PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO, SELECTIVOS Y

DIFERENCIALES.
OBJETIVO: reconocer los diferentes medios de cultivo existentes para
el crecimiento de microorganismos.
Como todos los organismos vivos, los microorganismos requieren ciertos
nutrientes bsicos y factores fsicos para el mantenimiento de su vida,
estas necesidades varan segn el tipo de microorganismo y es
necesario conocerlas para cultivarlos en el laboratorio.
Las necesidades nutricionales bsicas pueden suministrarse en el
laboratorio, mediante el uso de medios de cultivo artificiales, los cuales
se encuentran disponibles en una gran variedad y los cuales en general
aportan a los microorganismos:
1.- Una fuente de carbono: El carbono es el componente esencial y
central para formar la estructura celular y permitir a la clula realizar
todas sus funciones. Segn la fuente de carbono los microorganismos se
encuentran en dos grupos: Auttrofos y Hetertrofos. Los organismos
auttrofos pueden cultivarse en medios que contengan nicamente
compuestos inorgnicos (utilizan principalmente dixido de carbono
como carbono inorgnico). Los organismos hetertrofos en su lugar
necesitan un suministro de carbono orgnico (por ejemplo glucosa u
otro carbohidrato).
2.- Una fuente de nitrgeno: Elemento esencial para que la clula
construya macromolculas como: protenas y cidos nucleicos. Algunos
microorganismos usan nitrgeno atmosfrico, otros emplean sales de
nitrato o de amonio como compuestos inorgnicos, as como, otros
requieren compuestos orgnicos que contengan nitrgeno como los
aminocidos.
3.- Elementos no metlicos. Iones no metlicos como el azufre y el
fsforo. El azufre puede encontrase en protenas, sulfatos o como azufre
elemental; mientras que el fosforo puede encontrarse formando sales.
4.- Elementos metlicos (Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, Fe+2 y Fe+3 ).
Llamados tambin micronutrientes, oligoelementos o elementos traza.

Encontrados en sales inorgnicas adicionadas a los medios y los cuales

son tomados en bajas concentraciones por los microorganismos.
5.- Vitaminas: Los microorganismos pueden tomarlas del medio ya
elaboradas o iniciar procesos de sntesis de las mismas. Algunos
microorganismos poseen una variedad de vas para sintetizar vitaminas;
mientras otros, sintetizan un nmero muy limitado de ellas a partir de
componentes del medio. Otros las requieren como suministro.
6.- Agua.
7.- Energa: Existen dos tipos bioenergticos de microorganismos, los
fototrofos y los quimiotrofos. Los fottrofos emplean la energa radiante
(luz solar), como nica fuente de energa: y los quimitros que,
obtienen la energa por oxidacin de compuestos qumicos orgnicos o
inorgnicos.
Las necesidades fsicas involucran factores como: Temperatura, pH y
gases, los cuales se encuentran en un rango ptimo especfico para cada
microorganismo; por lo tanto, su variacin puede acelerar o disminuir el
crecimiento.
El profesional que desarrolla trabajos con microorganismos o con un
microorganismo en particular, debe satisfacer sus necesidades
nutricionales, con el objetivo de recuperarlo y hacerlo crecer
adecuadamente. De manera general , estos medios pueden ser medios
artificiales o medios qumicamente definidos. Para los qumicamente
definidos se conocen las cantidades exactas de compuestos qumicos
puros que los conforman ya sean de tipo orgnico como inorgnico. Los
medios artificiales estn compuestos de un nmero limitado de
sustancias complejas, como extractos de plantas o de animales cuya
composicin qumica exacta no se conoce. De acuerdo a lo anterior, los
microorganismos en general pueden tomar los requerimientos
nutricionales de los medios de cultivo, ya sean sustancias naturales o
artificiales para multiplicarse.
MEDIOS DE CULTIVO Y CLASIFICACIN.
El conocimiento de la nutricin microbiana permite el cultivo de los
microorganismos en el laboratorio. Un medio de cultivo es una solucin
acuosa (bien como tal o , bien incorporada a un coloide en estado de

