2.

MT ODOS

d e

FIJACIN

Existen diferentes formas de fijar los

tejidos dependiendo del tipo de fijador, de
la estructura a fijar y de lo queramos
observar. Los mtodos de fijacin se
pueden clasificar en dos tipos: fsicos y
qumicos.
Fsicos
Los fijadores fsicos se basan o bien en
una congelacin muy rpida del tejido o
bien en la aplicacin de calor elevado. Se
utilizan cuando cuando los fijadores

qumicos alteran la estructuras que

queremos observar, cuando necesitamos
una fijacin muy rpida, o cuando el tipo
de tejido y la tcnica que usaremos lo
requiera.
La congelacin rpida es un buen
mtodo de preservacin de las
caratersticas moleculares, puesto que no
se vern alteradas por ninguna sustancia
qumica. La congelacin es conveniente
que sea rpida puesto que as se impide la
formacin de grandes cristales de hielo

que nos destrozaran la estructura del

tejido. Por ello es conveniente no usar
piezas mayores a 2 mm para que no se
retarde la congelacin de las zonas
centrales de la pieza. Asimismo, cuando
sea posible es conveniente embeber la
muestra en anticongelantes, tambin
llamados crioprotectores. Una una
congelacin rpida se consigue
sumergiendo la pieza en siopentano (-170
C) enfriado con nitrgeno lquido, o
colocando la muestra sobre un metal, el

cual se sumerge parcialmente en

nitrgeno lquido (-196 C), en mezclas de
hielo seco y acetona (-70 C) o incluso en
heliio lquido (-268 C).
La crioproteccin es siempre
recomendable, aunque no siempre es
posible. Normalmente se emplean como
agentes crioprotectores al
dimetilsulfxido, el glicerol y la sacarosa,
bien solos o en mezclados en diferentes
concentraciones. Hay que tener en cuenta,
sin embargo, que una vez que el tejido se

haya cortado se vuelve a descongelar y

hay que protejerlo de los procesos de
degradacin. Existen variantes a la tcnica
de congelacin como son la
criodesecacin o liofilizacin y la
criosustitucin. La criodesecacin parte de
tejido previamente congelado al que
posteriormente se le sublima el hielo, es
decir, el agua pasa de estado slido a
gaseoso sin pasar por estado lquido. Al
eliminar el agua se impide que se den
reacciones qumicas, por lo que, adems

de la fijacin, este mtodo preserva el

tejido en el tiempo.
La criosustitucintambin parte de tejido
congelado pero en este caso se produce
una sustitucin lenta del hielo por una
solucin fijadora. Con ello se posibilita una
fijacin qumica sobre un material que no
ha sufrido deterioro puesto que est
congelado.
La fijacin por calor no es frecuente en
histologa, puesto que produce deterioros
de los tejidos. Su efecto es la coagulacin

de protenas y disolucin de lpidos. Sin

embargo, se emplea para la observacin
de microorganismos, ya que preserva la
forma de etos y sirve para su
identificacin. Hoy en da, sin embargo, se
suele emplear el calor como un
complemento a la fijacin de qumica. As,
las muestras inmersas en un fijador se
introducen en un microondas y se llevan
hasta temperaturas de unos 55 C. Esta
temperatura no produce artefactos y tiene
dos ventajas: incrementa la velocidad de

fijacin y reduce el tiempo fijacin desde

varias horas o das a decenas de minutos.
El uso del microondas permite que el calor
sea homogneo en toda la muestra de
forma inmediata (si se hiciera en un bao
caliente habra un gradiente de calor en la
muestra desde la parte externa a la ms
interna.). Se cree que el incremento de la
velocidad de fijacin se debe slo al calor
generado y no al efecto directo de las
microondas. Las microondas se pueden
usar tambin para otros pasos del proceso

histolgico como la tincin.

Qumicos
Los mtodos qumicos utilizan soluciones
acuosas compuestas por molculas
fijadoras que establecen puentes entre las
molculas del tejido, mantenindolas en
sus lugares originales e impidiendo su
degradacin. Hay que considerar que los
fijadores qumicos afectan al tejidos tanto
fsica como qumicamemente. Los efectos
fsicos suelen ser retracciones o
distensiones, y la mayora endurecen el

tejido. Hay dos mtodos bsicos de

fijacin con fijadores
lquidos: inmersin y perfusin. En
cualquier caso el fijador debe llegar a
todas las partes el tejido lo ms
rpidamente posible.
Inmersin. En el mtodo de
inmersin las piezas de tejido se
sumergen en la solucin fijadora. Hay que
tener en cuenta algunas precauciones.
1) Las piezas de tejido no deberan
superar los 0.5 cm de espesor para que

el fijador alcance el interior de la pieza

antes de que sta comience a
deteriorarse. La velocidad de
penetracin del fijador depende de
cada fijador y de las caractersticas del
tejido. Esta velocidad nos condicionar
el tamao de la muestra. Para fijadores
lentos se recomindan piezas de 0.2 cm
de tamao. Esto tambin se ve
afectado por el tipo de tejido. Por
ejemplo, si es poroso o con grandes
espacios la difusin del fijador ser

ms rpida.

