Rf
Acet/hex. de
a
at
de
a
90/10
4,00
3,65
6,00
0,67
0,61
80/20
3,00
2,75
6,00
0,50
0,46
70/30
2,50
2,25
6,10
0,41
0,37
60/40
2,10
1,80
6,00
0,35
0,30
50/50
1,00
0,85
6,15
0,16
0,14
40/60
0,80
0,65
6,00
0,13
0,11
30/70
0,55
0,45
5,90
0,09
0,08
VC com base no Rf
de
a
1,50
1,64
2,00
2,18
2,44
2,71
2,86
3,33
6,15
7,24
7,50
9,23
10,73
13,11
VC da flash
experimental
1,69
2,01
2,63
3,63
6,21
7,66
19,47
A Figura 41 mostra o aumento de volumes de colunas na separao da trans-bixina

como funo da reduo da polaridade da fase mvel.
150
20
18
Volumes de coluna
16
14
12
10
8
6
4
2
0
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
ndice de polaridade P
Figura 41 - Volumes de colunas x ndice de polaridade da fase mvel para eluio da trans
bixina
4.13.3 Nmero de pratos tericos

Na Tabela 34 so apresentados os dados referentes aos picos da cis e trans-bixina
obtidos de duas corridas cromatogrficas realizadas em colunas de diferentes sees ( 0,292 e
0,931 cm2), nas quais foi empregado como fase eluente acetato de etila/hexano 80/20. Dos
seus correspondentes cromatogramas foram calculados o nmero de pratos tericos com base
nas equaes (35) apresentadas na Seo 2.9.5.
Tabela 34 - Nmero de pratos tericos

T reteno altura larg. Base larg.1/2 h
tr
h
tw
t1/2
min.
cm
cm
cm
trans-m
6,52
4,5
2,5
1,49
cis-m
148,5
5,2
5,6
3,2
trans-M
9
4,6
1,6
0,88
cis-M
338
5,4
9,1
5,4
N pratos tericos
N1
N2
108,83
106,08
11251,15 11930,61
506,25
579,47
22073,47 21704,79
Legenda: M , relacionada coluna de maior dimetro; m a de menor dimetro

Fase mvel acetato/hexano 80/20
151
2
t
t
R
R
N1 = 16 *
N2= 5,54
tW
t1
Considerando que quanto maior o nmero de estgios de equilbrio maior a eficincia de

2
separao pode-se concluir que:

a) O nmero de pratos tericos relacionados tanto ao ismero trans quanto o cis,
apresentou valores maiores na coluna de maior dimetro. Isto resultou do melhor
empacotamento obtido para esta coluna, fato evidenciado pelo volume de poros resultantes,
menores na coluna de maior seo comparado quela de menor seo. Ver Anexo G.
b) Para a fase mvel empregada, de maior polaridade, o isolamento da forma cis
resultou em maior nmero de estgios de equilbrio, para uma eficaz separao, caracterizado
por um maior nmero de pratos.
CAPTULO 5 - CONCLUSES E SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS 1152
CAPTULO 5 - CONCLUSES E SUGESTES PARA

TRABALHOS FUTUROS
5.1 PRINCIPAIS CONCLUSES OBTIDAS DO TRABALHO
1- A extrao de bixina das sementes de urucum com acetona, aps lavagens
previas com hexano e etanol, alm de consumir um grande volume de solvente no se
mostra eficaz, produzindo um concentrado com no mximo 56% de bixina. O emprego de
ter etlico em substituio ao etanol apesar de produzir concentrado com at 75 % no se
mostra competitivo quando comparado extrao com soluo hidro-alcolica amoniacal.
Com esta soluo foi obtido concentrado com at 87 %. Contudo, as lavagens prvias e
tambm o emprego de gua na mistura trazem dificuldades de processamento.
2- No desenvolvimento do trabalho, a determinao da solubilidade da bixina em
diferentes solventes permitiu definir as melhores condies para processamento da
semente de urucum. Observou-se que o extrato amoniacal produz um derivado de bixina
com solubilidade na ordem de 6,25mg/mL valor que supera a solubilidade da bixina em
clorofrmio. Este produto se tratado com cido regenera bixina. O mesmo produto, tratado
com on clcio produz precipitado de reduzida solubilidade.
3- O processo de extrao com soluo etanlica amoniacal anidra, alm da
rapidez, pode ser conduzida com reduzido consumo de solvente produzindo concentrado
com at 77% com nico ciclo de processo. Ainda, a possibilidade de recuperao parcial
tanto da amnia quanto do etanol, por destilao, mostra-se vivel, podendo estes insumos
ser reutilizados no processo em primeira abertura. O processo, se repetido dois ciclos de
extrao/precipitao produz concentrado com at 87,03%.
4- Os elevados valores de solubilidade apresentados pela bixina em soluo
alcolica amoniacal anidra, associado precipitao possibilitam estabelecer uma nova
tecnologia para extrao e purificao de bixina em escala comercial.
5- O processo de extrao deve ser conduzido temperatura ambiente, quando se
deseja obter produto com elevada concentrao de ismero cis.

6- A recristalizao em solvente, diferente de um processo de precipitao
possibilita melhor controle da pureza do material slido obtido. Neste sentido, a
recristalizao com acetona conduzida com lento e controlado resfriamento produziu
composto com at 98,27 %, sem a necessidade de reprocesso.
7- Os padres de bixina conservados sob vcuo ou nitrognio apresentaram, aps
90 dias de estocagem, degradao de at 13%, ainda que conservados 8 C e ausncia
de luz. Contudo a manuteno do composto em soluo alcolica ou em soluo de
acetonitrila/dimetilformamida nas mesmas condies de estocagem mostrou-se mais
eficientes. No primeiro solvente no foi detectada degradao no perodo observado, para
o segundo ficou na ordem de 1,5 %.
Em face de reduzida solubilidade da bixina, a conservao do padro na forma de
cristais imersos em etanol ou acetona mostrara-se adequada e vantajosa. Esta forma de
armazenamento permite dispor de uma maior quantidade de padro, facilitando emprego
quando se deseja produto com elevada pureza na forma cristalina.
8- No presente trabalho constatou-se que a anlise de bixina pelo mtodo da
hidrlise no aconselhvel, pois sua dependncia de variveis cinticas e ainda agravadas
pelas caractersticas de reduzida estabilidade acarreta impreciso nos resultados.
9- O emprego de clorofrmio como solvente para leitura espectrofotomtrica
atende ao objetivo de anlises de rotina quanto de pesquisa, apresentando valores
confiveis. A substituio do clorofrmio pelo etanol mostra-se como alternativa vivel,
pois a bixina apresenta grande estabilidade neste solvente, alm de no ser txico.
10- O emprego de espectrofotometria atende plenamente a anlise para teores
reduzidos de bixina at nveis de 0,05g/mL, dispensando em muitos casos outras tcnicas
analticas, em particular a HPLC.
11- Neste trabalho foi investigado o uso de cromatografia preparativa flash por fase
normal, para a obteno de padro de elevada pureza. Empregando-se diferentes relaes
de polaridade pela variao da composio da fase mvel acetato de etila/hexano, esta
tcnica mostrou-se eficaz na separao da cis e trans bixina.
12- Ainda que a cromatografia preparativa seja uma tcnica ideal para separao e
isolamento de compostos com elevada pureza, na purificao da bixina as relaes de
equilbrio que governam o fenmeno e a baixa solubilidade destes compostos dificultam a

utilizao desta tcnica para a obteno de quantidades maiores. Contudo, o seu emprego
se justifica quando se deseja isolar os ismeros com propsito analtico.
12- A mudana da polaridade resulta na inverso dos tempos de reteno dos

ismeros cis e trans, trazendo flexibilidade separao.
5.2 - SUGESTES PARA FUTUROS TRABALHOS

1- Proceder separao cromatogrfica em coluna HPLC empregando a mesma
fase mvel, no sentido de reproduzir o processo estudado. Ajustar os parmetros de
solubilidade empregando outras composies de solvente, no sentido, de desenvolver
metodologia analtica alternativa ao uso de fase reversa na determinao dos ismeros cistrans.
2- Isolar os ismeros em quantidades maiores, para posterior determinao dos
respectivos coeficientes de absortividade em diferentes solventes.
3- Avaliar as caractersticas fsicas e estruturais dos derivados; amoniacal e clcico.
4- Verificar a suscetibilidade hidrlise do composto amoniacal.
5- Avaliar a aplicabilidade de uso dos derivados clcico e amoniacal como padro
de bixina ou matriz para norbixina.
6- Estudar a obteno de outros derivados de bixina tendo como ponto de partida
no s o derivado amoniacal, mas tambm o clcico.
7- Avaliar o potencial para obteno de steres tendo como ponto de partida o
derivado amoniacal ou mesmo o clcico, visto que a facilidade de processamento destes
pode viabilizar a produo em maior escala.
8- Estudar uma rota para recuperar os resduos de destilao deixados pela soluo
alcolica amoniacal, visto que grande parte de tocotrienis encontrada na semente e
concentra-se neste extrato.
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ANEXO
169
ANEXO A
BALANO DE MASSA - EXTRAO ALCOLICA AMONIACAL
Massa de semente: 100,004g

Soluo extratora: etanol amoniacal 3% *
(500ml etanol absoluto + 38 g de Na2SO4+ 120 mL de NH4OH 28 %)
Obs.: * Soluo filtrada para eliminao do sal.
Determinao do teor de bixina na semente.

