Trichoderma 009 PDF

1
UNIVERSIDAD RICARDO PALMA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
DESARROLLO DE Verticillium chlamydosporium (Goddard ,1913) Y

EVALUACIN DE PATOGENICIDAD IN VITRO PARA EL CONTROL DEL
NEMATODO DEL NUDO DE LA RAIZ Melodoigyne incognita (Chitwood,
1949)
Tesis para optar el Titulo Profesional de

Licenciado en Biologa
Claudia Sofa Picho Gmez

Bachiller en Biologa
Lima - Per
2006
Este trabajo se lo dedico a DIOS, por todas las cosas maravillosas que
me ha dado y por toda su energa que siempre me manda.
A mis padres Hilda y Heriberto, a Diego y Mnica, por su paciencia,

cario, buenos consejos; por confiar mucho en mi y en todo lo que
puedo mostrar.
Por supuesto a mis amigos.y al Novoa, por todo...
MIS AGRADECIMIENTOS
Nuevamente a Dios, mi familia, mis seres queridos, mis amigos...
Al Doctor Tomas Agurto Senz

Por su amistad, tiempo y paciencia, en la orientacin para la realizacin de
este trabajo.
A la Dra. Vera Allegan, el Dr. Alcides Guerra y la profesora Mercedes

Gonzles, gracias por su tiempo empleado.
A la Mblga. Anny Zapata (Asesora externa), del rea de Produccin de

Hongos entomopatogenos del Programa Nacional de Sanidad Agraria
SENASA, por la amistad, y orientacin para la realizacin de este trabajo
Al Ing. Cosme Quispe, (Asesor externo) del rea de Nematologia del

Programa Nacional de Sanidad Agraria SENASA por su colaboracin
desinteresada y por todas sus observaciones.
Al Bilogo Enrique Torres por toda la ayuda brindada en todas las etapas de
la Tesis y por todos los nimos que echaba para la culminacin de esta
Tambin a todas aquellas personas que han colaborado indirectamente en

la realizacin de este trabajo.
GRACIAS
Resumen
El nemtodo del nudo de la raz Meloidogyne incognita (Chitwood, 1949), es

un nemtodo que ataca a diferentes cultivos, tanto en campo como en
invernadero, causando grandes prdidas econmicas. Como alternativa de
control de este nemtodo, se logr estandarizar la produccin masiva de
Verticillium chlamydosporium (Goddard, 1913) un hongo nematfago y se
evalu la patogenicidad in vitro del bionematicida obtenido.
Para la conservacin de la cepa de este hongo se probaron diferentes
medios de cultivo y para su desarrollo masivo, diferentes medios lquidos y
sustratos slidos, tambin se determinaron las condiciones apropiadas para
el ptimo desarrollo del hongo.
El mejor medio slido para la conservacin de la cepa fue Mdio 90, con lo
cual se obtuvo 4.31 x 108 con/ cm2 a los 8 das de sembrado y a los 30 das
se obtuvieron clamidosporas, que fueron conservadas a 5 C.
Para el desarrollo masivo, el medio liquido Papa Dextrosa con un promedio
de 16.73 UFC/ 300 l y el sustrato arroz fueron los mejores, obtenindose a
los 30 das de sembrado el hongo un promedio de 4 x 108 con/g.
Las condiciones apropiadas para el desarrollo del hongo Verticillium
chlamydosporium son temperatura 24C y humedad dentro de bolsa 30%
La patogenicidad de Verticillium chalmydosporium, observada en ootecas fue
de 32.25% y en huevos fue de 63.76%, esto demostr que el bionematicida
obtenido del desarrollo de Verticillium chlamydoporium fue un buen agente
controlador del nematodo del nudo Meloidogyne incognita
Abstract
The knoot root nematode Meloidogye incognita, (Chitwood, 1949), is one of

the main pest on differents crops, so much in field as in greenhouse, causing
big economic lost at the growers. As an alternative of control of this nematode,
to succeed in standarize the mass production of Verticillium chlamydosporium
(Goddard, 1913) a nematophagous fungi and evaluated its pathogenicity in
vitro of the bionematicide obtained.
In order to conservation the strain of this fungi, was tested differents culture
media and for its mass production differents liquid media and solid substrates,
also was determinated the appropriate conditions for the optimal fungus
development.
The best solid medium for the stored of the strain was Medium 90, obtained
4.31 x 108 con/cm2 at the 8 days, at the 30 days was obtained
chlamydosporas, that was stored at 5 C
To the mass production, the liquid media Potato Dextrose with an average of
16.73 UFC/ 300 l and the rice substrate were the best, obtaining at the 30
days of cultivated the fungi an average of 4 x 108 con/g.
The
appropiated
conditions
for
the
development
of
Verticillium
chlamydosporium are, temperature 24C and a humity inside the bag of 30%
The pathogenicity observed in ootecas was 32.25% and in eggs was 63.76%,
this demonstrated that the bionematicide obtained of the development of fungi
Verticillium chalmydosporium was a good control agent of knoot root

nematode Meloidogye incognita
INDICE
Resumen
Summary
I.
INTRODUCCIN
II.
ANTECEDENTES
11
2.1 Antecedentes Nacionales
11
2.2 Antecedentes Internacional
11
2.3 Control Biolgico de Meloidogyne incognita
13
2.4 Generalidades respecto al antagonista
14
2.4.1 Caractersticas morfolgicas
15
2.4.2 Mecanismo de accin
15
2.5 Generalidades respecto al hospedante M. incognita
17
2.5.1 Caractersticas Morfolgicas de M. incognita
18
2.5.2 Duracin del ciclo de vida sntoma y daos
19
2.6 Mtodos de Control de M. incognita
21
2.6.1 Control cultural
22
2.6.2 Control fsico
23
2.6.3 Control Qumico
23
2.7 Generalidades para la produccin de H. entomopatgenos
23
III.
27
MATERIALES Y MTODOS
3.1 Materiales
27
3.1.1 Material Biolgico
27
3.2 Metodologa
27
3.2.1 Obtencin de material biolgico de M. incognita
27
3.2.1.1 Identificacin de M. incognita
28
3.2.2.1 Reactivacin de cepa
28
3.2.2.2 Aislamiento del hongo
29
3.2.2.3 Cultivo monoesporico
29
3.2.2.4 Re-aislamiento del hongo
29
3.2.3 Produccin del hongo V. chlamydosporium
30
3.2.3.1 Fase I
30
3.2.3.1.1 Preparacin de inoculo liquido
31
3.2.3.1.2 Control de calidad del inoculo
32
3.2.3.2 Fase II
32
3.2.3.2.1 Preparacin de sustrato slido
32
3.2.3.2.2 Determinacin de humedad y Temperatura
33
3.2.3.2.2.1 Humedad
33
Preparacin de bolsas
33
Incubacin
34
Secado
34
Control de calidad
34
3.2.3.2.2.2 Temperatura
34
35
Incubacin
35
Secado
35
Control de calidad
35
3.2.3.2.3 Control de calidad
36
3.2.3.2.3.1 Concentracin de conidias
36
3.2.3.2.3.2 Porcentaje de germinacin o viabilidad
37
3.2.3.2.4 Prueba de Patogenicidad
38
3.2.3.2.4.1 Tratamiento de Ootecas
38
3.2.3.2.4.2 Tratamiento en huevos
38
3.2.3.2.4.3 Evaluacin
39
IV.
40
RESULTADOS
4.1 Desarrollo del hongo en medio de cultivo liquido para conservacin de

cepas
40
4.2 Desarrollo de medio lquido
40
4.2 Desarrollo de medio slido
40
4.3 Porcentaje de germinacin
41
4.4 Porcentaje de humedad
41
4.5 Porcentaje de parasitacin en ootecas
42
4.6 Porcentaje de parasitacin en huevos
42
V.
DISCUSIN
44
VI.
CONCLUSIONES
46
VII.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
47
VIII.
ANEXOS
53
INTRODUCCIN
Los nemtodos del gnero Meloidogyne, son considerados como los

nemtodos fitoparsitos, ms importantes debido a su amplio rango de
hospederos, en mayor parte cultivos alimenticios e industriales que son
susceptibles a esta plaga.
El promedio de las prdidas a nivel mundial en hortalizas causado por

el gnero Meloidogine y otros nematodos se estima en un 12.3 %, en pases
desarrollados, pudiendo llegar
a 14.6% en pases subdesarrollados, sin
embargo hay autores que han estimado prdidas de hasta un 25%. Adems
de un dao directo, Meloidogyne y otros nemtodos fitfagos, predisponen a
los cultivos a enfermedades fungosas y bacterianas causando prdidas aun
mayores, no slo en el rendimiento, sin tambin en la calidad de la cosecha.
Actualmente, para el control de ste nemtodo se utilizan productos

qumicos que son altamente txicos, estos son rpidos y eficientes, y son una
solucin temporal al problema causado por el nematodo, pero la utilizacin
de estos de una manera inadecuada, pueden favorecer al desarrollo de
resistencia del nemtodo al producto, y
ocasionar desequilibrios en el
ecosistema
La utilizacin de medidas de control biolgico es una alternativa para

reducir sus poblaciones, a un bajo nivel de dao econmico, sin riesgos de
contaminacin del ambiente. De estas hay que destacar el control microbiano,
por la utilizacin de microorganismos entomopatgenos. El uso del control
microbiano minimiza el problema de la resistencia de plagas, y el exceso de
residuos qumicos en los alimentos.
Entre las alternativas de control microbiano, se encuentra el uso del

hongo
nematfago
Verticillium
chlamydosporium,
(Goddard
,1913)
considerado como uno de los agentes de control biolgico ms promisorios
10
para el manejo de poblaciones de nemtodos formadores de agallas (Kerry y

