Examen 1

Revisin de mtodos espectroscpicos y elaboracin de curva

estndar de protena
Nombre:
Equipo:
1. Escriba con qu otros nombres se conocen las curvas estndar e indique para qu
son utilizadas.
2. Qu importancia o utilidad tiene conocer la concentracin de una protena?
Disctalo desde diversos enfoques: Industrial, Clnico, de Investigacin, etc.
3. Qu es el coeficiente de absortividad molar? Qu variables influyen en su valor?
Qu unidades presenta?
4. A continuacin, en formato FASTA, se presentan las secuencias de aminocidos
correspondientes a diversos ortlogos de las protenas ribosomales acdicas P0. El
estudio de estos factores es importante para entender la biognesis y funcin
ribosomal. De acuerdo con la frmula = (nW5690 M-1 cm-1) + (nY1280 M-1 cm-1) +
(ncystines120 M-1 cm-1), calcula el coeficiente de extincin molar () aproximado
para cada una (a pesar de que podran formarse cistinas, no las tomes en cuenta):
>RPLP0 Homo sapiens
MPREDRATWKSNYFLKIIQLLDDYPKCFIVGADNVGSKQMQQIRMSLRGKAVVLMGKNTMMRKAI
RGHLENNPALEKLLPHIRGNVGFVFTKEDLTEIRDMLLANKVPAAARAGAIAPCEVTVPAQNTGL
GPEKTSFFQALGITTKISRGTIEILSDVQLIKTGDKVGASEATLLNMLNISPFSFGLVIQQVFDN
GSIYNPEVLDITEETLHSRFLEGVRNVASVCLQIGYPTVASVPHSIINGYKRVLALSVETDYTFP
LAEKVKAFLADPSAFVAAAPVAAATTAAPAAAAAPAKVEAKEESEESDEDMGFGLFD
>RPP0 Saccharomyces cerevisiae
MGGIREKKAEYFAKLREYLEEYKSLFVVGVDNVSSQQMHEVRKELRGRAVVLMGKNTMVRRAIRG
FLSDLPDFEKLLPFVKGNVGFVFTNEPLTEIKNVIVSNRVAAPARAGAVAPEDIWVRAVNTGMEP
GKTSFFQALGVPTKIARGTIEIVSDVKVVDAGNKVGQSEASLLNLLNISPFTFGLTVVQVYDNGQ
VFPSSILDITDEELVSHFVSAVSTIASISLAIGYPTLPSVGHTLINNYKDLLAVAIAASYHYPEI
EDLVDRIENPEKYAAAAPAATSAASGDAAPAEEAAAEEEEESDDDMGFGLFD
>RPP0B Arabidopsis thaliana
MVKATKAEKKIAYDTKLCQLIDEYTQILVVAADNVGSTQLQNIRKGLRGDSVVLMGKNTMMKRSV
RIHSENTGNTAILNLLPLLQGNVGLIFTKGDLKEVSEEVAKYKVGAPARVGLVAPIDVVVQPGNT
GLDPSQTSFFQVLNIPTKINKGTVEIITPVELIKQGDKVGSSEAALLAKLGIRPFSYGLVVQSVY
DNGSVFSPEVLDLTEDQLVEKFASGISMVTSLALAVSYPTLAAAPHMFINAYKNALAIAVATEYT
FPQAEKVKEYLKDPSKFAVASVAAVSADAGGGAPAAAKVEEKEESDEEDYGGDFGLFDEE
>RpLP0 Drosophila melanogaster

MVRENKAAWKAQYFIKVVELFDEFPKCFIVGADNVGSKQMQNIRTSLRGLAVVLMGKNTMMRKAI
RGHLENNPQLEKLLPHIKGNVGFVFTKGDLAEVRDKLLESKVRAPARPGAIAPLHVIIPAQNTGL
GPEKTSFFQALSIPTKISKGTIEIINDVPILKPGDKVGASEATLLNMLNISPFSYGLIVNQVYDS
GSIFSPEILDIKPEDLRAKFQQGVANLAAVCLSVGYPTIASAPHSIANGFKNLLAIAATTEVEFK
EATTIKEYIKDPSKFAAAASASAAPAAGGATEKKEEAKKPESESEEEDDDMGFGLFD
5. Qu aminocidos permiten relacionar la absorcin de estas protenas a 280nm con
su concentracin?
6. Si su protena no presentara ninguno de los aminocidos que acaba de mencionar en
la pregunta anterior, cmo cuantificara su concentracin?
7. Qu tienen en comn los mtodos de la pregunta anterior?
8. Describa BREVEMENTE el fundamento de los mtodos de cuantificacin de
protenas de Bradford, Lowry, BCA y Biuret.
9. Qu ventajas y desventajas presentan los mtodos de cuantificacin de protenas?
Piense en costos, errores, interferencias e importancia de la muestra.
10. Qu mtodo o mtodos empleara para cuantificar a) una protena pura y b) una
mezcla compleja de protenas (extracto proteico).
11. Durante el curso estaremos empleando soluciones stock con la siguiente
nomenclatura: 5X, 6X, 10X, etc. Describa BREVEMENTE cul es el significado de
las tres expresiones anteriores ( medio punto extra).
12. Si requiere preparar una reaccin en donde emplee las soluciones 5X, 6X y 10X, de
manera individual, en un volumen final de 20 microlitros (L), cuntos L de cada
solucin agregara a su reaccin para que la concentracin final de las soluciones
anteriores sea 1X? (medio punto extra).
13. En la siguiente tabla se muestran los valores de absorbancia y cantidad de BSA (g)
para una curva estndar construida para cuantificar la concentracin de un
extracto proteico de un cultivo de 50 mL de levadura. Debido a que el valor de
absorbancia obtenido al medir la muestra original se sala de la curva, se decidi
tomar 10 L de extracto total y diluirlo con 60 L de agua milliQ.

BSA
(1.5 g/ L)
Muestra
problema
Diluida
i.

Volumen
(L)
2
4
6
8
10

Agua
(L)
798
796
794
792
790

Bradford
(L)
200
200
200
200
200

Absorbanci
a
0.11
0.161
0.205
0.236
0.264

795

200

0.227

Cantidad de
protena

Grafique Cantidad de Protena contra Absorbancia y obtenga la ecuacin de la

recta y asigne las variables correspondientes para que quede en la forma de la
ley de Lambert- Beer.

ii.
iii.
iv.
v.
vi.

Despeje la concentracin en la ecuacin anterior.

Sustituya la absorbancia de cada una de las muestras, en la ecuacin de la recta
anterior.
Calcul la concentracin de la muestra diluida
Calcule la concentracin real de la muestra ajustando el valor obtenido en el
paso anterior, empleando el factor de dilucin.
Cunta protena existe por mL de cultivo?

14. La protena SBDS se hizo reaccionar con el reactivo succinimidil ster 5

carboxifluorescena para formar un enlace covalente. Sin embargo, esta reaccn da
rendimientos bajos y slo una porcin de la fluorescena reacciona con la protena.
Los valores de absorbancia de la protena despus de la reaccin fueron los
siguientes: A280 = 0.321 y A494 = 0.102. Considera que a 494 nm slo absorbe la
fluorescena, mientras que a 280 nm tanto la protena como la fluorescena
contribuyen a la absorbancia. El coeficiente de absortividad molar de la protena
SBDS a 280 nm es de 11,460 M-1 cm-1 y el de la fluorescena es de 13,600 M-1 cm-1. A
494 nm el coeficiente de absortividad molar del reactivo de la fluorescena es de
68,000 M-1 cm-1.
a) Cul es la concentracin de la protena SBDS?
b) Cul fue el porcentaje de protena que reaccion con la fluorescena?
15. Por ltimo, cmo explicara usted los principios de cuantificacin de protenas a su
sobrinito o primito o nio de cinco aos ms cercano? (punto extra )
NOTA: El examen debe ser entregada a mano, con los clculos empleando calculadora (NO
EXCEL). Las respuestas a cada pregunta deben ser concisas y claras (cuide su redaccin).