10,422 g de sementes foram transferidas para um Becker de 50 mL, ao qual foi
acrescido 25 mL de clorofrmio. Submetida agitao em cuba de ultrason, a soluo, aps
repouso, era transferida com auxlio de uma pipeta Pasteur para um balo de 500mL. Foram
realizados seis ciclos sucessivos de extrao at esgotar o contedo de bixina das sementes,
resultando em uma soluo levemente corada. Aferido o balo, retirou-se uma alquota para
anlise do teor de bixina.
Teor encontrado - 1,31 %.
Extrao amoniacal
Procedeu-se 3 ciclos de extrao com 100 mL da soluo amoniacal. A cada ciclo
efetuado, agitava-se por 15 min a 45 C. Terminada a agitao filtrava-se a soluo e
lavava-se com mais 20mL de soluo, incorporando ao filtrado anterior. Desta soluo,
depois de medido o volume resultante, retirava-se uma alquota de 5 mL para determinao
da massa de extrato seco e verificao do percentual de bixina. As sementes provenientes
deste ciclo de extrao foram ento conduzidas ao prximo ciclo, repetindo-se todas as
operaes. A Tabela 1 apresenta os resultados relacionados ao extrato amoniacal.
As solues originadas em cada ciclo foram submetidas precipitao. A massa de
precipitado foi obtida de forma indireta, atravs da determinao da concentrao residual
mantida na soluo aps a precipitao com cido actico. Neste ensaio no foi
determinado a pureza dos cristais obtidos a cada ciclo de extrao. A Tabela 2 apresenta os
resultados relacionados s anlises aps precipitao.
ANEXO
170
As diferenas encontradas nas concentraes de bixina nos dois processos de

extrao se deve, alm dos erros inerentes coleta de volumes, tambm diferenas na
amostragem das sementes. Observa-se que junto com as sementes encontra-se uma grande
quantidade de pequenos pedaos de casca e tambm estames que se acumulam, em funo
da movimentao da embalagem alm de finos resultantes do atrito entre as sementes.
Desta forma, quando as sementes so amostradas, no se tem garantia de homogeneidade.
Tabela 1 - Avaliao do teor de bixina em funo dos ciclos de extrao amoniacal

Ciclo Extrato obtido
Slidos totais % bixina
Bixina/ST Total bix.soluo
% de extrao
(mL)
(mg/mL)
(mg/mL) (%)
(g)
(%)
98
36,94
7,089
19,2
0,694
52,57
110
14,02
3,869
27,6
0,425
31,97
107
6,98
1,965
28,1
0,21
15,8
1.329 (total)
Tabela 2 Avaliao do teor de bixina aps precipitao com cido actico

ciclos
Vol. original
(mL)
1
98
2
110
3
107
* medida indireta
Bixina em sol.
(mg/mL)
1,3
0,922
1,095
Rendimento em precipitado
Total Bixina soluo Massa de pptado *