gel), en las que estn presentes todas las sustancias necesarias para el
crecimiento de un(os) determinado(s) microorganismo(s)
Propiedades de los medios de cultivo.
Humedad: Indispensable para el crecimiento de microorganismos, su
carencia (desecacin) puede llevar a la muerte del microorganismo.
Fertilidad: Se refieren a los elementos o compuestos bsicos que
permiten el crecimiento bacteriano.
pH: Se refiere a los pH ptimos para el desarrollo bacteriano,
indispensable para su aislamiento; variaciones acidas o alcalinas,
pueden inhibir su crecimiento.
Transparencia:
morfolgica y
adecuados.

Permite la observacin bacteriolgica, evidenciar

fsicamente su crecimiento en medios de cultivo

La presentacin comercial de los medios sintticos y deshidratados

puede ser en polvo o granulados. En el mercado se pueden encontrar
medios listos para fundir o medios servidos en placas o tubos.
Los medios de cultivo granulados, son medios de cultivo elaborados a
partir de materias primas sometidas a molienda, mezclado,
pulverizacin y granulacin (aglutinacin de la mezcla pulverulenta).
Este tipo de medios tienen algunas ventajas frente a los medios
tradicionales en polvo

Clasificacin de los medios de cultivo de acuerdo a su estado fsico,

composicin y su propsito.

MATERIAL POR EQUIPO:

- 1 mechero.
- 1 matraz de 500 mL.
- 1 balanza.
- 1 esptula.
- 1 probeta de 250 mL.
- 14 cajas de Petri estriles.
- Mas King tape.
- Papel aluminio.
- Plumn indeleble.

EQUIPO
- Autoclave.

PROCEDIMIENTO:
1. Pesar cantidad necesaria para preparar 250 mL de medio y ponerlos
en el matraz.
2. Con la probeta, medir 250 mL de agua destilada y aadirla al matraz
con el polvo.
3. Poner el matraz sobre el mechero agitndolo para que
homogneamente.

se mezcle

4. Cuando la solucin est homognea, retirarla del mechero, dejar

enfriar y agregar sangre desfribilada al 5% derramndola sobre las
paredes del matraz y agitar hasta obtener una mezcla homognea,
tapar con algodn y con un pedazo de aluminio.
5. La autoclave estar prendida previamente e introduciremos el matraz
en el interior de la autoclave para su esterilizacin.
6. Vaciar el medio en las cajas de Petri estriles siguiendo la tcnica
asptica. Las cajas no pueden ser destapadas a menos que sea entre los

mecheros. Las tapas no se tocan por dentro con los dedos, ni se sacan
del rea de esterilidad.
7. Ya slidas, se cierran adecuadamente y se etiquetan con el tipo de
medio, equipo, grupo y fecha de elaboracin. Guardar en el refrigerador
para utilizar en la siembra por estras.

8. Anteriormente ya se haba tomado la muestra y puesta en el caldo

nutritivo incubndola en la estufa.
9.- Se realizo la siembra por el mtodo de estras:
Mediante esta tcnica buscamos obtener colonias separadas a partir del
inoculo. Se toma la caja petri en la palma de la mano y ligeramente
inclinada; con la
mano contraria, se manipula el asa de argolla
previamente esterilizada por flameado directo ala llama y con ella se
recoge el material de cultivo, para colocarlo en un rea perifrica de la
caja haciendo movimientos circulares para homogenizar el inoculo. El
asa debe ser nuevamente flameada y enfriada en un lateral del agar
(procurando no daarlo). A continuacin se realiza una estra partiendo
de la primera y arrastrando los microorganismos presentes en ella hacia
el extremo contrario de la superficie del agar. S e debe procurar que en
cada seccin de la caja, las estras queden trazadas con mayor
separacin. Finalmente se esteriliza el asa antes de descartarla.

10; Se identifico su tipo de morfologa bacteriana de nuestras cajas

petri.

MORFOLOGIA BACTERIANA
Las bacterias en condiciones normales se desarrollan con formas
definidas, las cuales son proporcionadas por la rigidez de la pared
celular; Estas formas son esfricas, ovaladas, en forma de bastn o
como espirales. De acuerdo, a lo anterior, es importante realizar una
correcta observacin de estas caractersticas, dado que, dicha forma se
convierte en uno de los principales marcadores para la identificacin
inicial de gneros, bacterianos, es importante destacar que cada gnero
posee unas caractersticas particulares que permiten diferenciarlo de
otros, esto teniendo en cuenta, la caracterizacin de un aislamiento
debe incluir otro tipo de marcadores, para pode concluir al respecto de
un genero y una especie.
La morfologa de los microorganismos puede ser observada a partir de
preparados frescos y fijos, y teidos por algunos de los mtodos te
tincin conocidas, ya que por su estructura es difcil de visualizar en su
estado natural.
En algunas ocasiones, es necesario fijar los microorganismos y durante
este proceso se produce la muerte celular debido a la coagulacin del
protoplasma, preservndose la morfologa celular adems de adherirlos
a la lmina.

CONSIDERACIONES GENERALES EN LA MORFOLOGIA DE LAS

BACTERIAS
FORMA.
ASPECTO.
COLOR.
BORDES.
TAMAO.
CONSISTENCIA.
CARACTERISTICAS A LA LUZ TRNSMITIDA.
CARACTERISTICAS A LA LUZ REFLEJADA.
Cuando los microorganismos crecen sobre medios de cultivo exhiben
diferencias en la apariencia macroscpica de su crecimiento, estas

diferencias llamadas caractersticas culturales, son la base para la

separacin de ellas en grupos taxonmicos. Las caractersticas culturales
son determinadas por el cultivo de los microorganismos en agar
nutritivo inclinado, en placas de petri, en caldo nutritivo y gelatina
nutriente.

11. Se realizo la tincin de gram.

TINCION DE GRAM
MATERIALES
1 mechero
1 asa de siembra
5 Portaobjetos
Piceta con agua destilada
Microscopio compuesto de campo claro
Cristal violeta.
Alcohol cetona.
Lugol.
Safranina.
Aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO
El profesor proporcionar a los alumnos cultivos lquidos y slidos de:
Escherichia coli, Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Bacillus subtilis,
Klebsiella sp. Y Pseudomonas fluorescens. El estudiante preparara frotis
de cada cepa obtenida de cultivo solid y otros de cultivo lquido, los
cuales se fijarn y teirn con azul de metileno.
El profesor explicar los principios de manejo del microscopio y la forma
de ajustar la iluminacin.
PREPARACIN DE FROTIS

1. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel.

2. Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta
que se ponga al rojo vivo.
3. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los
microorganismos sean destruidos. Despus acercar al mechero el cultivo
de bacterias.
Introducir el asa en la caja petri de cultivo y tomar cuidadosamente la
muestra.
4. Para el caso de cultivos lquidos, colocar la muestra en el centro del
portaobjetos, extenderla suavemente en un rea circular de 2 cm de
dimetro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar
el frotis al aire y repetir los procedimientos 3 y 4 por 2-3 veces ms.
5. Si el cultivo es de medio slido, previamente se colocar en el centro
del portaobjetos una gota de agua destilada en la que se mezcla una
pequea muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del
paso 3.
FIJACIN DEL FROTIS
1.-Los frotis de cultivos slidos, completamente secos se fijarn con
calor. Para esto se pasara el frotis rpidamente 2-3 veces en el interior
de la parte amarilla de la flama del mechero.
3. Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano
izquierda para enfriar y comprobar que no hubo sobrecalentamiento.

TINCIN SIMPLE
1. Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 30 segundos a 1
minuto.
2. Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o
con la ayuda de la piceta con agua destilada.
3.- Cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 seg. a un 1min.

