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UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA


DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA BIOLOGA MOLECULAR Y FARMACOLOGA
LABORATORIO EN BIOQUMICA
2006
ESPECTROFOTOMETRA UV-Vis, ABSORCIN ATMICA Y DE FLUORESCENCIA
I. FUNDAMENTOS
La luz est compuesta por ondas electromagnticas.
Una onda electromagntica consiste en un campo magntico y un campo elctrico, perpendiculares
entre s, los cuales oscilan de forma sinusoidal a medida que se propagan a travs del espacio, con una
velocidad de 300,000 Km/seg.
Por motivos de conveniencia, se puede tambin considerar que la luz consiste en un flujo de
cantidades discretas de energa denominadas cuantos o fotones. La cantidad de energa de cada cuanto
determina la longitud de onda de la radiacin.
La relacin entre energa y longitud de onda est descrita por la siguiente ecuacin:
E=

donde

hc
-- = hv
L

h = constante de Planck = 6.63 x E-34


c = velocidad de la luz
L = longitud de onda (distancia entre la cresta de dos ondas adyacentes)
v = frecuencia (nmero de oscilaciones por segundo)

Cuando una de estas ondas encuentra una molcula, puede ser dispersada (alterada su direccin de
propagacin) o bien absorbida (su energa se transfiere a la molcula). Si la energa electromagntica
de la luz es absorbida, se dice que la molcula est excitada, o en un estado excitado. La regin de las
molculas que pueden ser excitadas por la absorcin de la luz se denominan cromforos.
En un tomo en estado fundamental (no excitado), los electrones ocupan los niveles energticos ms
bajos.
Para pasar a un estado excitado, la energa del electrn debe elevarse en una cantidad correspondiente
a la diferencia de energa entre el nivel fundamental y el excitado (el tomo absorber slo los cuantos
que correspondan exactamente a la energa requerida para la transicin 1). De acuerdo a ello, una
longitud de onda L slo puede ser absorbida si
L=
donde,

hc
------- = hv
E 2 E1

E1 = energa del electrn en el nivel original


E2 = energa del electrn en el nivel final
Cuando se producen enlaces entre los tomos para formar una molcula, los electrones adquieren
nuevas posiciones en el sistema y por tanto nuevos niveles de energa. Adems, los tomos de una
molcula pueden vibrar y rotar alrededor de un eje de enlace, dando origen a subniveles energticos
vibratorios y rotatorios. Lo mismo que en los tomos, cada uno de los electrones de una molcula
ocupa el nivel de ms baja energa que le es posible (el estado fundamental). Anlogamente, en las
condiciones correctas, un electrn puede adquirir energa, lo que lo eleva a un nivel energtico
superior (a un estado excitado).

1. Se denomina transicin al cambio entre dos niveles de energa.

2
Se denomina espectro de absorcin a una representacin grfica de la probabilidad de absorcin de
energa de un sistema a diferentes longitudes de onda.
Debido a la carencia de subniveles energticos vibratorios en los sistemas elementales, los espectros de
absorcin de los tomos son simples espectros de lneas estrechas y claramente separadas.
Dado que en las molculas el estado fundamental y cada estado excitado estn subdivididos en cierto
nmero de subniveles energticos, los espectros de absorcin de las molculas se ven generalmente
como espectros de bandas (como son posibles las transiciones entre el estado fundamental y cualquiera
de los niveles de vibracin y de rotacin del primer estado excitado, las molculas pueden interactuar
con radiaciones de una amplia gama de longitudes de onda, provocando la produccin de espectros en
varias regiones distintas).
Regiones de energa electromagntica
Las radiaciones electromagnticas se subdividen en varias categoras, de acuerdo a su longitud de
onda.
Cada longitud de onda produce diferentes fenmenos fsicos en un sistema, de acuerdo a su nivel
energtico (fig. 3).
Algunas de estas regiones dan informacin de gran utilidad al bioqumico y se emplean
rutinariamente, mientras que otras regiones, que requieren aparatos ms sofisticados y ms
experiencia, se utilizan slo para la investigacin detallada de macromolculas y otras estructuras
subcelulares.
Longitud de onda (nm)
2