(mg)
(mg)
127 mg
567
101,5
323,5
117
93
567 + 323,5 + 93 = 0,983g
Massa extrada (disponvel em soluo amoniacal com trs ciclos de extrao) =1,329g
Rendimento de processo (precipitao) 0,983 / 1,329 = 73,96 %
171
ANEXO
ANEXO B
Microfotografias de bixina e derivados
1 - CRISTAIS DE BIXINA
Solvente clorofrmio ampliao 400x
Solvente acetato de etila ampliao 400x
Solvente acetona ampliao 400x
Solvente ter etlico ampliao 400x
Solvente etanol ampliao 400x
ANEXO
172
ANEXO B
1 - CRISTAIS DE DERIVADO AMONIACAL
ANEXO
173
ANEXO B
1 DERIVADO CLCICO
ANEXO
180
ANEXO E - COEFICIENTE de absortividade de bixina em soluo alcolica
Primeiro ciclo
Vol.alquota Conc.matriz * conc. Final
(mL)
(mg/mL)
(mg/mL)
0,02
3,21E-01
6,43E-04
0,04
3,21E-01
1,29E-03
0,06
3,21E-01
1,93E-03
0,08
3,21E-01
2,57E-03
0,1
3,21E-01
3,21E-03
* Aliquotas finais diludas para 10 mL
Segundo ciclo
(mL)
(mg/mL)
(mg/mL)
0,02
2,52E-01
5,03E-04
0,04
2,52E-01
1,01E-03
0,06
2,52E-01
1,51E-03
0,08
2,52E-01
2,01E-03
0,1
2,52E-01
2,52E-03
* Alquotas finais diludas para 10 mL
Terceiro ciclo
(mL)
(mg/mL)
(mg/mL)
0,02
2,54E-01
5,09E-04
0,04
2,54E-01
1,02E-03
0,06
2,54E-01
1,53E-03
0,08
2,54E-01
2,03E-03
0,1
2,54E-01
2,54E-03
Quarto ciclo
(mL)
(mg/mL)
(mg/mL)
0,02
1,68E-01
3,36E-04
0,04
1,68E-01
6,72E-04
0,06
1,68E-01
1,01E-03
0,08
1,68E-01
1,34E-03
0,1
1,68E-01
1,68E-03
Abs
0,162
0,348
0,530
0,655
0,781
Abs
0,104
0,200
0,325
0,419
0,556
Abs
0,095
0,187
0,295
0,385
0,537
Abs
0,062
0,156
0,246
0,339
0,437
ANEXO
181
Quinto ciclo
(mL)
(mg/mL)
(mg/mL)
0,02
1,50E-01
3,00E-04
0,04
1,50E-01
6,00E-04
0,06
1,50E-01
8,99E-04
0,08
1,50E-01
1,20E-03
0,1
1,50E-01
1,50E-03
Sexto ciclo
(mL)
(mg/mL)
(mg/mL)
0,02
1,59E-01
3,19E-04
0,04
1,59E-01
6,38E-04
0,06
1,59E-01
9,56E-04
0,08
1,59E-01
1,28E-03
0,1
1,59E-01
1,59E-03
Stimo ciclo
(mL)
(mg/mL)
(mg/mL)
0,02
1,45E-01
2,89E-04
0,04
1,45E-01
5,78E-04
0,06
1,45E-01
8,68E-04
0,08
1,45E-01
1,16E-03
0,1
1,45E-01
1,45E-03
Oitavo ciclo
(mL)
(mg/mL)
(mg/mL)
0,02
1,70E-01
3,40E-04
0,04
1,70E-01
6,79E-04
0,06
1,70E-01
1,02E-03
0,08
1,70E-01
1,36E-03
0,1 0,1698606 0,001698606
Abs
0,067
0,139
0,226
0,290
0,366
Abs
0,061
0,130
0,192
0,278
0,345
Abs
0,039
0,106
0,211
0,262
0,357
Abs
0,039
0,106
0,211
0,262
0,357
ANEXO
182
ANEXO F
Valores de absorbncia durante monitoramento de hidrlise
Tabela 1 - Absorbncia da bixina em solues de NaOH 0,02N (absoro em 482 nm).
Temperatura 5 C
Tempo
Abs/Abs
horas Abs.
max
0
0,337
0,54
0,18 0,323
0,52
0,35 0,367
0,59
0,52 0,359
0,58
15,60 0,538
0,87
15,78 0,515
0,83
16,00 0,517
0,83
16,18 0,527
0,85
20,67 0,556
0,90
20,97 0,534
0,86
21,35 0,537
0,87
21,40 0,517
0,83
21,73 0,544
0,88
22,62 0,540
0,87
22,68 0,550
0,89
69,98 0,525
0,84
70,15 0,542
0,87
89,65 0,561
0,90
89,90 0,587
0,95
117,57 0,540
0,87
117,73 0,553
0,89
142,15 0,570
0,92
142,25 0,570
0,92
166,73 0,568
0,91
160,40 0,578
0,93
235,40 0,658
1,06
285,73 0,583
0,94
285,98 0,618
0,99
309,82 0,587
0,95
328,48 0,575
0,93
765,82 0,617
0,99
765,98 0,621
1,00
Temperatura 25 C
Tempo
Abs/Abs
horas
Abs.
max
0
0,244
0,43
0,10
0,283
0,51
0,23
0,310
0,55
0,43
0,339
0,60
0,60
0,367
0,65
0,77
0,386
0,69
0,93
0,404
0,72
15,83
0,502
0,90
16,03
0,507
0,90
16,23
0,498
0,89
16,45
0,456
0,81
20,92
0,499
0,89
21,17
0,494
0,88
21,63
0,498
0,89
21,92
0,478
0,85
22,00
0,500
0,89
22,17
0,549
0,98
22,82
0,560
1,00
22,87
0,551
0,98
70,22
0,541
0,96
70,47
0,527
0,94
89,88
0,555
0,99
90,13
0,541
0,96
116,88
0,544
0,97
116,97
0,561
1,00
142,38
0,556
0,99
142,55
0,559
1,00
167,30
0,557
0,99
184,72
0,558
0,99
259,63
0,554
0,99
310,05
0,554
0,99
310,22
0,555
0,99
334,13
0,551
0,98
352,80
0,551
0,98
790,30
0,544
0,97
790,38
0,549
0,98
Temperatura 40 C
Tempo
horas
0
0,17
0,33
0,52
15,58
15,80
16,02
16,75
20,65
20,95
21,00
21,40
21,47
21,75
70,00
70,17
89,67
89,92
117,53
117,67
142,08
142,25
166,75
184,50
259,42
309,75
Abs.
0,315
0,360
0,410
0,444
0,523
0,510
0,512
0,519
0,511
0,506
0,528
0,492
0,508
0,511
0,497
0,484
0,489
0,482
0,484
0,472
0,484
0,489
0,480
0,495
0,480
0,476
Abs/Abs
max
0,60
0,68
0,78
0,84
0,99
0,97
0,97
0,98
0,97
0,96
1,00
0,93
0,96
0,97
0,94
0,92
0,93
0,91
0,92
0,89
0,92
0,93
0,91
0,94
0,91
0,90
ANEXO
183
Tabela 2 - Absorbncia da bixina em solues de NaOH 0,1N (absoro em 482 nm).

Temperatura 5 C
Tempo
Abs/Abs
horas Abs.
max
0,00 0,283
0,46
0,17 0,313
0,51
0,33 0,341
0,56
0,53 0,353
0,57
46,17 0,530
0,86
46,33 0,532
0,87
46,83 0,536
0,87
66,75 0,557
0,91
67,00 0,556
0,91
90,67 0,555
0,90
90,78 0,558
0,91
118,20 0,556
0,91
118,42 0,547
0,89
143,08 0,570
0,93
143,25 0,574
0,93
160,67 0,596
0,97
160,83 0,575
0,94
235,67 0,593
0,97
286,08 0,578
0,94
286,25 0,561
0,91
309,75 0,614
1,00
310,08 0,577
0,94
329,00 0,572
0,93
765,08 0,577
0,94
765,25 0,574
0,93
Temperatura 25 C
Tempo
Abs/Abs
horas
Abs.
max
0
0,182
0,32
0,08
0,242
0,42
0,22
0,275
0,48
0,37
0,325
0,57
0,53
0,360
0,63
0,72
0,389
0,68
46,33
0,564
0,99
46,58
0,531
0,93
47,00
0,566
0,99
66,92
0,569
1,00
67,17
0,557
0,98
94,00
0,561
0,98
94,17
0,554
0,97
118,42
0,551
0,97
118,67
0,556
0,98
143,25
0,570
1,00
143,50
0,568
1,00
160,83
0,566
0,99
161,00
0,566
0,99
236,00
0,553
0,97
286,25
0,553
0,97
286,42
0,549
0,96
309,92
0,546
0,96
310,08
0,546
0,96
329,17
0,544
0,95
765,33
0,505
0,89
765,50
0,504
0,88
Temperatura 40 C
Tempo
Abs/Abs
horas
Abs.
max
0
0,332
0,62
0,17
0,381
0,71
0,37
0,424
0,79
0,53
0,458
0,85
46,20
0,519
0,97
46,37
0,537
1,00
46,78
0,532
0,99
66,78
0,526
0,98
66,95
0,530
0,99
93,87
0,513
0,96
93,98
0,518
0,96
118,23
0,511
0,95
118,47
0,519
0,97
143,12
0,522
0,97
143,28
0,516
0,96
160,63
0,530
0,99
160,83
0,526
0,98
235,87
0,516
0,96
238,12
0,509
0,95
286,28
0,505
0,94
ANEXO
184
Tabela -3 Absorbncia da bixina em solues de NaOH 0,5N (absoro em 482 nm).

Temperatura 5 C
Tempo
Abs/Abs
horas Abs.
max
0
0,073
0,18
0,38
0,085
0,21
21,72 0,122
0,30
21,88 0,123
0,30
46,38 0,146
0,36
46,63 0,142
0,35
63,97 0,146
0,36
64,30 0,153
0,38
139,13 0,183
0,45
189,63 0,204
0,50
189,80 0,188
0,46
213,30 0,264
0,65
213,47 0,237
0,58
232,63 0,230
0,57
670,63 0,406
1,00
670,72 0,406
1,00
Temperatura 25 C
Tempo
horas
0
0,25
0,33
0,67
21,92
22,17
46,67
46,92
64,17
65,67
139,42
190,00
190,08
213,50
213,83
232,92
671,00
671,08
Abs.
0,073
0,073
0,077
0,092
0,223
0,230
0,294
0,295
0,309
0,321
0,357
0,369
0,370
0,373
0,369
0,376
0,400
0,401
Abs/Abs
max
0,18
0,18
0,19
0,23
0,56
0,57
0,73
0,74
0,77
0,80
0,89
0,92
0,92
0,93
0,92
0,94
1,00
1
Temperatura 40 C
Tempo
Abs/Abs
horas
Abs.
max
0,00
0,081
0,18
0,38
0,102
0,22
21,75
0,424
0,93
21,83
0,416
0,91
46,42
0,425
0,93
46,67
0,432
0,94
64,17
0,456
1,00
64,33
0,458
1,00
139,25
0,450
0,98
139,42
0,450
0,98
189,58
0,432
0,94
189,92
0,443
0,97
ANEXO
185
ANEXO G
Resumo de dados obtidos de colunas preparativas.
Fase
mvel
Acet/hex
Altura
coluna
cm2
Seo
coluna
cm2
slica
g/cm3 inicial
Pico 1
VC
centro
final
inicial
Pico 2
VC
centro
90/10
20,94
0,931
2,51 2,75
3,24
4,16
15,62 16,44
90/10
20,78
0,931
2.15 1,46
1,18
3,03
15,41 16,25
90/10
20.92
0,931
3,09 1,22
1,36
2,74
17,36 29,66
80/20
20,94
0,931
2,18 1,73
1,88
3,89
41,76 42,31
80/20
17,87
0,292
3,55 1,21
2,0
3,98
45,27 45,66
70/30
21,12
0,931
2,27 2,11
2,64
3,72
30,85 31,12
50/50
17,64
0,292
3,49 2,75
6,21
8,86
61,45 62,83
40/60
20,78
0,931
2,55 3,06
3,64
4,6
18,69 19,83
30/70
18,14
0,292
3,07 18,28 19,42 20,68 82,2
87,03
Obs. Corridas conduzidas sem a prvia secagem dos solventes e da slica.
final
17,28
17,9
31,03
42,94
47,25
31,53
64,59
21,45
89,42
Todas as corridas foram elaboradas sem condicionamento das colunas como

tambm no se procedeu a secagem dos reagentes, em particular o acetato.
Mesmo que, nas corridas com a mesma polaridade, tenha ocorrido variaes dos
valores dos volumes de coluna, no apenas para experimentos com colunas de diferentes
sees, mas tambm para aqueles com sees de mesma rea, ainda assim foram obtidas
separaes em todas aos experimentos.
Os desvios encontrados esto relacionados eficincia do empacotamento, ao
condicionamento da coluna, secagem dos reagentes entre outros fatores.
ANEXO
186
ANEXO H
Cromatogramas de duas colunas com diferentes seces
Concentrao de bixina (mg/mL)
0,06
0,05
0,04
B
A
0,03
0,02
0,01
0,00
-50
50
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700
Volum e percolado (m L)
Cromatograma da bixina em coluna flash, mostrando dados de duas colunas com diferentes
seces 0,292 cm2 e 0,913 cm2.
Fase mvel acetato de etila/hexano 80/20
A- Primeiro pico coluna de menor dimetro (0,292 cm2), B primeiro pico na coluna de
dimetro maior (0,931 cm2), C- segundo pico na coluna de menor dimetro e D,segundo,pico na coluna de dimetro maior.
ANEXO
187
Picos A, B, C e D em ampliados.
0,0010
0,020
Concentrao de boixina (mg/mL)
0,018
0,016
0,014
0,012
0,010
0,008
0,006
0,004
0,002
0,000
0
10
12
14
16
18
20
0,0008
0,0006
0,0004
0,0002
0,0000
198
200
202
Pico A
Concentrao (mg/mL)
208
210
212
0,04
Trans-bixina
0,02
0,01
0,00
0,0006
Cromatogramatrans-bixina
Colunadimetromaior
Faseacetato/hexano80/20
0,03
206
Pico C
0,06
0,05
204
Volume percolado (mL)
Volumepercolado(mL)
0,0005
0,0004
0,0003
0,0002
0,0001
0,0000
0
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
620
630
635
Volumepercolado(mL)
Volumepercolado(mL)
Pico B
625
Pico D
640
ANEXO
188
ANEXO I
Cromatograma Pico 2 deformado
Cromatograma de bixina, fase mvel 70/30 acetato de etila/hexano.
Coluna: slica gel 60 200-240 mesh.
0 ,0 2 5
0 ,0 2 0
0 ,0 1 5
0 ,0 1 0
0 ,0 0 5
0 ,0 0 0
0
50
100
150
200
250
300
V o lu m e p e r c o la d o ( m L )
Cromatograma de bixina, fase mvel 70/30 acetato de etila/hexano,

coluna slica gel 60 200-240 mesh.
Concentrao bixina (mg/m)
0,03
0,02
0,01
0,00
0
50
Volume percolado (mL)
Bixina; primeiro pico, volume percolado at o centro do pico: 50,3 mL.
concentrao Bixina (mg/mL)
Concentrao bixina(mg/mL)
0 ,0 3 0
0,005
0,000
250
300
V olum e percolado (m L)
Bixina: segundo pico, volume eludo de 240 a 270 mL
ANEXO
189
Anexo J
Planilha de Dados cromatogrficos obtidos da coluna flash
Fase mvel acetato de etila / hexano 90/10 v/v
A
(cm)
30,620
B
(cm)
9,840
C
(mL)
18,700
D
(cm)
4,305
I
(g)
10,0003
J
(mL)
4,654
K
L
(g/cm3) (mg)
2,149 140,300
E
(mL)
4,008
F
G
(cm)
(mL)
20,780 19,346
M
(mL)
0,060
N
(mL)
10mL
H
(mL)
14,692
O
P
Q
486nm (mg/mL) (mL)
0,818
0,473 0,414
A- comprimento da coluna de vidro; B- nvel de slica abaixo do topo;

C-Hexano adicionado coluna
D- altura do hexano acima do leito; E- volume de hexano (excesso)
=(D* 0,931( rea da seo da coluna)),
F- altura do empacotamento (A-B); G- volume do leito empacotado (F*0,931)
H- volume total dos poros (calculado) -VC = ( C-E); I- massa de slica no leito
J- volume ocupado pela slica (G-H); K-densidade da slica (calculada) = (G-H);
L-massa de slica incorporada amostra; M- alquota da matriz de bixina;
N- volume de diluio da alquota
O- absorbncia da alquota aps diluo; P- Concentrao da matriz
Q- alquota da matriz incorporada slica (em L) correspondendo 0,196 mg de bixina
Massa obtidas da coluna flash
pico P1
0,168 mg
pico P2
0,015 mg
Total
0,183 mgde um total incorrporado de 0,196 mg
R
1,203
a
1,547
R
S
T
U
V
X1
X2
Y1
Y2
Z1
Z2
S
20,780
T
14,692
U
0,707
V
1,701
a
2,188
X1
1,461
a
3,030
X2
15,406
a
17,900
Y1
0,945
Y2
Z1
Z2
0,135 1,801 16,2496
Vazo mdia at;1 pico, (frao):

37 ;e at o 2 170
Altura da coluna empacotada
Volume da coluna (poros)
Volume por unidade de comprimento
Velocidade mdia do solvente atravs da coluna: pico 1 e pico 2
Volume equivalente de coluna (1 pico)
Volume equivalente de coluna (2 pico)
Velocidade de deslocamento do 1 pico(cm/min)
Velocidade de deslocamento do 2 pico
Volume de coluna centro pico 1
Volume de coluna centro pico 2
Numero de fraes: picos 1 e 2:

Vol. incio-fim 1 pico 21,46
44,51
Vol. incio-fim 2 pico 226,34 262,99
Vol. centro do pico 1 26,46
Vol. centro do pico 2 238,74
14
37
133
170
ANEXO
190
Curva de calibrao da bixina em acetato de etila 90/10 v/v
pontos
1
2
3
4
Alquota
(mL)
0,06
0,04
0,06
0,08
Diluio
(mL)
10
10
10
10
concentrao.
(mg/mL)
0,002838
0,001892
0,000946
0,0003784
Absorbncia
486 nm
456 nm
0,946
1,038
0,615
0,677
0,313
0,344
0,134
0,147
Coeficiente de absortividade em 486 nm
1,2
y = 363,62 x
2
R = 0,9995
Absorbncia
1
0,8
0,6
0,002838
0,001892
0,000946
0,0003784
0,4
0,2
1,038
0,677
0,344
0,147
0
0
0,001
0,002
0,003
Concentrao (mg/mL)
Coeficiente de absortividade em 454 nm
Absorbncia
0,8
y = 331,05 x
2
R = 0,9995
0,6
0,4
0,2
0
0
0,0005
0,001
0,0015
0,002
Concentrao (mg/mL)
0,0025
0,003
ANEXO
191
ANEXO J Planlha
Planlha de dados cromatogrficos (cromatografia flash)
Fase mvel AAcetato de etila /hexano 90/10 v/v
Frao
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
Volume
Absorbncia Coeficiente Massa
momento integrado Fator de
de
da
Coletado da anlise
diluio.
486nm
Absortividade frao
(mL)
(mL)
(mL)
486nm
(g)
1,4
1,4
2,55
3,95
2,5
6,45
2,33
8,78
2,25
11,03
1,75
12,78
1,33
14,11
1,25
15,36
1,1
16,46
1
17,46
1
18,46
1
19,46
1
20,46
1
0,97
21,46
2
0,069
331,05
0,0004
1
0,97
22,46
4
0,567
331,05
0,00665
1
0,97
23,46
13,5
0,188
331,05
0,00744
1
0,95
24,46
7,66
0,978
331,05
0,0215
1
0,95
25,46
11
0,984
331,05
0,03106
1
0,95
26,46
26
0,454
331,05
0,03387
0,95
0,85
27,41
26
0,365
331,05
0,02437
0,95
0,85
28,36
26
0,242
331,05
0,01616
0,9
0,85
29,26
26
0,15
331,05
0,01001
0,95
0,9
30,21
26
0,086
331,05
0,00608
0,95
0,85
31,16
16
0,084
331,05
0,00345
0,95
0,85
32,11
7,66
0,112
331,05
0,0022
0,9
0,85
33,01
3
0,192
331,05
0,00148
0,95
0,9
33,96
3
0,113
331,05
0,00092
0,8
0,75
34,76
4
0,057
331,05
0,00052
0,9
0,8
35,66
4
0,038
331,05
0,00037
0,8
0,75
36,46
4
0,038
331,05
0,00034
0,8
0,75
37,26
4
0,032
331,05
0,00029
1
0,95
38,26
4
0,026
331,05
0,0003
1,25
1,1
39,51
4
0,02
331,05
0,00027
1,25
1,1
40,76
2
0,023
331,05
0,00015
1,25
1,1
42,01
2
0,02
331,05
0,00013
1,25
1,1
43,26
2
0,026
331,05
0,00017
1,25
1,1
44,51
2
0,023
331,05
0,00015
1,25
45,76
1,3
47,06
1,3
48,36
Da frao 38 a frao 132 no foi detectada bixina
integrada
(g)
0,0004
0,00704
0,01448
0,03598
0,06704
0,10091
0,12528
0,14143
0,15145
0,15752
0,16098
0,16318
0,16466
0,16558
0,1661
0,16646
0,16681
0,1671
0,1674
0,16766
0,16781
0,16795
0,16812
0,16827
ANEXO
192
Continuao da pagina anterior

130
131
132
133
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136
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145
146
147
148
149
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152
153
154
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156
157
158
159
160
161
162
163
164
165
166
167
168
169
170
1,55
1,5
1,5
1,5
1,5
1,55
1,35
1,4
1,4
1,3
1,35
1,3
1,25
1,25
1,25
1,2
1,2
1,2
1,2
1,1
1
1
1
1
0,95
0,95
0,9
0,8
0,8
0,85
0,8
0,75
0,75
0,75
0,75
0,7
1
0,4
0,3
0,2
0,2
1,5
1,5
1,55
1,35
1,4
1,4
1,3
1,35
1,3
1,25
1,25
1,25
1,2
1,2
1,2
1,2
1,1
1
1
1
1
0,95
0,95
0,9
0,8
0,8
0,85
0,8
0,75
0,75
0,75
0,75
0,7
1
0,4
0,3
0,2
0,2
221,84
223,34
224,84
226,34
227,84
229,39
230,74
232,14
233,54
234,84
236,19
237,49
238,74
239,99
241,24
242,44
243,64
244,84
246,04
247,14
248,14
249,14
250,14
251,14
252,09
253,04
253,94
254,74
255,54
256,39
257,19
257,94
258,69
259,44
260,19
260,89
261,89
262,29
262,59
262,79
262,99
2
2
2
2
2
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
5
5
5
4
4
4
4
4
4
4
1
1
1
1
0,019
0,022
0,024
0,026
0,024
0,052
0,049
0,046
0,068
0,082
0,071
0,066
0,062
0,063
0,065
0,062
0,077
0,08
0,083
0,09
0,085
0,064
0,57
0,061
0,019
0,02
0,02
0,045
0,024
0,022
0,024
0,025
0,025
0,024
0,025
0,016
0,012
0,008
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
331,05
0,00017
0,0002
0,00022
0,00021
0,0002
0,00022
0,00038
0,00038
0,00053
0,00062
0,00054
0,0005
0,00045
0,00046
0,00047
0,00045
0,00051
0,00048
0,0005
0,00054
0,00051
0,00037
0,00327
0,00033
0,00023
0,00024
0,00026
0,00043
0,00022
0,0002
0,00022
0,00023
0,00021
0,00029
3E-05
1,4E-05
7,2E-06
4,8E-06
0,00017
0,00037
0,0006
0,00081
0,00101
0,00123
0,00162
0,00199
0,00253
0,00314
0,00368
0,00418
0,00463
0,00509
0,00556
0,00601
0,00652
0,007
0,0075
0,00805
0,00856
0,00893
0,0122
0,01253
0,01276
0,013
0,01326
0,01369
0,01391
0,01411
0,01433
0,01455
0,01477
0,01506
0,01509
0,0151
0,01511
0,01511

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CARACTERIZAO, EXTRAO E PURIFICAO POR

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica do Centro

Orientador: Prof. Dr.Antnio Augusto Ulson de Souza

Juarez Souza de Oliveira

Florianpolis SC, 23 de fevereiro de 2005.

CARACTERIZAO, EXTRAO E PURIFICAO POR

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica do Centro

Orientador: Prof. Dr. Antnio Augusto Ulson de Souza

Juarez Souza de Oliveira

Florianpolis SC, 23 de fevereiro de 2005.

CARACTERIZAO, EXTRAO E PURIFICAO POR

Prof. Dr.Antnio Augusto U. de Souza.

Profa. Dra. Selene M. A. Guelli U. de Souza

Florianpolis, 23 de fevereiro de 2005.

A pacincia irm do tempo; ela vive e confia nele,

Dedico esta conquista a voc Jocinea,

CAPTULO 2 - REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 ADITIVOS NATURAIS E SUAS APLICAES

2.1.2 PESQUISAS NA REA DA SADE (MDICO-FARMACUTICA)

2.2 ESTABILIDADE DOS CORANTES NATURAIS

2.3.1 BIOSNTESE DOS CAROTENIDES

2.5 ALTERNATIVA BIOTECNOLGICA PARA PRODUO

2.7.1 PRINCIPAIS APLICAES PARA O PIGMENTO

2.7.2 COMPOSIO DA SEMENTE

2.7.4 MTODOS DE PRODUO DO PIGMENTO

2.7.5 AVALIAO DA ESTABILIDADE/DEGRADAO

2.8 PROCESSOS DE SEPARAO POR ADSORO

2.9.1 CROMATOGRAFIA PREPARATIVA

2.9.2 VARIVEIS E PARMETROS OPERACIONAIS NA

2.9.8 DESEMPENHO DE UMA COLUNA

2.11 POROSIDADE DE UM LEITO

CAPTULO 3 - MATERIAL E MTODOS

3.1 SEMENTE DE URUCUM

3.4 OTIMIZAO DO PROCESSO DE EXTRAO

3.4.1 PR-PURIFICAO DO EXTRATO SLIDO DE URUCUM

3.6 DETERMINAO DA SOLUBILIDADE DA BIXINA E

3.8 AVALIAO DAS CONDIES DE ESTOCAGEM DE

3.9 METODOLOGIA ANALTICA

3.9.2 DETERMINAO DA MASSA DO EXTRATO SECO

3.10 ACOMPANHAMENTO ESPECTROFOTOMTRICO NO

3.11 CRISTALIZAO DA BIXINA

3.12 CROMATOGRAFIA PREPARATIVA

3.12.1 PREPARAO DA COLUNA

3.13 OBTENO DE DERIVADOS DE BIXINA

CAPTULO 4 RESULTADOS E DISCUSSO

4.1.1 SOLUBILIDADE EM SOLUES ALCALINAS

4.2 OTIMIZAO DO PROCESSO DE EXTRAO

4.2.1 TEORES DE BIXINA DO EXTRATO SOLVEL DURANTE OS

4.3 DERIVADOS DA BIXINA

4.3.2 DERIVADO CLCICO

OBTENO DE BIXINA CRISTALIZADA

4.7.2 EMPREGO DO ETANOL

4.8 ESPECTROS DE ABSORO EM CLOROFRMIO

4.9 ESPECTROS DE ABSORO EM SOLUO ALCALINA

4.10 ACOMPANHAMENTO DA ESTABILIDADE DA BIXINA

4.12 MONITORAMENTO ESPECTROMTRICO NO CURSO DA

CAPTULO 5 - CONCLUSES E SUGESTES PARA

5.2 SUGESTES PARA FUTUROS TRABALHOS

CAPTULO 6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Anexo A BALANO DE MASSA - EXTRAO ALCOLICA AMONIACAL

Anexo B MICROFOTOGRAFIAS DE BIXINA E DERIVADOS

Anexo C ESPECTRO DE RMN DA CIS BIXINA