Jaffe, 1997), en particular de huevos de Meloidogyne incognita (Atkins et. al.
2003, Kerry e Hidalgo, 2004).
En el Per, la utilizacin de estos bioplaguicidas es incipiente,

desarrollando hace pocos aos la produccin masiva de hongos benficos,
los cuales se realizan en forma semi - industrial, para lo cual es necesario
realizar trabajos de investigacin que
estn
dirigidos al aislamiento,
seleccin de cepas nativas virulentas, medios adecuados para su produccin

con la finalidad de obtener formulaciones comerciales patognicos, capaces
de establecerse en el medio ambiente y sobrevivir a condiciones ambientales
adversas (Hidalgo, et al. 2004; Ciancio y Leonetti, 1999).
El objetivo de este trabajo fue
de evaluar diferentes medios de cultivos
slidos, lquidos y sustratos, y poder determinar las condiciones apropiadas

para el desarrollo de Verticillium chlamydosporium (Goddard ,1913)
observar su capacidad patognica en Meloidogyne incognita (Chitwood, 1949)

in vitro
11
ANTECEDENTES
En investigaciones efectuadas para el control biolgico de nemtodos,

se ha demostrado que Verticillium chlamydosporium (Goddard
1913), es efectivo contra Meloidogyne arenaria (Neal), Meloidogyne
incgnita (Kofoid), Meloidogyne javanica, y Meloidogyne hapla.
(Chitwood). As como tambin afecta a
nemtodos del gnero
Heterodera y Globodera (De Leij et al. 1991). Este hongo nematfago

es un habitante del suelo, siendo un controlador natural de nemtodos.
En un estudio cuyo objetivo fue determinar que agente natural era

mejor como controlador de Melodoigyne incognita bajo condiciones de
laboratorio, se determin que el hongo Paecilomyces. lilacinus era
mucho mas eficiente como controlador de Meloidogyne incognita, que
otros hongos como Verticillium lecanii y Verticillium chlamydisporium
(Limay ,1998)
Lpez-Llorca, et al. (2002), realizaron ensayos con tres hongos

nematfagos,
Pochonia
rubens,
P.
chlamydosporia
(V.
chlamydosporium) y Lecanicillium lecanii, observando infeccin en

huevos de Meloidogyne incgnita con porcentajes de 35%, 42% y
50% respectivamente.
Para la conservacin y produccin de hongos entomopatgenos se

desarrollaron diferentes metodologas, siendo una de ellas, las que ha
desarrollado el Laboratorio de Entomopatgenos del SENASA
(Gmez y Zapata 1998).
Camargo et al. (2002), realizaron un ensayo en el cual probaron cinco

medios de cultivo para el desarrollo de Verticillium lecanii encontrando
que el mejor medio para su desarrollo contiene peptona, extracto de
levadura y casena hidrolizada.
12
Olivares-Bernabeu y Lopez-Llorca (2002), estudiaron factores como

temperatura, pH y humedad relacionados con el desarrollo y actividad
de
diferentes
hongos
nematfagos,
incluido
Verticillium
chlamydosporium como agentes de control biolgico de nemtodos

fitfagos en suelos espaoles ( Melodoigne y Heterodera )
Atkins, et al. (2003), en un trabajo realizado determinaron el

parasitismo de Verticillium
chlamidosporium, bajo condiciones
semi controladas en invernadero, observando un parasitismo de 68%

en huevos y 70% en ootecas del nematodo del nudo Meloidogne
incognita
Bharadaj y Trivedi (2004), evaluaron diferentes sustratos para la

multiplicacin masiva de Verticillium chlamydosporuin y probaron
su
eficacia
sobre
Heterodera
cajani,
ensayando
diferentes
dosificaciones del hongo para el control de este nematodo, bajo

condiciones de invernadero.
Kerry e Hidalgo (2004), observaron 68 % de parasitismo en huevos de

Meloidogyne
incgnita,
utilizando
el
hongo
Verticillium
chlamydosporium.
Soberanis et al. (2005), realizaron ensayos de multiplicacin masiva

de hongos entomopatgenos para la obtencin de producto seco,
utilizando temperaturas de 17 C 2 C para la etapa de secado,
elevando la concentracin de conidias de 109 a 1011 conidias por kilo,
para los hongos
Beauveria.bassiana,
Metharhizium anisopliae,
Trichoderma harzianum y Paecilomyces. fumosoroseus
13
2.3 Control biolgico del gnero Meloidogyne
Los nemtodos del nudo de la raz estn ampliamente distribuidos y son

econmicamente importantes, por lo tanto la mayor parte de estudios de
control biolgico estn enfocados a este grupo de nemtodos, sin
embargo su habito endoparsito es el principal impedimento para el
desarrollo de un control biolgico exitoso (Stirling, 1991). La mayor parte
de su ciclo de vida, los nemtodos estn completamente rodeados por
tejido radicular y estn por lo tanto protegidos de los parsitos y
predadores del suelo (De Leij, et al 1992; Stirling, 1991).
Hasta hace poco el estado de desarrollo ms utilizado para estudios de

control biolgico de nemtodos endoparsitos sedentarios, ha sido el
segundo estadio juvenil (J2) (Stirling, 1991).
Sin embargo los J2 han sido un objetivo muy evasivo debido a que no se
presenta en forma constante en el suelo, el nmero de juveniles de
Meloidogyne varia de acuerdo a las condiciones ambientales de este, la
mayora de J2 son encontrados luego de una lluvia o riego, cuando la
humedad del suelo es favorable para la eclosin (Davies et al. 1991;
Taylor and Sasser, 1988; Stirling, 1991).
Otra caracterstica que vuelve a J2 en una difcil presa para los

antagonistas es su capacidad de escapar del parasitismo y predacion
invadiendo las races (Stirling, 1991), este proceso puede ocurrir
rpidamente y los J2 de Meloidogyne inoculados experimentalmente en
macetas o en agar pueden ser encontrados en las races despus de 24
horas, adems en 3 das los J2 pueden moverse hasta 50 cm para
establecerse en las races (Prot et al. 1979).
Debido a que las hembras de Meloidogyne estn protegidas por las

races, y los juveniles son mviles, los huevos parecen ser el estado de
desarrollo ms vulnerable para el ataque de los antagonistas (Stirling,
1991). Los huevos generalmente estn localizados sobre la superficie de
14
las races y bajo condiciones ideales, en 10 das pueden completar su

desarrollo y pueden eclosionar, adems ya que los huevos estn
agrupados en masas, un parasito o predador efectivo localizado cerca,
podra ser capaz de eliminar muchos de los huevos (Stirling, 1991).
Sin embargo hay situaciones, donde los huevos, son puestos dentro del
tejido nodulado y los antagonistas del suelo son incapaces de ejercer un
control efectivo, por tener un acceso limitado a los huevos (Kerry et al.
1984; Stirling, 1991). Factores como la planta hospedante, la temperatura
y la densidad del inculo inicial afectan la proporcin de huevos puestos
dentro o fuera de los ndulos y por lo tanto influenciaran en la eficacia de
la infeccin de los huevos (De Leij y et al. 1992; Stirling, 1991).
El control biolgico de nemtodos formadores de agallas abarca una gran

diversidad de organismos que viven en el suelo, como enemigos
naturales de los nemtodos que atacan a las plantas. Estos parsitos
incluyen hongos, bacterias, virus,
protozoarios otros nemtodos e
invertebrados (Whitehead, 1997; Kerry, 2001).
Kerry (1995), presenta una relacin de agentes microbianos para el

control biolgico de nemtodos parsitos de plantas (ANEXOS, Tabla N
01)
2.4 Generalidades respecto al antagonista
Verticillium chlamydosporium (Goddard ,1913)
La identificacin de esta especie se realiz en 1913, cuando Goddard

aisl de suelo de jardn a un hongo que identific como Verticillium
chlamydosporium.
15
Segn Agrios (1995), Verticillium chlamydosporium, es un hongo

imperfecto que pertenece:
Gnero:
Verticillium
Especie:
Verticillium chlamydosporium Goddard ,1913
2.4.1 Caractersticas morfolgicas
Verticillium
chlamydosporium
(Goddard,
1913),
presenta
conidiforos erectos, con ramificacin verticilada, presentando una

protuberancia en forma de mazo en la punta del conidiforo que
sostiene una sola espora; filides cilndricas de 15 30 m de longitud
en forma de espiral. Fialosporas hialinas, de 2 - 5 x 1,5 - 2 m de
dimetro,
ovoides
ligeramente
cilndricas,
de
paredes
lisas.
Chlamydosporas muy comunes, que presentan de 4 a 9 celdas

globulares de paredes gruesas, miden de 15 30 x 10 a 20 m,
muriformes, ligeramente lobulados, con contenido granular, naciendo
terminalmente sobre ramificaciones laterales cortas de 15 30 m de
longitud, son muy persistentes. El micelio maduro completamente
cubiertos de chlamydosporas, llegando a presentarse polvoso de color
crema u ocre (Cook and Bakes. 1989).
2.4.2 Mecanismo de accin
Verticillium chlamydosporium (Goddard, 1913), forma una red

miceliar muy ramificada la cual permanece en estrecho contacto con la
cutcula del huevo, luego el hongo produce rganos de penetracin
especializados denominados apresorios, desarrollados a partir de la
hifa indiferenciada que permite la colonizacin de la superficie de los
huevos de los nemtodos. Sin embargo, la penetracin, es el resultado
de una presin fsica y una actividad enzimtico (Lopez-Llorca, 2002).
16
El hongo causa la desintegracin de la capa vitelina de la pared del

huevo por una enzima proteasa serina alcalina (subtilasa), designada
como VCP1 y una dilucin parcial de la capa quitinolitica y lipdica del
huevo (Lopez-Llorca, 1986 y 2002; Segers et al. 1996; Tikhonov, 2002).
Adems de los diferentes efectos de parasitismo de Verticillium

chlamydosporium (Goddard ,1913), en el desarrollo embrionario, los
efectos
enzimticos
en
la
pared
del
huevo
incrementan
su
permeabilidad y posiblemente facilita la entrada de toxinas que pudieran

estar presentes en el medio ambiente (Lopez- Llorca, 1986; Morgan,
1988).
Diferentes
investigadores
chlamydosporium
(Goddard,
han
sugerido
1913),
podra
que
producir
Verticillium
toxinas
nemtodos. Meyer (1990); Morgan Jones, (1988), observaron que los

huevos no eclosionaron cuando el hongo estuvo cerca de ellos. Sin
embargo, Irving y Ferry (1986); Davies (1991), no obtuvieron ninguna
evidencia que sugiriera la produccin de toxinas.
Debido a que Verticillium chlamydosporium (Goddard ,1913), parece

ser una especie que ha desarrollado cierta especializacin en relacin
con los nemtodos del ndulo de la raz y los nemtodos quiste, en
1980, se comienza en Rothamsted, Inglaterra un programa de
investigacin para desarrollar mtodos de introduccin del hongo en el
suelo con propsitos de control biolgico (Kerry, 1984). El hongo puede
ser introducido en arena, cscara de trigo, grano de trigo en polvo o
alcuotas de suspensin de clamidosporas (Davies, 1991; Bharadaj,
2004). Cuando las clamidosporas fueron utilizadas como inculo, el
hongo fue capaz de establecerse en el suelo sin ninguna base
alimenticia, debido a que las esporas tienen suficientes reservas
alimenticias y no necesitaron de fuentes adicionales de nutriente.
(Crump, 1992). Las clamydosporas son el estado de sobrevivencia del
hongo de modo que es probable que pueda iniciar la infeccin (Crump,
1992)
17
2.5 Generalidades respecto al hospedante Meloidogyne incognita
Los nemtodos del nudo de la raz de Meloidogyne incognita tienen una

amplia distribucin a nivel mundial y son econmicamente importantes
patgenos de plantas, son parsitos obligados que atacan a miles de
diferentes
especies
de
plantas
incluyendo
monocotiledneas,
dicotiledneas, plantas herbceas y leosas, adems algunas especies

de Meloidogyne incognita son patgenos importantes de cultivos
alimenticios, hortalizas, frutales y ornamentales. Taylor and Sasser
(1983), mencionan que el problema con nemtodos se encuentra en
todas las reas del mundo donde los cultivos son de periodos largos, y
los mayores daos ocurren en reas de climas tropicales y semi
tropicales y una de las especies que mas dao ocasiona a los cultivos
es la especie Meloidogyne incognita.
La sistemtica para Meloidogyne incognita segn Rafiq Siddiki (2000),

es la siguiente:
Gnero:
Meloidogyne
Especie:
Meloidogyne
incognita
(Kofoid
&
White
1919),
Chitwood, 1949
2.5.1 Caracteres morfolgicos de Meloidogyne incognita
Ciclo biolgico
Pre-parastico:
El desarrollo del huevo comienza despus de la ovoposicin, resultando

una larva completamente formada, con un estilete, enrollada en la
18
membrana del huevo. Este es el primer estadio larval (Taylor and

Sasser, 1983).
La primera muda tiene lugar en el huevo, poco despus, la larva

emerge a travs de un agujero hecho en un extremo del cascaron
flexible del huevo, por medio de pinchazos repetidos con el estilete.
El J2 de Meloidogyne incognita es mvil, vermiforme e infectivo y se

desplaza en el suelo para penetrar en las races de una planta
hospedante (Eisenback et al. 1991; Hussey, 1985).
Parastico:
Penetracin en las races de hortalizas
Las larvas en el segundo estadio larval infectivo generalmente penetran

en la raz justamente sobre la caliptra (punta de la raz), se mueven
principalmente entre las clulas no diferenciadas de la raz (Taylor and
Sasser, 1983).
Con sus estiletes perforan las paredes de las clulas e inyectan

secreciones de sus glndulas esofgicas. Esto da lugar a la formacin
de clulas gigantes (tambin llamadas sincitos), formadas por una
agrandamiento de las clulas (hipertrofia), a la posible disolucin de
paredes celulares, a un agrandamiento del ncleo y a cambios en la
composicin de los contenidos celulares. Al mismo tiempo, hay una
intensa multiplicacin de clulas vegetales (hiperplasia), alrededor de la
cabeza de la larva (Taylor and Sasser, 1983).
Mientras se estn formando las clulas gigante y las agallas, aumente

el ancho de la larva, y hay una dilatacin de las glndulas esofgicas.
Las glndulas del primordio genital se dividen y este se agranda
19
hacindose notorias dos ramificaciones en la hembra, o formando un

cuerpo alargado en el macho.
Morfologa:
La longitud promedio de las hembras adultas de las especies de

Meloidogyne flucta alrededor de 0.44 a 1.3 mm y el ancho promedio
esta entre 0.325 y 0.7 mm, las hembras de la mayora de las especies
tienen cuerpo simtricos, es decir hay una lnea que va desde la vulva
del estilete, atravesando la mitad del cuerpo (Taylor and Sasser, 1983).
2.5.2 Duracin del ciclo de vida, Sntomas y daos
Depende de la temperatura, a una temperatura de 29 C las primeras

hembras adultas de Meloidogyne incognita (Chitwood, 1949), aparecen
a los 13 15 das despus de la penetracin en las races, las hembras
empiezan a ovipositar a los 19 21 das, despus de la penetracin, el
promedio de vida de una hembra es de 2 3 meses (Taylor and Sasser,
1983).
Los J2 penetran en las races detrs de la cofia, la penetracin la

realizan por medio de accin mecnica del estilete como enzimtico
(celulolitica o pectinolitica), a travs de ciertas secreciones de la
glndula
esofageal
despus
de
la
penetracin
el
J2
migra
intercelularmente desde la corteza a la regin de diferenciacin celular

donde se establece y empieza a alimentarse, la cabeza del J2 se
localiza en la periferia del tejido del parnquima vascular y el resto del
cuerpo en la corteza, paralelo al axis longitudinal de la raz (Huang,
1985; Hussey 1985; Taylor and Sasser, 1983).
Los sitios preferidos de alimentacin son principalmente el floema o las

clulas parnquimaticas indiferenciadas del periciclo adyacente.
20
En respuesta a la alimentacin del J2 el tejido de la planta hospedante

soporta grandes cambios morfolgicos y fisiolgicos, algunas clulas
del parnquima se desarrollan en clulas de alimentacin permanentes
para el nematodo. Estas clulas se transforman en unas clulas
hipertrofiadas y multinucleadas, clulas gigantes, posiblemente como
resultado de secreciones producidas por las clulas de la glndula
esofageal dorsal del J2 (Hussey 1985)
Los nemtodos consiguen su alimento a travs de estas clulas

especializadas y no pueden continuar su desarrollo sin ellas (Eisenback
et al, 1991; Taylor and Sasser, 1983). Las clulas gigantes son
esenciales para una exitosa relacin hospedante-parsito, su activo
metabolismo es mantenido a travs de las secreciones de la glndula
esofageal dorsal y por la remocin de solutos por parte del nematodo
(Eisenback et al, 1991). Las clulas gigantes son esencialmente clulas
transportadoras de alimentos hacia el nematodo (Huang, 1985).
Los fotosintatos son movilizados hacia las clulas gigantes en las races
y como resultado el crecimiento como la produccin de la planta puede
verse afectada (Eisenback y et al, 1991; Huang, 1985; Hussey, 1985).
Otros sntomas areos de las plantas infectadas incluyen clorosis en el
follaje y marchites temporal durante periodos de estrs hdrico, la
absorcin de agua y nutrientes es reducida grandemente por los daos
y la nodulacin del sistema radicular (Eisenback y et al, 1991; Huang,
1985, Taylor and Sasser, 1983).
El tejido radicular alrededor del nemtodo y de las clulas gigantes

sufre una hiperplgia e hipertrfia dando lugar al caracterstico ndulo
radicular (Eisenback et al. 1991; Huang, 1985, Taylor and Sasser, 1983)
Los ndulos generalmente se desarrollan a los 2 das despus de la
penetracin del J2 (Eisenback et al. 1991), el tamao del ndulo esta
generalmente relacionado al nmero de nemtodos presentes en el
21
tejido, pero tambin de la especie de planta parasitada (Dropkin, 1954;