0.1

10

REGION

Rayos X

EFECTO

Electrones excitados
a mayores niveles energticos

Capa interna

MEDIOS DE
ESTUDIO

10

10

UV

Vis

10

Infrarrojo

Vibracin
molecular

10

10

Microondas

Rotacin
molecular

Capa externa

Espectroscopa
de absorcin
normal

fig. 3:

Espectroscopa
infrarroja
y Raman

Resonancia
magntica
nuclear

Parte del espectro electromagntico de importancia para la bioqumica

Para la mayor parte de molculas, las longitudes de onda correspondientes a las transiciones entre el
estado fundamental y cualquiera de los niveles de vibracin del primer estado excitado caen en las
zonas ultravioleta y visible del espectro electromagntico. Tambin son posibles transiciones de baja
energa entre distintos niveles de vibracin dentro del mismo nivel electrnico. Estas transiciones se
producen en la zona de las radiaciones infrarrojas.
La espectrofotometra es una de las tcnicas analticas ms valiosas de que disponen los bioqumicos.
Se pueden identificar compuestos desconocidos por su espectro de absorcin caracterstico en el
ultravioleta, visible o infrarrojo (tabla 1). Pueden determinarse las concentraciones de compuestos
conocidos midiendo la absorcin de luz a una o ms longitudes de onda. Frecuentemente las
reacciones catalizadas por enzimas pueden seguirse midiendo espectrofotomtricamente la aparicin
de un producto o la desaparicin de un sustrato.
TABLA 1.
LONGITUDES DE ONDA DE LAS RADIACIONES ELECTROMAGNETICAS
EN LA REGION VISIBLE DEL ESPECTRO

3
Violeta

390 - 422 nm

Azul

422 - 492

Verde

492 - 535

Amarillo

535 - 586

Naranja

586 - 647

Rojo

647 - 770

Ley de Lambert-Beer
La fraccin de luz incidente que es absorbida por una sustancia, depende: 1) del espesor de la muestra,
2) de la concentracin del compuesto absorbente y 3) de la naturaleza qumica del compuesto.
La relacin matemtica entre la concentracin y la luz absorbida por una sustancia particular fue
formulada por Lambert (Ley de Lambert).
La relacin matemtica entre la longitud del paso de luz y la luz absorbida por una sustancia
particular fue formulada por Beer (Ley de Beer).
La ley de Lambert-Beer expresa la relacin matemtica entre la concentracin, longitud del paso de
luz (espesor de la muestra) y la luz absorbida por una sustancia particular:

Io
Log -----I

=acl

donde
a = ndice de absorbancia o "coeficiente de extincin" para el compuesto particular.
log Io/I = absorbancia (A) o densidad ptica (O.D.).
Si la concentracin est expresada en molaridad, a se denomina coeficiente de extincin molar o
coeficiente de absorcin molar (am o E).
Si la concentracin est dada en g/L, a es llamado coeficiente de absorcin especfica (a s)
am = as x PM

(PM = peso molecular)

Si la concentracin est dada en porcentaje peso/volumen al coeficiente de extincin se le da el


smbolo de a1% o E1%
En la mayora de clculos bioqumicos se emplean molaridades y coeficientes de extincin molar.
Adems, el espesor de la cubeta es generalmente igual a 1 cm. Por lo tanto, a m tiene generalmente
como unidades M-1x cm-1.
Los coeficientes de absorcin varan con las diferentes longitudes de onda. As, por ejemplo, a m340 se
refiere al coeficiente de extincin molar de una sustancia a 340 nm.
La absorbancia de una solucin 1 M de una sustancia a una longitud de onda determinada, medida en
una cubeta de 1 cm de paso, sera numricamente igual a a m. Ntese que la absorbancia es funcin
lineal de la concentracin:

A = amcl

4
Naturaleza exponencial de la ley de Lambert-Beer:
Consideremos un rayo de luz que atraviesa una cubeta de 1 cm de paso la cual contiene 1 mg/ml de un
compuesto que absorbe la luz. Supongamos que 80% de la luz incidente es transmitida (20% es
absorbida) (fig.4A).
Ahora coloquemos una cubeta idntica en el paso de luz justo detrs de la primera. Cul es la
intensidad de la luz transmitida a travs de ambas cubetas?. La ley de Lambert y Beer no es una
relacin lineal. De esta manera I 2 no es 0.6, y cada centmetro de paso de luz no absorbe una cantidad
constante de luz, sino que cada centmetro absorbe 20% de la luz incidente. La luz incidente en la
segunda cubeta es 0.8, y sta absorbe 20% de luz que recibe (0.16) y transmite el 80 % restante (0.64),
que correspondera a 64% de la luz incidente original (fig.4B).
Se habran obtenido exactamente iguales resultados si utilizando cubetas con 2 cm de paso o
incrementado la concentracin del compuesto absorbente, manteniendo l constante (fig.4C).
A.
Io = 1.00

I1 = 0.80
c = 1 mg/L

l = 1 cm

B.
Io = 1.00

I1 = 0.80

I2 = 0.64

c = 1 mg/L

c = 1 mg/L

l = 1 cm

l = 1 cm

C.
Io = 1.00

I = 0.64
c = 1 mg/L

l = 2 cm

fig. 4:

Naturaleza exponencial de la ley de Lambert-Beer

Desviaciones de la ley de Beer


En ciertos casos, si c es muy alta, am pasa a ser funcin de c, y entonces puede decirse que se viola la
ley de Beer. Esto puede suceder a causa de la dispersin de la luz o de cambios estructurales en el
sistema (p.ej. dimerizacin, agregacin o cambios qumicos) que pueden ocurrir a elevadas
concentraciones (fig.5).

Concentracin
baja

Concentracin

Desviacin

alta

Se cumple

positiva
Desviacin
negativa

Densidad
ptica

Coeficiente
de
extincin

L2
L1

L3

Concentracin

Longitud de onda

fig.5:

Desviaciones de la ley de Beer

II. ESPECTROFOTOMETRIA VISIBLE Y ULTRAVIOLETA


Como ya se mencion, los espectros de absorcin en la regin ultravioleta y visible se deben a
transiciones de energa de los electrones exteriores de la molcula, participen o no en los enlaces.
Generalmente estn implicados electrones deslocalizados, tales como los electrones de enlace de los
dobles enlaces C=C, y el par solitario del nitrgeno y el oxgeno.
Componentes de un espectrofotmetro
Las mediciones de absorbancia se realizan con un espectrofotmetro.
Aunque pueden variar en diseo, todos los espectrofotmetros constan de una fuente de luz, un
monocromador (para seleccionar la longitud de onda), un recipiente pticamente transparente para
contener la muestra, un detector de luz y un registrador para medir las seales que enve el detector.
Normas para el trabajo en espectrofotometra
1. Los ensayos espectrofotomtricos generalmente se realizan en la longitud de onda a la que se
produce el pico de mxima absorcin del cromforo (Lmax).
En una misma molcula pueden existir varios cromforos con diferentes L max; en estos casos se dice
que la sustancia tiene varios mximos de absorcin (L1, L2 ...Ln).
Es conveniente confirmar la(s) longitud(es) de onda de mxima absorcin cuando se realiza un ensayo
por primera vez.
2. La cubeta de referencia (blanco) debe contener todos los reactivos, excepto la sustancia que se
ensaya, en las mismas concentraciones que en las cubetas de ensayo.
3. La cubeta de referencia y su contenido requieren un cuidado especial, porque cualquier error
cometido en su preparacin se reflejar en todos los valores obtenidos.
4. Normalmente, los ensayos deben realizarse por duplicado, y deben representarse los valores
individuales, no la media de ellos.
5. Debe trazarse la mejor recta entre los puntos, no la mejor recta entre el origen y los otros puntos (si
la mejor recta no pasa por el origen, tanto el blanco como las otras muestras pueden estar mal
preparadas).

6
6. La curva de calibracin puede variar de uno a otro lote de reactivos o de standard; tambin puede
variar entre ensayos. Por ello es til construir una nueva curva de calibracin cada vez que se hace un
ensayo.
7. Las curvas de calibracin no pueden extrapolarse ms all del valor de absorbancia ms alto
medido.
8. Debido a la naturaleza logartmica de la escala de absorcin, es recomendable que las muestras se
lean entre valores de absorbancia de 0 y 0.7.
9. Si el valor de absorbancia de una muestra queda fuera de la curva de calibracin, lo mejor es repetir
el ensayo con una concentracin de muestra cuya absorbancia caiga dentro de esta curva.
Si el sistema cumple con la ley de Lambert-Beer, se diluyen las muestras y el blanco con una solucin
apropiada (normalmente con la misma solucin del blanco).
Para evitar la dilucin, se pueden utilizar cubetas con paso de luz ms corto.
10. En los ensayos espectrofotomtricos la reproducibilidad del mtodo por el experimentador es muy
importante (es esto lo que determina la exactitud de los datos finales). Los aparatos deben estar
limpios; los volmenes, los tiempos y las temperaturas deben medirse cuidadosamente y seguirse con
fidelidad para obtener resultados reproducibles.
Factores que afectan las propiedades de absorcin de un cromforo
Aunque el espectro de absorcin de un cromforo est determinado bsicamente por la estructura
qumica de la molcula, hay una gran cantidad de factores que pueden producir alteraciones
detectables en Lmax y en am. Son precisamente los efectos de estos factores ambientales los que
proporcionan la base para el uso de la espectroscopa de absorcin como instrumento para la
caracterizacin de macromolculas.
1. pH: El pH del solvente determina el estado de ionizacin del cromforo. En el caso de la tirosina,
por ejemplo, tanto Lmax como am aumentan cuando se disocia el -OH fenlico (fig. 6).

Lmax pH 6: 274 nm
Lmax pH 13: 295 nm
pH 13
4000
a

2000

pH 6

250

270

290

310

330

longitud de onda (nm)


fig. 6:

Espectro de absorcin de la tirosina a pH 6 y 13

2. Polaridad del solvente: En los cromforos polares (sobre todo si la molcula contiene O, N o S), la
Lmax aparece a longitudes de onda menores en los solventes polares que en los solventes no polares
(fig. 7).

etilenglicol 20%

agua

250 260 270 280 290 300


longitud de onda (nm)
fig. 7: Efecto de la polaridad del solvente sobre el espectro de la tirosina

3. Orientacin relativa de los cromforos cercanos: Las caractersticas espaciales de la molcula


ejercen fuertes efectos sobre Lmax y am. El ms conocido es el denominado hipocroma de los cidos
nucleicos. La capacidad de absorcin de luz disminuye en el DNA nativo con respecto a una solucin
con la misma composicin de nucletidos libres, debido a las interacciones electrnicas entre las bases
apiladas de la cadena doble. As, el coeficiente de extincin de una solucin de DNA se hace mayor
mientras menos cercanos entre s y ms desordenados se encuentren los nucletidos (mientras ms
desnaturalizado est el DNA) (fig. 8). Este fenmeno es conocido como efecto hipercrmico.

DNA de doble cadena


DNA de cadena simple

absorbancia

nucletidos libres

230

250

270

290

310

330

longitud de onda (nm)


fig. 8:

Hipocroma del DNA o efecto hipercrmico de su hidrlisis

Ejemplos de aplicaciones
1. Concentracin de protenas
Existen varios mtodos espectrofotomtricos para la determinacin de protenas en solucin.
El mtodo de Biuret se basa en la reaccin del Cu +2 con pptidos en una solucin alcalina para dar
complejos prpuras que tienen un mximo de absorcin a 540 nm. El mtodo se usa para soluciones
que tienen de 0.5 a 10 mg protena/ml. Existen compuestos que interfieren con la lectura, tales como
tioles y NH4, que pueden removerse precipitando la protena con un volumen igual de cido
tricloroactico al 10%, resuspendiendo el precipitado que contiene las protenas en NaOH 1 N.
El color producido por el mtodo de Lowry resulta de la reaccin de Biuret ms la reduccin del
reactivo de fosfomolibdato-fosfotungstato (Folin-Ciocalteu) por residuos de tirosina.
La mayora de protenas presenta un mximo de absorbancia a 280 nm, debido a la presencia de
aminocidos aromticos (tirosina, triptofano y fenilalanina). La absorbancia a 280 nm puede usarse
para medir protenas en concentraciones entre 0.1 y 0.5 mg/ml, en la ausencia de sustancias que
interfieran con la lectura. Algunas preparaciones de protenas parcialmente purificadas pueden tener
cidos nucleicos, los cuales tienen un mximo de absorcin a 260 nm. Una ecuacin para calcular la
concentracin de protena en la presencia de cidos nucleicos en cubetas de 1 cm de paso es:

