Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
Molecular
Diamar Costa-Pinto
FIOCRUZ
Viso da Apresentao
PCR
Bibliotecas genmica e de expresso
Fragmentao - digesto
Separao - eletroforese
Clonagem molecular
Sequnciamento
By Diamar
Diagnstico do sculo 21
- Podemos fazer anlises genmicas,
pois a maioria dos cromossomo j esto
mapeados.
- O projeto genoma tem sido uma
grande ferramenta para unir genomas e
laboratrio clnico.
By Diamar
Enzimas de Restrio
By Diamar
Enzimas de Restrio
(continuao)
Palndrome:
ARARA
ARARA
OMO
OMO
ANA
ANA
By Diamar
Enzimas de Restrio
(continuao)
By Diamar
Enzimas de Restrio
(continuao)
By Diamar
By Diamar
Vdeo de Enzima de
Restrio
By Diamar
Eletroforese
By Diamar
Eletroforese
Fonte de eletroforese
Vertical
Horizontal
By Diamar
Eletroforese
By Diamar
Vdeo de Eletroforese
By Diamar
Clonagem Molecular
By Diamar
By Diamar
Bactria
DNA
Plasmdeo
Transformao
Digesto
Enzima de restrio
Tesoura gentica
Clonagem
DNA da bactria
rDNA
By Diamar
O DNA recombinante
By Diamar
Vdeo de Clonagem
Molecular
By Diamar
Vetor
So molculas de transporte
Molculas de DNA
Diversos tipos: plasmdeos, cosmdeos, fagos,
vrus, YACs, etc.
Diferenas de tamanho de inserto
Podem ter comportar linear e/ou circular
By Diamar
Vetor
(continuao)
Promotores fortes
Stios de ligao a ribossomos
Stios de clonagem
Vetor
(continuao)
Caractersticas gerais
Regio promotora
Stio Mltiplo de Clonagem - Polylinker
Gene de resistncia a antibiticos
Origem de replicao
Gene reprter
By Diamar
Vetor
(continuao)
PLASMDEOS:
Vetor
(continuao)
FAGOS
Vrus de bactrias
Fago o mais utilizado
Fita dupla linear
Recirculariza durante a infeco na bactria
Aceita at 20 mil pb
By Diamar
Vetor
(continuao)
COSMDEOS
Pequeno tamanho 4 a 6 Kb
Engenherado: empacota rDNA no capsdeo do
fago para infectar bactria
Possuem seqncias cos
Aceitam insertos de at 50 mil pb
By Diamar
COSMDEOS
By Diamar
Vetor
(continuao)
By Diamar
- Hormnio de crescimento
- Insulina humana
- Vacina da Hepatite B
- Hormnio sexuais
By Diamar
Sequenciamento
Sequenciamento
(continuao)
Consideraes
P
P
A
BN
C5
C4
C4
Ribose
C3
C2
OH
NTP
cido ribonucleico
5
O - Necessrio
para ligao
fosfodister
Polimerizao
C1
G
T
Pentose
C3
C2
OH
OH
BN
C5
C1
OH
ddNTP
dNTP (Didesoxinucleotdeo)
cido desoxirribonucleico
3
By Diamar
Sequenciamento
A
DNA molde
Primer
DNA polimerase
ddNTP
G
dNTP
dNTP
dNTP
ddNTP
Fragmento 1
Fragmento 2
dNTP
ddNTP
dNTP
dNTP
Fragmento 3
By Diamar
Sequenciamento automatizado
Vdeo do Sequenciamento
(Cycseqpc)
By Diamar
Southern Blotting
E. M. Southern (1975)
Fragmentos de DNA so separados em gel de
agarose
Transferidos para membranas por ao capilar
DNA desnaturado antes ou durante a
transferncia
Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na
membrana
Detecta polimorfismo de DNA ou mutao
By Diamar
Southern blot
Descrio:
- Digesto do DNA em teste com enzimas
de restrio;
- Resoluo dos fragmentos com
eletroforese em gel de agarose;
- Transferncia do DNA para membrana de
nylon;
- Hibridao com uma sonda de DNA ou
RNA marcada com radioatividade ou
quimioluminescentes
Aplicao: Alteraes em um nico
nucleotdeos; deteco de inseres, delees
e rearranjos; ordenamento de fragmentos do
DNA em um mapa fsico; fragmentos de
cromossomo.
Com o advento da PCR seu uso tornou-se
limitado.
By Diamar
Southern blot
By Diamar
Northern blotting
By Diamar
Northern blotting
(Continuao)
By Diamar
Northern blotting
Marcadores
rRNA
Western blotting
By Diamar
Western blotting
(continuao)
By Diamar
Western blotting
By Diamar
Western blotting
Anlise de protenas por anticorpos especficos aps
eletroforese e transferncia para membrana.
By Diamar
Vdeo Immunoblotting
(3EIMMBLOT)
RFLPs
Polimorfismo dos comprimentos dos
fragmentos de restrio
Mapa de Restrio
By Diamar
PCR - RFLP
By Diamar
RFLPs
Polimorfismo dos comprimentos dos
fragmentos de restrio
RFLP de Planta
DNAs genmico de
Arabidopis digerido
com EcoRI.
Southern blotting
com sonda azul e
verde.
F1 heterognio
possui fragmentos de
ambos os genitores.
F1 autopoliniza:
1:2:1 Ecotipo
diferentes: CColombia, NNiederzenzes e H
Heterozigoto.
Descrio:
- Hibridao preferencial de sonda
marcada para testar DNA com composio
de bases complenmentar nica.
Aplicao:
- Alelos de composio conhecida.
FISH
Hibridao in situ com fluorescncia
By Diamar
FISH
(Hibridao in situ com fluorescncia)
By Diamar
By Diamar
FISH
(Hibridao in situ com fluorescncia)
Relao evolutiva
entre cromossomos.
DNA de gibo
Hylobates lar
sondado com DNA
Humano.
Setas indicam
cromossomo 8 do
gibo.
Cromossomo
humano 4 hibrida
com cromossomo
(laranja) do macaco
verde africano.
Evoluo cromossmica em mamferos
SSCP
Single-strand conformational polymorphism
Protocolo Bsico
) Gel no desnaturante.
) Sensvel para
) DNA desnaturado.
) Detecta a mudana
de uma base.
(eletroforese)
) Mobilidade diferente
da normal indica
mutao.
By Diamar
SSCP
Single-strand conformational polymorphism
By Diamar
Microarray
Microarranjos de DNA Chips de DNA
uma tcnica que emprega arranjos (arrays),
que contm um grande nmero de genes
roboticamente distribudos de forma ordenada em
uma placa de vidro.
Pode comparar a expresso de um grande
nmero de gene, simultaneamente.
Existem lminas de 400.000 pontos.
So feitas com ponteiras de titneo.
By Diamar
Utilizao
Tcnica cara
- Mapear mutaes
Sensibilidade reduzida
- Oncogenes
Lminas no so reutilizadas
- Regies regulatrias
de genes de levedura
Grande quantidade de
mRNA (2 a 5 g)
- Expresso de genes
annimos
- Analisar 10.000 amostras
em 12 horas
Descrio:
- Hibridao do DNA em
teste com disposies
ordenadas de nucleotdeos
em chip de silicone.
Aplicao:
- Deteco de DNA em
teste com composio
conhecida.
By Diamar
Referncias Bibliogrficas:
By Diamar
Obrigada!
By Diamar