Eisenback et al. 1991).
2.6 Mtodos de control de Meloidogyne incognita.
Las decisiones para la implementacin de medidas de control estn

determinadas por la densidad mnima daina de nemtodos (poblacin
mnima del nemtodo capaz de causar dao econmico).
La densidad mnima daina varia dependiendo de la especie de

nemtodo, que varia en su patogenicidad y agresividad. En tomate
Meloidogyne incognita requiere de 25 juveniles/100 gramos de suelo para
causar dao econmico, Rotylenchus requiere mas de 200 juveniles
/100gramos de suelo para causar dao econmico (Quispe ,1995).
En conclusin la densidad mnima daina es variable para cada

relacin hospedero-parsito (Quispe, 1995).
2.6.1 Control cultural
Escape:
Consiste en sembrar en pocas en que las densidades poblacionales

son bajas o que no favorecen el desarrollo del nemtodo (Quispe, 1995).
Abonamiento:
El uso de abono orgnico es efectivo para reducir las poblaciones de

nemtodos, al descomponerse origina acido, gases, que tienen una
accin nematicida. La temperatura se eleva por la fermentacin en
algunas ocasiones llega a 70C la desventaja es que se requiere
grandes volmenes 20 30 toneladas/ha (Quispe, 1995).
22
Solarizacin:
Es un mtodo de pasteurizacin del suelo que permite suprimir la

mayora de las especies de nemtodos patgenos eficazmente. Sin
embargo solo es consistente en lugares con veranos calidos y calurosos.
La tcnica consiste en poner una o dos laminas de plstico transparente
encima
del
suelo
ligeramente
humedecido
durante
el
verano
aproximadamente de 6 a 8 semanas.
Plantas trampa
Plantas susceptibles que se siembran con la finalidad de que el

nemtodo penetre y estas se arrancan y se queman (Talavera, 2003).
Rotacin de cultivos
Consiste en alternar hospederos eficientes con plantas no hospederas

esto reduce grandemente la poblacin. Sin embargo son pocas las
plantas no hospederas y su rentabilidad baja en comparacin con los
que generalmente se cultivan (Talavera, 2003; Quispe, 1995).
2.6.2 Control fsico:
Temperatura:
Someter el suelo a temperaturas altas que sea letal para los nemtodos
y que no sean dainos para el material vegetal. El suelo para almacigar
puede ser tratado a una temperara de 121 C 15 lb de presin atm
durante 20 horas (Quispe, 1995).
23
2.6.3 Control qumico:
Desde que se eliminaron del mercado el bromuro de metilo, el DBCP y

otros fumigantes, la agricultura se ha encontrado desprotegida del
ataque de nemtodos pero en cambio se han desarrollado nematicidas
no fumigantes, que se aplican al suelo en forma granulada dentro de
estos tenemos ETHOPROP, CARBOFURAM, ALDCARBO, OXAMIL,
FEMIPHOS (Quispe, 1995).
2.7 Generalidades para la produccin de hongos entomopatgenos
La produccin de hongos entomopatgenos involucra la eleccin de

medios lquidos y slidos apropiados, los cuales proporcionaran los
nutrientes necesarios para el buen desarrollo el hongo con la finalidad
de obtener un biopreparado que proporcionen al usuario un producto de
mxima eficacia en condiciones de campo.
Existen diversas tecnologas de produccin de un bioplaguicida a partir

de hongos, las ms usadas son a partir de soportes slidos, en cultivos
lquidos sumergidos o combinaciones de ambos. Estos mtodos se
consideran generalmente artesanales o semiartesanales atendiendo al
nmero de manipulaciones que involucran, cada mtodo tienen ventajas
y desventajas, lo ms importante es la calidad del producto final y su
factibilidad tecnolgica y econmica (Fernandz-Larrea, 2001).
El proceso de produccin semi-industrial se realiza en varias fases, que
van desde la obtencin del cultivo puro hasta la formulacin del
producto, en general el proceso est organizado en dos etapas, la etapa
de cepario y la etapa de produccin:
24
Cepario
Aislamiento del hongo

Elaboracin de cultivos puros
Produccin
Preparacin de matraces y bolsas

Inoculacin e incubacin de matraces
Inoculacin e incubacin en bolsas
Proceso de secado
Cosecha del hongo
Elaboracin de formulaciones
Un requisito indispensable es contar con un buen aislamiento que

mantenga
su
virulencia
homogeneidad
debiendo
ser
cuidadosamente conservadas, libres de contaminantes en un medio

de cultivo adecuado (Gmez y Zapata, 1998; Soberanis et al. 2005).
El medio lquido debe estimular un rpido desarrollo micelial el cual

ser usado para inocular el substrato slido (Jenkins et al. 1998).
Debe contener fuentes de carbohidratos que le suministran energa y
nitrgeno en forma de protenas o aminocidos, los cuales son
esenciales para el desarrollo del hongo.
Existen
diversos sustratos slidos disponibles para usarlos en la
produccin de hongos para el control biolgico, los que provee un

soporte fsico para que el hongo produzca conidias areas.
Generalmente el sustrato es un cereal como arroz, mjjo, maz, trigo,
cebada, avena, sorgo. Los hongos utilizan ciertas proporciones de los
nutrientes proporcionados por los sustratos durante su desarrollo y
esporulacin. La eleccin del sustrato depende de un nmero de
factores que incluyen la disponibilidad local, costo y preferencia del
25
aislado (Jenkins, et. al. 1998).
Un sustrato ideal no solo deber
contener partculas con las dimensiones correctas, sino tambin

mantener su integridad estructural durante la preparacin de los
procesos de produccin (Maheva et al. 1984; Bradley et al. 1992).
A nivel mundial, existen numerosos pases en los cuales grupos de

investigadores y empresas productoras
se concentran en el
desarrollo de productos comerciales a partir de hongos entre los que

se encuentran, Cuba, Brasil, Colombia, Australia, Italia, Inglaterra,
Holanda, Estados Unidos (Burges, 1998; Butt and Copping, 2000).
26
III. MATERIALES Y METODOS
El presente trabajo de investigacin se realiz en el Laboratorio de

Entomopatgenos de la Subdireccin de Control Biolgico (SCB) y en el
Laboratorio de Nematologa del Centro de Diagnostico de Sanidad Vegetal
(CDSV), dependencias del Servicio Nacional de Sanidad Agraria SENASA,
con sede en Vitarte y La Molina Lima, durante los meses de enero del 2005
a julio del 2006.
3.1 MATERIALES
3.1.1 MATERIAL BIOLGICO
Cepa de Verticillium chlamydosporium (Goddard, 1913), obtenida

de la micoteca del
Laboratorio de Entomopatgenos de la
Subdireccin de Control Biolgico (SCB) y de la Universidad Nacional

Agraria de La Molina, sin cdigo, ao de conservacin 2002. Este
hongo nematfago ha sido introducido por el Dr. M. Canto, en el ao
de 1996.
Huevos inmaduros y hembras de Meloidogyne incognita (Chitwood,

1949), a partir de races de plantas de tomate, obtenidas de la
empresa ICATOM S.A.
3.2 METODOLOGIA
3.2.1 Obtencin del material biolgico Meloidogyne incognita (Chitwood,

1949)
Se colectaron races de tomate de los campos de la empresa ICATOM

S.A. Ica, para lo cual se examinaron las races que presentaba
27
nodulaciones. Las races fueron colocadas individualmente en bolsas de

papel hasta su acondicionamiento en laboratorio
3.2.1.1 Identificacin de Meloidogyne incognita (Chitwood, 1949)
La identificacin de Meloidogyne incognita (Chitwood, 1949), se

realiz mediante cortes sagitales de hembras adultas, en machos
adultos se observ el estilete, la posicin del bulbo esofgico, la parte
posterior del cuerpo y su medicin corporal, confirmando la
identificacin el Ing. Quispe, Nematlogo del Laboratorio de Sanidad
Vegetal del SENASA
3.2.2.1 Reactivacin de cepa
Una vez obtenidos las races de tomate con las agallas formadas por
el nemtodo, fue llevado al laboratorio en el cual se realiz la
diseccin de las agallas para obtener masas de huevos del nemtodo.
Esta operacin se realiz con sumo cuidado con la ayuda de un bistur
tratando de no cortar las masas de huevos. Una vez obtenidas las
masas de huevo se colocaron en una placa de Petri estril, estas
masas de huevos fueron lavadas con hipoclorito de sodio al 0.5 % por
espacio de 30 segundos, luego fueron lavadas con agua destilada
estril por 4 veces. Se obtuvieron 30 masas de huevos de
Meloidogyne incognita Chitwood, 1949.
La reactivacin consisti en: a las masas de huevos expuestos en la

placa de Petri se les asperj una suspensin de conidias 1 x 108
conidias / mililitro y se les dej con la suspensin de conidias por un
espacio de 2 minutos, luego con la ayuda de un pincel fueron
colocadas en una placa de Petri que contena agar agua, se colocaron
10 masa de huevos por placa, se colocaron en la incubadora a una
temperatura constante de 25C y a una humedad de 65% por un
espacio de 8 das.
28
3.2.2.2 Aislamiento
del
(Goddard ,1913)
hongo
Verticillium
chlamydosporium
Al observarse que las masas de huevo presentaban micelio, con la

ayuda de un asa de siembra se sembr por puntura en placas de Petri
que contenan medio PDA, luego se colocaron en la incubadora a una
temperatura constante de 25C y a una humedad de 65% durante 8
das.
3.2.2.3 Cultivo monoesprico
El cultivo monoesprico se realiz siguiendo la metodologa propuesta

por Lecuona (1995). La metodologa fue la siguiente: con un
sacabocado de un 1cm de dimetro se tom una muestras del hongo
con medio y se realizaron diluciones (10-4), luego se sembr en placas
de Petri que contenan agar agua en cuyo fondo se marcaron unas
lneas en forma de W, la siembra se realiz con la ayuda de un asa
de siembra por encima de las lneas marcadas, una vez listas las
placas, fueron rotuladas, selladas y se colocaron en la incubadora a
una temperatura constante de 25C y a una humedad de 65% por
espacio de cuatro das.
3.2.2.4 Re-aislamiento
(Goddard ,1913)
del
hongo
Verticillium
chlamydosporium
Para el re-aislamiento del hongo se utilizaron cinco tratamientos:
T1
(medio 90), T2 (Saboraud dextrosa agar), T3 (Papa dextrosa agar), T4

(Papa dextrosa agar + levadura) y T5 (Corn meal agar).
29
A los cuatro das de desarrollo del cultivo monoesprico, con la ayuda

de un bistur se cortaron las colonias y se colocaron en placas de Petri
que contenan los diferentes tratamientos.
Por cada tratamiento se prepararon cinco placas colocndose una

colonia en el centro de la placa, se dejaron incubar por 12 das a una
T de 24 C a una humedad de 60%, durante 8 das.
Se realiz el control de calidad
3.2.3 Produccin del hongo Verticillium chlamydosporium (Goddard ,1913)
Se realiz siguiendo la metodologa empleada en el Laboratorio de

Entomopatgenos de la SCB, la cual consiste en una produccin
bifsica, una fase lquida y una fase slida
3.2.3.1 Fase I
3.2.3.1.1 Preparacin de inculo lquido
Se prepararon diferentes medios de cultivo lquido con la finalidad

de obtener el medio ms adecuado en que se consiga el desarrollo
ptimo de Verticillium chlamydosporium (Goddard, 1913) Los
medios lquidos utilizados o tratamientos fueron: T1 (Czapeck), T2
(Papa dextrosa + levadura de cerveza), T3 (Medio 90), y T4 (Papa
- dextrosa)
El procedimiento fue el siguiente: se prepararon 300 ML de inculo
de cada medio, para lo cual se utilizaron frascos erlenmeyer de 500
ML de capacidad. Una vez preparados los frascos se esterilizaron
a 121 C y 15 libras de presin durante 15 minutos, dejando enfriar a
medio ambiente. Una vez fros, a cada frasco se le agreg 0.3 GR
de sulfato de estreptomicina y luego se inocularon con una placa
30
que contena Verticillium Chlamydosporium (Goddard ,1913)

esporulada.
Por cada medio se prepararon de tres frascos, haciendo un total de
15 frascos.
Se dej agitar por espacio de tres das en un agitador orbital a una
velocidad de 150 rpm a 24C
Los medios lquidos utilizados
M90:
1000 ML de agua destilada
5 GR de peptona universal
3 GR de extracto de malta
Czapeck:
35 GR de medio
PD + levadura
12 GR de levadura de cerveza
20 GR de dextrosa
PD
20 GR de dextrosa
200 GR de papa
Para preparar el medio PD + levadura y PD, se utiliz papa huayro,
la cual
fue pelada, cortada y sancochada en el agua, luego el
lquido obtenido fue pasado por un tamiz cuidando de que no pase

ningn residuo slido, se enras a 1000 ML con agua destilada
estril y se esteriliz en autoclave a 15 libras de presin y 121 C
por espacio de 20 minutos.
31
3.2.3.1.2 Control de calidad del inculo
Por cada tratamiento se tom 1 ML de inculo y se realizaron

diluciones hasta obtener la dilucin 10-7, con la ayuda de una
micropipeta se sembraron 300 microlitros por cada placa que
contena agar agua, se realizaron 3 repeticiones por inculo. Se dej
incubar a una T constante de 24 C.
Para verificar el medio que presentaba mayor concentracin de

conidias, se utiliz la metodologa de unidades formadoras de
colonias UFC.
3.2.3.2 Fase II
3.2.3.2.1 Preparacin de sustrato slido
Como soporte slido para la produccin de conidias areas

(propgulos
infectivos),
se
ensayaron
diferentes
cereales,
tenindose siete tratamientos: T1 (sorgo), T2 (cebada), T3 (trigo), T4

(arroz + salvado de trigo), T5 (arroz seco), T6 (arroz hmedo), T7
(arroz seco + biodac). El arroz seco fue el tratamiento testigo, pues
es el que se utiliza para la produccin de los diferentes hongos que
produce el Laboratorio de Entomopatgenos de la SCB.
Los granos (sorgo, cebada y trigo) se dejaron remojar por un tiempo

de 16 horas, luego se dejaron escurrir por 30 minutos. Para el arroz
hmedo, se dej remojar por 2 horas y se dej escurriendo por 30
minutos.
Para esta fase se prepararon bolsas de polipropileno que contena
100 GR de sustrato. Por cada tratamiento se prepararon 5 bolsas,
haciendo un total de 35 bolsas (Tabla N 02).
32
Se procedi a autoclavar por 30 minutos a 121 C y 15 libras de

presin.
Cuando las bolsas estuvieron fras, se procedi a sembrarlas en una

cmara de flujo laminar, a cada bolsas se le agreg 4.5 ML del
inculo preparado, luego se pasaron a la sala de incubacin con una
temperatura constante de 24C y una humedad de 95%, por un
tiempo de cuatro das, luego de las cuales se abrieron las bolsas
para eliminar la humedad de las bolsas y favorecer la esporulacin.
3.2.3.2.2 Determinacin de humedad y temperatura
Una vez que se determin que el mejor sustrato para la produccin

de Verticillium chlamydosporium (Goddard, 1913), se procedi a
realizar los ensayos con la finalidad de determinar
la humedad
ptima para el desarrollo del hongo.
Para determinar el porcentaje de humedad ptimo de desarrollo de

Verticillium chlamydosporium (Goddard, 1913), se ensayaron los
siguientes porcentajes de humedad: T1 (30%), T2 (46%), T3 (56%) y
T4 (66%), se tom como referencia las humedades que utilizan en la
produccin de otros hongos entomopatgenos. La humedad testigo
fue del 30%, que es la humedad utilizada en el Laboratorio de
Entomopatgenos de la SCB del SENASA.
3.2.3.2.2.1Humedad
Se utilizaron 5 bolsas que contenan 500 GR de arroz, por cada

tratamiento (humedad), con su respectivo testigo, la humedad del
testigo fue de 30%, en total se prepararon 20 bolsas. Una vez listas
33
las bolsas, se procedi a esterilizar
por 30 minutos en una
autoclave a 121 C y 15 libras de presin. (Tabla N 03).
Incubacin
Cuando las bolsas estuvieron fras, se procedi a inocularlas en una

cmara de flujo laminar, se agreg 30 ML de inculo por bolsa, se
agitaron para homogenizar el inculo con todo el sustrato, se
rotularon y se llevaron a la sala de incubacin, las bolsas fueron
acondicionadas en la sala de incubacin para su germinacin y
esporulacin, a una temperatura de 24 2 C y una humedad
relativa ambiental, por espacio de tres das.
Secado
Luego las bolsas se removieron y se abrieron para eliminar la

humedad y favorecer la esporulacin, mantenindose as por
espacio de cinco das.
La cual mantienen una temperatura constante de 24 C y una

humedad ambiental de 95% por espacio de tres das. Despus de
este tiempo, las bolsas se removieron y se llevaron a la sala de
secado en donde se procedi a abrirlas para retirar la humedad, en
donde permanecieron por espacio de ocho das a una temperatura
constante de 24 C y una humedad relativa ambiental de 60 65%
3.2.3.2.2.2 Temperatura
Para la fase de secado del los hongos entomopatgenos, la

temperatura utilizada es de 17 C en la cual se obtiene una mayor
cantidad de conidias. Para determinar la temperatura ptima de
34
secado de Verticillium chlamydosporium (Goddard, 1913), se

ensayaron dos temperaturas, 24 C y 17 C como testigo.
Se utilizaron 20 bolsas por tratamiento que contenan 500 GR de

arroz, las cuales se prepararon siguiendo la misma metodologa ya
descrita anteriormente.
Incubacin
Una vez inoculadas las bolsas fueron acondicionadas en la sala de

incubacin para su germinacin y esporulacin, a una temperatura
de 24 2 C y una humedad relativa ambiental, por espacio de
tres das, luego las bolsas se removieron y se abrieron para
eliminar la humedad y favorecer la esporulacin, mantenindose
as por espacio de cinco das.
Secado
Despus de este tiempo fueron trasladadas a la sala de secado,

en que se mantiene una temperatura constante de 17 C. Las
bolsas en desarrollo fueron evaluadas diariamente, con la finalidad
de observar las caractersticas tpicas del desarrollo del hongo en
estudio
Control de calidad
No se pudo realizar el control de calidad por estrs del hongo.
35
3.2.3.2.3 Control de calidad
3.2.3.2.3.1 Concentracin de conidias
Las bolsas con crecimiento de Verticillium chlamydosporium

(Goddard, 1913), se mezclaron para homogenizar las conidias con
el sustrato, se tom 1 GR y se puso en un tubo de prueba que
contena 10 ML de agua destilada estril + tween,
se procedi a
agitar en el Vortex por 2 minutos, se tom 1 ML para llevar a otro

tubo de prueba conteniendo 9 ML de agua destilada esteril
(dilucin 10-1), as sucesivamente hasta obtener la dilucin 10-3.
De esta ultima y mediante una pipeta se llen
la Cmara de
Neubauer, y se hizo la lectura con la ayuda de un microscopio.

Para obtener la concentracin de conidias se utilizo la siguiente
formula:
X
C = ---------Fc (d). N
Donde:
C = Concentracin de conidias
Fc = Factor de la cmara
d = dilucin de la suspensin
N = Nmero de cuadrados secundarios tomados e el cuadrado
principal central. En este se cont en cinco cuadrados secundarios
de un total de 25 existentes en la cmara, esto es 5/25 o 1/5.
X = es el promedio de conidias contadas en los cinco cuadrados
secundarios.
36
3.2.3.2.3.2 Porcentaje de germinacin o viabilidad
La viabilidad se estim mediante el porcentaje de germinacin de

conidias. De cada bolsa, al igual que para la concentracin de
conidias se tom 1 GR de muestra y se deposit en un tubo de
prueba que contena 10 ML de agua destilada estril + tween, se
agit en un vortex, se tom 1 ML y se agreg a un tubo de prueba
conteniendo 9 ML de agua destilada estril + tween,
y as
sucesivamente hasta obtener la dilucin 10-3, de esta ltima con la

ayuda de una pipeta se tom alicotas de 2 ML y se deposit sobre
laminas delgadas de PDA contenidos en placas de Petri. Luego
se extendi por toda la placa con la ayuda de una asa de siembra
y se incub a 25C durante 15 horas; transcurrido el tiempo, con
un bistur estril se cort cuadraditos de 1cm 2 y se colocaron sobre
lminas portaobjeto, luego se agreg 1 gota de azul de lactofenol
para colorear las estructuras del hongo
Se registr el numero de conidias germinadas y no germinadas,
tomando cinco campos de lectura por cada cm2 y tres cm2 por
placa
Para calcular el porcentaje de germinacin se utilizo la siguiente

relacin:
% de germinacin =
x 100
a+b
Donde:
a = Numero de conidias germinadas
b = Numero de conidias no germinadas
37
3.2.3.2.4 Prueba de patogenicidad
Para las pruebas de patogenicidad se utiliz el mtodo de inmersin,

utilizando una solucin de esporas de una concentracin conocida,
utilizndose ootecas y huevos de Meloidogyne incognita (Chitwood,
1949)
3.2.3.2.4.1 Tratamiento de ootecas
Se tomaron 100 ootecas de Meloidogyne incognita (Chitwood,

1949), de races
de tomate. Las ootecas se extrajeron con la
ayuda de dos estiletes y un estereoscopio, fueron lavadas con

hipoclorito de sodio al 0.5% por un minuto, luego fueron
enjuagadas por tres veces con agua destilada estril. Luego fueron
sumergidas
en
una
solucin
del
hongo
Verticillium
chlamydosporium (Goddard, 1913), desarrollado en M90 por un

espacio de 10 das, a una concentracin de 2.42 x 109 conidias /
mililitro por 5 minutos, luego con la ayuda de un pincel fueron
colocadas en placas de Petri que contena agar agua, se
colocaron 20 ootecas por placa, se colocaron en la incubadora a
una temperatura constante de 25C y a una humedad de 65% por
espacio de 8 das.
3.2.3.2.4.2 Tratamiento de huevos
Se tomaron 5 GR de races con presencia de ootecas, se les

coloc en un frasco con hipoclorito de sodio al 1%, se tap el
frasco y se agit durante cinco minutos, con lo cual se logr
desintegrar
la
masa
gelatinosa
que
recubre
los
huevos,
obtenindose una suspensin de huevos, los que fueron lavados
38
tres veces
con agua estril con la ayuda de un tamiz de 38
micrones. Una vez obtenido los huevos se sumergi en una

solucin de esporas a una concentracin de 2.42 x 109 conidias /
mililitros por 2 minutos, luego con la ayuda de un gotero se
colocaron 5 gotas de la suspensin de huevos tratada en placas
que contenan M90, cada gota contena aproximadamente 35
huevos, los lugares donde fueron colocados los huevos fueron
marcados con un plumn indeleble por el envs de la placa. Una
vez listas las placas, se colocaron en una incubadora a 25 C por
espacio de siete das.
3.2.3.2.4.3 Evaluacin
Antes de la evaluacin se colocaron cubreobjetos esterilizados en

los medios de cultivo donde se haban colocado los huevos y se
procedi a evaluarlos con la ayuda de un microscopio. El
parasitismo fue reconocido cuando se observ invasin del micelio,
en las partes internas del huevo y la consiguiente destruccin del
mismo, los resultados se expresaron como % de huevos
parasitados
Se evaluaron cinco placas petri, cada de unas de las cuales se
consideraba un repeticin y por cada placa se evalu 100 huevos,
se consider como testigo a los huevos sin el tratamiento con el
hongo Verticillium chlamydosporium (Goddard, 1913).
Para determinar el porcentaje de mortalidad sobre las ootecas y

huevos de Meloidogyne incgnita, se utiliz la formula de Abbot
modificada:
% Mortalidad = mortalidad en el testigo - mortalidad en el ensayo x 100
100 mortalidad en el testigo
39
IV. RESULTADOS
4.1 Desarrollo del hongo en medio de cultivo para conservacin de cepas
Se observ que el mejor tratamiento a los 10 das de evaluacin, fue el

T1 (Medio 90), en el que se obtuvo 4.31 x 108 conidias / mililitro, seguido
del T3 (PDA) con 4.65 x 107 conidias / mililitro. El tratamiento en que
obtuvo menor nmero de conidias fue el T5 (CMA),
con 5.93 x 106
conidias / ML, pero estadsticamente no hubo diferencias significativas

entre los tratamientos evaluados. (ANEXOS Tabla N 04) (ANEXOS Fotos
N 1, 2, 3, 4,5)
4.2. Desarrollo en medio liquido
Se observ que el mejor medio lquido para la multiplicacin masiva del

hongo Verticillium chlamydosporium (Goddard, 1913) es PD con un
promedio de 16,73% UFC/250l, seguida de Czapeck con 12,23%
UFC/250l. El medio que present la mnima cantidad de UFC/250l
fue el Medio 90 con 6.63%, pero estadsticamente no hubo diferencias
significativas entre los tratamientos. (ANEXOS Tabla N 05).
Para el control de calidad de los medios lquidos se utiliz el parmetro

de UFC/250l, debido a que los inculos presentaban aglomeraciones
de micelio, lo que no permiti realizar el conteo de conidias, esto puede
deberse a la caracterstica del hongo que presenta desarrollo sumergido
(ANEXOS Tabla N 05). (ANEXOS Foto N 8)
4.3 Desarrollo en medio slido
En la tabla N 06, se observa que a
los 15 das de inoculados los
tratamientos presentaban diferencias significativas, siendo los mejores

tratamientos el T4 (Arroz seco) con 8.2 x 108 con/g y T7 (Arroz + Biodac)
40
con 7.62 x 108 conidias / gramos
siendo el sustrato Sorgo el que
present menor nmero de conidias con 2.74 x 108 conidias / gramos.

Entre los dems tratamientos no hubo diferencias significativas.
(ANEXOS Tabla N 06).
A los 23 das se observa las mismas diferencias significativas siendo los

mejores tratamientos T4 y El T7 con 4,5 x 108 conidias / gramos
respectivamente. Con relacin a la evaluacin a los 15 das, el
tratamiento que present menor nmero de conidias fue cebada con 1.8 x
108
conidias / gramos. As mismo a los 23 das se observ una
disminucin del nmero de conidias con relacin a lo observado a los 15

das. (ANEXOS Tabla N 06) (ANEXOS Fotos N 10, 11, 12, 13)
A los 30 das no hubo diferencias significativas entre los tratamientos
(AENEXOS Tabla N 06).
4.3.1 Porcentaje de Germinacin
Se obtuvo en todos los sustratos una germinacin del 100%, a las 16

horas de haber sido sembrado el hongo en placa, ya que al hacer las
observaciones al microscopio todas las conidias estaban germinadas.
4.4 Porcentaje de Humedad
En cuanto al % de humedad se observ que el testigo, con una humedad

de 30% present un nmero mayor de conidias, de 2.16 x 108 conidias /
mililitro, lo que concuerda con lo utilizado por el Laboratorio de
Entomopatgenos del SENASA, para la produccin masiva de los
diferentes hongos entomopatgenos.
Segn la prueba de Duncan existe diferencias significativas entre los
tratamientos,
aunque
(ANEXOS Tabla N 07)
numricamente
sean
relativamente
iguales.
41
4.4.1 Porcentaje de Germinacin
Se obtuvo en todos los sustratos una germinacin del 100%, a las 16

horas de haber sido sembrado el hongo en placa, al hacer las
observaciones al microscopio todas las conidias presentaban sus tubos
germinativos.
4.5 Porcentaje (%) de Parasitacin en Ootecas
De acuerdo a la frmula de mortalidad corregida de Abbot, se observ

una mortalidad de 32.25% en ootecas por el hongo Verticillium
chlamydosporium (Goddard, 1913)
En donde hubo una mortalidad en el tratamiento (Verticillium

chlamydosporium) de 79% y una mortalidad en el testigo de 69%
4.7 Porcentaje (%) de Parasitacin en Huevos
De acuerdo a la formula de mortalidad corregida de Abbot , se observ

una mortalidad del 63.76%, sobre huevos de Meloidogyne incognita
(Chitwood, 1949)
por el hongo Verticillium chlamydosporium
(Goddard, 1913). (ANEXOS Foto N 17)
En donde hubo una mortalidad en el tratamiento (Verticillium

chlamydosporium) de 73.4% y una mortalidad en el testigo de 26.6%
42
V. DISCUSION
El uso de un agente de control biolgico con fines de control de plagas

depende del mantenimiento de las cepas,
de la obtencin de medios
adecuados para su desarrollo, permitiendo su conservacin por un largo

periodo de tiempo, tanto en cepario como en anaquel hasta su utilizacin.
En este estudio se determin que para la conservacin del hongo

nematfago Verticillium chlamydosporium (Goddard, 1913) el mejor medio
de cultivo para su conservacin es el Medio 90 (peptona, extracto de
levadura) lo que concuerda con lo observado por Camargo et al. (2002), que
encontraron que el mejor medio para el desarrollo de Verticilium lecanii, fue
el medio completo (peptona, extracto de levadura y casena hidrolizada),
manifestando que los resultados obtenidos se deban a que la peptona y el
extracto de levadura contienen varios macro y microelementos que favorecen
el desarrollo del hongo.
El medio lquido en el que se obtuvo mayor cantidad de UFC fue Papa

Dextrosa, lo cual difiere con De Leij y kerry (1991), que utilizaron el medio
Czapeck Dox con lo cual obtuvieron mayor cantidad de conidias
El hongo Verticillium chlamydosporium, tuvo un mejor desarrollo en arroz

seco, lo cual concuerda con Bharadaj y Trivedi (1998), Mendonca (1992),
Ibrahim and Low (1993), Milner et al. (1993), quienes manifiestan que el
sustrato comnmente seleccionado para la produccin de conidias fungales
es el arroz blanco, debido a una combinacin de factores incluyendo un
balance nutricional, costo, disponible a nivel mundial, caractersticas fsicas
tales como el tamao del grano y su forma, propiedades de hidratacin e
integridad estructural an despus de su colonizacin por el hongo.
La temperatura ptima para todas las etapas de desarrollo de Verticillium

chlamydosporium fue de 24C
2C, lo cual concuerda con Olivares-
Bernebeu, (2002), quien manifiesta que la temperatura ptima para el

desarrollo de hongos parsitos de nematodos flucta entre 25 -
30 C,
43
mientras que Soberanis et. al. (2005), utiliza 17C de temperatura para la
etapa de secado, de los diferentes hongos entomopatgenos y antagonistas
que produce el Laboratorio de Entomopatgenos del SENASA
La humedad ptima del sustrato para el desarrollo de Verticillium

chlamydosprium, fue de 30% en la etapa de germinacin, el cual permite la
formacin de gran cantidad de conidias. Esto se diferencia de los dems
hongos entomopatgenos, en que se utiliza una humedad de 50%, para esta
etapa (Gmez y Zapata, 1998).
El porcentaje de parasitismo de Verticillim chlamydosporium observado en

huevos de Meloidogyne incognita, fue de 63.76%, lo cual concuerda con
Kerry e Hidalgo (2004), Atkins, et. al. (2003), Lpez-Llorca, et. al. (2002) y
Limay (1998), quienes observaron un parasitismo promedio entre 60 70%,
en huevos de Meloidogyne incognita.
44
VI. CONCLUSIONES
1.
El mejor medio de cultivo para la conservacin de Verticillium

chlamydosporium es el M90, ya que a los 30 das el hongo llega a
formar estructuras de resistencia que
son las clamydosporas, las
cuales son ideales para su conservacin.
2. El mejor medio lquido a utilizarse para la produccin es el Caldo

Papa Dextrosa, en el cual se formaron mayor cantidad de Unidades
formadoras de Colonias (UFC).
3. El sustrato con el cual se obtuvo mayor concentracin de conidias y

un porcentaje de germinacin del 100% en este estudio fue el sustrato
arroz
4. La patogenicidad de Verticillium chlamydosporium in vitro en

huevos fue de 63.76%, lo cual indica que es un buen controlador de
Meloidogyne incognita
5. En la fase de secado el hongo Verticillium chlamydosporium

necesita una temperatura de 24 C a bolsa abierta.
6. En este estudio se observ que hasta los 30 das el hongo

Verticillium chlamydosporium mantiene su calidad en cuanto a
concentracin de conidias y germinacin permitiendo su estabilidad
por
mas
tiempo
comercializacin.
lo
cual
permite
mayor
facilidad
para
su
45
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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51
ANEXOS
52
Tabla N 01
Agentes microbianos para el control biolgico de nemtodos parsitos de

plantas. (Kerry, 1995)
Grupos
Agentes potenciales
Probable modo de accin
Parsitos obligados
Pasteuria penetrans
Parsitos verdaderos que colonizan estados
Bacterias
Pasteuria thornei
vermiformes y sedentarios de nematodos y
Pasteuria rishizanome
los cuales no tienen un modo de accin

toxica
Hirsutella rhossiliensis
Drechmeria coniospora
Parsitos
Paecylomices lilacinus
Parsitos de nematodos que pueden
facultativos
Verticillium lecanii
tambin colonizar materia orgnica en
de
Verticillium chalmydosporium
el suelo y la rizosfera.
atrapadores
Arthrobotrys oligospora
Fusarium oxysporum
Compiten en las races de las plantas y
Cylindrocarpon destructans
destruyen las clulas alimenticias de
Mycorrhizae
los nematodos sedentarios o producen
Hongos
Hongos
parasito
nematodos
Hongos
de nematodos
Hongos endefiticos
toxinas, los nematodos tambin pueden

ser colonizados
Bacterias
de
rizosfera
la
Agrobacterium radiobacter
Reducen la invasin de Las races por
Bacillus aphaericus
nematodos mediante la produccin de
Bacillus subtilis
toxinas, cambios en los exudados

radiculares
por
una
supresin
reducida
Hongos del suelo
Trichoderma harzianum
Producen metabolitos txicos en
Gliocladium virens
suelo y o en la rizosfera
el
53
Tabla N 02
Sustratos ensayados para la multiplicacin masiva del nematfago

Verticillium chlamydosporium
Tratamientos
Agua
destilada Inoculo (ml)
(ml.)
T1 (Sorgo)
33
4.5
T2 (Cebada)
32
4.5
30.5
4.5
T4 (Arroz seco )
24
4.5
T5 (Arroz + salvado )
30
4.5
Sin agua
4.5
24
4.5
T3 (Trigo )
T6 (Arroz hmedo )
T7 (Arroz seco + Biodac)
Sustratos evaluados, para determinar cual de estos produce mayor

nmero de conidias en la multiplicacin masiva del hongo nematfago
Verticillium chlamydosporium.
54
Tabla N 03.
Porcentaje de humedad del sustrato arroz, para la multiplicacin masiva

del nematfago Verticillium chlamydosporium
Tratamiento
Cantidad de agua agregada para
Cantidad de Inculo
500gr de arroz
T1 30%
120 ml. de agua
30 ml
T2 46%
200 ml de agua
30 ml
T3 56%
250 ml de agua
30 ml
T4 66%
300 ml de agua
30 ml
Porcentaje de humedad evaluados, para determinar cual de estos

produce mayor nmero de conidias en la multiplicacin masiva del hongo
nematfago Verticillium chlamydosporium.
55
Tabla N 04
Promedio de concentracin de conidias de

evaluados a los 10 das.
Tratamientos
Verticillium chlamydosporium,
DE
Sig.
T1 (Medio 90)
4.31 x 10
1.19
T2 (SDA)
3.27 x 107
2.90
T3 (PDA)
4.65 x 107
3.65
T4 (PDA + levadura)
3.26 x 107
2.87
T5 (CMA)
5.93 x 106
3.37
Segn Duncan ( = 0,05) letras iguales en la misma columna no difieren en los

porcentajes estadsticamente entre si.
X= Promedio. DE = Desviacin estndar
Sig. = Significancia
Se observ que el mejor tratamiento a los 10 das de evaluacin, fue el T1

(Medio 90), en el que se obtuvo 4.31 x 108 conidias / mililitro, seguido del T3
(PDA) con 4.65 x 107 conidias / mililitro. El tratamiento en que obtuvo menor
nmero de conidias fue el T5 (CMA), con 5.93 x 106 conidias / ML, pero
estadsticamente no hubo diferencias significativas entre los tratamientos
evaluados.
56
Tabla N 05
Promedio de UFC/250l en los diferentes medios lquidos a las 72 horas de

evaluacin
Tratamientos
DE
Sig.
T3 (Medio 90)
6,63
T1 (Czapeck)
12,23
T4 (PD)
16,73
T2 (PD+ Levadura de cerveza)
8,41

Se observ que el mejor medio lquido para la multiplicacin masiva del

hongo Verticillium chlamydosporium (Goddard, 1913) es T4 (PD) con un
promedio de 16,73% UFC/250l, seguida de T1 (Czapeck) con 12,23%
UFC/250l. El medio que present la mnima cantidad de UFC/250l fue el
Medio 90 con 6.63%.
57
Tabla N 06
Tabla N 06. Concentracin de conidias sobre sustrato slido a los 15, 23 y