4.- Eliminar el exceso lavado suave al agua corriente o con la ayuda de

la piceta con agua destilada.
5.-Con el portaobjetos inclinado agregar a gotas el decolorante alcoholcetona hasta que no fluya color.
6.- Eliminar el exceso lavado suave al agua corriente o con la ayuda de
la piceta con agua destilada.
7.-Aplicar 2 gotas de safranina por 30seg.
8.- Eliminar el exceso lavado suave al agua corriente o con la ayuda de
la piceta con agua destilada.

OBSERVACIN AL MICROSCOPIO
1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con
papel seda.
2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observacin,
siguiendo las indicaciones del profesor.
3. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la
preparacin con el objetivo de 10x, colocar previamente una pequea
gota de aceite de inmersin sobre la preparacin.
4. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con
papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que
daan estos sistemas.

Medio de cultivo
S110

Forma
Cocos

V.B.
A.S.
M.C.
E.M.B.
S.S.

Cocos
Cocos
Cocos
Cocos
Cadena de cocos

(Gram +)
Staphylococus
hepidermis
(Gram -)
(Gram +)
(Gram -)
(Gram + y -)
(Gram -)

-PRUEBA DE CATALASA
Fundamento: Detecta la presencia de la enzima catalasa.

-TSI
Fundamento: Detecta la presencia de la enzima catalasa.

-SIM
Fundamento: Detecta la presencia de la enzima catalasa.

Prueba del Citrato

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar
citrato como nica fuente de carbono y compuestos amoniacales como
nica fuente de nitrgeno en su metabolismo, provocando una
alcalinizacin del medio. Entre las enterobacterias estas caractersticas
se dan en los siguientes gneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia,
Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia,
Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de
crecer con esos nutrientes.
Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio
contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y
de nitrgeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de
pH. Slo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrn
multiplicarse en este medio y liberarn iones amonio lo que, junto con la
eliminacin del citrato (cido), generar una fuerte basificacin del
medio que ser aparente por un cambio de color del indicador de pH, de
verde a azul.

Mtodo de kliger

Permite un diagnstico rpido orientativo del tipo de entero bacteria

aislado. Las enterobacterias mas patgenas no suelen fermentar
(producir cidos de) la lactosa. Se detecta la produccin de cidos
(acompaada o no del desprendimiento de gases) de glucosa o lactosa y
produccin de SH2.
Se seleccionaron 2 colonias de los medios EMB(bacilos Gram - ) y
110( cocos Gram +)

RESULTADOS
MIO

SIMMON
TSI

SIM

COL 1
Produccion
de
gas
positiva
Ornitina
descarboxilasa
positiva,
movilidad
negativa,
indol
negativo.
Positiva
Acido/acido
Produccin
de
gas
positiva.
Produccin de acido
sulfidhrico negativo
Catalaza positiva
Alcalino/acido.
Produccin
de
gas
positiva.
Produccin de acido
sulfhdrico negativo.
Catalaza negativa.
Movimiento negativo.
Acido sulfhdrico.
Indol negativo.

COL 2
Produccin
de
gas
positiva,
ornitina
descarbolxilasa
positiva,
movilidad
negativa,
indol
negativo.
Positiva
Acido/acido
Produccin
de
gas
positiva.
Produccin de
acido
sulfhdrico negativo.
Calataza positiva.
Acido/alcalino.
Produccin
de
gas
negativa.
Produccin de acido
sulfhdrico negativo.
Catalaza positiva.
Movimiento negativo.
Acido
sulfhdrico
negativo.
Indol negativo.

Conclusin: de acuerdo a la tabla de la gua clnica las posibles nombres

de bacterias serian:
Klebsiella spp.
Enterobacter spp.
Salmonella spp.

UNIVERSIDAD POLITECNICA DE GUANAJUATO

MICROBIOLOGIA

*JUAN PEDRO MEZA ROQUE.

*MISAEL ANTONIO JUAREZ AGUILERA.

*HECTOR IVAN HERNANDEZ FLORES.

PROF: ELIZABETH PEREZ MORA.

PRACTICA: MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES.