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PRCTICA II
OBTENCION DE CELULAS DEL SISTEMA
INMUNOLOGICO APARTIR DE ORGANOS
LINFOIDES
I. INTRODUCCIN
Las respuestas inmunitarias innata y adaptativa dependen de las actividades de los
leucocitos. Estas clulas se originan en la mdula sea, y muchas tambin se
desarrollan y maduran ah. Despus migran para proteger los tejidos perifricos,
algunas de ellas residen dentro de los tejidos, otras circulan en el torrente sanguneo
y en un sistema de vasos especializado llamado sistema linftico, que drena lquido
extracelular y clulas libres desde los tejidos, los transporta por el cuerpo como linfa,
y finalmente se vaca de regreso hacia el sistema vascular sanguneo.
Los linfocitos circulan en la sangre y la linfa, y se encuentran tambin en grandes
nmeros en tejidos linfoides u rganos linfoides, que son agregados organizados de
linfocitos en una red de clulas no linfoides. Los rganos linfoides pueden dividirse a
grandes rasgos en rganos linfoides centrales o primarios, donde se generan los
linfocitos, y rganos linfoides perifricos o secundarios, donde se mantienen los
linfocitos vrgenes maduros y se inician respuestas inmunitarias adaptativas.
Los rganos linfoides centrales son la mdula sea y el timo, un rgano que se
encuentra en la parte alta del trax. Los rganos linfoides perifricos comprenden los
ganglios linfticos, el bazo, y los tejidos linfoides de la mucosa del intestino, las vas
nasales y respiratorias, las vas urogenitales, y otras mucosas. Los ganglios linfticos
estn interconectados por medio de un sistema de vasos linfticos, que drenan lquido
extracelular desde los tejidos, a travs de los ganglios linfticos, y de regreso hacia
la sangre.
II. MATERIALES Y REACTIVOS
- Medio RPMI 1640
- Etanol al 70%
- Tijeras y frceps
- Placas petri
- Jeringas (3ml)
- Agujas 22G1
- Tubos Falcon de 15ml
- Homogeneizador de tejidos de vidrio
- Suspensin celular.
- Hemocimetro
- Pipetas
- Pipetas pasteur
- Tubos eppendorf
- Solucin de Turk
- Azul de trypan, 0.4%(w/v) en agua
- PBS
- Tubo plstico de 5ml
III. PROCEDIMIENTO
A) OBTENCION DE CELULAS
MDULA SEA
1. Matar
sobre una tabla de diseccin con el vientre hacia arriba. Empapar la rata con
etanol para reducir el transporte de pelos con el aire.
2. Hacer un corte transversal largo a travs de la piel en la parte media del rea
abdominal. Retirar la piel de las patas traseras.
3. Separar las piernas del cuerpo al nivel de la articulacin de la cadera. Retirar la
grasa y colocar las piernas en una placa petri con medio.
4. Retirar el tejido muscular del fmur y la tibia. Separar el fmur y la tibia y
cortar las epfisis en ambos extremos.
5. Inyectar por los extremos del hueso 3ml de medio o PBS, con una jeringa para
expulsar la medula sea
6. Remover los desechos grandes y los acmulos celulares.
7. Lavar la suspensin por centrifugacin a 300xg por 10 minutos a 4 grados y
colocar en el medio al 5% de FS.
TIMO
1. Matar
sobre una tabla de diseccin con el vientre hacia arriba. Empapar el abdomen la
rata con etanol para reducir el transporte de pelos con el aire.
2. Usando la tijera, hacer una incisin desde la regin xifoidea hasta la regin
3.
4.
5.
6.
7.
BAZO
sobre una tabla de diseccin con el vientre hacia arriba Empapar el abdomen la
rata con etanol para reducir el transporte de pelos con el aire.
2. Hacer una incisin a travs de la piel en la regin inguinal. Con los dedos sobre
ambos lados del corte, tire entre la cabeza y la cola hasta que la pared
peritoneal este lo suficientemente expuesta. Empapar la cavidad peritoneal con
etanol.
3. Cortar el peritoneo, levante el bazo con los frceps, y separe este de los
tejidos adyacentes con la tijera. Colocar el bazo en una placa petri con medio.
4. Cortar el bazo en pequeos trozos y haga una suspensin.
5. Cuidadosamente triturar el tejido en el homogeneizador de vidrio, utilizando el
embolo de una jeringa de 5 ml.
6. Remover los desechos grandes y los acmulos celulares.
7. Lavar la suspensin por centrifugacin a 300xg por 10 minutos a 4 grados y
colocar en el medio al 5% de FS.
B)
CONTEO
1.
CELULAR
Diluir las clulas
en la solucin de Turk.
2. Mezclar completamente y aadir 1 gota en la cmara de Neubauer usando la
pipeta Pasteur o micropipeta
3. Contar las clulas de los cuadrantes de los extremos (1,3,7 y 9). Incluya en
este recuento las clulas que se observan sobre las lneas de dos lados de cada
cuadrado revisado.
4. Conteo de clulas/ml=Numero de clulas (promedio correspondiente a un rea
de 1mm2) x factor de dilucin x104.
C) DETERMINACIN DE LA VIABILIDAD CELULAR (Exclusin por azul de
Trypan)
1. Mezclar 0.05 ml de la solucin de azul de trypan, y 0.05 ml de la suspensin
celular. Dejar incubar 5 minutos.
2. Transferir una pequea cantidad de la suspensin a la cmara de Neubauer y
contar las clulas. Las clulas no viables estarn teidas de azul.
X 100
El azul de trypan tiene mayor afinidad por las protenas del suero que por las
protenas celulares. Si el extendido es muy oscuro, resuspender las clulas en
en una
proporcin (1/4)
2. Mezclar el tubo por inversin 5-6 veces
3. Incubar las muestras sobre hielo, durante 5min (mezclar el tubo 2-3 veces
durante la incubacin).
4. Centrifugar a 4000rpm durante 2 min.
5. Descartar el sobrenadante (cuidando de no eliminar el pellet que contiene los
leucocitos).
6. Lavar el pellet con 1mL de suero fisiolgico y volver centrifugar
Nota: Si el pellet sigue contaminado con eritrocitos repetir la lisis.
IV. RESULTADOS
Fmur y tibia y
Rata muertael procedimiento de aislamiento de clulas inmunolgicas a partir de
1. Esquematice
cortar las
la
epfisis
Medula sea, timo y bazo
Lavar la suspensinExtraer
por
centrifugacin a 300xg por
10 minutos a 4 grados
MEDULA
Inyectar PBS a
OSEA
la difisis
Colocar en el
medio al 5% de
FS.
TIMO
Rata
muerta
Retirar timo y
ponerlo en una
placa Petri.
Colocar en el medio al 5%
de FS.
Triturar el
tejido
BAZ
O
ORGANOS LINFOIDES
SECUNDARIOS
Bazo
V. CUESTIONARIO
1. Indique cuales son los rganos linfoides primarios y secundarios
2. Mencione
rganos
respuesta
cual
es la funcin de los
linfoides
en
la
inmunitaria
CONCLUSINES
El presente experimento permitio visualizar la cantidad de clulas del sistema inmune
de una rata, evidenciando la enorme cantidad de estasy su distribucin. Esto permite
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS: