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GUIA DE PRCTICAS LABORATORIO DE

MICROBIOLOGA GENERAL

ROGER VALLE
JORGE ARBOLEDA
ANTONIO INSIGNARES
ROBERTO JOS GARCIA-ALZATE

Universidad del Atlntico


Facultad de Ciencias Bsicas
Programa de Biologa
Barranquilla, 2016

PROGRAMA DE BIOLOGA
CURSO: Microbiologa General
CDIGO: 20404-20407
PGINA: 2 de 52

GUIA DE LABORATORIO MICROBIOLOGA

CONTENIDO

Pgina
INTRODUCCIN

NORMAS DE CONDUCTA EN EL LABORATORIO

PRECAUCIONES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO

EVALUACION

PLAN DE TRABAJO

LISTA DE MATERIALES (POR GRUPO)

LABORATORIO No. 1
DISTRIBUCION Y UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS

LABORATORIO No. 2
TCNICAS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

LABORATORIO No. 3
TCNICAS DE COLORACIN BACTERIANA (TENCIN SIMPLE)

LABORATORIO No. 4

9
9

12
12

21
21

28

TCNICAS DE COLORACIN BACTERIANA (TENCIN DIFERENCIAL)

28

LABORATORIO No. 5- 7

32

METABOLISMO BACTERIANO

32

LABORATORIO No.8-9
METODO PARA EL RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS VIABLES EN UNA MUESTRA

LABORATORIO No.9.
ESTIMACIN DEL NMERO DE BACTERIAS POR MTODOS INDIRECTOS (TURDIMETRA)

38
38

42
42

LABORATORIO No.10

45

SENBILIDAD BACTERIANA

45

LABORATORIO No.11

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HONGOS

LABORATORIO No.12.
ALGUNOS PARASITOS DE IMPORTANCIA HUMANA

LABORATORIO No.13.
VIRUS

47

49
49

Error! Marcador no definido.


Error! Marcador no definido.

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NORMAS GENERALES DE CONDUCTA EN EL LABORATORIO

INTRODUCCIN
Estas prcticas proponen introducir al estudiante en el conocimiento de las
principales tcnicas y procedimientos utilizados en Microbiologa experimental, lo
cual complementado con los conocimientos tericos, le servir de herramienta
para continuar estudios avanzados, para Ia deteccin de problemas y el
planteamiento de soluciones a stos. Las prcticas se harn de forma secuencial
buscando interrelacin y coherencia con los conceptos tericos del curso de
Microbiologa, sin que esto, se constituya en una camisa de fuerza para el
desarrollo del mismo.

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NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO


Aunque las normas de conducta varan de un laboratorio a otro, en el laboratorio
de Microbiologa es fundamental que se tengan en cuenta y se cumplan ya que se
trabaja con microorganismos y material estril. El cumplimiento de stas,
garantizarn Ia seguridad de todos y Ia confiabilidad de los resultados obtenidos.
1. Debe llegar puntualmente a las sesiones de Laboratorio
2. No se debe comer, fumar, ni beber en el laboratorio.
3. Evite llevar objetos no estriles a Ia cara, boca y ojos.
4. Use bata o blusa de laboratorio limpia.
5. Nunca retire los cultivos de microorganismos del Iugar de trabajo.
6. Si quiebra una preparacin en fresco con uno de los objetivos del
microscopio, no Ia limpie con Ia mano o pauelo; sino que debe informar al
profesor.
7. Flamee el asa antes y despus de usarla.
8. Cuando tenga el asa bacteriolgica cargada con algn cultivo de
microorganismos, no se desplace de cada parte a otra, pues puede crear
aerosoles. Trabaje solo en su puesto.
9. Marque cuidadosamente todos los cultivos y las preparaciones que de ellos
se hacen. lncube en el lugar asignado por el profesor o monitor
10. AI terminar el laboratorio, limpie Ia superficie de Ia mesa de trabajo descarte
cultivos y el material que no necesite. Deje todo el material de trabajo en su
respectivo puesto.
11. Lave sus manos con agua y jabn al terminar su trabajo.
PRECAUCIONES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO
Tenga en cuenta que el microscopio que se le entrega por grupo al iniciar el
semestre ser una herramienta valiosa para su trabajo en el laboratorio, por ser un
instrumento delicado, de precisin y costoso, es importante que tenga presente las
recomendaciones para su conservacin y buen uso.
1. Evite tocar con los dedos las lentes del microscopio.
1. No olvide retirar el aceite de inmersin del objetivo de alto poder 100X al
finalizar Ia prctica. Utilice siempre el material adecuado para ello.
2. No deje placas montadas en el microscopio.
3. Prenda Ia lmpara nicamente al momento de iniciar sus observaciones.

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4. Cuando no lo est usando, baje Ia intensidad de Ia lmpara (no Ia apague).
5. No retire ni afloje los lentes del microscopio.
6. AI iniciar su trabajo en el laboratorio, revise el equipo y el material a utilizar,
si observa alguna anormalidad, informe al profesor, auxiliar o al monitor.

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EVALUACION
La evaluacin del laboratorio se har con base en Ia realizacin de pruebas cortas
(quices), presentaciones y notas de seguimiento, las cuales sern definidas al
iniciar cada semestre, teniendo en cuenta las normas acadmicas vigentes.
CONTENIDO DE LAS NOTAS DE SEGUIMIENTOS O INFORME DE LABORATORIO

Cada informe deber ser entregado semanalmente y ser realizado de forma


grupal o individual, segn como lo defina el docente. El informe debe contener las
siguientes partes, segn las normas del ICONTEC:
Resumen: Debe contener la informacin necesaria para darle al lector una idea
precisa de la actividad realizada, la metodologa, los resultados obtenidos y las
conclusiones (Mximo 250 caracteres).
Introduccin: Debe responder al porqu y para qu se realiz esta actividad.
Debe contener el contexto terico en el cual se ubica el tema, por ello requiere de
una revisin bibliogrfica previa sobre la temtica a tratar (Mximo 250 palabra).
Objetivos: Debe responder al que de la prctica realizada. Se recomienda
formular un solo objetivo general, coherente con el laboratorio llevado a cabo, y los
objetivos especficos necesarios para lograr el objetivo general.
Metodologa: Describe en forma organizada y precisa, el cmo se alcanz cada
uno de los objetivos propuestos. Deben detallarse los materiales y equipos
utilizados durante la prctica, as como los procedimientos realizados, tcnicas,
actividades y dems estrategias metodolgicas que se requirieron (Mximo 250
palabra).
Resultados: Se detallan los logros obtenidos con los procedimientos realizados.
Se puede recurrir a esquemas, tablas, grficos o dibujos para demostrar el
conocimiento adquirido.
Conclusiones: Permiten evidenciar, de modo concreto, claro y preciso el logro de
los objetivos sealados, y debe estar apoyadas y relacionadas con el
conocimiento terico.
Bibliografa: Anotar las tres referencias principales en los cuales se apoy.

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PLAN DE TRABAJO
1. AI iniciar cada practica se har una discusin sobre el laboratorio anterior.
Usted debe traer los resultados obtenidos durante Ia lectura para ser
discutidos y complementados con los de sus compaeros.
2. Llegue siempre al laboratorio con un conocimiento completo de Ia prctica
que va a realizar. Esto le ahorra tiempo, le permite obtener mejores
resultados y una mayor comprensin.
3. Las tcnicas de laboratorio correspondientes a Ia prctica que se va a
realizar, sern explicadas y demostradas por su profesor.
4. Traiga siempre a cada prctica su libreta de anotaciones y el material
solicitado. Anote cuidadosamente todos los resultados obtenidos.
LISTA DE MATERIALES (POR GRUPO)
Cada grupo de trabajo estar conformado por 3-4 estudiantes, los cuales
realizarn durante todo el semestre las prcticas de laboratorio. Cada grupo debe
tener los siguientes materiales:
1. Bata de laboratorio (cada estudiantes)
2. Un Marcador (Sharpie)
3. Un encendedor
4. Una botella de jabn lquido
5. Dos rollos de cinta de enmascarar (1 cm y 2 cm)
6. Un paquete de papel de arroz
7. Un tapa bocas y gorro

Adems de los implementos que debe tener cada grupo de trabajo, el curso debe
entregar los siguientes materiales al monitor asignado:
1. Una botella de alcohol antisptico
2. Una bolsa de detergente en polvo (2, 5 kg)
3. Un par de guantes para lavado
4. Dos rollos de papel absorbente (papel toalla)
5. Una bolsa de algodn (para torundas)
6. Dos rollos de papel aluminio (3 metros)
7. Tres caja de portaobjetos (50 lminas)
8. Una caja de cubreobjetos

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LABORATORIO No. 1
DISTRIBUCION Y UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS
INTRODUCCIN
Los microorganismos se encuentran en muchos ambientes naturales. Pueden estar
localizados en suelo, agua, aire, alimentos, tracto intestinal, piel y otros rganos de
animales, el hombre y otros seres vivos. Solo unos pocos lugares en Ia naturaleza como
crteres de volcanes activos y tejidos sanos de rganos internos del hombre y animales
estn libres de ellos.
Su amplia distribucin puede ser demostrada exponiendo medios estriles al contacto con
el medio ambiente y diferentes superficies.
En nuestro medio se encuentra una gran variedad de microrganismos suspendidos en el
aire o sobre superficies, por lo cual, en el laboratorio se deben tomar las precauciones
necesarias para evitar Ia contaminacin de medios de cultivo, soluciones y equipos a
utilizar.
OBJETIVOS
1. Conocer algunas de las tcnicas utilizadas para demostrar Ia existencia de
microorganismos en un ambiente determinado.
2. Distinguir las diferentes formas de crecimiento de estos microorganismos en los
medios de cultivo.
MATERIALES
1. Cajas de Petri con agar nutritivo
2. Escobilln de algodn estril
3. lncubadora
PROCEDIMIENTO
Muestras de Ia poblacin bacteriana ambiental: Coloque una caja de Petri
sobre cualquier Iugar del laboratorio, destpela y djela expuesta al medio
ambiente durante 15 minutes. Despus de este periodo tpela y mrquela
adecuadamente. lncube dejando Ia caja invertida a 37 C de 24 a 48 horas.

Bacterias en Ia superficie de Ia mesa de trabajo: Tome un escobilln y frtelo


sobre Ia superficie de Ia mesa de trabajo, levante Ia tapa de Ia caja de Petri y
aplique el escobilln sobre un extremo de Ia superficie de agar, hacienda luego
estras con el asa estril segn figura No. 1 (No rompa el agar). Tape Ia caja,

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invirtala y mrquela adecuadamente, incube a 37C por un tiempo de 24 a 48
horas.

Microorganismos de mucosas y de piel: Con un escobilln estril frtelo sobre


cualquier parte de Ia superficie del cuerpo o insrteselo en Ia nariz o carrillo de la
boca y frote suavemente Ia mucosa de Ia misma. Puede ser tambin un cabello,
aliento, huella digital, etc. inocule una caja de agar nutritivo como lo hizo en el
caso anterior. Tape Ia caja, invirtala adecuadamente, incube a 37 C por un
tiempo de 24 a 48 horas.

RESULTADOS
Despus del perodo de incubacin, observe cada una de las cajas inoculadas. Note las
diferencias entre las colonias de acuerdo a las siguientes caractersticas:
1. Color
2. Forma
3. Tamao
4. Cantidad de crecimiento (escaso, moderado, abundante)
Registre estos datos en el cuaderno de notas o en el formato de preinforme que ser
documentado con fotos o dibujos de los resultados obtenidos.

Figura 1. Manera de inocular una caja de Petri con Agar Nutritivo

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CONSULTAR SOBRE
Distintos tipos de medios de cultivo.
Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo.
Mtodos de esterilizacin

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LABORATORIO No. 2
TCNICAS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS
INTRODUCCIN
En Ia naturaleza, las bacterias hacen parte de los diferentes ecosistemas. Como los
dems seres vivos, para su crecimiento necesitan nutrientes apropiados y condiciones
ambientales optimas, tales como pH, presin osmtica, oxgeno, temperatura y humedad
entre otros.
Para el cultivo, aislamiento, identificacin y determinacin de las actividades metablicas
de las bacterias en el laboratorio se utilizan medios adecuados, los cuales segn su
consistencia pueden ser slidos, semi-slidos y lquidos; esta consistencia se obtiene por
Ia adicin de un polisacrido denominado agar-agar extrado de algas marinas del genero
Gellidium, su concentracin en el medio slido es de 1,5% a 2%, en el semi-solido de
0,5% y los medios lquidos son sin agar.
Los medios simples se preparan con agua, extracto de carne, peptona, extracto de
levadura, sales inorgnicas y carbohidratos. A algunos medios se les adicionan
sustancias como: Lquido asctico, vitaminas, antibiticos, colorantes, sales biliares,
sangre y suero o glicerina, obtenindose de esta forma, medios enriquecidos, de
enriquecimiento, diferenciales, selectivos y de transporte
En el aislamiento de bacterias se utilizan varias tcnicas, una de las cuales es la siembra
por estras en superficie que busca agotar Ia muestra sobre Ia superficie del medio para
obtener colonias separadas y poder observar sus caractersticas
Es importante tener en cuenta que la inoculacin de los microorganismos en los medios
de cultivo, siempre deber realizarse en condiciones aspticas (cerca del mechero o en
campana de flujo laminar), que limitan la presencia de microorganismos contaminantes.
OBJETIVOS
1. Conocer los mtodos ms utilizados para el aislamiento y cultivo de bacterias a
partir de diferentes muestras.
2. Conocer Ia composicin y el uso de los diferentes medios de cultivo utilizados en
el laboratorio.
3. Diferenciar las caractersticas de crecimiento de las bacterias, segn el medio de
cultivo utilizado.

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MATERIALES Y REACTIVOS

1 caja de Petri con agar nutritivo (por grupo de trabajo)


1 caja de Petri estril vaca
20 mL de agar nutritivo fundido y temperado a 45C
1 tubo con agua destilada estril
1 tubo con caldo nutritivo
1 tubo con agar nutritivo en plano inclinado
1 asa de inoculacin
1 aguja de inoculacin
1 Mechero de alcohol
1 encendedor
Cinta de rotular
Marcador (Sharpie)
Cepa Gram positivas (Staphylococcus aureus) suministrada por el profesor
Cepa Gram negativa (Escherichia coli) suministrada por el profesor

PROCEDIMIENTO

Cultivo en cajas de agar: siembra por estras cruzadas en la superficie para


obtener colonias separadas. Proceda de la siguiente manera:
a. En la parte posterior externa de la caja y con la ayuda del marcador realice
una divisin en cuatro cuadrantes. Tome una muestra con el asa
previamente flameada y fra, inocule la muestra haciendo 4-5 estras
simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja y
cierre la caja.
b. Flamee el asa de inoculacin y gire la caja en un cuarto. Abra nuevamente
la caja y enfri el asa tocando la superficie del medio lejos de la zona de
estras recin hechas.
c. Roce con el asa una vez la superficie del primer cuadrante y haga un
segundo grupo de estras en el segundo cuadrante.
d. Repita el procedimiento b y c en el tercer cuadrante y efectu la siembra en
el ltimo cuadrante sin flamear el asa y haciendo estras ms abiertas.
e. Incube las cajas de Petri a 37C durante 24 a 48 horas, colocndolas en
forma invertida para evitar que el agua de condensacin caiga sobre el
cultivo.

Cultivo en tubos con caldo nutritivo: siembre un cultivo puro de la cepa


asignada por el profesor de la siguiente manera:
a. Tome el tubo que contiene el cultivo puro, retire la tapa del tubo y flamee la
boca del tubo.

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b. Introduzca el asa en el tubo sin tocar las paredes y tome un poco del
cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo, tpelo y djelo en una gradilla.
c. Tome el tubo de caldo nutritivo estril en el cual va a colocar la muestra,
destpelo, flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el asa
con la muestra obtenida. Realice movimientos de rotacin con el asa para
emulsionar con el caldo las paredes del tubo. Retire el asa, flamee la boca
del tubo y tape.
d. Esterilice el asa en el mechero despus de usarla.
e. Incube los tubos a 37C por 24 horas. Observar el crecimiento obtenido

Cultivo en tubos con agar inclinado:


Procede de la misma forma que en la siembra anterior pero con la aguja de
inoculacin realice una puncin y estre en el plano inclinado.

RESULTADOS
Despus del perodo de incubacin, observe cada una de las cajas y tubos inoculados.
Recopilar la informacin de la caracterizacin colonial de cada cepa. De acuerdo a sus
observaciones identifique las especies presentes en la muestra problema.
Morfologa colonial de Cultivos Bacterianos
E. coli
Aislamiento por estra
cruzada
Forma
Color:
Tamao (mm):
Borde:
Superficie:
Aspecto:
Elevacin:
Consistencia

S. aureus

muestra
problema

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Descripcin morfolgica de cultivos puros en tubos de cultivo


muestra problema
E. coli
S. aureus
Tubos inclinados de agar
nutritivo
Crecimiento
cultivo en Tubos con caldo
Crecimiento:
color:

Figura 2. Mtodo para inocular las cajas de Agar

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Figura 3. Mtodo para inocular tubos con agar inclinado

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Figura 4. Descripcin de las colonias en cajas con Agar

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Figura 5. Diferentes tipos de crecimiento en agar inclinado

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Figura 6. Formas de crecimiento en la superficie de un medio lquido

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CONSULTAR SOBRE

Qu es el agar y de donde se obtiene?


Por qu el agar nutritivo es un medio general para el cultivo de bacterias?
Cules son las ventajas de un cultivo puro?
Por qu razn no debes compartir el mechero de Bunsen?
Cul es la razn para flamear los tubos antes y despus de cada transferencia?
Explica por qu debes evitar que el asa llena de inculo toque la boca del tubo
fuente o del tubo a ser inoculado.
Cuando tomas un inculo de una caja de Petri. Por qu es necesario tocar una
parte estril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano?
Por qu el asa debe ser flameada antes y despus de todos los procedimientos
de siembra?
Por qu las cajas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubacin?

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LABORATORIO No. 3
TCNICAS DE COLORACIN BACTERIANA (TENCIN SIMPLE)
INTRODUCCIN
La observacin microscpica de las bacterias nos permite diferenciar tres de las formas
ms tpicas que son: cocos, bacilos y espirales entre otras. Los cocos son clulas
esfricas que se pueden agrupar en parejas (Diplococos), racimos (Estafilococos),
cadenas (Estreptococos), de a cuatro (Ttradas) en cubos (Sarcinas). Estas formas de
agrupacin estn determinadas genticamente.
Los bacilos son clulas en forma de bastn o varilla que pueden presentarse
individualmente o agrupadas al asar, formando cadenas, empalizadas o estacas.
Las espirales son clulas que presentan forma helicoidal y generalmente no se agrupan.
Las anteriores formas bacterianas se pueden observar per medio de los siguientes
mtodos:
a. Preparaciones no coloreadas: Con este mtodo se observan las bacterias vivas,
lo cual hace que podamos detectar con facilidad Ia movilidad en las que Ia poseen
y su forma.
b. Preparaciones coloreadas: Como las bacterias son incoloras y tienen el mismo
ndice de refraccin del agua, es necesario utilizar colorantes para poderlas
visualizar mejor. Los mtodos para observar bacterias, proporcionan las siguientes
ventajas:

Un contraste entre Ia bacteria y el medio que Ia rodea, permitiendo diferenciar los


tipos morfolgicos bacterianos.
Una visualizacin de las estructuras internas y externas tales como: endosporo,
equivalente nuclear, grnulos citoplasmticos, pared celular, capsula y flagelo.

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Los colorantes ms utilizados para Ia observacin de bacterias son compuestos orgnicos


los cuales presentan unas caractersticas moleculares que permiten realizar diferentes
tcnicas de coloracin. Qumicamente, un colorante puede ser definido como un
compuesto orgnico que contiene un anillo bencnico unido a un grupo cromforo y un
grupo auxcromo (Figura 7).

Figura 7. Composicin qumica de un colorante o tinte.


La capacidad de un colorante de unirse a un componente celular como las protenas o los
cidos nuclecos depende de la carga inica del cromgeno as como, de la carga de la
sustancia a ser teida.
La carga del ion coloreado, puede ser un Anin o un Catin, segn el caso, los colorantes
se denominan:
Colorante cido: Son aquellos en los que el cromgeno al ser ionizado toma una carga
negativa presentando una fuerte afinidad por constituyentes celulares con carga positiva.
Ejemplo: Anin coloreado EO- y catin incoloro Na+: Eosinato de Sodio (EO- Na+)
Colorante Bsico: Son aquellos en los que el cromgeno al ser ionizado toma una carga
positiva presentando una fuerte afinidad por constituyentes celulares con carga negativa
Ejemplo: Cation coloreado AM+ y anin incoloro Cl-: Clorhidrato de Azul de Metileno (ClAM+)
En la actualidad son muchas las tcnicas de tincin que se encuentran disponibles para
visualizacin, diferenciacin y separacin de microorganismos en trminos de sus

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caractersticas morfolgicas y estructuras celulares. Un resumen de los procedimientos
ms usados para estos propsitos se encuentra en la figura 8.

Figura 8. Tipos de colorantes o tintes.


Para la aplicacin de cualquier tcnica de tincin se requiere de la preparacin previa de
un frotis. Esta preparacin no es difcil pero requiere de mucho cuidado por lo que se
recomienda seguir meticulosamente las siguientes reglas.
1

Limpieza del portaobjeto: La limpieza de los portaobjetos es esencial para la


preparacin del frotis y las grasas o aceites de los dedos que pueden estar sobre
la lmina o portaobjeto deben ser removidos lavndolos con agua y jabn o
detergente y enjuagndolas con alcohol al 95%. Luego de ser lavados, colquelos
sobre un papel toalla hasta que est listo apara usarlos.
Preparacin del Frotis: un frotis denso es absolutamente esencial. Un buen frotis
es aquel en el que al secarse aparece sobre la lmina una fina capa o pelcula.
Los frotis se pueden realizar de un caldo de cultivo o un agar de la siguiente
manera:
a. Caldos: Con la ayuda de una asa de aro estril, tomar una o dos veces
suspensin de bacterias, las cuales se deben colocar directamente sobre la lmina

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o portaobjetos y esparcir la muestra con movimientos circulares en un rea de
aproximadamente un centmetro de dimetro.
b. Agares: Colocar sobre la lmina una gota de solucin salina al 0,85% y con la
ayuda de un asa de inoculacin estril (de aguja) tocar suavemente la colonia de
donde desea tomar la muestra teniendo cuidado de no tomar un exceso de clulas
ni medio de cultivo. Posteriormente homogenizar las clulas con la gota de
solucin salina y con movimientos circulares realizar un esparcido de
aproximadamente un centmetro de dimetro. Dejar secar completamente el frotis
teniendo precaucin de No frotarlo ni sacudirlo en el aire.
3

Fijacin al calor: Para evitar que los microorganismos sean barridos o prdida de la
muestra durante los procesos de lavado durante la tincin, la muestra debe fijarse o
adherirse a la lmina mediante calor, que hace que las protenas se coagulen. La
fijacin se obtiene pasando rpidamente dos a tres veces el frotis sobre la llama del
mechero.

OBJETIVOS
1 Conocer algunos de los mtodos de observacin de las bacterias.
2 Diferenciar las formas de accin de los colorantes, sobre Ia clula, de acuerdo al
carcter qumico de stos (cidos o bsicos).
3 Diferenciar las caractersticas morfolgicas, de agrupacin y de tincin de las
bacterias observadas al microscopio
MATERIALES Y REACTIVOS:

Colorantes (Azul de metileno, Cristal violeta, Carbol fucsina)


1 asa de inoculacin
1 aguja de inoculacin
1 Mechero de alcohol
1 encendedor
Cinta de rotular
Marcador (Sharpie
Microscopio
Puente de coloracion
Frasco lavador
Aceite de inmersion
Papel de aroz
Papel toalla
Lminas o portaobjetos
Cultivos en agar de 24 horas de E. coli y Bacillus sp. suministrados por el profesor
Cultivos en caldo de 24 horas de S.aureus suministrados por el profesor

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PROCEDIMIENTO
1 Preparaciones no coloreadas. (Preparacin en fresco).
a. Cuando Ia muestra a analizar se encuentra en un medio lquido, proceda as: Con
el asa estril deposite una gota de cultivo bacteriano en el centro de un
portaobjetos limpio. Coloque un cubreobjetos o laminilla sobre Ia gota evitando Ia
formacin de burbujas. Observe con objetivos de 1OX y 43X. Haga esquemas y
describa lo observado.
b. Si Ia muestra a analizar se encuentra en medio solido se debe proceder de Ia
siguiente forma: coloque una gota de solucin salina sobre un portaobjetos, toque
con el asa una colonia de cultivo y haga con esta muestra una emulsin en Ia
gota. Cubra Ia preparacin con el cubreobjetos. Observe al microscopio. Haga
esquemas y describa lo observado.
2. Preparaciones coloreadas
a. Con colorantes bsicos. (Coloracin simple o directa).
Los colorantes bsicos mas empleados son: azul de metileno, cristal violeta,
safranina, carbofucsina y verde de malaquita.
El procedimiento para preparar y fijar las bacterias para Ia tincin es el siguiente:
a. Prepare en lminas separadas el frotis de cada microorganismos siguiendo el
procedimiento discutido previamente.
b. Siguiendo las instrucciones del docente cubra los frotis con el colorante indicado,
usando el tiempo de exposicion adecuado para cada uno.
Carbol fucsina 15 a 30 segundos; cristal violeta 20 a 60 segundos; azul de
metileno 1 a 2 minutos.
c. Lave el frotis con agua de la llave para remover el exceso de colorante. Coloque la
lmina o portaobjetos paralela al flujo de agua para reducuir la perdida de
microorganismos.
d. Seque los alrededores del frotis con papel toalla y deje secar el frotis al aire.
e. Repita el procedimiento para cada organismo usando un colorante diferente.
f. Examine cada tincin bajo el objetivo de inmersin.
RESULTADOS.
1. Dibuje un campo representativo de cada organismo.
2. Describa la forma y arreglo del organismo.

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Figura 7. Tincin directa de colorante bsico

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CONSULTAR SOBRE

Por qu los colorantes bsicos son ms efectivos para las tinciones bacterianas
que los tintes cidos?
Una tincin simple puede ser usada para identificar algo mas que las
caracteristicas morfologicas de un microorganismo? Explique.
Si se te olvidara fijar la muestra durante la aplicacin del procedimiento de tincin
simple, Qu diferencias crees que encontrarias al mirar tu muestra en
comparacin con unca correctamente fijada?
Si durante una charla de amigos uno de ellos derrama caf sobre tu camiseta y
luego de varias labadas no puedes recuperar su color original; podemos decir
que el caf es un verdadero tinte biologco o es solo una sustancia capaz de
impartir color? Explica tu razonamiento.

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LABORATORIO No. 4
TCNICAS DE COLORACIN BACTERIANA (TENCIN DIFERENCIAL)
INTRODUCCIN
Las tinciones diferenciales son aquellas que se usan para diferenciar de manera ms
explcita los microorganismos. Las tinciones diferenciales ms importantes que se
empleanen bacteriologa son las de Gram y la tincin cido-resistente. Ambas tinciones se
utilizan para obtener informacin acerca de la composicin de las capas de la pared
celular de las clulas bacterianas.
Tincin de Gram: El bacterilogo Dans Christian Gram, descubri en 1884 un mtodo
de coloracin el cual ha dividido a las bacterias en dos grupos, el de las gram positivas y
el de las gram negativas. La tcnica esta basada en Ia capa gruesa de peptidoglicano que
poseen las bacterias gran positivas que es capaz de retener el complejo colorantemordiente (cristal violeta- durante Ia decoloracin con el alcohol acetona, que provoca
una deshidratacin de esta gruesa pared y se reduce la porosidad, atrapando entonces el
complejo en el interior de la clula.
Las bacterias Gram negativas, poseen una delgada capa de peptidoglicano pero rica en
lpidos como el lipopolisacarido o LPS que son disueltos y se permite la salida del
complejo colorante-mordiente (cristal violeta-yodo), perdiendo el color purpura propio del
cristal violeta y deben ser coloreadas nuevamente con el colorante secundario o de
contraste como .la safranina, que es un colorante de contraste de color rojo, dicho
colorante da un color rojo claro a las clulas decoloradas.
Este mtodo de coloracin diferencial constituye una de las tcnicas ms importantes en
el trabajo bacteriolgico, pues Ia informacin que da, ayuda a Ia identificacin bacteriana.
Tincin de Ziehl-Neels: Esta coloracin fue desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich
para demostrar la presencia de los bacilos causantes de tuberculosois en muestras
clnicas de pacientes. La tcnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de bacterias:
bacilos cido alcohol resistentes (BAAR) positivas y BAAR negativas.
Las paredes celulares de ciertos microorganismos contienen cidos grasos (cidos
miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de
resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos.
Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis
y M. marinum y los parsitos coccdeas como Cryptosporidium parvun se caracterizan por
sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen
requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene
lpidos como el colesterol y ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua,

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provoca una nueva solidificacin de lo cidos grasos de modo que el colorante ya no
puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energa cintica
de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias. Las
bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y la que no se ven de color azul.
OBJETIVOS
1
2
3

Adquirir destreza en Ia tcnica de coloracin de Gram.


Diferenciar con base en Ia aplicacin de esta tcnica las bacterias gram positivas
de las gram negativas.
Conocer los diferentes campos de aplicacin de esta tcnica.

MATERIALES

Portaobjetos
Papel absorbente
Puente de coloracin
Mechero de alcohol
Aceite de inmersin
Reactivos requeridos para Ia coloracion de Gram: Cristal violeta, Safranina, Lugol y
alcohol acetona.
Asas bacteriolgicas
Microscopio
Cultivos de estreptococos, estafilococos, bacilos Gram (+) y Gram (-)

PROCEDIMIENTO
1. Prepare, seque y fije Ia muestra con se realiz en la laboratorio anterior (# 3).
2. Cubra el extendido con cristal violeta. Djelo actuar durante un minuto. Lave el
exceso de colorante con agua.
3. Cubra el extendido con solucin yodada de Gram (Lugol) durante un minuto. Este
acta como un mordiente. Lave con agua.
4. Decolore con alcohol acetona durante 20 a 30 segundos aproximadamente y lave
con agua.
5. Cubra el extendido con safranina. Djela actuar durante un minuto.
1 Lave con agua, seque y observe al microscopio con el objetivo de inmersion.
RESULTADOS.
1. Dibuje un campo representativo de cada organismo.
2. Describa la forma y arreglo del organismo.

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CONSULTAR SOBRE

Cul es la ventaja de la tcnica de tincin diferencial frenta a la de tincin simple?


Diga cual es la funcin de Cada uno de los siguientes reactivos en una tincin
diferencial: tinte primario, contratinte, agente decolorante, mordiente
Por qu es escencial que el colorante primario y el contra tengan colores
contrastantes?.
Cal cree usted que es el paso ms crucial en la coloracin de Gram? explique.
Suponga que el laboratorio de hoy fue aplasado y se realiza la proxima semana
con el cultivo de B. cereus que tiene 9 das de antigedad. Al realizar la tincin de
Gram usted observa celular teidas de violeta intenso y otras de color rosa.
Proponga una explicacin a este reultado

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Figura 8. Procedimiento para Ia tincin de Gram

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LABORATORIO No. 5- 7
METABOLISMO BACTERIANO
INTRODUCCIN
El metabolismo bacteriano se define como el conjunto de reacciones qumicas que
desarrolla Ia clula. Estas reacciones incluyen procesos de obtencin de energa como
son: la descomposicin de molculas orgnicas en las bacterias quimitrofas
(catabolismo) o la captacin de luz para el caso de las fottrofas, as como de sntesis de
material celular a partir de nutrientes esenciales (anabolismo). Todas las reacciones
metablicas son catalizadas por enzimas que en su mayora funcionan dentro de la clula
por lo que se conocen como endoenzimas, hay tambin exoenzimas principalmente
lashidrolticas que son liberadas por la clula para catalizar reacciones fuera de sta.
El nmero y Ia clase de enzimas bacterianas son diferentes, debido a que cada enzima
est fabricada bajo un control gentico, per lo cual se dan variaciones en Ia utilizacin de
los sustratos. Estas variaciones se utilizan a su vez para ayudar a determinar los
diferentes gneros y especies bacterianas.
En el laboratorio, es posible conocer las caractersticas metablicas de los
microorganismos, inoculndolos en diferentes medios de cultivo, con sustratos que
pueden utilizar como fuente de energa, fuente de carbono y de otros nutrientes
esenciales para su crecimiento.
La mayora de microorganismos, utilizan la glucosa como fuente de carbono y de energa.
Al entrar a la clula, la glucosa es oxidada en forma incompleta (fermentacin) o completa
(respiracin) dependiendo de la presencia de oxgeno y de las capacidades enzimticas
de los microorganismos.
En la fermentacin, los microorganismos obtienen 1-2ATP/mol de glucosa y liberan cidos
orgnicos u otras pequeas molculas orgnicas como productos metablicos; mientras
que las bacterias y levaduras de catabolismo respiratorio obtienen mayor cantidad (36-3
8ATP /mol de glucosa), CO2 y agua. Algunas especies microbianas pueden ser de tipo
respiratorio o fermentativo de acuerdo a las condiciones de oxigenacin.
Se han propuesto numerosas pruebas bioqumicas en medios de cultivo con indicadores
de pH para detectar la produccin de cido o lcali; con inhibidores selectivos como bilis,
cianuro, colorantes, sulfuros, etc., que facilitan la determinacin de diferentes actividades
metablicas como son: la capacidad para fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa,
sacarosa), catabolizar aminocidos y urea, la produccin de enzimas especficas de tipo
endo o exo como oxidasas, reductasas, amilasas, lipasas ,etc.

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Como se ha observado en las prcticas anteriores, algunas bacterias y levaduras tienen
caractersticas coloniales y microscpicas muy similares, lo que no permite decidir si dos
cultivos bacterianos o de levaduras morfolgicamente similares pertenecen a una misma
especie.
Con algunas pruebas bioqumicas es posible su diferenciacin e incluso su identificacin,
cuando el nmero de pruebas es suficientemente amplio.
Pruebas Bioqumicas de algunas Bacterias Entricas Gram Negativas
Prueba de carbohidratos: Se utiliza el agar Kliger inclinado, en cual contiene dos
hidratos de carbono: Lactosa a una concentracin del 1% y glucosa en concentracin de
0,1 %, sales de hierro y rojo de fenol como indicador de pH. Es utilizado para diferenciar
los bacilos Gram negativos de este grupo par su capacidad para desdoblar los azucares y
liberar sulfuros. La fermentacin de los azucares est indicado por un cambio de color del
rojo inicial al amarillo. En algunos casos hay produccin de gas o de H2S; este ltimo se
manifiesta por un ennegrecimiento del medio.
Prueba del citrato: Determina si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como fuente
de carbono. Se utiliza el agar citrato de Simmons inclinado, el cual contiene como
principal componente citrato de sodio como nica fuente de carbono y azul de bromotimol
como indicador de pH. Las bacterias que lo utilizan alcalinizan el medio, lo cual se
manifiesta con un cambio del color verde a azul.
Prueba de motilidad: Establece Ia diferencia entre bacterias mviles y no mviles. Se
utiliza el agar blando, el cual es un medio semislido que permite fcilmente el
desplazamiento de las bacterias. La movilidad de los microorganismos se manifiesta por
un crecimiento difuso alrededor de Ia lnea de inoculacin.
Prueba de hidrlisis de Ia Urea: Seala Ia capacidad de un microorganismo para
desdoblar Ia Urea por accin de Ia enzima ureasa y obtiene como resultado Ia formacin
de amonaco. El indicador de pH es rojo de Fenol. Los microorganismos que Ia utilizan
cambian el color amarillo inicial del medio rojo rosado.
Urea

Ureasa

Amoniaco + C02

Prueba de SIM: Con esta prueba se pueden observar tres reacciones:


1 Produccin de cido sulfidrico (H2S): Ayuda a diferenciar entre las especies de
bacterias capaces de producir cido sulfdrico. El medio contiene aminocidos
azufrados, que por accin enzimtica de las bacterias producen un gas incoloro
(H2S), que al reaccionar con una sal pesada de citrato frrico de amonio produce
un precipitado negro insoluble (sulfato ferroso).
Cistina Desulfurasa cisteina Cisteina
cido pirvico + H2S + NH3

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H2S + citrato frrico de amonio
2

Sulfuro ferroso (precipitado negro).

Prueba del lndol: Seala Ia capacidad de las bacterias para oxidar el triptfano. La
accin enzimtica de Ia triptofanasa produce varios metabolitos entre los cuales
esta el lndol.
Triptofano Triptofanasa
lndol + cido pirvico + Amonaco
Desaminacin

.
El indol producido se detecta adicionndole al cultivo dos o tres gotas del reactivo
de Kovacs (P-Dimetilaminobenzaldehido)
.
lndol +(Kovacs)
anillo (color rojo violaceo) l
3

Prueba de motilidad En este medio se puede detectar Ia movilidad de las bacterias


que Ia poseen, siempre y cuando no haya produccin de H2S que dificulta Ia
lectura. Cuando esto ocurre Ia motilidad se observa en el medio Agar blando
descrito anteriormente.

OBJETIVOS

1 Diferenciar Ia actividad bioqumica de las bacterias mediante Ia utilizacin


de medios de cultivo con sustratos especficos.
2 Analizar las pruebas bioqumicas utilizadas y con base en los resultados,
realizar Ia determinacin de las bacterias
3 Comprender la importancia de las pruebas bioqumicas para la
caracterizacin e identificacin de estos microorganismos.
MATERIALES

Papel absorbente
Mechero de alcohol
Asas bacteriolgicas
2 cajas con agar almidn
2 tubos con campana de Durham y 5mL de cada uno de los siguientes medios:
glucosa rojo de fenol, lactosa rojo de fenol, sacarosa rojo de fenol y manitol-rojo de
fenol.
2 tubos con 7mLde medio SIM (Sulfuro, Indl, Motilidad)
2 tubos con 7mL de medio TSI (triple azcar hierro) o Klinger (dos azucares,
hierro) solidificados en forma inclinada
2 tubos con 7mL medio de citrato de Simmons solidificados en forma inclinada
2 tubos con 7mL de caldo urea
Portaobjetos
H202 (Perxido de hidrgeno)

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Suero humano o de conejo


Cultivos en agar de 24 horas de Klebslella sp. Stafilococcus sp. Streptococos
sp., E. coli y Bacillus sp. gram (+) y gram (-) suministrados por el profesor

PROCEDIMIENTO

El profesor proporcionar los cultivos puros de Bacillus sp, E. coli, Klebslella sp. o
Stafilococcus sp. a cada uno de los equipos. Adems de un cultivo problema.
Todos los tubos y cajas deben etiquetarse e inocularse de acuerdo a las
siguientes instrucciones:
1.
2.
4
5
6
7
8
9

Esterilice Ia aguja de inoculacin.


Toque una colonia de Ia muestra a analizar
lnocule el TSI o Kliger, introduciendo Ia aguja hasta el fondo, luego squela y haga
una estra en zig-zag en Ia superficie del bisel.
Sin tomar una muestra y sin flamear Ia aguja, inocule el agar citrato de Simmons
hacienda estras en Ia superficie del bisel.
Luego, sin flamear introduzca Ia aguja hasta Ia mitad del contenido del agar SIM.
lnocule el agar blando procediendo como en el literal anterior.
Finalmente y sin flamear Ia aguja, inocule el caldo urea agitndola.
lncube todos los tubos de estas pruebas a 37C por 24 horas.

Nota: Adems de estas pruebas, existen actualmente otras sofisticadas y rpidas que
permiten una determinacin bastante confiable de las diferentes especies de bacterias,
ejemplo, el sistema API y Micro-ID.
RESULTADOS.
Hacer observaciones alas 24 y 48 horas de incubacin y determine si hay crecimiento,
cambios en el color del indicador y produccin de gas en la campana de Durham
comparando cada tubo problema con tubos control que contienen los mismos medios de
cultivo pero sin inoculacin de microorganismos. Para Ia identificaci6n de las
Enterobacteriaceas utilice Ia Tabla No. 1.
Otras Pruebas Complementarias para Bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Fermentacin de carbohidratos: Una amplia variedad de carbohidratos son
fermentados por bacterias y el patrn de fermentacin es caracterstico de ciertos gneros
y especies.
As el conocimiento de Ia fermentacin de carbohidratos por un organismo particular
ayuda a su determinacin. Esta caracterstica se puede determinar inoculando el
organismo dentro de un caldo de carbohidratos. Este medio esta compuesto

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esencialmente de caldo nutritivo adicionado con 0,5% del carbohidrato particular ms un
indicador de pH y adems contiene un tuba de Durham (pequeo tubito invertido dentro
del tubo con caldo). Puesto que los productos finales de Ia fermentacin de los
carbohidratos son cidos y gas, el indicador revelar Ia produccin de cido y el tubito
invertido atrapar el gas si este se produce.
Para esta prueba proceda de Ia siguiente manera:
1. Esterilice el asa.
2. lnocule el caldo de carbohidratos con una asada del cultivo a analizar.
3. Rotule bien los tubos e incbelos a 37C por 48 horas. Incube tambin un
tubo del caldo con carbohidratos sin inocula como como control.
Hidrlisis de almidn: Algunas bacterias producen enzimas (amilasa) capaces de
desdoblar las molculas complejas de polisacridos. Estas enzimas son extracelulares y
realizan Ia ruptura de los sustratos por medio de Ia hidrlisis. As, Ia amilasa hidroliza el
almidn cuando los organismos que Ia producen se cultivan en un medio que contiene
este polisacrido (Agar almidn). Para esta prueba, proceda de Ia siguiente manera:
1. Divida una caja de Petri en cuatro cuadrantes.
2. Marque un cuadrante con Ia palabra control y las dems con su respectiva cepa.
3. Esterilice el asa.
4. lnocule el agar en el centro de cada cuadrante con Ia respectiva bacteria.
5. lncube a 37C por 24 a 40 horas.
6. Despus de Ia incubacin cubra Ia superficie del agar con una solucin de lugol,
este en presencia de almidn origina un color azul oscuro. Un halo transparente
alrededor de Ia colonia nos indica que Ia bacteria hidroliza el almidn. La ausencia
de halo significa un resultado negativo.
Prueba para Ia catalasa: Diferencia entre especies de bacterias que utilizan el oxigeno.
La catalasa es una enzima que esta relacionada con Ia capacidad de un organismo para
utilizar el oxigeno. Esta enzima cataliza Ia degradacin del agua oxigenada en agua y
oxigeno, no se encuentra en los organismos anaerobios, lo cual produce en stos Ia
muerte cuando se encuentran en presencia de oxigeno. Para esta prueba, proceda de Ia
siguiente manera:
1. Esterilice el asa.
1. Tome varias colonias de un cultivo de Staphylococcus spp. y colquelas sobre un
portaobjetos limpio.
2. Agregue sobre las colonias una gota de H202 al 30%.
3. Observe Ia produccin de pequeas burbujas, lo que indica Ia presencia de Ia
catalasa en las bacterias. Repita el proceso con una cepa problema.
Prueba para Ia coagulasa: Seala Ia capacidad de ciertas bacterias para coagular el
plasma por Ia accin de esta enzima. El plasma humano o de conejo, coagula igual que si
fuera sangre entera. Esto se previene si se aade un poco de citrato de sodio
(anticoagulante general), el cual mantiene lquido el plasma. La coagulasa que esuna

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1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Escherichia coli
Shigella spp
Klebsiella spp
Enterobacter
aergenes
Serratia marcescens
Salmonella spp
Citrobacter freundii
Proteus vulgaris
Pseudomonadaceae
Pseudomona aerugin

A
K
A
A

+
V
V
-

A
A
A
A

K
K
2
V
K

V
V

Tabla 1: Identificacin de enterobacterias

IMVIC
Voges

Lisina
de
Carbox
ilasa

A
A
A
A

Rojo
de
Metilo
+
+
+/V
-

A-cido
A- cido-gas
A- cido con produccin lenta de gas
K- Alcalino
V- Variable
V Variable
1
-Lento
2
-Puede ser retardado
9: No es Enterobacteria

Indol

HS

Motilid
ad

Familia Enterobacteriaceae

KLIGLER
Fondo
Inclinacin

Ureasa

exoenzima elaborada par Ia mayora de los Staphylococcus aureus invierte Ia accin del
anticoagulante (en este caso el citrato de sodio). Cuando a este plasma se le inocula Ia
cepa patgena del S. aureus, Ia coagulacin se realiza tal como si no se hubiera aadido
citrato. Para esta prueba, proceda as:
1. Esterilice el asa.
2. Agregue 0,5 ml de plasma citratado a cada tubo de ensayo (2 tubos)
3. Tome una asada de colonias de S. aureus (coagulasa positiva) e introduzca en
uno de los tubos con plasma.
4. Proceda de igual forma con el tubo problema.
5. Observe por una o dos horas, revisando cada media hora. cuando el plasma ya
no fluya como al principio, Ia prueba es positiva, en caso contrario es negativa.

V
+

1
V
-

V
+
+

+
+

Citro
Simmo
ns
+
+

V
+
+
+

+
-

+
V
+
+

+
+
V
+

+
+
+
+

V
d
V
+

+
+
-

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LABORATORIO No.8-9
METODO PARA EL RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS VIABLES
EN UNA MUESTRA

INTRODUCCIN
Los estudios que involucran el anlisis de materiales como alimentos, agua, leche y en
algunos casos aire, requiere la cuantificacin de los microorganismos presentes en dicha
sustancia y se han diseados muchos mtodos para conseguir esto, incluyendo conteo
directo al microscopio, uso de contadores electrnicos de clulas, mtodos qumicos para
la estimacin de la masa celular o de constituyentes celulares, medida turbidimtrica y el
mtodo de diluciones seriadas-conteo en caja. A continuacin describiremos de modo
general cada uno de ellos:

Conteo directo al microscopio: este mtodo requiere el uso de una cmara de


conteo especializada llamada cmara de Petroff-Hauser o cmara de Neubauer,
en la que se cuenta un alcuota de suspensin de clulas y el nmero total de
clulas se determina matemticamente. Este mtodo tiene como ventaja el hecho
de ser muy rpido pero la desventaja es que tanto clulas vivas como muertas se
incluyen en el conteo.

Contador electrnico de clulas: es un instrumento capaz de contactar


rpidamente el nmero de clulas suspendidas en un fluido conductor, que pasa a
travs de un diminuto orificio por donde fluye una corriente elctrica. Cuando una
clula pasa por el detector, aumenta la resistencia del lquido conductor
registrndose como una clula. Este mtodo tampoco distingue entre celular vivas
o muertas y adems es incapaz de diferenciar entre partculas inertes y clulas.

Mtodos qumicos: el incremento de la turbidez en un cultivo es indicador de


crecimiento. En un turbidmetro la cantidad de luz transmitida disminuye
proporcionalmente al aumento del tamao poblacional del cultivo. Este mtodo es
rpido pero su mayor limitacin radica en que slo es sensible a suspensiones
celulares de ms de 10 millones de clulas.

Diluciones seriadas-conteo en caja: la mayor desventaja de los mtodos


anteriores radica en su incapacidad de distinguir entre clulas vivas y muertas y la
mayora de las veces se requiere el nmero de clulas viables. Para conseguir
esto comnmente se usa el mtodo de diluciones seriadas-conteo en caja. Este
mtodo incluye una dilucin seriada de una suspensin bacteriana en agua estril
(blanco). Una vez diluidas las clulas un volumen conocido de stas se colocan en

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el medio cultivo adecuado. Generalmente se vierte una cantidad conocida de la
suspensin celular en una caja de Petri vaco y estril y posteriormente se vierte
en el mismo el agar fundido y se mezcla por rotacin suave de la caja para
garantizar la distribucin homognea de las clulas. Las diluciones deben ser
hechas por duplicado para garantizar la exactitud. Posteriormente se incuban
durante toda la noche y con ayuda de un contador de colonia se cuenta el nmero
de colonias y las cajas seleccionadas para el conteo no deben tener menos de 30
ni ms de 300 colonias. El nmero total de clulas por volumen de muestra se
obtiene multiplicando el nmero de clulas contadas en la caja por el factor de
dilucin.

OBJETIVOS
1
2

Conocer algunos de los mtodos de recuento de microorganismos.


Adquirir destreza en Ia aplicacin de algunos de stos mtodos y determinar
cuantitativamente el nmero de clulas viables en un cultivo bacteriano.

MATERIALES

Tubos con 20mL de agar nutritivo


Tubos con 9 mL solucin salina peptonada (SSP) estril para diluciones.
Cajas de Petri estriles
Bao Mara con termostato
Termmetro
Gradillas
Mecheros
Pipetas estriles de 1mL
Propipeteador
Solucin desinfectante
Marcador
Cultivo de 24-48 horas de E. coli en caldo nutritivo.

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PROCEDIMIENTO
1. Funda los tubos con agar y mantngalos a 45C en el bao Mara con
termostato
2. Rotule el cultivo de E. coli como tubo nmero 1 y los tubos con 9mL de
agua destilada con los nmeros del 2 al 8. Rotule las cajas de Petri como
1A, 1B, 2A, 2B, 3A y 3B.
3. Agite el tubo 1 para asegurarse que las clulas bacterianas estn bien
homogneas y dispersas en el cultivo.
4. Con una pipeta estril y aspticamente, transfiera 1mL del tubo 1 al tubo 2.
Descarte la pipeta en solucin desinfectante.
5. Mezcle bien el tubo 2 y con una nueva pipeta trasfiera 1mL del tubo 2 al
tubo 3. Descarte la pipeta en la solucin desinfectante.
6. Contine haciendo las diluciones de cada tubo transfiriendo con una nueva
pipeta 1mL del tubo hasta llegar al tubo 8. Descarte la pipeta en la solucin
desinfectante.
7. Adicione a cada uno de las cajas de Petri, los volmenes de muestra como
se indica a continuacin.
Caja
1
1B
2
2B
3
3B

Tubo
Tubo 5
Tubo 6
Tubo 6
Tubo 7
Tubo 7
Tubo 8

Volumen
0,1mL
1,0mL
0,1mL
1,0mL
0,1mL
1,0mL

8. Asegrese que el agar este fundido y a 45C. Seque la parte externa de los
tubos con un papel toalla. Usando tcnicas aspticas, vierta un tubo de
agar dentro del tubo 1A y mezcle por rotacin suave para asegurar una
distribucin uniforme de las clulas en el medio.
9. Repita el paso el paso anterior con las dems cajas.
10. Una vez el agar se halla solidificado incube las cajas en posicin invertida a
37C durante 24 horas.

OBSERVACIONES Y RESULTADOS
1. Observe todas las colonias sobre las cajas. Las cajas que contengas ms de 300
colonias no deben ser contados y sern reportados como muy numerosos para
contar (MNPC). Cajas con menos de 30 colonias sern reportados como muy
pocas para contar (MPPC). Cuente y reporte slo las cajas que contengas entre
30 y 300 colonias.

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2. El nmero de organismos por mililitro del cultivo original de E. coli se calcula al
multiplicar el nmero de colonias contadas por el factor de dilucin por el volumen
aadido en la caja as: Clulas/mL = Colonias contadas x Factor de dilucin x vol.
aadido
Ejemplo:
Colonias contadas = 50
Dilucin = 10-6
Volumen aadido = 1mL
Clulas/mL = 50 x 1.000.000 x 1
Clulas/mL = 50.000.000 o 5,0X107cel/mL
3. Consigne sus observaciones y clculos en la siguiente tabla.
Caja

Dilucin
en el tubo

Mililitros de la
dilucin
aadidos a la
caja

Dilucin
final en
la caja

Nmero
de
colonias

Nmero
de
bacterias
por mL de
muestra

Nmero
promedio
de cel/mL

1A
1B
2A
2B
3A
3B

CONSULTAR SOBRE

Cul es la mayor desventaja de los mtodos de conteo de microorganismos a


excepcin del mtodo empleado en este laboratorio
Diferencie entre dilucin y factor de dilucin
Cules son las ventajas y desventajas del mtodo empleado en este laboratorio?
si 0,1mL de una dilucin 1X10-6 produce en una caja de Petri 56 colonias, calcule
el nmero de clulas por mL en el cultivo original.

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LABORATORIO No.9.
ESTIMACIN DEL CRECIMIENTO Y EL NMERO DE BACTERIAS POR
MTODOS INDIRECTOS (TURBIDIMETRA)

INTRODUCCIN
La determinacin de la turbidez (turbidimetra) es un mtodo prctico para controlar y
estimar el crecimiento bacteriano para algunos tipos de trabajo experimental. Cuando las
bacterias se multiplican en un medio lquido, ste se torna turbio o nebuloso por las
clulas y el instrumento que se utiliza para medir este efecto es un espectrofotmetro o
colormetro. En este equipo un haz de luz se transmite a travs de la muestra a una celda
fotoelctrica y cuando la cantidad de bacterias aumenta, la luz se dispersa y menos luz
alcanza la celda fotoelctrica. Este cambio de luz se registra en el instrumento como
porcentaje de transmisin. Tambin se puede determinar como una medicin logartmica
del instrumento denominada absorbancia o densidad ptica (D.O), el cual se utiliza para
graficar el crecimiento bacteriano. Cuando las bacterias se encuentran en la fase
logartmica de crecimiento o de muerte, la representacin de la absorbancia frente al
tiempo forma una lnea casi recta.
Es importante tener en cuenta para visualizar los primeros puntos o trazas de turbidez de
haber ms de un milln de clulas bacterianas por mililitro de muestra y se precisan de 10
a 100 millones de bacterias por mililitro para que la suspensin se vuelvo lo bastante
turbia como para ser leda en un espectrofotmetro. Por lo tanto, la turbidemetra no es un
mtodo til para medir contaminacin de lquidos con un nmero relativamente pequeo
de bacterias.

OBJETIVOS
Conocer y estimar el crecimiento bacteriano mediante una curva de cintica de la
biomasa celular.
MATERIALES

45 mL de caldo nutritivo
Espectrofotmetro
Gradillas
Mecheros
Pipetas estriles de 5mL

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Propipeteador
Solucin desinfectante
Marcador
Cultivo de 24-48 horas de E. coli en caldo nutritivo (50 mL).

PROCEDIMIENTO
1. Tome 5 mL del cultivo de E. coli y depostelos en un Erlenmeyer que
contenga 45mL de caldo nutritivo, homogenice el cultivo mediante agitacin
suave.
2. Tome 3 mL de este cultivo homogneo y depostelos en una celda del
espectrofotmetro para leer el valor de densidad ptica (D.O) a 600 nm.
Esta lectura corresponder al tiempo 0 (t =0).
3. Incube el cultivo a 37 C. Lea y anote las D.O a las 0,5- 1,0-1,5-2,0-3,0, 4,0
y 6,0 horas pos incubacin, de la misma manera que ley el tiempo cero.

OBSERVACIONES Y RESULTADOS
1. Elabore una grfica de D.O vs tiempo e identifique las fases de crecimiento y
duracin (fase Lag o perodo de adaptacin, fase exponencial, fase estacionaria y
Fase de muerte).
2. Determine las generaciones (n) o nmero de divisiones celulares en el cultivo. n=
(logN-logNo)/log 2 n= (logD.O-logD.Oo)/log 2. Tener en cuenta que Log 2= 0,301
3. Calcule la velocidad de crecimiento (Vc): Vc= n/t, es decir el nmero de
generaciones (n) que ocurren por unidad de tiempo.
4. Tiempo de generacin (tg): es el tiempo requerido para que se duplique el nmero
de clulas de la poblacin bacteriana.tg=1/vc.
CONSULTAR SOBRE

Qu factores biticos y abiticos controlan el crecimiento microbiano?.


Que otros tipos de mtodos directos e indirectos hay para valorar el crecimiento
bacteriano?
Responda las siguientes preguntas de acuerdo a la siguiente grfica.

En qu fase de crecimiento se encuentra el


cultivo en el punto (a)?

Qu eventos metablicos estn ocurriendo en


las clulas en el punto (a)?

Proponga una hiptesis del porque el nmero de


microorganismos no aumenta en el punto (c).

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A qu se debe la disminucin del nmero de microorganismo en el punto (d)?.


Justifique su respuesta.

Qu tipo de cultivo permite que el microorganismo pase por las cuatro fases de
crecimiento?. Justifique su respuesta.

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LABORATORIO No.10
SENBILIDAD BACTERIANA (CONTROL MICROBIOLGICO)

INTRODUCCIN
Sabemos que el control de los microorganismos se basa en el conocimiento previo de las
condiciones fsicas favorables y de una fuente de nutrientes necesarios para su
crecimiento ptimo que permite la modificacin de stas, las cuales pueden ser
potencialmente letales. Entre los agentes ms utilizados por el hombre en el control de
microorganismos tenemos los Biolgicos, Fsicos y Qumicos como Ia temperatura, Ia
radiacin con Ia luz ultravioleta, variaciones en el pH, Ia presin osmtica, lo mismo que
Ia accin de algunos compuestos qumicos de uso corriente como los antibiticos. Estos
agentes actan distintamente, dependiendo de varios factores tales como el tiempo de
exposicin, la temperatura, la concentracin, su intensidad, la presencia de materia
orgnica o el pH; s como el nmero, clase y naturaleza de los microorganismos y tambin
del material de soporte para su aplicacin.
Es importante destacar que segn sus caractersticas, los agentes que se utilizan para el
controlar los microorganismos, ocasionan diferentes efectos sobre su estructuras, entre
las que podemos mencionar: daos en Ia pared, Ia membrana celular, los cidos
nuclecos, el citoplasma o en los ribosomas, as como Ia inhibicin de Ia actividad
metablica.
En Ia presente prctica estudiaremos, como actan sobre los microorganismos algunos
antibiticos.

OBJETIVOS
Conocer y. evaluar Ia accin de los antibiticos sobre los microorganismos
utilizando el mtodo del antibiograma, el cual consiste en discos de papel filtro
impregnados con distintos antibiticos.
MATERIALES

Cajas de Petri con agar Muelller- Hinton o nutritivo


Escobilln de algodn estril
lncubadora

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Cultivo de 24-48 horas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella spp en


caldo nutritivo.
Mechero
Sensidiscos para antibiograma
Marcador

PROCEDIMIENTO
1. Humedezca el escobilln en la suspensin de cultivo y quite el exceso de
caldo presionando y girando el escobilln sobre la pared interna del
recipiente, por arriba del nivel del caldo.
2. Estri el medio en tres o cuatro direcciones sobre la totalidad de la
superficie del agar para obtener un inculo uniforme y espere 3 a cuatro
minutos que se seque el inculo
3. Tome una pinza estril y coloque los sensidiscos en un tiempo menor a 15
minutos despus de haber inoculado la caja, presione ligeramente los
discos para asegurar un contacto con la superficie. Evite una sobreposicin
de las zonas de inhibicin con una distribucin adecuada de los discos y
con un lmite no menos de 15 cm de los bordes de la placa
4. Invierte la cajas e incube el cultivo a 37 C por 16 a 18 horas

OBSERVACIONES Y RESULTADOS
Con la ayuda de una regleta mida el dimetro del halo de inhibicin por el fondo de
la caja, la cual se ilumina con la luz reflejada y clasifique las cepas en trminos de
resistente (R), intermedio (I) o sensible (S), dependiendo del dimetro del halo de
inhibicin.
CONSULTAR SOBRE

Cul es el mecanismo de accin del medicamento presente en los sensidiscos


utilizados?

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LABORATORIO No.11
HONGOS

INTRODUCCIN
Los hongos son organismos eucariticos, porque poseen un verdadero ncleo delimitado
y definido. Se encuentran ampliamente distribuidos en el suelo, en el aire, en el agua y
como parsitos de plantas, animales y el hombre. Tambin como contaminantes de
alimentos y otras sustancias.
Muchas especies de hongos descomponen Ia materia orgnica para que pueda ser
utilizada por las plantas; otras especies se utilizan en procesos industriales como en Ia
produccin de cidos, alcoholes y antibiticos, y unos pocos causan enfermedades en los
seres vivos, especialmente en las plantas.
Los hongos se presentan en dos formas: Como Mohos cuando sus estructuras son de
forma filamentosa y crecen en los cultivos en forma algodonosa o como Levaduras
cuando son unicelulares y su crecimiento en los medios de cultivo es parecido al de las
bacterias.
Los hongos se clasifican en cuatro clases atendiendo a Ia forma como se reproducen, as:
Zygomicetos, los que poseen esporangiosporas para Ia reproduccin asexual y
zigosporas para Ia sexual.
Ascomicetos, los que poseen ascosporas para Ia reproduccin sexual y
conidiosporas para Ia asexual.
Basidiomicetos, los que poseen basidiosporas para Ia reproduccin sexual y
oidiosporas o artrosporas para Ia asexual.
Deuteromicetos, los que solamente se les conoce reproduccin asexual por media
de micro o macroconidias.

Para la clasificacin de los hongos se utiliza una serie de herramientas, tales como las
caractersticas morfolgicas microscpicas y macroscpicas entre otras, para su inclusin
en un grupo taxonmico, igualmente para darle una denominacin definitiva
(nomenclatura) se requiere adems, identificar sus estructuras de reproduccin y evaluar
su fisiologa.

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OBJETIVOS

Identificar a partir de cultivos en medios slidos y preparaciones en lminas las


principales caractersticas que se deben considerar para la clasificacin
taxonmica de los hongos y reconocer su gran variabilidad fenotpica.

MATERIALES

Estiletes o asas de aguja


Cubre y portaobjetos
Solucin salina al 0,85%
Lugol
Azul de lactofenol
Cultivo de Levadura (Candida spp) en medio Sabouraud o Mycosel.
Cultivo de Mohos (Rhizopus sp, Penecillium sp, Aspergiflus sp.)-

PROCEDIMIENTO
Observacin de las levaduras:
1. Tome una asada de levaduras del cultivo y colquelas en un portaobjetos,
cbrala con una laminilla y obsrvelas con objetivo 10X y 40X. Haga
esquemas.
2. En un portaobjetos coloque una gota de lugol y luego tome una asada del
cultivo de levaduras y haga una emulsin con el asa, colquele un cubreobjeto
y observe al microscopio con 1O y 40X.
3. Trate de identificar las siguientes estructuras: pared celular, cicatriz de yema,
ncleo, vacuolas, blastoconidias, etc. Realice esquemas de lo observado.
Observacin de Mohos
1. Examine las colonias de hongos presentes en las cajas con Agar Sabouraud
y/o Mycosel. Describa su color, su contextura, su forma, etc.
2. Prepare una placa tomando con el asa estril, una muestra del cultivo;
depostela en un portaobjeto y adicinele una gota de azul de lactofenol; luego
pngale una laminilla y observe al microscopio con objetivo 1 OX y 43X. Haga
esquemas del tipo de hifa y rganos de reproduccin e identifique el gnero del
moho observado.

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LABORATORIO No.12 - 13.


ALGUNOS PARASITOS DE IMPORTANCIA HUMANA (Intestinales - Tisulares)

INTRODUCCIN
Los protozoos y helmintos estn entre las causas ms comunes de infecciones y
enfermedades que afectan al ser humano y otros animales. Las enfermedades que
ocasionan tienen una gran repercusin socioeconmica y en Salud Pblica. Las
enfermedades causadas por parsitos, especialmente los intestinales (helmintos y
protozoos) a menudo son la causa principal de morbilidad. Estimaciones sugieren que al
menos el 50% de la poblacin mundial puede estar infectados con una o ms especies de
helmintos, mientras las tasas de prevalencia de infecciones por protozoos pueden oscilar
entre el 15 y el 30% para las regiones tropicales y desde <1% a 10% en las zonas
templadas. La transmisin de muchas de las enfermedades parasitarias, particularmente
las infecciones por helmintos, son con frecuencia, el resultado de suministros de agua
inadecuados, falta de saneamiento o eliminacin de aguas residuales mal tratadas. Sin
embargo, recientemente el agua contaminada con materia fecal se est asociando con
brotes de nuevas enfermedades protozoarias transmitidas por el agua, lo cual se est
convirtiendo en una preocupacin cada vez mayor.

Para la clasificacin de los parsitos se utiliza una serie de herramientas, tales como las
caractersticas morfolgicas microscpicas y macroscpicas, as como su modo de
infestacin.

El diagnstico de las parasitosis intestinales se realiza mediante un examen denominado


coprolgico que consiste en colocar en un portaobjetos limpio, una gota de solucin salina
en un extremo y una de lugol en el otro. Posteriormente con un palillo se toma una
pequea porcin de Ia muestra de material fecal a analizar y se hace una emulsin
primero en Ia gota de solucin salina y luego en Ia de lugol. Esta muestra se le coloca un
cubreobjetos y se observa al microscopio con 1OX y 40X.

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Para la observacin de los parsitos tisulares como los hemoparsitos, la tcnica para su
diagnstico es la gota gruesa y se realiza de la siguiente manera: En el centro de una
placa coloque una gota de sangre y extindala en zig-zag en una superficie de un
centmetro aproximadamente. Posteriormente, deje secar la preparacin utilizando una
estufa a 37C por 1 2 horas, o temperatura ambiente y por ltimo coloree con Wright o
Giemsa

Otros parsitos de importancia mdica son los ectopsitos como el Pthirus pubis,
Pedculos humanus, o Sarcoptes scabiei que afectan a la piel de los animales de dos
formas: ectodrmica (sobre la piel) o contraindica (dentro de la piel).

OBJETIVOS

Conocer las principales caractersticas morfolgicas de algunos parsitos de


importancia en humanos.
Adquirir destreza en el manejo de las tcnicas ms utilizadas en el diagnstico de
estos parasitos.

MATERIALES

Guantes
Placas de demostracin
Especmenes conservados en formol
Solucin salina
Cubre y portaobjetos
Solucin salina al 0,85%
Lugol
Palillo de madera para hisopos
Muestra problema (materia fecal)

PROCEDIMIENTO
Observacin de Protozoos lntestinales: Entre los protozoos intestinales que revisten
importancia patolgica para el hombre tenemos: Entamoeba histolftica, Giardia Iamblia y
el Balantidium coli. En las muestras, lo mismo que en las demostraciones observe al
microscopio con objetivo de 40X y analice las diferencias entre los trofozoitos y los
quistes.
Observacin de Helmintos: Algunos de los helmintos que afectan al hombre son:
Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Enterobius vermicularis, Taenia solium, Fasciola
hepatica y Ancylostoma duodenale. De algunos de estos organismos se encuentran

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placas demostrativas y muestras para observacin en fresco. Observe los parsitos
adultos y los huevos en el microscopio con objetivo de 10x y 40x. Dibuje y anote
caractersticas que permiten su clasificacin e identificacin.
Observacin de Protozoos Hemoprasitos: Los parsitos del gnero Plasmodium cuyas
especies ms frecuentes en nuestro pas son el P. vivax y P. falciparum constituye un
problema de Salud Pblica para los pases que se encuentran entre el trpico de cncer y de
capricornio. De este hemoprasito, al igual que de Trypanosoma cruzi y Toxoplasma gondi, en
el Laboratorio encontrarn placas demostrativas con preparaciones de gota gruesa
teidas con el colorante de Wright o Giemsa. Observe en el microscopio con objetivo de
100X y haga esquemas de lo observado que le permita clasificarlo e identificarlo.

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Figura 9. Algunos protozoos y helmintos intestinales