[protena]mg/ml = 1.55 A280nm - 0.76 A260nm


La ecuacin fue derivada para enolasa (A 280/A260 = 1.75) en la presencia de cido nucleico de
levadura (A280/A260 = 0.49) y por tanto puede no ser precisa para otras protenas y otros cidos
nucleicos. La absorbancia a 280 nm de una solucin de protena 0.1% (p/v) vara entre 0.5 y 2.5,
dependiendo de la proporcin de aminocidos aromticos que contengan.
Todas las protenas absorben fuertemente debajo de 230 nm. Por ejemplo, la albmina srica bovina
(0.1% p/v) absorbe 5.0 y 11.7 a 225 y 215, respectivamente (comparado con 0.66 a 280 nm). La
absorbancia por debajo de 230 nm es debido al enlace peptdico. Consecuentemente los valores de
a0.1% son casi los mismos para todas las protenas. Concentraciones de protenas en el rango de 10 a
100 ug/ml pueden determinarse de la diferencia de absorbancias a 215 y 225 nm. Se prepara una
curva standard graficando A vs. protenas.

(protena)ug/ml = 144 (A1cm215 - A1cm225)


La diferencia de absorbancia es usada para minimizar errores que resulten de compuestos no proteicos
en solucin. Altas concentraciones de ciertos buffers pueden interferir (no se puede usar 0.1 N NaOH
para disolver la protena, pero 5 mM NaOH no causa problemas).
2. Concentracin, composicin y propiedades de los cidos nucleicos
a) Para el DNA de cadena doble, una A260nm = 1 corresponde a una concentracin de 50g/ml (en este
caso la ley de Beer se cumple hasta una A = 2).
b) En los primeros trabajos para determinar la composicisin en bases del DNA, se hidrolizaba el
DNA y se separaban las bases por cromatografa. Las bases separadas se podan identificar obteniendo
sus espectros y midiendo la Lmax: 260.5 nm (adenina), 264.5 nm (timina), 275.0 (guanina), 267.0
(citosina). Para evitar la determinacin del espectro completo, se podan distinguir unas bases de otras
midiendo la razn A250/A280. Estos valores son 2.00 para la adenina, 1.26 para la timina, 1.63 para la
guanina y 0.31 para la citosina. Despus de haber identificado las bases, se calculaba la cantidad de
cada una de ellas, ya que los valores de a m a Lmax son conocidos: 13,400 (adenina), 7,900 (timina),
8,100 (guanina) y 6,100 (citosina).
c) Como ya se ha discutido, la A260 del DNA aumenta debido al desapilamiento progresivo de los
nucletidos. Esta fenmeno ha permitido dilucidar algunas de las principales propiedades del DNA,
mediante la evaluacin de su estabilidad (midiendo la A260) respecto a distintas condiciones de
temperatura, pH, fuerza inica, tipo de solvente y otras sustancias.
3. Concentracin de microorganismos en una suspensin
La espectrofotometra tambin es til para calcular la concentracin de microorganismos en
suspensiones. A la longitud de onda que se utiliza (650 nm), toda la absorbancia aparente procede en
realidad de la dispersin de la luz ocasionada por las bacterias. Se debe hacer una curva de calibracin
(absorbancia vs. concentracin de la suspensin) para cada partcula que se analice, pues la cantidad
de energa dispersada depende del tamao de la partcula en suspensin.

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ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ATOMICA
La espectrofotometra de absorcin atmica se basa en el hecho de que cada elemento, dependiendo de
su conformacin electrnica, absorbe energa electromagntica a longitudes de onda especficas.
El espectrofotmetro de absorcin atmica mide la cantidad de energa absorbida por los tomos
volatilizados y llevados a carga 0 en la llama. La energa absorbida es proporcional al nmero de
tomos presentes en el recorrido ptico.
Las longitudes de onda del espectro de un elemento que se absorben con ms facilidad, son aquellas
en que el cambio de energa es mnimo, tales como la radiacin anaranjada de la lnea de transicin D
del espectro del sodio, que implica una pequea transicin 3s-3p (fig. 1). Dado que las transiciones
posibles a los electrones de cualquier tomo vienen especificadas por los niveles de energa
disponibles y los niveles ocupados, los espectros atmicos son absolutamente caractersticos del
elemento implicado. Tericamente, la estructura electrnica de los tomos ms simples podra ser
deducida a partir de sus espectros de lneas.

Componentes de un espectrofotmetro de absorcin atmica

1. Fuente de radiacin: Con objeto de producir un haz de radiacin con una ancho de banda muy
estrecho, se utilizan lmparas de descarga de ctodo hueco o lmparas de descarga sin electrodo. Las
lmparas de descarga son especficas para el elemento que se ensaya.

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2. Nebulizadores (atomizadores), llamas y horno de grafito: El nebulizador y el quemador tienen por
funcin producir tomos libres y con carga 0 a partir de la muestra que se ensaya.
La fuente de energa para producir tomos libres es el calor de combustin de ciertas mezclas de gases
(tabla 1). El tomo se lleva a carga 0 por accin de agentes xido-reductores presentes en la mezcla de
gases.
La nebulizacin se produce mediante una corriente de aire comprimido que pasa por un tubo capilar,
cuya punta est sumergida en la solucin de ensayo. El aerosol generado pasa por inyeccin directa,
con la corriente de aire, hacia el quemador.
Tabla 1. Mezclas de gases y temperaturas de las llamas utilizadas con mayor frecuencia en
espectrofotometra de absorcin atmica.
Mezcla de gases

Temperatura C

Ejemplos de elementos
ensayados

argn/hidrgeno
aire/gas natural
aire/propano
aire/hidrgeno
aire/acetileno

300-800
1500
1900
2000
2300

As, Se
Na, K (Ca)
Ca
Cs, Rb, K, Na

xido nitroso/acetileno

2900

Ca, Mg, Fe, Li *


Ti, V *

(*) El 90% de los elementos son ensayados bajo estas condiciones.


La principal limitacin del uso de la llama es que el sistema nebulizador-quemador es relativamente
ineficiente en la generacin de la muestra. Slo una pequea fraccin de la muestra alcanza la llama,
y la muestra atomizada pasa rpidamente a travs del paso de luz.
En el horno de grafito, la llama es reemplazada con un tubo de grafito, calentado elctricamente. La
muestra es introducida directamente en el tubo, que es calentado en forma seriada con objeto de
remover el solvente y los componentes principales de la matriz, y luego atomizar el resto de la
muestra, donde se encuentra el elemento problema. Toda la muestra es atomizada, y los tomos son
retenidos dentro del tubo, lo que permite que se mantengan en el paso de luz por un tiempo ms largo.
Estas caractersticas hacen al horno de grafito un sistema con mayor sensibilidad que el tradicional
nebulizador-quemador.
Sin embargo, el tiempo requerido para el anlisis con un horno de grafito es ms largo, y no todos los
elementos que pueden ser analizados con nebulizador-quemador pueden serlo en horno de grafito.
3. Sistema ptico y detectores: Existen aparatos con pticas de uno y doble haz. Los de doble haz
incluyen un colimador en el recorrido luminoso y en un circuito adecuado, que evita que la luz
descarriada se registre en el sistema detector.
Interferencias
Las interferencias en absorcin atmica son de 5 tipos:
1. Qumica:
Ocurre cuando el elemento de inters se combina con algn otro catin o anin en solucin para
formar un compuesto, que altera su grado de reduccin a tomos neutrales en la llama utilizada. As,
el nmero de tomos en la llama con capacidad de absorber la radiacin emitida por la lmpara vara,
variando tambin la sensibilidad del ensayo.
Este problema puede solucionarse, 1) utilizando una llama de mayor temperatura (lo que disminuira
la probabilidad de formacin del compuesto con el elemento problema), o 2) aadiendo un agente
"liberador" a la muestra, que puede reaccionar con el elemento de inters o con el elemento
interferente, de modo tal que no se produzca el compuesto causante de la interferencia.
2. De matriz:
Se pueden obtener errores en los resultados cuando las caractersticas fsicas (viscosidad, tensin
superficial, etc.) de la muestra y del standard difieren considerablemente. Esto puede suceder cuando
la muestra contiene gran cantidad de sales o cido, cuando se utilizan diferentes solventes para el
standard y la muestra, o cuando la temperatura del standard es muy diferente de la de la muestra.

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Las interferencias de matriz pueden controlarse diluyendo la muestra hasta que el efecto de las sales
disueltas o el cido sea despreciable. Cuando no es posible diluir la muestra, se pueden aadir al
standard los principales constituyentes de la matriz de la muestra; o si esto tampoco es posible, se
puede utilizar el mtodo de adicin (ver adelante).
3. De ionizacin:
Sucede cuando la temperatura de la llama es lo suficientemente alta como para generar la remocin de
un electrn de un tomo neutral, produciendo un in cargado positivamente. Aunque este in es
tambin capaz de absorber energa, lo hace a una longitud de onda diferente que el tomo con carga 0
(que es la longitud de onda que emite la lmpara especfica). Al disminuir el nmero de tomos
neutrales en la llama, disminuye la sensibilidad de la lectura.
Esta interferencia puede controlarse aadiendo tanto al standard como a la muestra un exceso de
algn elemento fcilmente ionizable (ms electronegativo que el elemento problema).
4. Espectrales:
Este tipo de interferencia se produce cuando un elemento presente en la muestra absorbe energa a una
longitud de onda similar al elemento que se quiere cuantificar. Esto produce falsas lecturas,
excesivamente altas.
5. Absorcin de fondo
Ciertas muestras, al ser atomizadas, pueden absorber o dispersar la luz emitida por la lmpara fuente
debido a la presencia de molculas en forma de gas, partculas de sal, humo, etc. El conjunto de estos
factores de interferencia se denomina "absorcin de fondo". Por lo general, los efectos de la absorcin
de fondo se hacen ms notorios a longitudes de onda bajas.
Como el elemento de inters absorbe slo la longitud de onda emitida por la lmpara fuente, la
absorcin de fondo puede ser corregida leyendo la absorbancia de la muestra a una longitud de onda
cercana pero diferente a la del elemento problema.
Otra forma de corregir la interferencia por absorcin de fondo es utilizando un dispositivo llamado
corrector de deuterio. En este sistema, se pasa la luz producida por la lmpara fuente y la producida
por un arco de deuterio en forma alternada a travs de la llama. El elemento problema absorbe slo la
longitud de onda proveniente de la lmpara fuente, mientras que la absorcin de fondo ocurre en
ambos casos. Un dispositivo electrnico resta la seal de absorcin de fondo de la absorcin total,
corrigiendo la interferencia.
Mtodo de adicin
Este mtodo se utiliza cuando la matriz en que se encuentra el elemento problema produce
interferencia en la lectura, y esta interferencia no puede ser reproducida en el standard (por ejemplo,
su composicin es desconocida, o vara demasiado de muestra a muestra).
Procedimiento:
Se toman 3 alcuotas de la muestra. La primera se diluye con solvente a un volumen determinado. La
segunda y la tercera se llevan al mismo volumen pero con cantidades conocidas del elemento
problema (disuelto en el mismo solvente).
Se lee la absorbancia para cada solucin y se grafican vs. la concentracin de elemento problema
aadida (fig. 3). La recta obtenida se extrapola hasta el cero de absorbancia. El intercepto en el eje de
las x da la concentracin del elemento problema en la muestra diluida.
Para lograr una determinacin precisa del elemento problema mediante este mtodo, 1) la curva de
adicin que se obtenga debe ser lineal, y 2) las cantidades conocidas de elemento problema que se
aaden deben tener aproximadamente la misma concentracin que se espera para el elemento
problema en la muestra diluida.

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INTRODUCCIN A LA FLUORESCENCIA
Las tcnicas de la fluorescencia permiten a investigadores detectar los componentes y la estructura de
los complejos biomoleculares, incluyendo las clulas vivas, con gran sensibilidad y selectividad. El
propsito de esta introduccin es delinear brevemente que es la fluorescencia.
El proceso de Fluorescencia
La fluorescencia es el resultado de un proceso de tres fases que ocurre en ciertos hidrocarburos
poliaromticos o heterocclicos llamados molculas o tintes fluorescentes. Un fluoroforo es una sonda
fluorescente, que es diseado para localizar una regin especfica dentro de un espcimen biolgico o
para marcar un evento esperado a un estmulo especfico. El proceso responsable de la fluorescencia
de las sondas fluorescentes y de otros fluoroforos es ilustrado por el diagrama simple del estado
electrnico (diagrama de Jablonski) mostrado en figura 1.

Figura 1 Diagrama de Jablonski que


ilustra los procesos implicados en la
creacin de un estado electrnico
excitado del singlete por la absorcin
ptica y la emisin subsiguiente de la
fluorescencia.

Estado 1 : Excitacin
Un fotn de energa hvEX que es provedo por una fuente externa tal como una lmpara incandescente
o un lser es absorbido por el fluoroforo, creando un estado electrnico excitado del singlete (S1').
Este proceso distingue fluorescencia de quimioluminescencia, en cul el estado excitado es producido
por una reaccin qumica.
Estado 2 : Singlete excitado
El singlete en estado excitado existe por un tiempo finito (tpicamente 110 10-9 segundos). Durante
este tiempo, el fluoroforo experimenta cambios conformacionales y est tambin sujeto a mltiples
interacciones con su ambiente molecular. Estos procesos tienen dos consecuencias importantes.
Primero, si la energa de S1 se disipa parcialmente producir un singlete dbilmente excitado en su

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estado (S1) produciendo una emisin de la fluorescencia menor que la que originalmente podra
emitirse. En segundo lugar, no todas las molculas excitadas inicialmente por la absorcin (etapa 1)
vuelven a su al estado cero o basal (S0) por la emisin de la fluorescencia. Otros procesos tales como
la extincin por colisin, la transferencia de energa de la fluorescencia y la trasferencia al
intersistema pueden tambin el reducir los S1. La produccin de un quantum de la fluorescencia, que
es el cociente del nmero de los fotones de la fluorescencia emitidos (etapa 3) respecto al nmero de
los fotones absorbidos (etapa 1), es una medida del grado relativo de la ocurrencia de estos procesos.
Estado 3 : Emisin de la Fluorescencia
Cuando se emite un fotn la energa hvEM vuelve al fluoroforo a su estado basal S0. Debido a la posible
disipacin de la energa durante la vida media del estado excitado, la energa emitida de este fotn es
ms baja, y por lo tanto se produce una longitud de onda ms larga que el h vEX original del fotn de la
excitacin. La diferencia en la energa o la longitud de onda representada por (hvEXhvEM) se llama
corrimiento de energa. El corrimiento de energa es fundamental para la sensibilidad de las tcnicas
de la fluorescencia porque permite que los fotones de la emisin sean detectados contra un fondo de
luz bajo, aislndose de los fotones de la excitacin. En cambio cuando se usa el espectrofotmetro de
absorcin se requiere medir la relacin entre los niveles de la luz incidente en la misma longitud de
onda con la luz transmitidos del fluoroforo
Espectro Fluorescencia
El proceso entero de la fluorescencia es cclico. A menos que el fluoroforo se destruya
irreversiblemente en su estado excitado (un fenmeno importante conocido como photobleaching), el
mismo fluoroforo puede ser excitado y detectado varias veces. Para las molculas poliatmicas en la
solucin, las transiciones electrnicas discretas representadas por el hvEX y el hvEM en la figura 1
son substituidas por los espectros de energa algo amplios llamados el espectro de la excitacin de la
fluorescencia y espectro de emisin de la fluorescencia, respectivamente. Las anchuras de banda de
estos espectros son parmetros de importancia particular para los usos en los que dos o ms
fluoroforos (diverso en estructura y por ende en longitudes de emisin/excitacin) puedan ser
detectados simultneamente Con pocas excepciones, el espectro de la excitacin de la fluorescencia de
una sola especie del fluoroforo en una solucin diluida es idntico a su espectro de absorcin. Bajo las
mismas condiciones, el espectro de emisin de la fluorescencia es independiente de la longitud de
onda de la excitacin, debido a la disipacin parcial de la energa de la excitacin durante la vida
media del estado excitado segn lo ilustrado en la figura 1. La intensidad de la emisin es
proporcional a la amplitud de excitacin del espectro de la fluorescencia en la longitud de onda de la
excitacin (figura 2).
Figura 2 Excitacin de un fluoroforo a
tres diferentes longitudes de onda (EX
1, EX 2, EX 3) no cambia el perfil de
la emisin sino produce variaciones en
intensidad de la emisin de la
fluorescencia (EM 1, EM 2, EM 3)
eso corresponde a la amplitud del
espectro de la excitacin.