30 das de evaluacin.
15 das
Tratamientos
T1 (Sorgo)
T2 (Cebada)
T3 (Trigo)
T5 (Arroz +
salvado de
trigo)
T4 (Arroz
seco)
T6 (Arroz
hmedo)
T7 (Arroz +
biodac)
DE
2,7 x 10
5,3 x 10
6 x 10
0.73
1.41
23 das
Sig
b
ab
DE
30 das
Sig
DE
Sig
1,7 x 10
0.55
1,8 x 10
0.70
1.95
0.68
2.87
2,1 x 10
1,8 x 10
1.39
ab
3,2 x 10
1.67
ab
3,6 x 10
0.52
1.08
ab
b
5,7 x 10
1.53
ab
3,4 x 10
0.57
ab
2,7 x 10
8,2 x 10
4.08
4,5 x 10
2.72
4 x 10
6,6 x 10
4.04
ab
3,5 x 10
1.09
ab
3,1 x 10
1.28
7,6 x 10
1.23
4,5 x 10
0.60
3,9 x 10
0.61
Segn Duncan ( = 0,05) letras iguales en la misma columna no difieren en los porcentajes
estadsticamente entre si.
En la tabla N 06, se observa que a
los 15 das de inoculados los
tratamientos presentaban diferencias significativas, siendo los mejores

tratamientos el T4 (Arroz seco) con 8.2 x 108 con/g y T7 (Arroz + Biodac)
con 7.62 x 108 conidias / gramos, siendo el sustrato T1 (Sorgo) el que
present menor nmero de conidias con 2.74 x 108 conidias / gramos.
Entre los dems tratamientos no hubo diferencias significativas.
A los 23 das se observa las mismas diferencias significativas siendo los

mejores tratamientos T4 y El T7 con 4,5 x 108 conidias / gramos
respectivamente. Con relacin a la evaluacin a los 15 das, el
tratamiento que present menor nmero de conidias fue cebada con 1.8 x
108
conidias / gramos. As mismo a los 23 das se observ una
disminucin del nmero de conidias con relacin a lo observado a los 15

das.
58
A los 30 das no hubo diferencias significativas entre los tratamientos
59
Tabla N 07
Tabla N 07. Influencia de la humedad en el desarrollo de

chlamydosporium a los 12 das de inoculados.
Tratamientos
T3 (56%)
T2 (46%)
T4 (66%)
T1 (30% testigo))
DE
Sig.
0.09
0.18
bc
0.19
ab
0.23
1.38 x 10
1.68 x 10
1.98 x 10
2.16 x 10
V.

En cuanto al % de humedad se observ que el testigo, con una humedad

de 30% present un nmero mayor de conidias, de 2.16 x 108 conidias /
mililitro, lo que concuerda con lo utilizado por el Laboratorio de
Entomopatgenos del SENASA, para la produccin masiva de los
diferentes hongos entomopatgenos.
60
Re- aislamiento del hongo Verticillium chlamydosporium
Foto 1. Vista anterior y posterior de placa que contiene medio Papa

dextrosa agar + levadura de cerveza con el hongo Verticillium
chlamydoporium a los 6 das de haber sido traspasada la colonia de un
cultivo monoesporico (TABLA 04).
Foto 2. Vista anterior y posterior de placa que contiene medio Papa

dextrosa agar con el hongo Verticillium chlamydoporium a los 6 das de
haber sido traspasada la colonia de un cultivo monoesporico (TABLA 04)
61
Foto 3. Vista anterior y posterior de placa que contiene medio 90 con el

hongo Verticillium chlamydoporium a los 6 das de haber sido traspasada
la colonia de un cultivo monoesporico (TABLA 04)
Foto 4. Vista anterior y posterior de placa que contiene medio Saboraud

dextrosa agar con el hongo Verticillium chlamydoporium a los 6 das de
haber sido traspasada la colonia de un cultivo monoesporico (TABLA 04)
62
Foto 5. Vista anterior de placa que contiene medio Corn meal agar con el
hongo Verticillium chlamydoporium a los 6 das de haber sido traspasada
la colonia de un cultivo monoesporico (TABLA 04)
Foto 6. Placa que contiene M90 despus de 30 das de haber sido

sembrado el hongo Verticillium chlamydodporium, de un cultivo
monoesporico, se logro la obtencin de clamydosporas
63
Clamidosporas
Foto 7. Clamidosporas con cuatro clulas (estructuras de resistencia) del

hongo Verticillium chlamydporium.
Foto 8. Placas con Medio agar agua el cual han sido sembrados con 300
microlitros de diferentes medios lquidos, despus de tres das de
agitacin orbital a 150 rpm. De izquierda a derecha, Medio 90, Czapeck,
Papa dextrosa y Papa dextrosa + levadura. Ntese la mayor cantidad de
UFC en el medio lquido Papa dextrosa. (TABLA 05)
64
Foto 9. Sustratos con Verticilium chlamydosporium en sala de

esporulacin
Foto 10. De izquierda a derecha Arroz seco y arroz hmedo con el hongo
Verticillium chlamydoporium (TABLA 06)
65
Foto 11. De izquierda a derecha Biodac y Sorgo con el hongo Verticillium

chlamydoporium (TABLA 06)
Foto 12. De izquierda a derecha Cebada y Trigo con el hongo Verticillium

66
Foto 13. Arroz + salvado de trigo con el hongo Verticillium

Foto 14. Sustrato Arroz con Verticillium chlamydosporium a los 15 das de

sembrado. (Producto Final)
67
Foto 15. El dao causado por Meloidogyne incognita en tomate forma

nodulaciones en las races impidiendo la absorcin de nutrientes
(Lycopersicum esculetum).
Foto 16. Masa de huevo de Meloidogyne incognita en raz de tomate

(Lycopersicum esculetum)
68
Foto 17. Parasitacion en ootecas de Meloidogyne incognita (inmersin de

ootecas) en una suspensin de conidias de Verticillium chlamydosporium
Foto 18. Ootecas en Agar agua
69
Hifa emergiendo de huevo

de Meloidogyne incognita
Foto 19. Hifa de Verticillium chlamydosporium emergiendo de huevo de

Meloidigyne incognita.

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UNIVERSIDAD RICARDO PALMA

DESARROLLO DE Verticillium chlamydosporium (Goddard ,1913) Y

Tesis para optar el Titulo Profesional de

Claudia Sofa Picho Gmez

A mis padres Hilda y Heriberto, a Diego y Mnica, por su paciencia,

Nuevamente a Dios, mi familia, mis seres queridos, mis amigos...

Al Doctor Tomas Agurto Senz

A la Dra. Vera Allegan, el Dr. Alcides Guerra y la profesora Mercedes

A la Mblga. Anny Zapata (Asesora externa), del rea de Produccin de

Al Ing. Cosme Quispe, (Asesor externo) del rea de Nematologia del

Tambin a todas aquellas personas que han colaborado indirectamente en

El nemtodo del nudo de la raz Meloidogyne incognita (Chitwood, 1949), es

The knoot root nematode Meloidogye incognita, (Chitwood, 1949), is one of

Verticillium chalmydosporium was a good control agent of knoot root

2.1 Antecedentes Nacionales

2.2 Antecedentes Internacional

2.3 Control Biolgico de Meloidogyne incognita

2.4 Generalidades respecto al antagonista

2.4.1 Caractersticas morfolgicas

2.4.2 Mecanismo de accin

2.5 Generalidades respecto al hospedante M. incognita

2.5.1 Caractersticas Morfolgicas de M. incognita

2.5.2 Duracin del ciclo de vida sntoma y daos

2.6 Mtodos de Control de M. incognita

2.6.1 Control cultural

2.6.2 Control fsico

2.6.3 Control Qumico

2.7 Generalidades para la produccin de H. entomopatgenos

3.1.1 Material Biolgico

3.2.1 Obtencin de material biolgico de M. incognita

3.2.1.1 Identificacin de M. incognita

3.2.2.1 Reactivacin de cepa

3.2.2.2 Aislamiento del hongo

3.2.2.3 Cultivo monoesporico

3.2.2.4 Re-aislamiento del hongo

3.2.3 Produccin del hongo V. chlamydosporium

3.2.3.1.1 Preparacin de inoculo liquido

3.2.3.1.2 Control de calidad del inoculo

3.2.3.2.1 Preparacin de sustrato slido

3.2.3.2.2 Determinacin de humedad y Temperatura

3.2.3.2.3 Control de calidad

3.2.3.2.3.1 Concentracin de conidias

3.2.3.2.3.2 Porcentaje de germinacin o viabilidad

3.2.3.2.4 Prueba de Patogenicidad

3.2.3.2.4.1 Tratamiento de Ootecas

3.2.3.2.4.2 Tratamiento en huevos

4.1 Desarrollo del hongo en medio de cultivo liquido para conservacin de

4.2 Desarrollo de medio slido

4.3 Porcentaje de germinacin

4.4 Porcentaje de humedad

4.5 Porcentaje de parasitacin en ootecas

4.6 Porcentaje de parasitacin en huevos

Los nemtodos del gnero Meloidogyne, son considerados como los

El promedio de las prdidas a nivel mundial en hortalizas causado por

a 14.6% en pases subdesarrollados, sin

Actualmente, para el control de ste nemtodo se utilizan productos

La utilizacin de medidas de control biolgico es una alternativa para

Entre las alternativas de control microbiano, se encuentra el uso del

considerado como uno de los agentes de control biolgico ms promisorios

para el manejo de poblaciones de nemtodos formadores de agallas (Kerry y

En el Per, la utilizacin de estos bioplaguicidas es incipiente,

seleccin de cepas nativas virulentas, medios adecuados para su produccin