Fijacin por inmersin.

2) El volumen recomendado de fijador
es 20 vecessuperior al volumen de la
pieza.
3) La osmolaridad del tejido y de la
solucin fijadora deben estar
equilibradas.
4) El pH del fijador debe ser prximo al

fisiolgico.
5) El tiempo de fijacin, para una mismo
tipo de muestra, depende de cada tipo
de fijador: velocidad de difusin y
velocidad de fijacin (la rapidez e
intensidad con la que establece
puentes o coagula protenas). Debe ser
suficiente para que la muestra quede
bien fijada pero no excesivo para evitar
deterioros o alteraciones del tejido. Una
agitacin suave durante la fijacin
ayuda a la penetracin del fijador y

disminuye el tiempo. En general no se

recomiendan fijaciones mayores de 24
horas, excepto en algunos casos como
el formaldehdo para el que se suele
emplear una semana de fijacin.

Fijacin por perfusin de un rgano. Mediante

perfusin se consigue que la solucin fijadora llegue a
todas las clulas del rgano a travs del sistema
sanguneo. Mediante una bomba peristltica se
introduce la solucin fijadora a travs de la arteria que
irriga el rgano. Se obturan todos aquellos vasos
arteriales que no conducen al rgano.
Perfusin. Por este procedimiento la
solucin fijadora se introduce a travs del
sistema circulatorio por el cual accede a
todas las clulas del tejido gracias a la red
de capilares. Mediante este mtodo se

puede fijar un animal completo

introduciendo la solucin fijadora a travs
del ventrculo izquierdo del corazn. El
fijador llegar a todas las clulas
irriegadas por la sangre bombeada por
dicho ventrculo (circuito corporal). Si se
quieren fijar los pulmones habra que
introducir el fijador por el ventrculo
derecho. Tambin podemos fijar un nico
rgano en el caso de que podamos
introducir la solucin fijadora en la arteria
principal que irriga dicho rgano. La

perfusin no siempre es posible en

algunos casos como en muchas biopsias o
en los tejidos vegetale.
El mtodo de fijacin por perfusin es
mucho ms efectivo que el de inmersin
ya que la solucin fijadora llega
rpidamente a escasa distancia de todas
las clulas de la estructura perfundida. Por
tanto, la velocidad de penetracin del
fijador no es una condicin limitante.
Antes de introducir el fijador en el
sistema de vasos sanguneos hay que

eliminar previamente la sangre con

una solucin de lavado oxigenada, de otra
manera su interaccin con el fijador
produce trombos que impediran la fijacin
de determinadas zonas del animal o del
rgano. Respecto a las precauciones
mencionadas anteriormente en el mtodo
de inmersin debemos cuidar aqu
tambin la osmolaridad, el pH y el tiempo
de fijacin.

Fijacin por perfusin de un organismo completo.

Mediante este tipo de perfusin se introduce la
solucin fijadora en el sistema sanguneo. La bomba

peristltica aporta la presin suficiente para permitir al

fijador entrar a travs del ventrculo izquierdo (Vi) y
pasar a la aorta, desde la cual se distribuye por todo el
cuerpo (excepto por el circuito pulmonar). Tras pasar
por la red capilar la solucin fijadora pasa a los vasos
venosos que terminan por verter su contenido en la
aurcula derecha (Ad). A esta cavidad hay que hacerle
una abertura para que la solucin fijadora, una vez
realizada su funcin, salga del circuito. Ai: aurcula
izquierda; Vd: ventrculo derecho.
Este mtodo de fijacin por
perfusin requiere conocer la presin a la

que se va a introducir la solucin fijadora

en el animal o estructura, la cual debe ser
similar a la que posee la presin
sangunea normal en estado vivo. La
presin que ejercer la solucin fijadora se
puede regular mediante bombas
peristlticas (ver figura) o por gravedad,
es decir, variando la altura a la cual se
coloca la solucin fijadora respecto a la del
animal. Esto es importante porque una
presin muy baja prodra impedir que la
solucin fijadora alcanzara todas las

partes de la estructura y un presin muy

alta podra provocar roturas de los vasos
sanguneos y de la propia estructura
tisular.