Introduccin a la espectroscopa UV-visible

El estudio a nivel bioqumico de cualquier biomolcula requiere la

utilizacin de tcnicas analticas que permitan su determinacin cualitativa
y cuantitativa, as como su caracterizacin fsico-qumica y biolgica. Uno de
los mtodos ms sencillos, accesibles, tiles y utilizados es la
espectroscopa, en general, y la espectroscopa ultravioleta-visible, en
particular.
El fundamento de la espectroscopa se debe a la capacidad de las
molculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del
espectro UV-visible.
Se pueden identificar y cuantificar biomolculas en solucin y en
muestras biolgicas ya bien porque absorban la luz per se, o mediante el
empleo de reactivos especficos que reaccionan con el compuesto a analizar
y forman un producto coloreado que permite detectarlo en muestras
complejas.

Introduccin a la espectroscopa
Las tcnicas espectroscpicas son tcnicas de anlisis molecular
que se basan en el estudio de las interacciones que se
establecen entre las radiaciones electromagnticas y las
molculas.
En concreto nos centraremos en la absorcin de las radiaciones
ultravioleta (UV) y visible por parte de las molculas biolgicas.
Estudiando la interaccin de la radiacin electromagntica con
las molculas biolgicas podremos:
- Estudiar propiedades estructurales
- Estudiar propiedades dinmicas
- Estudiar la funcin
- Cuantificar

Espectroscopas
Rayos X
UV-visible (Espectrofotometra)
Fluorescencia
IR Infrared spectroscopy
CD Circular dichroism
EPR Electron paramagnetic resonance
RMN Nuclear magnetic resonance

Qu es la radiacin electromagntica
Es la propagacin a travs del espacio de una perturbacin
electromagntica producida en algn punto del mismo.
Las radiaciones electromagnticas tienen una naturaleza dual,
es decir, pueden ser consideradas como una onda o como un
corpsculo.
Modelo de Onda

Modelo ondulatorio
Una onda electromagntica es el resultado de la oscilacin de un
campo elctrico y un campo magntico que se propagan en el
espacio. Ambos campos son perpendiculares entre s y a la
direccin de propagacin de la onda. En el vacio, c= 300.000
km/s = velocidad de la luz.
Solo consideraremos el campo elctrico a la hora de estudiar la interaccin con la
materia

Modelo ondulatorio
Es importante destacar que, aunque los
vectores oscilen en esta figura en un
nico plano, tambin lo hacen en todos
aquellos perpendiculares al eje que
marca la direccin de propagacin. Una
onda como la representada es una
radiacin electromagntica polarizada
plana.

Parmetros de una onda

Longitud de onda (): distancia existente entre dos puntos en los que el
vector E es idntico, no solo en cuanto a mdulo, sino tambin en cuanto a
direccin y sentido. Se expresa en unidades de longitud, normalmente en
nanmetros (nm).

Espectro de radiacin electromagntica

La longitud de onda nos sirven para establecer una clasificacin de las
radiaciones electromagnticas. El amplio espectro de radiacin
electromagntica de la naturaleza, se puede dividir siguiendo valores
orientativos, pues se trata de una variacin continua.

UV lejano
170-250 nm
UV prximo
250-350 nm
Visible
350-1000 nm

Parmetros de una onda

Frecuencia (): nmero de oscilaciones de onda por segundo. Unidades s-1.

=c/
Si consideramos la radiacin electromagntica como un corpsculo, la
radiacin est cuantizada, es decir, formada por unidades discretas de
energa o cuantos, los fotones. La energa del fotn es:

E = h = h (c/)
Donde h es la constante de Plack
h= 6,6252 10-34 J s

Parmetros de una onda

Intensidad (I): energa que atraviesa la unidad
de rea, perpendicular a la direccin de
propagacin, por unidad de tiempo. Es decir, el
nmero de fotones por unidad de tiempo que
atraviesa una determinada superficie.
Pueden existir radiaciones electromagnticas
con la misma energa (idntica longitud de
onda) pero diferente intensidad (distinto
nmero de fotones por unidad de tiempo).
Por lo tanto:
La energa est asociada a la (inversamente)
La intensidad est asociada al mdulo del
vector de campo elctrico (E)

Interaccin de la radiacin electromagntica con la

materia
Cuando la luz (considerada como energa) es absorbida por una molcula se origina un
salto desde un estado energtico basal o fundamental, E0, a un estado de mayor
energa (estado excitado), E1*. Y slo se absorber la energa que permita el salto al
estado excitado.
Cada molcula tiene una serie
de estados excitados (o
bandas) que la distingue del
resto de molculas. Como
consecuencia, la absorcin
que a distintas longitudes de
onda presenta una molcula esto es, su espectro de
absorcin- constituye una
sea de identidad de la
misma. Por ltimo, la
molcula en forma excitada
libera la energa absorbida
hasta el estado energtico
fundamental.

Interaccin de la radiacin electromagntica con la

materia
Molcula + h

Molcula *

Siempre que h = Emolcula* = (Emolcula* - Emolcula)

La distribucin espacial de los electrones de una
molcula da lugar a los diferentes niveles
electrnicos. La diferencia de energa entre ellos
es del orden de 1 eV. Dentro de ellos, se
superponen los diferentes modos de vibracin y,
dentro de stos, los de rotacin. Los modos
vibracionales suponen incrementos de energa
de 0.1 eV, y los rotacionales de 0.01 eV. Los
diferentes modos de vibracin son debidos a las
tensiones y deformaciones de los enlaces
covalentes en la molcula, as como a
variaciones en las distancias de los ncleos entre
s. As, mediante cambios de este tipo se podrn
dar transiciones vibracionales sin cambio de
nivel electrnico.

Absorcin de radiaciones electromagnticas

Parte de la energa que atraviesa un medio se consume, pues parte de los fotones se
consumen en trnsitos electrnicos. Por lo tanto, la Intensidad (I) de la luz emergente
al atravesar un medio, ser menor que la incidente I0.
Los electrones que son excitados
volvern al estado fundamental
cediendo la energa, por ejemplo en
forma de energa cintica, aunque en
algunos casos esta desexcitacin
supondr la emisin de luz
(fluorescencia).

I0

Ley de Beer-Lambert
Cuando un haz de luz atraviesa un material se puede producir la absorcin de parte
de esa radiacin por las molculas presentes. En tal caso, la intensidad del haz
emergente ser

I = I0 Ia
Si tenemos en cuenta la distancia que el haz de luz atraviesa,

I= I0e-kL

Ley de Lambert

Donde k es el coeficiente de absorcin y L la distancia recorrida.

Cuando se trabaja con disoluciones, en las que el disolvente no absorbe, la
absorcin ser funcin directa de la concentracin del soluto. La ecuacin que
gobierna esta dependencia es la ley de Beer:

I= I0e-2,303CL

Ley de Beer

Ley de Beer-Lambert
En la prctica, lo que se mide no es propiamente la intensidad de luz absorbida, sino
otras magnitudes relacionadas con ella:
Transmitancia: % de luz transmitida

Absorbancia: Valor del logaritmo decimal de la relacin de intensidades de luz

incidente y emergente, respectivamente.

A = log I0
I
A partir de esta definicin y las ecuaciones de Beer y Lambert, podemos
definir la ecuacin de beer-Lambert.

A=CL

Coeficiente de extincin molar

Basndonos en la ecuacin de Beer-Lambert, el coeficiente de extincin molar () de
una sustancia podra definirse como la absorbancia de una disolucin 1 M de un
soluto, para un paso ptico de 1 cm.
Tambin hay que destacar el carcter aditivo de
la absorbancia. Mientras que T vara con la
concentracin de soluto de manera exponencial,
en el caso de la absorbancia la relacin mantiene
una proporcionalidad directa. As la absorbancia
de una disolucin es la suma de las absorbancias
de sus componentes. As, en disoluciones en las
que solo hay un soluto:
Adisolucin = Adisolvente + Asoluto
Por lo tanto, podemos restar la Absorbancia del disolvente a la absorbancia del soluto
para obtener la absorbancia debida a ste.
Densidad Optica (DO) se refiere a la absorbancia de una muestra cuando el paso
ptico es 1 cm.

Espectro de absorcin
El espectro de absorcin de una molcula es la representacin grfica del suceso de
absorcin o emisin de radiacin en relacin a la energa expresada como longitud de
onda con la cual irradiamos el cromforo. Se podra definir tambin como una
representacin de su coeficiente de extincin molar en funcin de la longitud de onda
de la luz incidente.
A

Aplicaciones de la Espectrofotometra de absorcin

Cuantificacin de compuestos biolgicos:
-Medida de concentraciones
-Medidas cinticas (Reacciones enzimticas)
-Identificacin de cromforos
-Cambios conformacionales en macromolculas

Espectrofotmetros
La medida de absorbancia de una disolucin se realiza en los Espectrofotmetros.
Partes:

Tipos de espectrofotmetros
Espectrofotmetros
-Medidas en el UV (cubetas de cuarzo) y visible (plstico).
-Utiliza monocromadores
-Utiliza fotomultiplicadores

Colormetros
-Medidas solo en el visible (colores)
-Filtros en lugar de monocromador ( de mayor anchura)
-Clula fotoelctrica en lugar de fotomultiplicador (menos
sensible)

Densitmetros
-Preparados para la medida de la absorbancia de muestras
dispuestas en una lmina. Ej: autorradiografas, geles,
membranas, filtros, etc
-Barrido de la muestra (scanning).
-Algunos pueden utilizar luz laser aumentando la resolucin.

Espectrofotmetros de flujo continuo

-La cubeta ha de ser de flujo y de muy pequeo volumen.
-Suelen acoplarse a sistemas de cromatografa (HPLC, etc)

Espectrofotmetros
Nanodrop
Espectrofotmetro
UV-Visible
para
microvolmenes (0.5-2 l) sin necesidad de utilizar
cubetas. El nanodrop utiliza la tecnologa de la fibra
ptica y un sistema de retencin de muestra
basado en la tensin superficial. Al cerrarse el
brazo, se produce un ajuste para que la muestra
forme una columna entre las dos superficies
pticas. El aparato realiza un ajuste de esta
distancia para hacer una medida a 1 mm y otra a
0,2 mm, lo que le da un elevado rango dinmico (23700 ng/ml para el DNA) y evita el tener que hacer
diluciones.

Espectrofotmetros
Nanodrop
Xenon flash lamp
Fibra ptica

1 l muestra

0,2 mm paso ptico

CCD detector